Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)
GIỚI THIỆU
Tính cấp thiết của luận án
Theo thống kê của FAO năm 2022, hành là một loại cây trồng rộng rãi, với sản lượng thế giới 20,9 triệu tấn trên diện tích khoảng 1,18 triệu ha Trung Quốc và Ấn Độ là các nước trồng hành chính, tiếp theo là Hoa Kỳ, Ai Cập, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Pakistan, Brazil, Liên bang Nga và Hàn Quốc (FAO, 2023) Trong canh tác, hành lá là một loại cây trồng ngắn ngày được trồng ở vĩ độ thấp, hành lá thường được gọi là "Nữ hoàng của nhà bếp” do hương vị, mùi thơm được đánh giá cao và các hợp chất có đặc tính y học của hành lá (Griffiths et al., 2002) Về giá trị sử dụng, hành lá là loại rau được sử dụng trong suốt cả năm, ví dụ như trong món cà ri, trong dạng gia vị, trong món salad như một loại gia vị hoặc nấu với các loại rau khác chẳng hạn như luộc hoặc nướng (Koch & Lawson, 1996)
Hành lá (Allium fistulosum L.) được nông dân trồng phổ biến tại Vĩnh Long với diện tích xấp xỉ 1.000 ha/năm do hiệu quả kinh tế cao (Trung Thành, 2020) và Đồng Tháp (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019) Tuy nhiên, canh tác hành lá chuyên canh luôn gặp nhiều khó khăn do nhiều loại mầm bệnh do nấm và vi khuẩn gây hại như bệnh cháy đầu lá do nấm Botrytis sp., bệnh đốm tím trên lá do nấm Alternaria pori, bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv allii, chết buội do vi khuẩn Erwinia sp., và đặc biệt là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây hại Đây là một trong những bệnh quan trọng và gây thiệt hại nặng đến sản lượng và năng suất hành lá, nông dân chủ yếu sử dụng nhiều loại thuốc hóa học và phun nhiều lần để phòng trị bệnh (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019) Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe người sử dụng do lưu tồn của thuốc trên hành lá Một trong những biện pháp thân thiện môi trường đã được nghiên cứu và ứng dụng trên cây trồng là kích thích tính kháng bệnh, gọi tắt là kích kháng (induced resistance) Kích kháng là biện pháp giúp cho cây trồng tạo được nhiều cơ chế chống lại mầm bệnh, do đó mang tính bền vững cao (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016) Nhiều loại hóa chất có khả năng kích kháng đã được ghi nhận trên thế giới như salicylic acid (SA), dichloroisonicotinic acid (INA), benzothiazoles (Agrios, 2005), Acibenzolar- S-Methyl, Tiadinil, Isotianil, Probenazole (PBZ), nhóm Imprimatin, Azelaic Acid (AZA), Glycerol-3-phosphate (G3P) (Tripathia et al., 2019), acid oxalic, KH2PO4, CuCl2.H2O, và chitosan (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016) Một trong những hóa chất giúp giảm bệnh cháy lá và bệnh đốm nâu trên lúa là SA 0,4 mM (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016), chất này cũng thể hiện khả năng kích thích cây trồng sản sinh các chất giúp cây trồng kháng bệnh trên cây đậu gà (Cicer arietinum L.) khi được xử lý với nồng độ 1,5 mM (War et al., 2011); đồng thời, xử lý với nồng độ 2 mM ở giai đoạn sau thu hoạch giúp giảm bệnh thán thư trên xoài (Junyu et al., 2016) Bên cạnh đó, calcium chloride 100 mM (CaCl2) cũng được ghi nhận giúp kích thích tính
2 kháng bệnh thán thư trên dưa leo hoặc bệnh sọc trắng lá bắp Đồng thời cho hiệu quả giảm bệnh tốt và bền đối với bệnh thán thư dưa leo trong điều kiện ngoài đồng, giúp gia tăng hoạt tính enzyme chitinase sớm và đạt đỉnh cao vào 144 giờ sau khi phun nấm lây bệnh (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016) Calci trong hợp chất calci oxide còn giúp giảm bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas trên cây hành lá thông qua việc rải vào đất trồng (Tạ Duy Hùng et al., 2019) Các hóa chất này giúp giảm bệnh thông qua sự gia tăng hoạt tớnh của enzyme chitinase, ò-1,3-glucanase, peroxidase, cỏc chất dẫn truyền tín hiệu hoặc các hợp chất phenolic, lignin, …trên cây xoài, dưa leo và bắp (Junyu et al., 2016; Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016)
Việc nghiên cứu về hiệu quả kích thích tính kháng bệnh thán thư của các loại hóa chất tại Việt Nam trên các loại rau ăn lá còn rất ít, đặc biệt là cây hành lá Vì vậy, đề tài
“Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum spp trên cây hành lá ( Allium fistulosum L.)” đã được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả quản lý bệnh thán thư bằng các hóa chất CaCl2 và SA, đồng thời nghiên cứu đi sâu về mặt cơ chế kích thích tính kháng bệnh của các hóa chất triển vọng này trong chiến lược quản lý bệnh theo hướng an toàn tại Việt Nam.
Mục đích nghiên cứu
Phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh thán thư hành lá của một số chủng nấm
Colletotrichum spp thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp, từ đó định danh loài gây hại nặng Bên cạnh đó, xác định được cơ chế, hiệu quả và kỹ thuật sử dụng CaCl2 và SA như một hoá chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum spp gây bệnh thán thư trên hành lá, góp phần hạn chế tác hại của bệnh và sản xuất hành lá bền vững ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung chính:
- Nội dung 1 Thu thập, phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại một số tỉnh trồng hành lá ở ĐBSCL Đồng thời, định danh loài đối với chủng nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hành lá
- Nội dung 2 Nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sử dụng hoá chất CaCl2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum gây bệnh thán thư hại hành
- Nội dung 3 Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl2 và SA thông qua biểu hiện mô học, sinh hoá và gen.
Tính mới của luận án
- Đã xác định được nguyên nhân gây bệnh thán thư hành lá tại Việt Nam do ít nhất một loài Colletotrichum gloeosporioides gây ra
- Đã chứng tỏ 2 loại hóa chất CaCl2 200 mM và SA 2 mM có tiềm năng áp dụng trong thực tiễn phòng chống bệnh thán thư hành lá
- Đã chứng minh được 2 hóa chất CaCl2 200 mM và SA 2 mM có tạo tính kháng trên cây hành lá chống lại nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư khi có sự gia tăng sớm và cao của các hợp chất phenol, tế bào phát quang (khía cạnh mô học), của các enzyme β 1,3 glucanase, chitinase, peroxidase, catalase (khóa cạnh sinh hóa) và gen tổng hợp enzzyme chitinase (biểu hiện gen).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.5.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là cây hành lá, bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum gloeosporioides và hóa chất kích kháng CaCl2, SA
Thu thập mẫu bệnh thán thư hành lá ở 2 tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp, phân lập và tuyển chọn dòng nấm gây hại nặng trong điều kiện nhà lưới Dòng nấm này được định danh dựa vào quan sát đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi quang học và giải trình tự gen để xác định loài Sau đó, các thí nghiệm xác định nồng độ, cách xử lý, số lần phun CaCl2 hoặc SA để đạt được hiệu quả quản lý bệnh thán thư và tăng năng suất được thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng Cuối cùng, cơ chế kích kháng được khảo sát thông qua các thay đổi về khía cạnh mô học, sinh hóa và gen khi xử lý 2 loại hóa chất CaCl2 200 mM và SA 2 mM.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Luận án là công trình nghiên cứu có giá trị khoa học đi từ các nghiên cứu cơ bản đến nghiên cứu ứng dụng về bệnh thán thư hành lá và biện pháp phòng trừ bệnh bằng hóa chất kích kháng Kết quả của luận án đã xác định được loài gây bệnh thán thư nặng trên cây hành lá là Colletotrichum gloeosporioides, xác định được nồng độ, cách xử lý và số lần phun CaCl2 và SA giúp quản lý có hiệu quả đối với bệnh này Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã kết hợp các phân tích mô học, sinh hóa và biểu hiện gen chitinase đã chứng minh được 2 hóa chất CaCl2 và SA có tạo tính kháng trên cây hành lá chống lại nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư
Luận án đã xác định và định danh loài nấm thán thư hành lá góp phần xác định tác nhân gây bệnh cụ thể Đồng thời, biện pháp kích thích tính kháng bệnh do phức hợp loài C gloeosporioides trên cây hành bằng CaCl2 200 mM và SA 2 mM là biện pháp phòng trừ phù hợp, thân thiện với môi trường
VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu, đối tượng, dụng cụ thí nghiệm
- Trang thiết bị và vật liệu trong phòng thí nghiệm: tủ cấy vi sinh, tủ thanh trùng khô, thanh trùng ướt, cân điện tử, giấy thấm, lam đếm mật số, bình tam giác, đĩa Petri, ống nghiệm, kính hiển vi, chlorine 1%
- Vật liệu nấu môi trường: khoai tây, đường, agar
- Các loại môi trường nuôi cấy nấm (Burgess et al., 2009):
Môi trường thạch nước cất (WA - Water Agar)
Agar 20 g Nước cất 1000ml pH 6,5
Môi trường thạch đường khoai tây (PDA-Potato Dextrose Agar)
Khoai tây 250g Đường Dextrose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml pH 6,5
Môi trường thạch cà rốt khoai tây (PCA-Potato Carrot Agar)
Môi trường được thanh trùng ở nhiệt độ 121 0 C trong 20 phút
- Hóa chất kích kháng: CaCl2, SA (salicylic acid)
- Thuốc trừ bệnh: Totan 200WP (hoạt chất Bronopol), Mataxyl 500WG (hoạt chất Metalaxyl) và Anvil 5SC (hoạt chất Hexaconazole)
- Phân bón hóa học: ure, DAP, NPK 20-20-15, KCl
- Giống hành sậy: được mua từ Hợp tác xã Hành lá Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
- Các phương tiện dùng để thực hiện phản ứng PCR: tube, pipet, water bath, máy ly tâm lạnh, máy ly tâm chân không, máy lắc, vortex, máy PCR, máy điện di, máy chụp hình gel…
- Hóa chất trích DNA: EB (Extraction buffer), SDS (Sodium dodecyl sulfate), Isopropanol, TE buffer (10mM Tris HCl, 1mM EDTA), CTAB (Tris HCl + NaCl + EDTA + CTAB + SDS + mercaptoethanol), Chloroform: Isoamyl Alcohol (24:1), Ethanol 70%, BiH2O (nước cất hai lần vô trùng)
- Hóa chất trong điện di: TAE, loading buffer, Ethidium Bromide, Agarose, thang chuẩn Genruler 100bp ladder
- Hóa chất tẩy diệp lục tố và nhuộm màu tế bào: ethanol – acetic acid (tỷ lệ 3:1); dung dịch lactoglycerol (lactic acid + glycerin + nước cất với tỷ lệ 1:1:1); aniline blue 0,5%; Toluidine Blue O 0,05%, pH=6,8
- Hóa chất và dụng cụ cho phân tích enzyme: máy đo quang phổ Shimazdu UV-1900; nitơ lỏng; Na-Acetate buffer, pH=5,2; ống eppendorf; 4-methylumbelliferone (4MU); dimethyl sulfoxide (DMSO); sodium carbonate; sodium acetate; laminarin; nước cất thanh trùng; phosphate buffer (pH=6,8); EDTA 1 mM; H2O2 75 mM; H2O2 1%; guaiacol 4%
- Hóa chất và dụng cụ tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA: Kit RN-Sure Plant (Apro Science, Tokushima, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Biotek, Hoa KSurekit M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Hàn Quốc).
Phương pháp thí nghiệm
3.3.1 Nội dung 1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp; đồng thời định danh loài nấm này
3.3.1.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp
Mục tiêu: xác định chủng nấm Colletotrichum sp có độc tính cao để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thu thập, phân lập nấm bệnh: mẫu bệnh được thu thập từ các ruộng hành lá tại tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long, cho vào túi nilon, bên ngoài ghi ký chủ, địa điểm thu mẫu và đem về phòng thí nghiệm
Sau đó nấm gây bệnh thán thư được phân lập trên môi trường WA bằng cách rửa thật sạch mẫu bệnh và để trên giấy thấm cho ráo nước, sau đó cắt từng mẫu nhỏ (2-3 mm 2 ) giữa ranh giới vết bệnh và phần không bệnh Khử trùng bằng dung dịch Chlorine 1% trong 1 phút, rửa mẫu với nước cất thanh trùng 3 lần trong tủ cấy vô trùng Đặt các mẫu trong đĩa petri đã hấp khử trùng có lót giấy thấm vô trùng cho ráo nước và cấy trên môi trường WA, mỗi mẫu bệnh được cấy trên 5 đĩa petri đã được khử trùng, mỗi đĩa cấy
Các đĩa cấy mẫu được để ở điều kiện phòng thí nghiệm Khi trên mẫu bệnh xuất hiện khuẩn ty nấm thì cấy chuyền sang môi trường PDA (Burgess et al., 2009)
Trước khi bố trí thí nghiệm, các chủng nấm thu thập được xác định là chi
Colletotrichum spp bằng nguyên tắc Koch (Koch's postulates), có ghi nhận hình dạng tản nấm và hình dạng, kích thước bào tử Sau đó, các chủng nấm Colletotrichum này được nuôi cấy trong 96 giờ cho sợi nấm phát triển, tản nấm được đục khoanh tròn ở gần mép rìa khuẩn lạc có đường kính 5 mm và cấy vào tâm đĩa petri chứa 10ml môi trường PDA Miệng đĩa petri được quấn màng parafin để tránh mất hơi nước trong thời gian thí nghiệm và ngăn chặn kiến và nhện xâm nhiễm
Bảng 3.1 Các chủng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây hành lá được thu thập tại tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp
STT Ký hiệu Địa điểm thu thập (xã, huyện, tỉnh)
1 BT6VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
2 BT7VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
3 BT9VL Tân Hưng, Bình Tân, Vĩnh Long
4 BT12VL Tân Hưng, Bình Tân, Vĩnh Long
5 BT13VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
6 BT14VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
7 LHVL1 Lộc Hòa, Long Hồ, Vĩnh Long
8 LHVL2 Lộc Hòa, Long Hồ, Vĩnh Long
9 PH2 Phước Hậu, Long Hồ, Vĩnh Long
10 PH3 Phước Hậu, Long Hồ, Vĩnh Long
11 ĐT1 Phú Thuận A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
12 ĐT2 Phú Thuận A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
13 ĐT3 Long Thuận, Hồng Ngự, Đồng Tháp
14 ĐT4 Long Thuận, Hồng Ngự, Đồng Tháp
15 ĐT5 Long Khánh A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
16 ĐT6 Long Khánh A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
17 ĐT7 Long Khánh B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
18 ĐT8 Phú Thuận B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
19 ĐT9 Phú Thuận B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
20 ĐT10 Định An, Lấp Vò, Đồng Tháp
Trồng hành lá: hành được trồng chậu nhựa có đường kính 20cm, cao 15cm Giá thể trồng gồm đất, sơ dừa, tro trấu trộn với tỷ lệ 1:1:1 Mỗi chậu hành trồng 2 tép Các tép hành được chọn đồng đều về đường kính gốc, chiều cao cây và màu lá Hành được chăm sóc bón phân và phòng ngừa sâu bệnh thường xuyên Sau 15 ngày trồng thì dùng cho thí nghiệm
Thu bào tử nấm: 20 chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA đến thời điểm 10 NSC tiến hành thu lấy bào tử nấm và tính mật số bào tử Sau đó pha loãng về mật số 10 6 bào tử/ml, dùng cho lây nhiễm bệnh trên hành
Bố trí thí nghiệm: bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (HTNN) một nhân tố là 20 chủng nấm Colletotrichum sp với 5 lần lặp lại (Bảng 3.1) Mỗi lần lặp lại 1 chậu hành (3 tép/chậu) Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng cách phun huyền phù bào tử nấm Colletotrichum spp mật số 10 6 bt/ml lên toàn cây đến khi bề mặt phủ một lớp sương huyền phù bào tử nấm thì ngưng Các chậu trồng cây được để trong phòng tối ủ bệnh 2 ngày (nhiệt độ 25 0 C), sau đó đem ra nhà lưới và chăm sóc bình thường
Chỉ tiêu về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh được thu thập vào các thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 ngày sau lây bệnh (NSLB) dựa vào số lá bệnh và tổng số lá trên buội, cấp bệnh trên giống hành sậy theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn (2013) Từ đó suy ra tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo công thức như sau:
Tỷ lệ bệnh/tỷ lệ hại (%) = Tổng số lá bị bệnh
X 100 Tổng số lá điều tra
Chỉ số bệnh/chỉ số hại (%) =
N1 là số lá bị bệnh ở cấp 1;
N3 là số lá bị bệnh ở cấp 3; …
Nn là số lá bị bệnh ở cấp n
N là tổng số lá điều tra n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9)
Cấp 1: ≤ 1% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh tròn, nhỏ
Cấp 3: > 1% - 5% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh lõm xuống
Cấp 5: > 5% - 25% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh có màu đen
Cấp 7: > 25% - 50% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh biến màu, thối đen
Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh, xuất hiện nhiều vết bệnh trên lá, các vết bệnh có thể liên kết lại với nhau
Xử lý số liệu: tổng hợp số liệu về các chỉ tiêu ghi nhận ở các nghiệm thức, phân tích phương sai và trắc nghiệm phân hạng với kiểm định Duncan 5% bằng phần mềm SPSS 22.0
3.3.1.2 Định danh loài đối với chủng nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hành lá
Mục tiêu: Xác định tên loài của chủng nấm Colletotrichum gây hại nặng trên cây hành lá đã tuyển chọn từ thí nghiệm 3.3.1.1
Tiến hành: dùng que cấy lấy đỉnh sinh trưởng của khuẩn ty nấm cây vào tâm của đĩa petri chứa 10ml môi trường PDA Miệng đĩa petri được quấn parafin để tránh mất hơi nước trong thời gian thí nghiệm và ngăn chặn nhện xâm nhiễm Định danh loài nấm bằng hình thái: sự phát triển và hình dạng, màu sắc của tản nấm được quan sát Bên cạnh đó, bào tử nấm gây bệnh cũng được quan sát dưới kính hiển vi quang học về hình dạng, màu sắc, kích thước Mẫu nấm được cấy trên lame với môi trường PCA để tạo đĩa áp và tiếp tục quan sát hình dạng, kích thước và màu sắc của đĩa áp dưới kính hiển vi Đối sánh với miêu tả của Sutton (1980) và Barnet & Hunter (1998) để xác định chi nấm gây bệnh Định danh loài nấm bằng kỹ thuật giải trình tự vùng rDNA-ITS
DNA tổng số của nấm được tách chiết bằng kít Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada) Phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA-ITS của mẫu nấm được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu ITS1 (mồi xuôi) (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3’); và ITS4 (mồi ngược) (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’) được mô tả bởi White et al (1990) Thể tớch cho mỗi phản ứng PCR là 25 àl gồm PCR buffer 1X [Tris
- HCl 10 mM (pH 8,8 ở 25oC), KCl 50 mM, triton X-100 50 mM], MgCl2 1,5 mM, 0,2 mM mỗi loại dNTP, 0,4 àM mồi mỗi loại, 0,5 U DNA Polymerase: GoTagR Green Master Mix (Promega) và 25 ng DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt (MJ Research PTC-
100, USA) với nhiệt độ biến tính ban đầu là 94 0 C trong 2 phút, sau đó là 35 chu kỳ với nhiệt độ biến tính là 94 0 C trong 20 giây, nhiệt độ bắt cặp là 53 0 C trong 30 giây, nhiệt độ kéo dài là 72 0 C trong 30 giây và nhiệt độ kéo dài cuối cùng là 72 0 C trong 5 phút Kiểm tra đoạn DNA được khuếch đại bằng phương pháp điện di trên gel Gel được quan sát dưới đèn UV và chụp ảnh bằng máy chuyên dụng (GelDoc-ItImaging System UVP, USA) Kích thước của các đoạn DNA khuếch đại được so sánh với thang DNA chuẩn
Sản phẩm PCR được tinh sạch, giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa Các trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit (ver 6.0.7, Mỹ) và so sánh với các trình tự tương ứng của các chủng đã được đăng ký trên genBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm Mega (ver.11) theo phương pháp Neighbor - Joining với khoảng cách di truyền giữa các trình tự được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura hai tham số Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê Boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp)
và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum gây bệnh thán thư hại hành
Nội dung 3 Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl 2 và SA thông qua biểu hiện mô học, sinh hoá và gen
mô học, sinh hoá và gen
3.3.3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN một nhân tố với 3 nghiệm thức và 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu hành được trồng 3 tép Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức 1 Phun SA 2 mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 2 Phun CaCl2 200 mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 3 Không xử lý chất kích kháng, có lây bệnh
Cách chuẩn bị cây và kích kháng, lây bệnh: cây hành được trồng và phun chất kích kháng ở 15 NST, lây nhiễm bệnh nhân tạo vào 18 NST Mẫu lá hành được thu vào thời điểm 24, 36, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ sau khi chủng nấm tấn công Lá hành được cắt thành 2 đoạn dài khoảng 4 cm cho vào đĩa petri có lót giấy thấm và dung dịch ethanol – acetic acid (tỷ lệ 3:1) để tẩy diệp lục tố lá Thay giấy thấm và dung dịch ethanol – acetic acid cho đến khi mẫu lá không còn màu xanh của diệp lục tố, sau đó chuyển sang nước cất trong 1 giờ Mẫu được trữ trong dung dịch lactoglycerol (lactic acid + glycerin + nước cất với tỷ lệ 1:1:1) cho đến khi được quan sát
Lá được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 400-440 nm) bằng cỏch nhuộm trong dung dịch aniline blue (0,01%) theo phương phỏp của Jứrgensen et al (1998) Ghi nhận chỉ tiêu với 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại quan sát ngẫu nhiên 100 đĩa áp
(quan sát 4 lá, mỗi lá quan sát ngẫu nhiên 25 đĩa áp) Ghi nhận số lượng đĩa áp tạo nên sự phát sáng vách tế bào, số lượng đĩa áp tạo nên sự phát sáng tế bào thịt lá, số lượng vách tế bào phát sáng, diện tích phát sáng và đánh giá mức độ phát sáng của tế bào theo
+: tế bào phát sáng màu vàng nhạt
++: tế bào phát sáng ở mức trung bình
+++: tế bào phát sáng có màu vàng đậm Đối với đĩa áp có sự phát sáng tế bào biểu bì được phân biệt thành 2 dạng phát sáng là phát sáng vách đơn tế bào (vách của một tế bào ở bên dưới đĩa áp có màu vàng) và vách đa tế bào (vách của nhiều tế bào ở bên dưới đĩa áp có màu vàng) Từ đó suy ra
51 phần trăm đĩa áp tạo sự phát sáng tế bào, tế bào thịt lá, vách đơn tế bào, vách đa tế bào và phần trăm đĩa áp tạo sự phát sáng tế bào ở mức độ “+”, “++” và “+++” và số lượng vách tế bào phát sáng trên mỗi đĩa áp theo các công thức sau:
Tỷ lệ đĩa áp tạo phản ứng phát sáng = (Số đĩa áp tạo phản ứng phát sáng/Số đĩa áp quan sát) x 100
Số lượng vách tế bào phát sáng/đĩa áp = (Tổng số vách tế bào phát sáng/Số đĩa áp tạo phát sáng vách tế bào) x 100
Xử lý số liệu: các số liệu được tổng hợp và phân tích phương sai, so sánh sự khác biệt về giá trị trung bình bằng phép kiểm định Duncan 5% của các chỉ tiêu thu thập để rút ra kết luận
3.3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát phản ứng tế bào hành lá thông qua sự tổng hợp polyphenol
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN một nhân tố với 3 nghiệm thức và 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu hành được trồng 3 tép Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức 1 Phun SA 2 mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 2 Phun CaCl2 200mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 3 Không xử lý chất kích kháng, có lây bệnh
Cách trồng cây, kích kháng và lây bệnh được thực hiện tương tự thí nghiệm 3.2.3.1 Mẫu lá hành từ các nghiệm thức trên được thu thập vào thời điểm 24, 36, 48,
72, 96, 120 và 144 giờ sau khi chủng nấm tấn công Phương pháp tẩy diệp lục tố được tiến hành tương tự thí nghiệm 3.2.3.2 Sau khi tẩy diệp lục tố, lá hành được nhuộm với Toluidine Blue O 0,05%, pH=6,8 và quan sát dưới kính hiển vi quang học (Neergaard, 1997) Sự tổng hợp polyphenol được thể hiện ở vùng tế bào quanh đĩa áp có màu xanh lá cây khi nhuộm với Toluidine Blue O Ghi nhận chỉ tiêu với 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại quan sát ngẫu nhiên 100 đĩa áp (quan sát 4 lá, mỗi lá quan sát ngẫu nhiên 25 đĩa áp) Đối với đĩa áp có tạo sự tổng hợp polyphenol ở tế bào thì ghi nhận diện tích vùng tế bào có sự tổng hợp phenol Từ đó suy ra phần trăm đĩa áp có tạo sự tổng hợp chất phenol ở tế bào theo công thức sau:
Tỷ lệ đĩa áp tạo sự tổng hợp phenol = (Số đĩa áp tạo sự tổng hợp polyphenol/Số đĩa áp quan sát) x 100
Xử lý số liệu: các số liệu được tổng hợp và phân tích phương sai, so sánh sự khác biệt về giá trị trung bình bằng phép kiểm định Duncan 5% của các chỉ tiêu thu thập để rút ra kết luận
3.3.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát sự gia tăng hoạt tính enzyme catalase, peroxidase, β-1,3-glucanase và chitinases trong sự kích kháng a Chuẩn bị mẫu cây hành cho phân tích các enzyme
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN một nhân tố với 6 nghiệm thức và
Nghiệm thức 1 Phun SA 2 mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 2 Phun CaCl2 200mM, có lây bệnh
Nghiệm thức 3 Không xử lý chất kích kháng, có lây bệnh
Nghiệm thức 4 Phun SA 2 mM, không lây bệnh
Nghiệm thức 5 Phun CaCl2 200 mM, không lây bệnh
Nghiệm thức 6 Không xử lý chất kích kháng, không lây bệnh
Cách trồng cây, kích kháng và lây bệnh được thực hiện tương tự thí nghiệm 3.2.3.1
Mẫu lá hành thu từ các nghiệm thức được dùng để xác định khả năng kích kháng bằng cách đo sự gia tăng hoạt tính của các enzyme liên quan đến tính kháng bệnh bằng phương pháp đo độ quang truyền hấp thu (máy đo quang phổ Shimazdu UV – 1900) Mẫu khảo sát được thu vào các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60,
66, 72, 78, 84, 90 và 96 giờ sau khi lây bệnh Mỗi nghiệm thức dùng kéo cắt ngẫu nhiên
5 lá hành/lặp lại Sau đó cho mẫu vào giấy bạc có ký hiệu sẵn và cho vào thùng có chứa nitơ lỏng Các mẫu vừa thu thập được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ - 34 o C cho đến khi phân tích b Khảo sát sự gia tăng hoạt tính enzyme chitinase
Chuẩn bị mẫu: 0,2 gram mẫu được cân và cho vào cối chày đã được làm lạnh ở 4ºC, thêm khoảng 2 mL nitơ lỏng Mẫu được nghiền nhuyễn sau đó thêm vào 1 mL dung dịch 50 mM Na-Acetate buffer, pH = 5,2 và nghiền đến khi thu được dung dịch đồng nhất Dung dịch mẫu được cho vào ống eppendorf 1,5 mL và giữ lạnh ở 4ºC trong 3 giờ sau đó đem ly tâm (Vieira et al., 2006) Mẫu đã nghiền được đưa vào máy ly tâm lạnh ở nhiệt độ 4°C, tốc độ 12.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó thu dịch trích thô Dịch trích thô được pha loãng 10 lần
Enzyme chitinases: được xác định dựa theo phương pháp của Vieira et al (2006) Xây dựng đường chuẩn 4MU gồm: 5 mg 4-methylumbelliferone (4MU), 25 mL Dimethyl sulfoxide (DMSO), 2 g Sodium carbonate (Sigma-Aldrich, catalog number: S2127) Cách pha stock 4-methylumbelliferone (20 mg/mL): thêm 0,25 mL DMSO vào 5 mg 4-methylumbelliferone trong chai thủy tinh tối màu có nắp Chất này khó tan nên cần vortex 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ủ 2 giờ ở 37ºC trong điều kiện lắc 170 rpm đến khi tan hết Dung dịch stock (gốc) được trữ ở -20ºC Pha loãng thành dung dịch
5 μg/mL 4-methylumbelliferone khi sử dụng
