Tóm tắt: Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)

Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Ngành: Bảo vệ thực vật

Mã ngành: 62 62 01 12

NGUYỄN QUỐC THÁI

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP KÍCH KHÁNG BẰNG HÓA CHẤT ĐỐI VỚI BỆNH THÁN THƯ DO

NẤM Colletotrichum spp TRÊN CÂY HÀNH LÁ

(Allium fistulosum L.)

2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn: PGS TS Trần Thị Thu Thủy

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở

Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường Đại học Cần Thơ Vào lúc 8 giờ ngày 11 tháng 11 năm 2023

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Đắc Khoa

Phản biện 2: PGS TS Hà Viết Cường

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

PGS TS Lê Văn Vàng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyễn Quốc Thái & Trần Thị Thu Thủy (2023) Nghiên cứu biện pháp xử lý Calcium chloride và Salicylic acid để

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của luận án

Theo thống kê của FAO năm 2022, hành là một loại cây trồng rộng rãi, với sản lượng toàn thế giới 20,9 triệu tấn trên diện tích khoảng

1,18 triệu ha Tại Việt Nam, hành lá (Allium fistulosum L.) được nông dân

trồng phổ biến tại nhiều tỉnh như Vĩnh Long, Đồng Tháp, … Tuy nhiên, canh tác hành lá chuyên canh luôn gặp nhiều khó khăn do nhiều loại mầm bệnh do nấm và vi khuẩn gây hại, đặc biệt là bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum sp gây hại Đây là một trong những bệnh quan trọng và

gây thiệt hại nặng đến sản lượng và năng suất hành lá, nông dân chủ yếu

sử dụng nhiều loại thuốc hóa học và phun nhiều lần để phòng trị bệnh Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có ảnh hưởng xấu đến môi trường

và sức khỏe người sử dụng do lưu tồn của thuốc trên hành lá Một trong những biện pháp thân thiện môi trường đã được nghiên cứu và ứng dụng trên cây trồng là kích thích tính kháng bệnh, gọi tắt là kích kháng (induced resistance) Kích kháng là biện pháp giúp cho cây trồng tạo được nhiều

cơ chế chống lại mầm bệnh, do đó mang tính bền vững cao Nhiều loại hóa chất có khả năng kích kháng đã được ghi nhận trên thế giới và Việt Nam như salicylic acid (SA), CaCl2, benzothiazoles, acibenzolar-S-Methyl, … Tuy nhiên, việc nghiên cứu về hiệu quả kích thích tính kháng bệnh thán thư của các loại hóa chất tại Việt Nam trên các loại rau ăn lá còn rất ít, đặc biệt là cây hành lá Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu biện pháp

kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

spp trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)” đã được thực hiện nhằm đánh

giá hiệu quả quản lý bệnh thán thư bằng các hóa chất CaCl2 và SA, đồng thời nghiên cứu đi sâu về mặt cơ chế kích thích tính kháng bệnh của các hóa chất triển vọng này trong chiến lược quản lý bệnh theo hướng an toàn tại Việt Nam

1.2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh thán thư hành lá của một

số chủng nấm Colletotrichum spp thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp,

từ đó định danh loài gây hại nặng Bên cạnh đó, xác định được cơ chế,

hiệu quả và kỹ thuật sử dụng CaCl2 và SA như một hoá chất kích kháng

để hạn chế nấm Collectotrichum spp gây bệnh thán thư trên hành lá, góp

phần hạn chế tác hại của bệnh và sản xuất hành lá bền vững ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Thu thập, phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng

nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại một số tỉnh trồng hành lá ở

ĐBSCL Đồng thời, định danh loài đối với chủng nấm Colletotrichum có

khả năng gây bệnh nặng trên hành lá

Nội dung 2 Nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sử dụng hoá

chất CaCl2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm

Collectotrichum gây bệnh thán thư hại hành

Nội dung 3 Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl2 và SA thông qua biểu hiện mô học, sinh hoá và gen

1.4 Tính mới của luận án

- Đã xác định được nguyên nhân gây bệnh thán thư hành lá tại Việt

Nam do ít nhất một loài Colletotrichum gloeosporioides gây ra

- Đã chứng minh được 2 hóa chất CaCl2 và SA có tạo tính kháng

trên cây hành lá chống lại nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư dựa

trên các phân tích mô học, sinh hóa và biểu hiện gen chitinase

- Đã chứng tỏ 2 loại hóa chất CaCl2 và SA có tiềm năng áp dụng trong thực tiễn phòng chống bệnh thán thư hành lá

1.5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.5.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây hành lá, bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum gloeosporioides và hóa chất kích kháng CaCl2, SA

1.5.2 Phạm vi nghiên cứu

Mẫu bệnh thán thư hành lá được thu thập ở 2 tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp và tiến hành phân lập, tuyển chọn dòng nấm gây hại nặng trong điều kiện nhà lưới, định danh dòng nấm này dựa vào đặc điểm hình thái và giải trình tự gen để xác định loài Tiếp theo, thí nghiệm xác định nồng độ và cách xử lý, số lần phun CaCl2 hoặc SA để đạt được hiệu quả

quản lý bệnh thán thư được thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng tại huyện Bình Tân và Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long Đồng thời, các thí nghiệm khảo sát các biểu hiện thay đổi về khía cạnh mô học, sinh hóa và gen khi xử lý 2 loại hóa chất CaCl2 và SA trong kích thích tính kháng bệnh thán thư cũng được thực hiện

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.6.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của luận án đã xác định được loài gây bệnh thán thư nặng

trên cây hành lá thuộc phức loài Colletotrichum gloeosporioides, xác định

được nồng độ, cách xử lý và số lần phun CaCl2 và SA giúp quản lý có hiệu quả đối với bệnh này Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã kết hợp các phân tích mô học, sinh hóa và biểu hiện gen chitinase đã chứng minh được 2 hóa chất CaCl2 và SA có tạo tính kháng trên cây hành lá chống lại nấm

C gloeosporioides gây bệnh thán thư

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Luận án đã xác định và định danh loài nấm thán thư hành lá góp phần xác định tác nhân gây bệnh cụ thể Đồng thời, biện pháp kích thích

tính kháng bệnh do phức hợp loài C gloeosporioides trên cây hành bằng

CaCl2 200 mM và SA 2 mM là biện pháp phòng trừ phù hợp, thân thiện với môi trường

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh thán thư trên hành lá

2.1.1 Tình hình và mức độ gây hại của bệnh thán thư hành lá

Bệnh thán thư trên hành là bệnh phổ biến ở châu Âu, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản Bệnh gây hại nặng vào mùa mưa, thiệt hại

năng suất ước tính từ 50-100% (Kanlong et al., 1988) Vào năm 1995,

trên những cánh đồng trồng hành ở miền Nam Berlin nước Đức xuất hiện một bệnh lạ làm mùa màng mất trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế ở đây Năm 2004, đã xác định đây là bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum gloeosporioides gây ra (Sikirou et al., 2011) Theo Alberto et al (2004), tại Philippines bệnh thán thư trên hành do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây ra xuất hiện đầu tiên

vào những năm 2000 và 2001, dịch bệnh bùng phát đã gây ảnh hưởng nghiệm trọng đến kinh tế vùng trồng hành ở tỉnh Nueva Ecija và Luzon

Đồng thời, nấm C gloeosporioides gây bệnh nặng trên cả 3 giống hành

phổ biến là Yellow Granex, Red Creole và Shallot (Alberto, 2014) Tại

tỉnh Cam Túc (Trung Quốc), Chen et al (2021) đã có báo cáo đầu tiên về

các thiệt hại nghiêm trọng của bệnh thán thư hành lá tại đây với tỷ lệ mắc

bệnh cao (khoảng 60%) do nhiễm nấm C circinans Ở Việt Nam, bệnh

thán thư trên hành được nghiên cứu từ năm 1988 ở Bắc Ninh, Hải Dương,

Hà Tây, Vĩnh Phúc, được ghi nhận có thể làm giảm năng suất từ 10-15%

(Vũ Triệu Mân et al., 2007) Đây cũng là một trong năm bệnh hại chính

trên cây hành lá trồng tại Vĩnh Long và Đồng Tháp (Lê Thị Trúc Phương

& Dương Ngọc Thành, 2019)

2.1.2 Triệu chứng bệnh thán thư

Bệnh có thể xuất hiện trong suốt thời gian sinh trưởng, trên các

bộ phận của cây trên đồng ruộng Ngoài ra, bệnh cũng gây hại trong quá trình tồn trữ và vận chuyển (Verma & Sharma, 1999) Theo Trần Thị Ba

et al (2008), bệnh gây hại cả trên hành lá lẫn hành củ Trên lá vết bệnh

ban đầu có hình bầu dục, màu sáng trắng, xung quanh có viền màu vàng nhạt Vết bệnh đầu tiên thường xuất hiện ở giữa lá, ít gặp ở chóp lá Sau

đó, vết bệnh lan rộng và kéo dài theo chiều dài lá Trên vết bệnh xuất hiện rất nhiều chấm đen nhỏ xếp thành vòng tròn đồng tâm, đó là các đĩa đài

của nấm gây bệnh (Vũ Triệu Mân et al., 2007) Bệnh nặng khi vết bệnh

nối liền nhau sẽ làm cháy lá và chết cây

2.2 Kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng

Kích thích tính kháng thường được gọi tắt là “kích kháng”, là sự kích thích để tạo ra tính kháng bệnh của thực vật Hiện tượng này giúp cho giống cây trồng bị nhiễm trở nên có khả năng kháng được bệnh ở mức độ nào đó sau khi xử lý chất kích kháng Phương pháp kích kháng không có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm bệnh như những thuốc trừ dịch hại thông thường mà dựa trên sự kích thích của những cơ chế tự nhiên của cây trồng Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vật không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hóa

chất nào đó không độc và không có tác động trực tiếp diệt mầm bệnh như những hóa chất được dùng trong nông dược (Phạm Văn Kim, 2002) Theo

Pieterse et al (1996), kích kháng bệnh là hiện tượng mà cây trồng biểu

hiện mức độ kháng lại tác nhân gây bệnh sau khi nhận được sự kích thích thích hợp Cơ chế liên quan đến tính kích kháng bao gồm sự lignin hóa,

sự hình thành những cấu trúc rào cản và những protein liên quan đến sự phát sinh bệnh Ưu điểm của biện pháp này là không chuyên biệt, nghĩa

là có nhiều cách xử lý kích kháng, có thể áp dụng trên nhiều loại cây trồng

và với nhiều đối tượng gây bệnh (Dann, 2003)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Thời gian: từ tháng 08/2018 đến tháng 8/2022

Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Cửu Long; phòng

thí nghiệm Phòng trừ Sinh học, Khoa Bảo vệ thực vật, trường Nông nghiệp; Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ; ruộng trồng hành lá tại huyện Bình Tân và Long Hồ, Vĩnh Long

3.1 Phương tiện và vật liệu thí nghiệm

Tủ cấy vi sinh, tủ thanh trùng khô, thanh trùng ướt, cân điện tử, giấy thấm, lam đếm mật số, bình tam giác, đĩa Petri, ống nghiệm, kính hiển vi, chlorine 1% Vật liệu nấu môi trường; các hóa chất kích kháng: CaCl2, SA (salicylic acid); thuốc trừ bệnh Totan 200WP (hoạt chất Bronopol), Mataxyl 500WG (hoạt chất Metalaxyl) và Anvil 5SC (hoạt chất Hexaconazole); giống hành sậy; hóa chất trích DNA, tẩy diệp lục tố

và nhuộm màu tế bào; hóa chất phân tích enzyme, hóa chất và dụng cụ tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Nội dung 1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long

và Đồng Tháp; đồng thời định danh loài nấm này

3.2.1.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp

Mục tiêu: xác định chủng nấm Colletotrichum sp có độc tính

cao để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

Tiến hành: mẫu bệnh được thu thập từ các ruộng hành lá tại tỉnh

Đồng Tháp và Vĩnh Long Sau đó nấm gây bệnh thán thư được phân lập trên môi trường WA bằng cách rửa thật sạch mẫu bệnh và để trên giấy thấm cho ráo nước, sau đó cắt từng mẫu nhỏ (2-3 mm2) giữa ranh giới vết bệnh và phần không bệnh Khử trùng bằng dung dịch Chlorine 1% trong

1 phút, rửa mẫu với nước cất thanh trùng 3 lần trong tủ cấy vô trùng Đặt các mẫu trong đĩa petri đã hấp khử trùng có lót giấy thấm vô trùng cho ráo nước và cấy trên môi trường WA Khi trên mẫu bệnh xuất hiện khuẩn

ty nấm thì cấy chuyền sang môi trường PDA Trước khi bố trí thí nghiệm,

các chủng nấm thu thập được xác định là chi Colletotrichum spp bằng định đề Koch (Koch's postulates) Sau đó, các chủng nấm Colletotrichum

này được nuôi cấy trong 96 giờ cho sợi nấm phát triển, tản nấm được đục khoanh tròn ở gần mép rìa khuẩn lạc có đường kính 5 mm và cấy vào tâm đĩa petri chứa 10ml môi trường PDA Miệng đĩa petri được quấn màng

parafin để ngăn chặn kiến và nhện xâm nhiễm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên

(HTNN) một nhân tố là 20 chủng nấm Colletotrichum spp với 5 lần lặp

lại Mỗi lần lặp lại 1 chậu hành (3 tép/chậu) Hành được trồng và chăm sóc bón phân, phòng ngừa sâu bệnh thường xuyên Sau 15 ngày trồng thì dùng cho thí nghiệm Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng cách phun

huyền phù bào tử nấm Colletotrichum spp mật số 106

bt/ml lên toàn cây đến khi bề mặt phủ một lớp sương huyền phù bào tử nấm thì ngưng Các chậu trồng cây được để trong phòng tối ủ bệnh 2 ngày (nhiệt độ 250

C), sau đó đem ra nhà lưới và chăm sóc bình thường

Chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh được thu thập vào các thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 ngày sau lây bệnh (NSLB) dựa vào số lá bệnh và tổng số lá trên buội, cấp bệnh trên giống hành sậy theo Bộ Nông nghiệp

& Phát triển nông thôn (2013) Từ đó suy ra tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo công thức như sau:

Tỷ lệ bệnh/tỷ lệ hại (%) = Tổng số lá bị bệnh X 100

Tổng số lá điều tra

Chỉ số bệnh/chỉ số hại (%) =  

Nxn

Nnxn x

N x N x

Cấp 5: > 5% - 25% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh có màu đen

Cấp 7: > 25% - 50% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh biến màu, thối đen Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh, xuất hiện nhiều vết bệnh trên lá, các vết bệnh có thể liên kết lại với nhau

Xử lý số liệu: phân tích phương sai và trắc nghiệm phân hạng với

kiểm định Duncan 5% bằng phần mềm SPSS 22.0

3.2.1.2 Định danh loài đối với chủng nấm Colletotrichum có khả năng

gây bệnh nặng trên hành lá

Mục tiêu: Xác định tên loài của chủng nấm Colletotrichum gây

hại nặng trên cây hành lá đã tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.1.1

Tiến hành: dùng que cấy lấy đỉnh sinh trưởng của khuẩn ty nấm

cây vào tâm của đĩa petri chứa 10 ml môi trường PDA Miệng đĩa petri được quấn parafin để ngăn chặn kiến và nhện xâm nhiễm

Định danh loài nấm bằng hình thái: quan sát sự phát triển và

hình dạng, màu sắc của tản nấm; hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử nấm gây bệnh Mẫu nấm được cấy trên lame với môi trường PCA để tạo đĩa áp và tiếp tục quan sát hình dạng, kích thước và màu sắc của đĩa áp dưới kính hiển vi Đối sánh với miêu tả của Sutton (1980) và Barnet & Hunter (1998) để xác định chi nấm gây bệnh

Định danh loài nấm bằng kỹ thuật giải trình tự vùng ITS: DNA tổng số của nấm được tách chiết và khuếch đại gen vùng

rDNA-rDNA-ITS của mẫu nấm với cặp mồi đặc hiệu ITS1 (mồi xuôi) (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’); và ITS4 (mồi ngược) (5’-

TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’) được mô tả bởi White et al (1990)

Kiểm tra đoạn DNA được khuếch đại bằng phương pháp điện di trên gel Kích thước của các đoạn DNA khuếch đại được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bps Sản phẩm PCR được tinh sạch, giải trình tự tại Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa Các trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit (ver 6.0.7, Mỹ) và so sánh với các trình tự tương ứng của các chủng đã được đăng ký trên genBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm Mega (ver.11) theo phương pháp Neighbor - Joining

Xử lý số liệu: các kết quả khảo sát về hình thái nấm và cây phả

hệ từ trình tự gen vùng ITS của DNA chủng nấm được dùng để phối hợp

kết luận loài nấm Colletotrichum nghiên cứu

3.2.2 Nội dung 2 Nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sử dụng hoá chất CaCl 2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm

Collectotrichum gây bệnh thán thư hại hành

3.2.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của các chất kích kháng đến

sự sinh trưởng của nấm Colletotrichum

Mục tiêu: đánh giá khả năng ức chế sự phát triển nấm

Colletotrichum của các chất kích kháng

Tiến hành: nấm Colletotrichum có tính độc mạnh ở nội dung 1

được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 3 ngày Thí nghiệm được thực

hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa (Abussaud et al., 2013); bố trí với

7 lần lặp lại, HTNN, các hóa chất thử nghiệm gồm: CaCl2 100 mM; CaCl2

200 mM; CaCl2 300 mM; SA 1 mM; SA 2 mM; SA 4 mM; đối chứng (dùng nước) Ở mỗi lần lặp lại, 1 đĩa petri có chứa môi trường PDA được

dùng để đặt đồng thời 1 khoanh nấm Colletotrichum (đường kính 6 mm)

và 1 khoanh giấy thấm (đường kính 6 mm) với 1 trong các loại hóa chất trên, khoảng cách giữa 2 khoanh là 3 cm Sau đó, đĩa petri được đậy nắp lại, quấn parafin và để ở điều kiện phòng thí nghiệm Ghi nhận bán kính vòng tròn kháng nấm ở các khoanh giấy thấm hóa chất khi nấm phát triển đến khoanh giấy đối chứng

3.2.2.2 Thí nghiệm 2 Nghiên cứu hiệu quả hạn chế bệnh thán thư khi sử dụng CaCl2 và SA ở các nồng độ và phương pháp xử lý khác nhau

Mục tiêu: so sánh hiệu quả kích kháng của hóa chất qua 2 cách

xử lý là nhúng và phun

Tiến hành: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân

tố HTNN trên giống hành sậy, 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 3 chậu, mỗi chậu trồng 3 tép hành Nhân tố A là 2 loại hóa chất ở 3 nồng độ, gồm CaCl2 100 mM; CaCl2 200 mM và CaCl2 300 mM; SA 1 mM; SA 2 mM;

SA 4 mM; và đối chứng (nước cất); nhân tố B là 2 phương pháp xử lý gồm nhúng gốc (nhúng gốc hành vào hóa chất) và phun lá (phun hóa chất lên lá hành) Các chất kích kháng được xử lý vào thời điểm trồng hành Các tép hành này được trồng vào chậu khi đã ráo chất kích kháng (mỗi chậu trồng 3 tép hành đã xử lý với 10 ml hóa chất) Lây bệnh nhân tạo vào thời điểm 3 ngày sau xử lý chất kích kháng bằng cách phun huyền

phù bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides với mật số 106 bào tử/ml (10 ml/chậu) Sau đó, các chậu trồng hành được chuyển vào phòng tối và đặt trong ngăn tủ kín có trùm bọc nilon với nhiệt độ 250C trong thời gian

2 ngày để ủ bệnh và được chuyển ra nhà lưới để tiếp tục chăm sóc, theo dõi tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh Chỉ tiêu về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh được ghi nhận vào các thời điểm 0, 5, 7, 9, 11, 13, 15 và 17 ngày sau khi lây bệnh (NSLB) theo như thí nghiệm 3.2.1.1 Tính hiệu quả giảm bệnh (%)

ở các thời điểm trên theo công thức Abbott

3.2.2.3 Thí nghiệm 3 Nghiên cứu hiệu quả hạn chế bệnh thán thư và gia tăng năng suất khi sử dụng CaCl2 và SA với các tần suất khác nhau ở điều kiện nhà lưới

Mục tiêu: xác định số lần phun hóa chất kích kháng mang lại

hiệu quả cao trong giảm bệnh và tăng năng suất

Tiến hành: thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN 5 lặp lại

với 2 nhân tố: chất kích kháng và số lần phun Chất kích kháng được sử dụng là CaCl2 200 mM, SA 2 mM và đối chứng (phun nước) Số lần phun lần lượt gồm: 1, 2, 3 và 4 lần, mỗi lần phun cách nhau 10 ngày bắt đầu từ

15 ngày sau trồng (NST) Cây hành lá giống được trồng và chăm sóc, bón

phân theo Trần Thị Ba et al (2008) Đến thời điểm 18NST, tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh thán thư với huyền phù bào tử nấm C gloeosporioides mật số 106 bt/ml Sau đó, các chậu trồng hành được chuyển vào phòng tối và đặt trong ngăn tủ kín có trùm bọc nilon với nhiệt

độ 250C trong thời gian 02 ngày để ủ bệnh và được chuyển ra nhà lưới để tiếp tục chăm sóc Cây hành được thu hoạch vào 70 ngày sau trồng (tương ứng 58 NSLB) Chỉ tiêu về tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh được ghi nhận

ở mỗi nghiệm thức vào thời điểm 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37 và 42 NSLB, tính hiệu quả giảm bệnh theo như thí nghiệm 3.2.1.1 và khối lượng thực

tế (g/chậu), khối lượng thương phẩm (g/chậu)

Xử lý số liệu: phân tích phương sai, so sánh sự khác biệt về giá

trị trung bình bằng phép kiểm định Duncan 5%

3.2.2.4 Thí nghiệm 4 Đánh giá hiệu quả quản lý bệnh thán thư và một số bệnh hại chính khác trên cây hành lá của calcium chloride hoặc salicylic acid ở Bình Tân, Vĩnh Long

Mục tiêu: xác định hiệu quả của các chất kích kháng đã có hiệu

quả trong điều kiện ngoài đồng

Tiến hành: thí nghiệm được thực hiện trên giống hành sậy, tại

huyện Bình Tân vào mùa mưa (tháng 9-11/2020), bố trí theo thể thức

đối chứng dương (xử lý theo nông dân): phun thuốc trừ bệnh có hoạt chất Bronopol và Metalaxyl + Hexaconazole và đối chứng âm (không xử lý hóa chất trừ bệnh); với 4 lần lại (120 m2/lặp lại) Phun 4 lần bắt đầu ở 15 NST và cứ 10 ngày phun 1 lần Hành lá được thu hoạch vào thời điểm 70 NST Ghi nhận tỷ lệ bệnh (%), chỉ số bệnh thán thư (%), và tính hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư, cháy lá và chết buội ở các thời điểm 15, 25, 35,

45 và 55 NST theo như thí nghiệm 3.2.1.1; chỉ tiêu về năng suất thực tế (tấn/ha), năng suất thương phẩm (tấn/ha) và tính tỷ lệ thương phẩm (%) Tính giá trị diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) theo Campbell & Madden (1990)

Xử lý số liệu: phân tích phương sai, so sánh sự khác biệt về giá

trị trung bình bằng phép kiểm định Duncan 5%

3.3.2.5 Thí nghiệm 5 Đánh giá hiệu quả quản lý bệnh thán thư và một

số bệnh hại chính khác trên cây hành lá của calcium chloride hoặc salicylic acid ở Long Hồ, Vĩnh Long

Thí nghiệm được tiến hành với giống hành sậy, tại xã Phước Hậu (huyện Long Hồ) vào mùa nắng (tháng 01-3/2021) của tỉnh Vĩnh Long tương tự với thí nghiệm tại huyện Bình Tân

3.2.3 Nội dung 3 Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl 2 và SA

3.2.3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức HTNN một nhân tố với 3 nghiệm thức và 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu hành được trồng 3 tép Các nghiệm thức gồm: phun SA 2 mM, có lây bệnh; phun CaCl2 200mM,

có lây bệnh; không xử lý chất kích kháng, có lây bệnh

Tiến hành: cây hành được trồng và phun chất kích kháng ở

15NST, lây nhiễm bệnh nhân tạo vào 18 NST Mẫu lá hành được thu vào thời điểm 24, 36, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ sau lây bệnh (GSLB), cắt thành đoạn dài khoảng 4 cm cho vào đĩa petri có lót giấy thấm và dung dịch ethanol – acetic acid (tỷ lệ 3:1) để tẩy diệp lục tố lá Thay giấy thấm

và dung dịch ethanol – acetic acid cho đến khi mẫu lá không còn màu xanh của diệp lục tố, sau đó chuyển sang nước cất trong 1 giờ Mẫu được trữ trong dung dịch lactoglycerol (lactic acid + glycerin + nước cất với tỷ

lệ 1:1:1) cho đến khi được quan sát Lá được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 400-440 nm) bằng cách nhuộm trong dung dịch

aniline blue (0,01%) theo phương pháp của Jørgensen et al (1998) Ghi

nhận chỉ tiêu với 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại quan sát ngẫu nhiên 100 đĩa áp (quan sát 4 lá, mỗi lá quan sát ngẫu nhiên 25 đĩa áp) Ghi nhận số lượng đĩa áp tạo nên sự phát sáng vách tế bào, số lượng đĩa áp tạo nên sự phát sáng tế bào thịt lá, số lượng vách tế bào phát sáng, diện tích phát sáng và đánh giá mức độ phát sáng của tế bào theo 3 mức độ “+”, “++” và “+++” Tính phần trăm đĩa áp tạo sự phát sáng tế bào ở mức độ “+”, “++” và

“+++” và số lượng vách tế bào phát sáng trên mỗi đĩa áp

Xử lý số liệu: phân tích phương sai, so sánh sự khác biệt về giá

trị trung bình bằng phép kiểm định Duncan 5%