Tóm tắt: Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 94 20 201

NGUYỄN TUẤN HẢI

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TẠO KHÁNG SINH

TRONG ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ,

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

2024

ii

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: GS.TS Cao Ngọc Điệp

Người hướng dẫn phụ: (không)

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp trường

Họp tại: Phòng…, Trường Đại học Cần Thơ

Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …

Phản biện 1: PGS.TS …

Phản biện 2: PGS TS …

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

PGS.TS ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

iii

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2021 Isolation, selection and

antimicrobial activity of actinomycetes from mangrove soil of Can Gio forest,

HoChiMinh City, Vietnam Global journal of science frontier research: C

(Biological Science), Volume 21, Issue 4, pp 7-22

2 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2022 Bioactive secondary metabolites

from marine streptomyces isolated from mangrove forest soil of Can Gio,

HoChiMinh City, Vietnam International Journal of Pharmaceutical and

Clinical Research, Volume 14, Issue 2, pp 7-15

3 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2022 Antimicrobial compounds of

one Streptomyces celluloflavus strain isolated from Can Gio mangrove soil, Vietnam GSC Biological and Pharmaceutical Sciences, Volume 19, Issue 3,

pp 120–126

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1 1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật Kháng sinh là nhóm thuốc tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp chống lại quá trình nhiễm khuẩn và còn được

ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như nông nghiệp, chế biến… (Ceylan et al., 2008 và Kohanski et al., 2010)

Tuy nhiên, hiện nay đang nổi lên hiện tượng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc Vì vậy rất cần thiết cải tiến các

kháng sinh cũ, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới (Xu et al., 2014)

Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo kháng sinh thì vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi

khuẩn sợi, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Berdy, 2005) Hơn nữa, Streptomyces phân lập từ các nguồn

đại dương được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) có giá trị

như kháng sinh, kháng ung thư, kháng khối u (Xu et al., 2014)

Rừng ngập mặn là một tập hợp các loại cây nhiệt đới, cận nhiệt đới thích nghi với vùng khắc nghiệt giữa

biển và đất liền (Ottoni et al., 2015) Nguồn carbon dồi dào từ xác bã động thực vật giúp cho các quần xã vi sinh vật phát triển, trong đó có vi khuẩn sợi (Miththapala et al, 2008) Rừng ngập mặn huyện Cần Giờ (thành phố Hồ

Chí Minh) được UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển thế giới với hệ sinh vật đa dạng, có tiềm năng to lớn

Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật rừng ngập mặn Việt Nam nói chung và rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng vẫn còn rải rác trên nhiều đối tượng, như: phân lập, định danh, khảo sát đặc điểm của các vi khuẩn liên

kết thực vật và vi khuẩn sống trong đất vùng rễ cây rừng ngập mặn ở Cà Mau (Hồ Thanh Tâm và ctv., 2016);

nghiên cứu về vi sinh vật ở vùng ven biển Hải Phòng (Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thiên Thư, 2010); nghiên cứu vi

khuẩn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoates phân lập từ rừng ngập mặn Quảng Ninh (Nguyễn Thị Bình và ctv.,

2012) Từ đây đặt ra nhu cầu nghiên cứu các loài vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, bổ sung nguồn tiềm năng để thu nhận các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là kháng sinh mới

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp kháng sinh hỗ trợ chống lại bệnh nhiễm trùng và có thể ứng dụng rộng hơn

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tổng hợp kháng sinh Nghiên cứu được giới hạn trên phạm vi là đất rừng ngập mặn tại huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu và phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi được thực hiện vào tháng 02 năm 2019 Các dòng

có tính kháng khuẩn được chọn định danh từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021

Các nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi và sinh hóa được tiến hành tại phòng thí nghiệm

Vi sinh môi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Đại học Cần Thơ Một số phân tích hóa học chuyên sâu (như GC-MS) được gửi mẫu thực hiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại học Cần Thơ

2

1.5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi được chọn với các kỹ thuật khuếch đại trình tự gen 16S rRNA bằng PCR

sử dụng cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19 (Stach et al., 2003 và Sun et al., 2015), giải

trình tự, so sánh với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi

- Thu nhận hoạt chất kháng khuẩn và phân tích thành phần hóa chất bằng máy sắc ký ghép khối phổ MS)

(GC-1.6 Đóng góp mới của luận án

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trong đó, có 10 chủng kháng

lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm là Bacillus cereus (8 chủng), E coli (4 chủng), S

aureus (6 chủng) và V parahaemolyticus (3 chủng) Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định danh

ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau: Streptomyces tendae, S tanashiensis, S parvulus, S celluloflavus, S

aegytia, S africanus, S albogriseolus và S laurentii Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính

sinh học trong 8 dòng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là

100%

Đã chọn được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 Sáu hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl;

Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và Tetracosamethyl,

cyclododecasiloxane Đối với S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu

được xác định bao gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl

Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềm năng nhưng chưa được quan tâm nhiều Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bản địa; là công trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen chỉ thị kháng sinh của vi khuẩn sợi trong đất tại đây Đồng thời, chất kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tương lai

1.7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Kết quả thu được của luận án sẽ góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về lĩnh vực vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đông Nam Á nói chung Trong đó, có những loài đóng vai trò là nguồn sản xuất chất kháng khuẩn cho tương lai

Về mặt ý nghĩa thực tiễn, các dòng vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh, hoặc ức chế được nhiều chủng vi khuẩn gây hại sẽ có thể là nguồn giống vi sinh vật quý giá cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, góp phần giảm áp lực tìm kiếm kháng sinh mới, khắc phục hiện tượng đề kháng đang đe dọa nỗ lực điều trị của con người Ngoài ra, kết quả thu được từ luận án làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam; cho thấy giá trị sinh thái của rừng ngập mặn nước ta, có sự tương đồng về các loài vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất so với các vùng

ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn

2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực

nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll, 2014, Ottoni et al., 2015) Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là chi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera)

(Miththapala, 2008) Cây rừng ngập mặn có hai cơ chế thích nghi với điều kiện sống trong nồng độ muối cao: một là trên lá cây có tuyến muối để bài tiết lượng muối thừa; hai là tích lũy muối thừa vào tế bào thịt lá hoặc vỏ

cây sau đó sẽ được thải ra ngoài khi lá rụng hoặc khi tróc vỏ (Miththapala, 2008 và Spelchan và Nicoll, 2014)

Rừng ngập mặn đóng vai trò quan trọng khi cung cấp các sản phẩm sinh khối động thực vật cho con người, điều

tiết lũ, tích lũy phù sa và chuyển hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewel et al., 1998) Đất rừng ngập mặn

là một hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wu et al., 2016)

2.1.2 Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Theo Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới đầu tiên của Việt Nam, được UNESCO công nhận vào năm 2000, thuộc hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gòn, ở phía Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha Trong rừng ngập mặn Cần Giờ có 3 khu bảo tồn các loài động vật Ngoài ra, rừng ngập mặn Cần Giờ còn là nơi sinh sống của nhiều loài

động thực vật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007 Thực vật có 2 loài là Cóc đỏ (Lumnitzera

littorea) và Chùm lé (Azima sarmentosa); động vật có 9 loài bao gồm: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt

bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis); Bồ nông chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn (Anhinga melanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringa guttifer); Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah), và Cá mang rổ (Toxotes chatareus)

2.2 Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn

Vi sinh vật đất rừng ngập mặn rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyên sinh

(Thatoi et al., 2012), có khả năng chịu mặn và tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh (Sivakumar et al., 2007 và Thatoi et al., 2012) Các loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn của

Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia được báo cáo là có khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh mẽ

cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương (Hong et al., 2009 và Wiwin, 2010) Sivakumar et al (2007) khẳng định

chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc biển (rừng ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi trong đất liền Có đến 2000 dòng vi khuẩn sợi được phân lập từ rừng ngập mặn và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễm trùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine

phosphatase 1B (PTP1B), các enzyme phân giải… (Hong et al., 2009)

Cho tới nay, có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học được báo cáo là do vi khuẩn

sợi tổng hợp và 80% trong số ấy được thu nhận từ Streptomyces (Berdy, 2005) Vi khuẩn sợi rừng ngập mặn rất

đa dạng và độc đáo; cho đến nay, đã phân lập và định danh 24 chi (Amrita et al., 2012) Mặc dù vậy nhưng vì

những khó khăn khi nuôi cấy nên chỉ mô tả xác định được rất ít (5%) số lượng chủng loài, chưa tương xứng với

tiềm năng sẵn có (Thatoi et al., 2012) Do vậy, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác trong tương lai

2.3 Vi khuẩn sợi

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên

Vi khuẩn sợi là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh

4

trưởng được Vi khuẩn sợi mang nguồn gốc biển có khả năng chịu mặn cao, thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như đặc biệt là hải miên (bọt

biển) và san hô (Shamar et al., 2014)

2.3.3 Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi

a Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước và màu sắc thay đổi tùy theo loài và điều kiện nuôi cấy Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ hoặc có thể có dạng

da, dạng vôi, nhung tơ hay màng dẻo Khuẩn lạc vi khuẩn sợi thường có 03 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt,

lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)

d Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi

e Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là tỉ lệ G – C cao (xấp xỉ 70% hoặc hơn) (Ventura

et al., 2007 và Verma et al., 2013) Chúng còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có thể tự nhân lên

được gọi là plasmid với nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống

chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng khuẩn (Ventura et al.,

2007) Vi khuẩn sợi thường xảy ra sự đột biến Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc đồng

thời làm phức tạp việc nghiên cứu di truyền ở vi khuẩn sợi (Ventural et al., 2007) Khả năng đồng hoá các chất cũng thay đổi tùy theo các loài hay chủng vi khuẩn sợi khác nhau (Barka et al., 2016)

f Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩn sợi

2.4 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp

2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh

2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp:

Hai kháng sinh đầu tiên được khám phá ở vi khuần sợi là Actinomycin vào năm 1940 khi nuôi cấy loài

Streptomyces antibioticus (Barka et al., 2016) và Streptomycin (1943-1944) (Zaffiri et al., 2012) Từ đó về sau

người ta thu nhận được phần lớn chất kháng sinh từ nuôi cấy vi khuẩn sợi thuộc chủng Streptomyces (70%, Ningthoujam et al., 2009) Nhìn chung, vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương đủ khả năng tổng hợp khá nhiều nhóm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u và độc tố tế bào (Manivasagan et al., 2013), gồm 6 nhóm chất:

1 Aminoglycoside

5

2 Chloramphenicol

3 Glycopeptides, β-lactams, polyenes và actionomycins

4 Peptides là những chuổi đa phân tử ngắn

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozide)

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin)

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác

2.5 Sự tồn tại của các gen mã hóa kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả

Sự phát hiện các gen pksI, pksII và nrps phụ thuộc vào việc sử dụng mồi PCR phù hợp Bên cạnh đó, gen

nrps không nhất thiết phải liên quan đến sinh tổng hợp chất thứ cấp, mà có thể liên quan đến chức năng khác như

trao đổi sắt hoặc chưa có chức năng Tuy nhiên, chiến lược sàng lọc bằng PCR vẫn được đánh giá là hiệu quả

trong việc tìm kiếm những chất thứ cấp có ích lợi mới (Jiang et al., 2007)

Bảng 2.3: Những cặp mồi dùng để khuếch đại các trình tự 16S rDNA, PKS-KS và NRPS-A của vi khuẩn sợi cộng

sinh với hải miên (Liu et al., 2019)

Cặp mồi Trình tự

đích

Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước

đoạn khuếch đại (bp)

Nhiệt độ bắt cặp (oC)

Nhiệt độ bắt cặp (oC)

của NRPS

GCSTACSYSATSTACACSTCSGG SASGTCVCCSGTSCGGTAS

* Các gen mã hóa kháng sinh khác của vi khuẩn sợi

Những gen cần thiết cho sự hình thành cấu trúc khuẩn ty khí sinh (sinh bào tử) là các gen bld và whi Hoặc

gen KSα tổng hợp polyketide vòng thơm và qua đó gián tiếp làm marker nhận diện các chủng tạo kháng sinh, hỗ

trợ khá hiệu quả cho việc sàng lọc vi khuẩn sợi Barka et al (2016), cho rằng môi trường dinh dưỡng nghèo carbon

sẽ kích hoạt các cụm gen ngủ cpk (mã hóa cho kháng sinh coelimycin), loài Streptomyces coeliolor có hơn 20

cụm gene loại này

2.6 Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn

Các nhà khoa học của Mỹ, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Đức và Ai Cập cũng có xu hướng chuyển dần nghiên

cứu từ vi khuẩn sợi trong nội địa sang nhóm đại dương, thể hiện qua các công trình của Ayuso et al (2005) với mẫu đất ven biển, (Abdelmohsen et al., 2010) với mẫu hải miên và Kumar et al.,(2018) với mẫu trầm tích biển;

trong đó số lượng chi loài liên kết với hải miên có phần phong phú hơn

Mặc dù rất giàu tiềm năng nhưng điều kiện môi trường khắc nghiệt cũng làm cho kiến thức về các loài vi khuẩn sợi rừng ngập mặn chưa được khào sát sâu rộng đầy đủ Ví dụ 40,2% các chủng phân lập từ rừng ngập mặn

Malaysia là những chi vi khuẩn sợi hiếm ngoài chi Streptomyces và chỉ mới biết được 25% các hợp chất sinh học của chúng (Azman et al., 2015)

2.6.2 Ở Việt Nam

Đối với vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh, các nghiên cứu còn chưa thật sự nổi bật, chưa tập trung vào yếu

tố biển, còn rải rác trên nhiều nguồn phân lập hoặc thậm chí mục tiêu nghiên cứu không phải là chất kháng khuẩn

Như: nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng thuộc chi Streptomyces phân lập từ phế thải rơm

rạ, mùn gỗ ở Hà Nội của Nguyễn Thế Trang và ctv (2015); đề tài về khả năng kháng khuẩn của chi Streptomyces phân lập từ cây bưởi của Phan Thị Hồng Thảo và ctv (2016) Đất vùng ven thành phố Hồ Chí Minh, tuy không phải đất rừng ngập mặn nhưng cũng có kết quả phân lập và định danh được loài Streptomyces flaveus có hoạt tính kháng khuẩn (Phan Thị Huyền và ctv., 2015)

Tóm lại, vấn đề kháng thuốc cũng buộc con người tiếp tục tìm tòi các chất kháng khuẩn mới mà trong đó

vi khuẩn sợi, đặc biệt là các dòng có liên quan đến môi trường biển, là nguồn nghiên cứu rất tiềm năng Các loài

thuộc chi Streptomyces vẫn tiếp tục giữ vai trò nổi bật, xuất hiện nhiều nhất trong các phân lập và cung cấp nhiều

chất mang tính ứng dụng cao

7

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu đất tại rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, sử dụng các dụng cụ và trang thiết

bị cũng như cơ sở vật chất có tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật Môi trường và Phòng thí nghiệm Sinh học Phân

tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện các nội dung thí nghiệm bắt đầu từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 12 năm 2021 và tiến hành phân tích dữ liệu đến tháng 01 năm 2022

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Nguyên vật liệu

3.2.2 Thiết bị - dụng cụ

3.2.3 Hóa chất – môi trường

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu đất được rã lạnh, để khô ở nhiệt độ phòng, dùng cối sứ nghiền mịn Cân 10 g mẫu đất đó cho vào

90 ml nước cất vô trùng, lắc 120 vòng/phút trong 30 phút Dung dịch trên được pha loãng theo hệ số 10 Để lắng khoảng 3 giờ, lần lượt hút lấy 0,1 ml dung dịch ở các độ pha loãng 103-105 trải đều trên đĩa petri có môi trường SCA Các đĩa được để khô và ủ ở 30°C Từ ngày thứ 5, khuẩn lạc của vi khuẩn sợi xuất hiện, được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường mới nhiều lần đến khi rời nhau và hình thái khuẩn lạc rõ ràng nhất (3-6 tuần), kiểm tra bằng nhuộm Gram (vi khuẩn sợi giống thuộc Gram dương nên sẽ cho kết quả màu xanh hoặc tím) và quan sát dưới kính hiển vi Sau đó, tách cấy vi khuẩn sợi trong môi trường trên ống nghiệm để trữ ở tủ lạnh 4 -

5oC và tồn trữ dài hạn với glycerol 15% ở - 80oC

3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.3.3.1 Mục tiêu thí nghiệm

3.3.3.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

- Tiến hành trải các vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ 106 CFU/mL lên môi trường MHA bằng tăm bông vô trùng

- Khoan lỗ tạo giếng thạch trên các đĩa đã trải vi sinh vật thử nghiệm (Giếng thạch có đường kính 6 mm, sâu khoảng 2,5 mm; mỗi đĩa 5 giếng thạch)

- Hút 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn sợi trong ống falcon cho vào tube 2,2 mL đã khử trùng Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

- Lọc bỏ phần cặn, lấy phần dịch trích trong cho vào tube mới

8

- Hút 50 µL phần trong từ tube, nhỏ vào giếng đã khoan lỗ sẵn trên môi trường đã trải các dòng vi sinh vật thử nghiệm; mỗi dòng vi khuẩn sợi lặp lại 3 lần

- Hút 50 µL kháng sinh đã pha loãng nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng dương

- Hút 50 µL nước cất (đã khử trùng) nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng âm;

- Ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ

3.3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát, ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ trên đĩa thạch theo công thức sau đây: Đường kính vòng kháng khuẩn = D - d (mm) Với: “D” là đường kính vòng kháng trên đĩa thạch và lỗ, “d” là đường kính của lỗ đục sẵn trên đĩa thạch

So sánh tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng căn cứ vào quy ước của Galindo (2004) (Bảng 3.5) và khả năng kháng được nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn (Galindo, 2004)

*Phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA

Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn sợi (Stach et al., 2003 và Sun et al.,2015):

*Giải trình tự

Các mẫu DNA sau khuếch đại được gửi để phân tích trình tự nucleotide, do Công ty CP Công nghệ TBR, TP.Hồ Chí Minh thực hiện

9

3.3.4.3 Phân tích kết quả

Kết quả trình tự các đoạn gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn sợi được so sánh độ tương đồng ngân hàng

dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Kết hợp với các đặc điểm sinh học khác để đề xuất tên phân loại Đồng thời, khảo sát các mối quan hệ di truyền bằng phần mềm CLUSTALX, version 1.8 và phần mềm Mega 7.0 với hệ số bootstrapping 1000 lần

3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS

3.3.6 Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn

3.3.6.1 Mục tiêu

3.3.6.2 Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi

Dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn được nuôi với trong môi trường lỏng Starch Casein lỏng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày

10

3.3.6.3 Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi với ethyl acetate

Các hợp chất trong dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi được chiết theo phương pháp chiết tách lỏng – lỏng bằng

dung môi ethyl acetate, tỷ lệ 2:1, lặp lại 3 lần (Lee et al., 2014 và Siddiquee et al., 2015)

*Đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu cao chiết

Mẫu cao chiết thô sau khi chiết tách của dòng vi khuẩn sợi được đánh giá khả năng kháng khuẩn gồm các bước như trong mục 3.3.3 ở trên

*Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)

Mẫu cao chiết được gửi tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột, tiếp theo được phân tích bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) để tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học Các kỹ thuật sắc ký do Bộ môn Khoa học Môi trường thuộc Khoa Môi trường và Tài nguyên thiên nhiên, Đại học Cần Thơ, giúp đỡ thực hiện

Chương trình phân tích:

Chế độ ion hóa: EI, 70 eV Loại ion: Positive

Vùng khối phổ: 35-400 amu

Buồng tiêm: Nhiệt độ: 3000C Thể tích tiêm: 1 L Mode: Split Split ratio: 10

Bảng 3.10: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS

Tốc độ (0C/phút) Nhiệt độ (0C) Giữ (phút)