Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Mục tiêunghiên cứu

TuyểnchọncácdòngvikhuẩnsợitrongđấtrừngngậpmặnhuyệnCầnGiờ,thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp các chất ức chế vi khuẩn gây bệnh cho con người.

Đối tượng và phạm vinghiêncứu

Đối tượng là các vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tạo kháng sinh.

Nghiên cứu được giới hạn trong các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc 6 đơn vị hành chính cấp xã của huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, thu thập trong thời gian từ tháng 02 đến tháng 4 năm 2019.

Thời gian và địa điểmnghiên cứu

Thumẫuvàtiếnhànhphânlập,tuyểnchọncácdòngvikhuẩnsợicókhảnăngtổng hợp kháng sinh được thực hiện từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 Sau đó định danh vi khuẩn sợi từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm2021.

Các nghiên cứu vi sinh vật được tiến hành tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường ĐạihọcCầnThơ.MộtsốphântíchGC-MSvàhóahọcchuyênsâukhácđượcthựchiện bởiBộmônKhoaHọcMôiTrường,khoaMôiTrườngvàTàiNguyênThiênNhiên,Đại HọcCầnThơ.

Nội dungnghiêncứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gâybệnh.

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi bằngkỹthuật khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA, với cặp mồi đặc hiệu S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19 (Sunet al., 2015), so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi đồng thời xây dựng giản đồ phân nhóm di truyền bằng phần mềmMEGA.

- Thu nhận hoạt chất kháng vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra hoạt tính và phân tích thànhphầnhóachấttheocácphươngphápphântíchphổsửdụngmáysắckýghépkhối phổ(GC-MS).

Đóng góp mới củaluậnán

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trongđó,có10chủngkhánglạiítnhấtmộttrongbốnloàivikhuẩngâybệnhthửnghiệm làBacillus cereus(8 chủng),E coli(4 chủng),S aureus(6 chủng) vàV.parahaemolyticus(3 chủng).

Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định danh ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chiStreptomyceshọ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau:Streptomyces tendae, S tanashiensis, S. parvulus, S celluloflavus, S aegytia, S.africanus, S albogriseolus và S laurentii.Tỷlệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chấtcóhoạttínhsinhhọctrong8dòngvikhuẩnsợiđượcghinhậncósựkhácnhau,bao gồmpksIlà 50%,pksIIlà 0% vànrpslà100%. Đã chọn được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao làS.albogriseolusANTHOIDONG 7.1 vàS celluloflavusANTHOIDONG 4.1 Sáu hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từS albogriseolusANTHOIDONG 7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane Đối vớiS celluloflavusANTHOIDONG 4.1, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được xác định bao gồm: 2-pentanone, 4- hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2- hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane,hexadecamethyl. ĐấtrừngngậpmặnCầnGiờvớivikhuẩnsợilànguồnchấtkhángkhuẩntiềmnăng nhưng chưa được quan tâm nhiều Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bảnđịa;làcôngtrìnhnghiêncứuđầutiênvềtínhtrạngkhángkhuẩnvàgenchỉthịkháng sinhcủavikhuẩnsợitrongđấtởrừngngậpmặnhuyệnCầnGiờ.Đồngthời,chấtkháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tươnglai.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn củaluận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh có đặc tính tổng hợp được kháng sinh Kết quả của luận án góp phần làm phong phú tư liệu vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đông Nam Á nói chung về thành phần loài và các lợi ích Trong đó, có những loài mang ý nghĩa kinh tế - xã hội, góp phần trong công cuộc tìm kiếm kháng sinh mới. Ý nghĩa thực tiễn là những vi khuẩn sợi ức chế được nhiều loài vi khuẩn gây hại có thể sẽ là nguồn sản xuất chất kháng sinh, khắc phục hiện tượng kháng thuốc, làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam Hơn nữa, giá trị của các vi khuẩn sợi như vậy càng khẳng định vai trò của rừng ngập mặn trong hệ sinh thái toàn cầu Riêng đối với rừngngậpmặnCầnGiờ,thểhiệnđượcsựtươngstđồngvềcácloàivikhuẩnsợivàthành phần hoạt chất so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thếgiới.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Sơ lược về rừngngậpmặn

Khái niệm và phân loại rừngngậpmặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng quan trọng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll,

2014, Ottoniet al.,2015) Rừng ngập mặn trên thế giới phân bố chủ yếu ở Châu Á (42%), Châu Phi (20%), Bắc và Trung Mỹ (15%), Châu Đại Dương (12%) và NamMỹ(11%);tỷlệ bao phủ khoảng 60% –75% vùng nhiệt đới toàn cầu và các đường bờ biển cận nhiệt đới (Giriet al.,2011) Cây rừng ngập mặn chủ yếu là những loài cây thân gỗ, có hạt và một số cây bụi Trên thế giới có gần 70 loài cây rừng ngập mặn với chiều cao thayđổitừ1,5mđến50m.Nhữngchithựcvậtthườngthấytrongrừngngậpmặnlàchi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera) (Miththapala,2008).Câyrừngngậpmặnhìnhthànhhaicơchếthíchnghivớiđiềukiện sốngtrongmôitrườngcónồngđộmuốicao:mộtlàtrênlácâycótuyếnmuốiđểbàitiết lượngmuốithừa;hailàtíchlũymuốithừavàotếbàothịtláhoặcvỏcâysauđósẽđược thảirangoàikhilárụnghoặckhitrócvỏ(Miththapala,2008;SpelchanvàNicoll,2014) Tổng diện tích rừng ngập mặn trên toàn thế giới vào khoảng 11 – 18 triệu hecta (Spelchan và Nicoll, 2014) Rừng ngập mặn đóng vai trò quan trọng khi cung cấp các sảnphẩmsinhkhốiđộng- thựcvậtchoconngười,điềutiếtlũ,tíchlũyphùsavàchuyển hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewelet al.,1998) Đất rừng ngập mặn là nơi cóđộẩmcao,độmặncaovàchịuđượctìnhtrạngthiếuoxy,làmộthệsinhtháiđadạng với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wuet al.,2016).

Trên thế giới chủ yếu có 3 loại rừng ngập mặn (Miththapala, 2008), bao gồm:

 Rừng ngập mặn ven sông, như tên gọi của nó, xuất hiện dọc theo sôngsuối và bị ngập bởi thủy triều hàng ngày Loại rừng ngập mặn này có thể được tìm thấy ở Kuraburi và Kapoe, Ranong, TháiLan.

 Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy dọc theo khu bảo vệ các đường bờ biển, các đảo và vùng nước lộ thiên của các vịnh và đầm phá Các rừng này bị ngậptheothủytriềunhưngkhôngphảichukỳngàyđêmnhưloạivensông Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy ở Vịnh Honda, Palawan,Philippine.

 Rừng lưu vực: loại rừng này nằm sâu trong đất liền, trong vùng trũng kênh chảy từ nội địa ra bờ biển Chúng bị ngập không theo quy luật thủy triều.Rừng ngập mặn lưu vực được tìm thấy ở Maduganga, Galle, SriLanka.

Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố HồChí Minh

Theo Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ có tên đầy đủ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Rừng ngập mặn (DTSQTG RNM) Cần Giờ, làKhuDTSQTGđầutiêncủaViệtNam,đượcUNESCOcôngnhậnvàongày21/1/2000, thuộc thuộc khu vực hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm ở phía Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha Rừng ngập mặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng nhưsau:

1 Vùng lõi, diện tích 6.134,43 ha, có chức năng bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên; bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước; bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả thực vật lẫn động vật; nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái có giớihạn.

2 Vùng đệm, diện tích 29.152,10 ha đất rừng và 12.763,56 ha diện tích mặt nước), có chức năng phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ưu thế; bảo vệ vùng lõi; tạo không gian lớn hơn cho thú hoang hã ngoài vùng lõi; tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái; tạo điều kiện cho các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môitrường.

3 Vùng chuyển tiếp có diện tích 13.227,79 ha đất rừng và 7.267,47 ha mặt nước,gồmcáckhuvựccònlạicủahuyệnCầnGiờ.Vùngchuyểntiếpcóchứcnăng khuyến khích các mô hình phát triển kinh tế, hợp tác với sự tham gia của cán bộ quản lý, các cơ sở kinh tế, các tổ chức đoàn thể, tôn giáo, văn hóa, xã hội, cácnhà khoa học, các tổ chức giáodục…

TheoBanQuảnlýrừngphònghộCầnGiờ(2021),vềđadạngsinhhọc,rừngngập mặn Cần Giờ có hệ động-thực vật rất phong phú, baogồm:

+ Hệ thực vật: có 318 loài thực vật bậc cao

- Nhóm cây ngập mặn chủ yếu: 37loài

- Nhóm cây tham gia rừng ngập mặn: 56loài

- Nhóm cây du nhập: 225loài + Hệ động vật:

- Thú: 35loài+ Phiêu sinh vật: 66 loài động vật nổi, 66 loài thực vật nổi.

Bên cạnh đó, trong rừng ngập mặn Cần Giờ có 3 khu bảo tồn các loài động vật, bao gồm:

• Khu bảo tồn chim (Sân Chim Vàm Sát) là môi trường sống của khoảng 2.000 cá thể chim thuộc 33 loài, trong đó có 26 loài định cư và 07 loài dicư.

• Khu bảo tồn dơi (Đầm Dơi) tại tiểu khu 15a là nơi trú ngụ của hơn 500 cá thể dơi, chủ yếu là loài Dơi ngựa (Pteropus lylei);

• Khu bảo tồn khỉ (Khu Đảo Khỉ), với đàn Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis) phát triển trên 1.000con.

Ngoài ra, rừng ngập mặn Cần Giờ còn là nơi sinh sống của nhiều loài động-thực vật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007 Về thực vật có 2 loài là Cócđỏ(Lumnitzeralittorea)vàChùmlé(Azimasarmentosa);vềđộngvậtcó9loàibao gồm:

• Thú: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đuôi dài (Maccacafascicularis);

• Chim: Bồ nông chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn

(Anhingamelanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringaguttifer),

• Bò sát: Rắn hổ chúa (Ophiophagushannah),

• Cá: Cá mang rổ (Toxotes chatareus)

(Nguồn: Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ,2021) Đểcóđượcsựđadạngsinhhọcnhưtrên,rừngngậpmặnCầnGiờphảitrảiqua40 nămphụchồikểtừkhibịtànphábởichiếntranhtrongnhữngnăm1970.Đồngthời,áp lựcônhiễmmôitrườngtừcáckhucôngnghiệpvàkinhtếnăngđộngcủathànhphốHồ Chí Minh vẫn là một nguy cơ cần kiểm soát để bảo vệ sự ổn định của hệ sinh thái rừng ngập mặnCần Giờ (Thanh-Nho vàctv.,2019).

Vi sinh vật trong đất rừngngậpmặn

Mật số vi sinh vật trong đất thường rất dồi dào và đa dạng, ước tính có đến

10 9 CFU/gđất,thuộc10.000loài(GriffithsvàPhilippot,2013).Quầnxãvisinhvậtchủyếu là vi khuẩn và nấm mốc, đảm trách rất nhiều chức năng (80 – 90% các phản ứng trong đất thông qua trung gian vi sinh vật), hình thành mùn đất, tuần hoàn các yếu tố dinh dưỡng, cải thiện cấu trúc đất và ảnh hưởng đến cây trồng (Grzadielet al.,2018). Đối với đất rừng ngập mặn, nhờ nguồn carbon và dinh dưỡng đầy đủ, các quầnxã vi sinh vật rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyênsinh (Thatoiet al., 2012) Vi sinh vật đất rừng ngập mặn có khả năng chịu mặn và tổng hợp chấttraođổithứcấp,đặcbiệtlàcácvikhuẩnsợitạođượckhángsinh(Sivakumaretal.,2007;

Rừng ngập mặn rất giàu các loại tảo phù du, tảo đáy và tảo nhu động Chúng thường tập trung ở khu vực gốc, rễ của cây ngập mặn và trong lớp đất bùn mềm Các loài tảo này có tính chống chịu khá đối với sự thay đổi độ mặn của môi trường và tạo được những chất chống đông máu, kháng ung thư (Thatoiet al., 2012). Đấtrừngngậpmặntrênthếgiớisởhữuđến1500loàivinấm.Trongsốđó,cóloài làtácnhânkýsinhgâybệnhchocâyrừngngậpmặn,nhưngcóloàisảnsinhraacidhữu cơ tham gia vào cơ chế hòa tan lân cung cấp dinh dưỡng cho cây (Thatoiet al.,2012).

Vi khuẩn là quần xã nổi bật và tạo nhiều sinh khối cho rừng ngập mặn, bao gồm cácloàivớinhiềutínhnăngkhácbiệtnhưcốđịnhđạm,hòatanlân,oxyhóalưuhuỳnh, phân giải cellulose và vi khuẩn sinh methane (Thatoiet al.,2012).

CácloàivikhuẩnsợitrongđấtrừngngậpmặncủaTrungQuốc,ẤnĐộ,Indonesia được ghi nhận khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh vi khuẩn GramâmlẫnvikhuẩnGramdương(Hongetal.,2009vàRetnowati,2010).S i v a k u m a ret al.

(2007) khẳng định chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc biển (rừng ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi trong đất liền. Cáchợpchấtđóphứctạpvềcấutrúcvàđanăngvềhoạttínhsinhhọc(Hongetal.,2009 và Liet al., 2010) Có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học được báo cáo do vi khuẩn sợi tổng hợp và 80% các hoạt chất này được thu nhận từStreptomyces(Berdy, 2005) Môi trường rừng ngập mặn như vị trí địa lý, pH, nhiệt độ, độmặn,độẩmvàdinhdưỡngrấtbiếnđộngởcácvùngkhácnhaunênvikhuẩnsợirừng ngập mặn rất đa dạng và độc đáo; theo thống kê của Amritaet al.(2012) có 24 chi của 11 họ và 8 phân ngành dưới bộ Actinomycetales được phân lập và định danh từ rừng ngậpmặn.Cóđến2.000dòngvikhuẩnsợiđượcphânlậptừrừngngậpmặnvàcácchất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễm trùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), các enzyme phân giải… (Honget al., 2009).Tuy nhiên, vì những khó khăn khi nuôicấynên chỉ mô tả xác định được rất ít (5%) số lượng chủng loài, chưa tương xứng với tiềm năng sẵn có (Thatoiet al., 2012) Do vậy,cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác trong tươnglai.

Vikhuẩnsợi

Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi(xạkhuẩn)

Về nguồn gốc danh xưng “vi khuẩn sợi” (actinobacteria), theo Dworkin (2006), nhóm vi sinh vậtnàycó nhiều tên gọi và được phân loại không rõ ràng thành nấmhoặc vikhuẩn.Danhtừ“xạkhuẩn”-Actinomycete,đượcdùngtừnăm1870đến1921,(thậm chí hiện nay vẫn dùng ở Việt Nam) Từ sau năm 1980, nhờ những thành tựu trong việc sosánhtrìnhtự16SrDNAkếthợpvớicáctiêuchíphânloạihóahọc(chemotaxonomic), cùngvớiđặcđiểmnhữngvisinhvậtGramdươngcóthểcóhoặckhôngcócấutrúc“tia xạ”, Dworkin (2006) đề xuất một tên phân loại mới là Actinobacteria – vi khuẩn sợi (VKS).

Do vậy, đây sẽ là từ được dùng trong luận ánnày.

Phân bố của vi khuẩn sợi trongtự nhiên

Vikhuẩnsợilàmộtnhómvikhuẩnthật(Eubacteria),phânbốrấtrộngrãitrongtự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trongnhữngcơchấtmàcácvisinhvậtkháckhôngsinhtrưởngđược.Sốlượngvikhuẩn sợi trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác củađấtvàkhảnăngbaophủcủathựcvật.Đấtgiàudinhdưỡngvàlớpđấtbềmặtthường có mật số vi khuẩn sợi lớn trong đất Số lượng vi khuẩn sợi trong đất thay đổi theo thời gian trong năm. Trong đất vùng rễ, vi khuẩn sợi thể hiện tỷ lệ cao về sinh khối vi sinh vật Mật số của chúng thường chiếm hơn 30% (khoảng 10 6 đến 10 9 CFU/g) và thông thường hai chiStreptomycesvàNocardiachiếm ưu thế, thậm chíStreptomycescó thể chiếm khoảng 95% (Venturaet al.,2007).

Vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như hải miên (bọtbiển)vàsanhô(Shamaretal.,2014).Vikhuẩnsợiởbiểnthườngcókhảnăngchịu mặn cao, đặc biệt có những loàiStreptomycesspp có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl16%vànhiềuloàithuộcchiStreptomycesvàNocardiasinhtrưởngtốtkhiởnồng độNaCl10%,chiMicromonosporaspp.vàSalinosporaspp.đềucókhảnăngchịumặn cao(Solanoet al.,2009).

Đặc điểm sinh học tổng quát của vikhuẩn sợi

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện nuôi cấy Khuẩn lạc của vi khuẩn sợikhôngtrơn,ướtnhưởvikhuẩnhaynấmmenmàthườngcódạngthôráp,cócácnếp tỏa ra theo hình phóng xạ Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có thể có dạng da, dạng vôi, dạng nhungtơhaydạngmàngdẻo(Hình2.1).Màusắccủakhuẩnlạcrấtđadạng:đỏ,dacam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng vàctv.,2001).

Hình 2.1: Hình dạng các khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường tinh bột-casein đặc (Starch casein agar) (Ranjaniet al.,2016) b Khuẩnty

Vi khuẩn sợi giống có hệ sợi giống nấm mốc, nhưng lại đơn bào, không có nhân thựcvàkíchthướcgiốngvikhuẩn.Vikhuẩnsợicó3lớpkhuẩnty,lớpvỏngoàicódạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ, có thể tích lũy trong sinh khối của tế bào vi khuẩn sợi hay được tiết ra môi trường (Nguyễn Lân Dũng vàctv.,2001).

Trên môi trường đặc, hệ sợi của vi khuẩn sinh trưởng thành hai hướng tạo thành khuẩntycơchấtvàkhuẩntykhísinh(Hình2.2).Khuẩntycơchấtsinhtrưởngcắmsâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ty khí sinh.Khuẩn ty khí sinh còn được gọi là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp là loại khuẩn ty sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm Nhiều loài vi khuẩn sợi chỉ có khuẩn ty cơ chất mà không có khuẩn ty khí sinh, nhưng có loài vi khuẩn sợi thuộc chiSporichthyalại chỉ có khuẩn ty khí sinh Khi đó, khuẩn ty khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản (Nguyễn Lân Dũng vàctv.,2001).

Hình 2.2: Khuẩn ty ở vi khuẩn sợi (Nguyễn Lân Dũng vàctv, 2001)

Khuẩn ty của vi khuẩn sợi thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính từ 0,2 -3 àm,khụngcúvỏchngănvàkhụngtựđứtđoạn.Saumộtthờigiansinhtrưởng,ởđầucỏc khuẩn ty khớ sinh thường hình thành các sợi bào tử Khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định vàphụthuộcvàođiềukiệnsinhlývànuôicấy.Đặcđiểmnàyphânbiệtvớinấmmốcvì hệ sợi của nấm mốc cú đường kớnh rất lớn thay đổi từ 5 – 50 àm, dễ quan sỏt bằng mắt thường (Nguyễn Lân Dũng vàctv,2001). c Thành thế bào

Theo Nguyễn Lân Dũng vàctv.(2001) thành tế bào vi khuẩn sợi có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin Thuộc nhóm này có cácchi:

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin Thuộc nhóm này có các chi:Micromonospora, Actinoplanes,Ampullariella.

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm các chiDermatophilus,Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis,

Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium,Actinosynnema.

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose Gồm các chiNocaridia, Oerskovia, Promicromonospora,Pseudonocardia,

Thành tế bào vi khuẩn sợi chủ yếu gồm 03 lớp: lớp ngoài dày 60 – 120 Å, khi già có thể dày tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dày 50 Å và lớp trong dày 50 Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptide gồm các gốc N-acetylglucosamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glycoside Lớp ngoài thành tế bào vi khuẩn sợi có cấu tạo bằng lipid Thành tế bào vi khuẩn sợi không chứa cellulose hay chitin Vi khuẩnsợi phân lập từ các vùng ngập mặn có thành tế bào dày hơn và độ bền cơ học cao hơn, có thểchốngchịuvớiđiềukiệnbấtlợicủamôitrường(nồngđộmuốitừ3-4%,pHtừ6,8

– 8,5vànhiệtđộdaođộngtừ20–35 o C).Thànhtếbàocủanhómvikhuẩnsợichịukiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều acid như acid galacturonic, acid glutamic, acid aspartic và acid phosphoric Với điện tích âm, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na + , H + , ngược lại thải các ion OH - Bên cạnh đó, tuy nhóm vi khuẩn sợi trung tính vànhómchịukiềmcólớppeptidoglycangiốngnhauvềcấutrúcnhưnglạikhácnhauvề thànhphầnhợpchấtcấuthành,vikhuẩnsợiưakiềmchứanhiềuhesoaminvàacidamin (Kamekura và Kates,1999). d Sự hình thành bào tử ở vi khuẩnsợi

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại vi khuẩn sợi là dựa vào hình tháivàkíchthướccủacuốngsinhbàotử(Barkaetal.,2016).Sợibàotửcóthểcónhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (retiflexibilis), xoắn (spirales)hoặc có móc, vòng (retinaculiaperti)… có loại mọc vòng một cấp, có loại mọc vòng hai cấp. Mộtsốvikhuẩnsợicósinhnangbàotử,bêntrongcóchứacácbàotửnang.Bềmặtcủa bàotửcóthểnhẵn(smooth),gai(spiny),tóc(hairy),xùxì(warty),nếpnhăn(rugose)… tùy thuộc vào loài vi khuẩn sợi Sự hình thành bào tử bắt nguồn từ sự hình thành khuẩn ty khí sinh.Bào tử vi khuẩn sợi được hình thành theo ba phương thức sau đây: (1) phương thức sinh trưởng toàn bộ (toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra bàotử);(2)phươngthứcsinhtrưởngtrongthành(bàotửsinhratừtầngnằmgiữamàng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty), trường hợp này gặp ở chiPlanomonospora;(3) phươngthứcsinhtrưởngbàotửnộisinhthật(thànhkhuẩntykhôngthamgiavàoquá trình hình thành bào tử), trường hợp này gặp ở chiThermoactinomycetes(Barkaet al.,2016).Cómốiquanhệgiữasựhìnhthànhbàotửvàmôitrườngnghèodinhdưỡngtrongnuôicấyvi khuẩnsợi(Barkaetal.,2016).ViệcbổsungCaCO3vàCaCl2vàomôitrườngsẽ kích thích sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định Nếu môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình hình thành bào tử thường sẽ bị kìm hãm Độ ẩm và nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử (Schmidtet al.,2005).

Bào tử vi khuẩn sợi được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å chia làm 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH,… Hình dạng, kích thước chuỗibàotử,cấutrúcmàngbàotửlànhữngtínhtrạngtươngđốiổnđịnhvàlàđặcđiểm quantrọngdùngtrongphânloạivikhuẩnsợi.Tuynhiênnhữngtínhtrạngnàycóthểcó nhữngthayđổinhấtđịnhkhinuôicấytrênmôitrườngcónguồnnitơkhácnhau(Shamaret al.,2014; Barkaet al.,2016). e Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩnsợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vậtnhânsơkháclàtỷlệG–Ccao(xấpxỉ70%hoặchơn)trongkhiđóởvikhuẩnlà25

– 45% (Venturaet al.,2007; Vermaet al.,2013) Ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắcthểcòncócácplasmidcóthểtựnhânđôi.Cácplasmidnàyđemlạichotếbàonhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu vớinhiệtđộbấtlợi,chốngchịuvớicáckhángsinh,chuyểngen,sảnxuấtcácchấtkháng khuẩn(Venturaetal.,2007).Vikhuẩnsợikhôngổnđịnhvềditruyềnvàthườngxảyra độtbiếntrongphântửDNA.Điềunàytạoratínhđadạngvềhìnhthái,tínhkhángthuốc Sự tự nhân lên của các đoạn DNA làm cho việc nghiên cứu di truyền ở vi khuẩn sợi phức tạp hơn (Venturaet al.,2007).

Vi khuẩn sợi thuộc loại sinh vật dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon đa dạng gồm đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrate Khả năng đồng hoá các chất thay đổi tùy theo chủng, loài khác nhau (Barkaet al.,2016). f Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩnsợi

Vi khuẩn sợi có vòng đời khá phức tạp bắt đầu bằng sự nẩy mầm của những bào tử, phát triển khuẩn ty dinh dưỡng rồi khuẩn ty phân nhánh và xuyên thấu vào cơ chất để giữ vững tế bào và hấp thu chất dinh dưỡng, tiêu hoá phần hữu cơ (polysaccharides,proteins,lipidsvàhợpchấthữucơkhác),bởinhữngenzymesngoạibào.Khuẩntydinh dưỡng hay khuẩn ty sơ cấp phát triển tiếp thành khuẩn ty thứ cấp hay khuẩn ty hiếu khí trênbềmặtcơchấtvàbắtđầuchogiaiđoạnsinhsảnvàhìnhthànhbàotử,tiếptụcquay trở lại vòng đời (Barkaet al.,2016).

Vòngđờicủavikhuẩnsợithayđổitheonguồndinhdưỡng,vớinguồndưỡngchất dồi dào sẽ cho các khuẩn ty phát triển tốt Ngược lại, chỉ có khuẩn ty dinh dưỡng phát triển(Dastageretal.,2006).Hầuhếtvikhuẩnsợi(chủyếulàchiStreptomyces)lànhóm hoại sinh (saprophytic) sống trong đất và gần như một nửa vòng đời của chúng là bào tử, chúng bị ảnh hưởng bởi nguồn dưỡng chất, chúng dễ thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái như môi trường có chút ít muối và không khí hay trong môi trường có nhiều sinh vật khác Trong điều kiện thiếu dinh dưỡng, vi khuẩn sợi là nhóm mẫn cảm với nhiệtđộcaonhưnglạichịuđựngtốttrongđiềukiệnkhôhạn(Manivasaganetal.,2013) Chúng hình thành bào tử và thay đổi từ động bào tử di động (mobile zoospores) thành thể bào tử sinh sản đặc biệt (specialized propagules) Vi khuẩn sợi thuộc nhóm tạo bào tử (chiStreptomyces) sẽ hình thành bào tử trong vùng đặc biệt của khuẩn ty khí sinh, sảnxuấtmộtlượnglớnbàotửvàmỗibàotửnẩymầmrấtmạnh;chiThermoactinomycescó nội bào tử (endospores) trong khi các chiMicromonospora, Aleuriospores,Geodermatophilus,

KitasatoavàOerskovialà nhóm động bào tử di động (mobile zoospores)

Mật số của vi khuẩn sợi tuỳ thuộc vào hữu cơ trong đất và điều kiện khí hậu, đặc biệt lớp đất bề mặt đến độ sâu 2 m có tính kiềm hiện diện từ 10 6 đến 10 9 CFU/g đất; thông thường chiStreptomyceschiếm ưu thế, gần 95% những dòng thuộc lớp Actinomycetales được phân lập từ đất (Stackebrandtet al., 1997).

Những yếu tố khác như nhiệt độ, pH, và ẩm độ đất có ảnh hưởng đến sự tăng trưởngcủavikhuẩnsợi.Giốngnhưvikhuẩnđấtkhác,hầuhếtchúnglànhómchịunhiệt (mesophilic) với nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 25 o C đến 30 o C nhưng vẫn có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn, từ 50 đến 60°C, nhờ vào ẩm độ cao (Edwards, 1993) Vi khuẩnsợipháttriểntrongđấtcópHtrungtính,tốtnhấttrongkhoảng 6và9.Tuynhiên vài dòng của chiStreptomycesđược phân lập từ đất phèn có pH 3,5 (Kimet al., 2003) Nghiên cứu đầu tiên về ảnh hưởng của khí hậu trên sự phân bố của vi khuẩn sợi được thực hiện bởi ltner và Strửmer (Madiganet al., 2010), đếm và ghi nhận số vi khuẩn sợi này chỉ cú20% trong tổng số các nhóm vi sinh vật vào mùa xuân và hơn 30% vào mùa thuvìmùanàycómộtlượnglớnxácbãthựcvật;đếnmùađông,tuyếtlàmgiảmmậtsố vi khuẩn sợi xuống còn13%.

Phân loại (Taxonomy) vikhuẩnsợi

Khóa phân loại vi khuẩn sợi cổ điển dựa vào những đặc tính phân tử, sinh hoá và sinhlýđểphânbiệtcácloài.Hiệnnay,kếthợpthêmcácphươngpháphiệnđạinhưphân tíchbộgenvàphântíchprotein,cóthểphânchiangànhphụActinobacteriachitiếtthấp dần đến mức độ loài phụ (subgroups), ngoài ra còn có phân loại dựa trên vi hình thể (micro- morphology)vàsựthayđổicủacấutrúcvỏtếbào(Bảng2.1và2.2)(Gaoetal., 2006) Phương pháp sinh học phân tử thường dùng nhất hiện nay để định danh và phân loại là phân tích gene 16S rDNA của vi khuẩn sợi (Krishnaveniet al.,2011).

Bên cạnh đó, khóa phân loại vi khuẩn sợi còn dựa vào sự phân tích thành phần và cấu trúc của peptidoglycan trên màng tế bào, các chấtnàykhác nhau bởi những acid aminnằmởvịtrísố3trongchuỗitetrapeptides,sựhiệndiệncủaglycineởgiữacầunối peptide và carbohydrate chứa peptidoglycans Theo đó, có các nhóm như: nhómActinomyces(V- lysine và Ornithine),Rothia(V - lysine và acid aspartic),Oerskovia(VI + Gallysine; Galactose; acid Aspartic),Agromyces(2,4-D acid diaminobutyric và glycine) vàMycoplasma(meso-DAP nhiều loại acid amin khác nhau) (Bull,2004).

Bảng 2.1: Những dữ liệu chính yếu và những mối quan hệ đến sự phân loại vi khuẩn sợi (Bull, 2004)

Nhóm Loai vỏ tế bào

I I I I I II II II II IIIIIIII III III III III IIIIV IV IV IV IV

M ad ur os e, Không có arabinose và xylose

Galactose,arabinose và không cóxylose

Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của ngành Vi khuẩn sợi cùng với Lớp, Bộ và Họ (Bull, 2004)

Lớp Bộ Họ Tổng số chi

6 Thermoleo- Solirubrobacterales Conexibacteraceae 1 2 philia Parviterribacteraceae 1 2

Theo Bergeyet al.(2000), dựa theo phân tích gen 16S rDNA, vi khuẩn sợi (Actinobacteria) được xem là một ngành phụ lớn trong giới Vi khuẩn Phân chia các ngànhtronggiớiVikhuẩncòntuỳthuộcvàosựthêmvàohaybớtđinhómproteintrong gen 23S rDNA và sự sắp xếp khác nhau của các gen Vi khuẩn sợi được chia làm 2 nhóm: nhóm có khuẩn ty thô theo sau bởi những đoạn khuẩn ty dinh dưỡng; nhóm có một mạng khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium network)vớinhiều bào tử Các chi trong nhóm thứ hai này gồm cóStreptomyces, Actinoplanes, vàMicrobispora, Ngành phụ Actinobacteria bao gồm

5 lớp (classes), 19 bộ (orders), 50 họ (families) và 221 chi (genera) Năm lớp là:Acidimicrobiia, Actinobacteria, Coriobacteriia, Rubrobacteria và Thermoleophilia.(Hình 2.3 và Hình2.4).

Hình 2.3: Tỷ lệ phân bố của các lớp khác nhau trong ngành vi khuẩn sợi (Yadavet al.,2018)

Hình 2.4: Tỷ lệ phân bố khác nhau của các chi ưu thế trong ngành vi khuẩn sợi (Yadavet al., 2018)

Những ứng dụng công nghệ sinh học của vikhuẩn sợi

Vi khuẩn sợi có tầm quan trọng trong lĩnh vực nông nghiệp Một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn sợi sinh sản mạnh có thể góp phần gia tăng năng suất cây trồng bằng cách cải thiện dưỡng chất cho cây thông qua hai cơ chế:

- Trựctiếpcốđịnhđạm,hòatanlân,kalivàkẽm,sảnxuấtchấtđiềuhòasinh trưởng như acid indole acidic, acid gibberellic, zeatin, và sản xuất siderophores, enzyme ACC deaminase có hoạttính;

- Gián tiếp thông qua quá trình sản xuất ammonia, hydrogen cyanide, kháng sinh, enzyme lytic và sản xuất siderophores giúp hấp thusắt.

Ngoài ra, vi khuẩn sợi còn hướng đến giúp đề kháng lại những yếu tố gây stress sinhhọctrongmôitrường,giatăngtínhchịuhạnvàcảithiệnsựhấpthuphospho(Vermaet al., 2013,

Trong y học, vi khuẩn sợi tạo ra các hợp chất thứ cấp có tính kháng khuẩn (antimicrobial)baohàmcảchấtkhángnấmvàkhángkísinhtrùng(Sharmaetal.,2014;

Azmanetal.,2015);trongđó,vaitròcủachiStreptomyceschiếmtỷlệkhácao(Sharmaet al., 2014).

Năm 2010, Dharmaraj ghi nhận rằng các vi khuẩn sợiStreptomycessp từ biểnvàđạidương(baogồmtrongphùsa,bùn,nộisinhtrongcácsinhvậtbiểntrongđó có hải miên) tổng hợp ra nhiều hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) Trong những hợp chất đó, số lượng các chất có hoạt tính sinh học của chiStreptomycesphân lập từ biểnkhôngngừnggiatăng.Tùytheocấutrúcphântửđượcphânchianhưsau:Peptides, Quinones, Macrolides, Polyketides, Piericidins, Trioxacarcins, Marinopyrrols, Sisomicin, Triazolopyrimidine, Esters, Macrocyclic Lactam,Dẫnxuất Manamycin, và Streptoclorin (Dharmaraj, 2010; Shamaret al.,2014) Vi khuẩn sợiStreptomycessp. 211726,đượcphânlậptừđấtcủarừngngậpmặnWenchang,TrungQuốc,cónăngsuất tổng hợp macrocyclic lacton và năm thành phần khác của chất azalomycins không nhỏ, biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, đặc biệt là có cả chất ức chế thụ thể interleukin-1 loại I (Yuanet al.,2013).

Loài người đang gặp nhiều khó khăn trong điều trị các bệnh mãn tính, như thoái hóathầnkinhvàungthư.Mộttrongnhữngnguồntiềmnănglàvikhuẩnsợi,vớisựphân bố rộng trong tự nhiên; nhất là chiStreptomycescó thể được tìm thấy ở cả môi trường trên cạn và biển, tạo ra các hợp chất hoạt tính sinh học đa dạng, độc đáo, có lợi cho sức khỏeconngười.HaichủngStreptomyces(MUSC137TvàMUM256)đượcphânlậptừ trầmtíchrừngngậpmặnởbánđảoMalaysiakhikiểmtrahoạttínhsinhhọccóbiểuhiện các hoạt động chống oxy hóa và gây độc tế bào mạnh mẽ, ức chế một số dòng tế bào ung thư ở người (Seret al.,2017) Vi khuẩn sợi có nguồn gốc từ rừng ngập mặn được chorằngđãvàđangtrởthànhnguồntàinguyêntriểnvọngđểphânlậpcáctácnhânhóa trị liệu(Lawet al., 2020) Những kết quả này là thể hiện tầm quan trọng của vi khuẩn sợi từ các vùng chưa được khám phá ngoài hệ sinh thái trêncạn.

Kháng sinh do vi khuẩn sợitổnghợp

Lược khảo chung vềkhángsinh

TheoZaffirietal.(2012),hợpchấtcótínhkhángkhuẩnđầutiênđượcEhrlichgiới thiệu vào những năm 1909 - 1911 là Arsphenamine (sau đó gọi là Salvarsan), có chứa arsen Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh Penicillin từ loài nấm mốcPenicilliumnotatum.Năm1932,khámpháracáckhángsinhthuộcnhómsulfanilamide.

Năm1943,WaksmanvàAlbertSchatzthunhậnđượcchấtStreptomycintừloàivikhuẩn sợiStreptomyces griseus Năm 1949, chất Cephalosporin được thu nhận từ vi nấmCephalosporium acremonium.Xuất phát từ nhu cầu khắc phục hiện tượng vi khuẩn đề kháng lại kháng sinh, vào các năm 1961 và 1972 lần lượt có Ampicillin vàAmocixillin là những kháng sinhthếhệ hai, được cải biến từ Penicillin Đến nay, có nhiều kháng sinhthuộcthếhệbavàbốnvớiphổkhángkhuẩnrộnghơn,ứngdụng vàođiềutrịnhiều bệnh hơn và vẫn tiếp tục được cải tiến để đương đầu với vấn đề phát sinh những chủng loài vi sinh vật kháng thuốc Công thức phân tử của một số kháng sinh được trình bày trong Hình 2.5.

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của (a) arsphenamine với 2 nguyên tử Arsen, (b) penicillin, (c) streptomycin, và (d) cephalosporin C Trong đó, streptomycin có cấu trúc phức tạp nhất Còn penicillin và cephalosporin có gốc R thay đổi để đáp ứng với sự đề kháng

Cơ chế tác động của một vài nhóm kháng sinh được Zaffiriet al (2012) tóm tắt như sau:

 Sulfonamide: ức chế sự hình thành folate, từ đó ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh này có phổ rộng, tác động lên cả vi khuẩn Gram âm vàdương.

 Penicillin: trong cấu trúc hóa học có vòng β-lactam Kháng sinh nhóm nàyứcchếsựhìnhthànhpeptidoglycantrongváchtếbào,bámvàonhững enzymecủavikhuẩngâybệnh,từđóthúcđẩyquátrìnhtựphângiảivách tế bào Đây là kháng sinh phổ rộng nhưng dễ bị đềkháng.

 Streptomycin: là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn sợi, mở ra bước phát triển quan trọng trong điều trị ykhoa.Nógắnvàotiểuphần30Strongribosomecủavikhuẩngâybệnh, dẫn tới đọc sai mã và ức chế quá trình tổng hợp protein Kháng sinh này phổ rộng nhưng đạt hiệu quả tốt trên vi khuẩn Gramâm.

 Cephalosporin:cóvòngβ-lactamnhưpenicilinnhưnghiệuquảtùythuộc vào nhiều yếu tố Nó có hiệu quả điều trị với vi khuẩn Gram âm nhưng kémvớivikhuẩnGramdươngvàchotớinaytrảiquacảibiếnbốnthếhệ.

Kháng sinh do vi khuẩn sợitổnghợp

Mặc dù chất kháng sinh đầu tiên được khám phá ở vi khuẩn sợi là Actinomycin, khi nuôi cấy loàiStreptomyces antibioticustrong năm 1940 (Barkaet al., 2016),nhưng chất thường được nhắc đến là Streptomycin (1943-1944) vì theo Clardyet al.(2009), danhtừkhángsinh– (antibiotics)doWaksmanđềxuấtsaukhithunhậnchấtnàytừloàiStreptomyces gryseusphân lập trong hệ vi sinh vật đất (Zaffiriet al., 2012) Bên cạnh đó, chất kháng nấm từ vi khuẩn sợi là Nistatin được thu nhận từ dịch nuôi cấy loàiStreptomyces noursei(Khuất Hữu Thanh,2006).

Y học hiện nay thu nhận được nhiều chất kháng sinh hơn, phần lớn (70%) có nguồn từ vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomyces(Ningthoujamet al.,2009 và Sharmaetal.,2014).Cáckhángsinhnàythuộccácnhómchấtnhư:aminoglycoside,anthracyclin, macrolide, β-lactam, cloramphenicol, tetracyclin, nhóm polyene và griseofulvin (Barkaet al.,2016) Các macrolide được xếp loại theo kích cỡ vòng genin, quan trọng nhất là các chất có vòng mang 14 đến 16 nguyên tử carbon Riêng vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương đủ khả năng tổng hợp khá nhiều nhóm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u và độc tố tế bào (Manivasaganet al.,2013).

TheoXuetal.(2014),hiệncó122chấtchuyểnhóathứcấpkhácnhaubaogồm49 hợpchấtphổbiếnvà73chấtmớithuđượctừvikhuẩnsợirừngngậpmặn,baogồmcác alkaloid, benzen và các dẫn xuất cyclopentenon, dilactone, macrolite, 2-pyranones, sesquiterpenes và một số chất đặc biệt như salinosporamides, xiamycins và indolocarbazoles.ChiStreptomycestiếptụcđượcXuetal.(2014)đánhgiálànguồnsản xuất phong phú nhất Mặc dù các hợp chất được phát hiện lại nhiều lần, nhưng chúng vẫn được ghi nhận có hoạt tính sinh học mới tiềm năng (Xuet al.,2014).

Manivasaganet al.(2013) tổng kết các kháng sinh trên thế giới, trong đó nhấn mạnh vai trò của nhóm vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương, bao gồm:

1 Aminoglycoside: như Streptomycin là kháng sinh được khám phá từ vi khuẩn sợiStreptomyces griseus(Hình 2.6)

2 Chloramphenicol(Hình 2.7), được phát hiện từ vi khuẩn sợiStreptomycesvenezuelae;Tetracycline và Anthrocycline…đều là sản phẩm của vi khuẩn sợiStreptomycessp.

3 Glycopeptides, β-lactams, polyenes và actionomycins:Vancomycin (Hình

2.8) là kháng sinh điều trị nhiễm trùng ức chế vi khuẩn Gramdương.

4 Peptides đa phân tử ngắn:Hầu hết peptide củaStreptomycesdạng vòng và chứa những phân tử hiếm như chromophores hay những acid amin Piperazimycins A–

C là hexadepsipeptides độc phân lập từ sự lên men dung dịchStreptomycess p

Piperazimycin A ngăn chặn tổng hợp protein ở tế bào khối u làm khối u không phân cắt được (Hình 2.9 và 2.10).

Hình 2.6: Các kháng sinh thuộc nhóm amino - glycosides

Hình 2.7: Các kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol

Hình 2.8: Các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptide, β-lactams và các dẫn xuất

Hình 2.9: Các kháng sinh thuộc nhóm peptides

Hình 2.10: Cấu trúc hóa học của các polypeptides

5 Polyesters:Bonactin (Hình 2.11), một ester kháng khuẩn, phân lập từStreptomycessp BD21-2 ở mẫu đất trầm tích ven biển Hawaii, có khả năng kháng lại cả vi khuẩn Gram-dương, Gram-âm và kháng nấm (Schumacheret al.,2 0 0 3 )

Hình 2.11: Cấu trúc hóa học của polyester (Nguồn: Schumacheret al.,2003)

6 Các hợp chất sinh học mới:Salinipyrones A và B (Hình 2.12) là những polyketides mới, phân lập từ vi khuẩn sợi biểnSalinispora paciﬁca; tuy chưa được xác định làm dược phẩm cho người nhưng salinipyrone A có tác dụng như interleukin-5 ở nồng độ 10 àg/ml mà khụng ảnh hưởng đến dũng tế bào HCT-116 ở người (Ohet al.,2008) Newman và Crag (2004) báo cáo rằng loàiMicromonospora marinathu thập từ ngoài khơi Mozambique tổng hợp được chất ức chế DNA α-polymerase, có tác dụng với khá nhiều dòng tế bào ungthư.

Hình 2.12: Cấu trúc hóa học của 1 số hợp chất sinh học mới (Ohet al., 2008)

LoàiStreptomyces coeliolorlà hình mẫu để nghiên cứu sự tổng hợp kháng sinh với hơn 20 cụm gene mã hóa cho các chất trao đổi trung gian Hình thái của vi khuẩn sợi (phân mảnh hay nén chặt) có mối liên hệ phức tạp đến việc tạo thành kháng sinh (Barkaet al.,2016) Có thuyết cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm phụ của quá trình traođổichấtcủavikhuẩnsợi(Manivasaganetal.,2014);cóýkiếnchorằngchấtkháng sinh là chất tham gia vào quá trình cạnh tranh của vi khuẩn sợi trong môi trường sống tựnhiên(vanderHeuletal.,2018).Nhìnchung,cácconđườngsinhrachấtkhángsinh từ vi khuẩn sợi được tóm tắt như sau (Clardyet al.,2009):

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhómnucleozide).

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc 1 khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin,novobiocin).

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polymer hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác Có 4 dạng polymerhóa:

+ Chất kháng sinh nhóm polypeptide theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin.

+Chấtkhángsinhđượctạothànhnhờphảnứngpolymerhóacácđơnvịacetate, propionate: chất kháng sinh nhóm macrolide, tetracilin,rifamicin.

+ Chất kháng sinh aminoglycozide được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacaride: neomicin, streptomycin.

+ Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonide từ các đơn vị acetate,…

Nghiên cứu về các chất chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn sợi rừng ngập mặn vẫn cònởgiaiđoạnbắtđầuvàrấtcầnkhaitháckhẩncấpnhưmộtnguồnsảnphẩmtựnhiên có giá trị. Theo Giriet al.(2011) và Xuet al.(2014), các nghiên cứu và kỹ thuật bao gồm sàng lọc dựa trên trình tự, khai thác bộ gen hoặc phân lập các loài mới có thểnâng cao hiệu quả của việc khám phá các sản phẩm từ vi khuẩn sợi rừng ngập mặn Mặc dù thuđượckhánhiềukếtquảquantrọng,nhưngnhữngtháchthứcvẫntồntạivìcáclýdo sau: (1)sảnphẩmhoạtchấtbịtrùnglặp;(2)chưacókỹthuậtphântíchvànhậnbiếtcấu trúc hóa học hiệu quả hơn; (3) sự suy giảm diện tích nghiêm trọng của rừng ngậpm ặ n ;

(4) có những loài không thể nuôi cấy trong môi trường thí nghiệm; (5) chi phí tài chính cao (Giriet al., 2011 và Xuet al., 2014).

Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-IIvànrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợpkhángsinh

Polyketide là một nhóm các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đa dạng, bao gồm polyketide týp 1 và týp 2, được tạo thành do quá trình trùng ngưng các đơn vị acid carboxylic (giống như tổng hợp acid béo) Các polyketide có ứng dụng trong nông nghiệp lẫn y học, có thể kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tác nhân ung thư (Zhaoetal.,2009, 2011, 2018) nhưng theo Manivasaganet al.(2013) đa số polyketide có khả năng kháng khuẩn, ngược lại độc tính gây chết tế bào và khả năng kháng nấm không cao.Nhữngthuốccóchấtpolyketidebaogồm:aurantimycin,chartreusin,cocanamycin, kirromycin, lisolipin và polyketomycin (Weberet al.,2003) Các vi khuẩn sợi phân lập từbiểnsâu(hoặcnóichunglàcónguồngốctừbiển/đạidương–marineactinobacteria) thườngcónhữngenzymetổnghợppolyketide( P K S –polyketidesynthases)vàenzyme tổng hợp polyketide không phải ribo-thể (NRPS – nonribosomal polyketide synthase) (Zhaoet al.,2009; Sunet al.,2015) Theo nghiên cứu của Ayusoet al.(2005), mã hóa choenzymetổnghợppolyketide(chỉthịkhángsinh)gồmcácgenlàpksI,pksIIvànrps Ở vi khuẩn sợi các gen tổng hợp polyketide thường phân bố theo từng cụm (Manivasaganet al.,2013).

Theo Jenke-Komadaet al.(2006), các enzyme tổng hợp polyketide týp 1, tương ứngvớiPKS-Icủavikhuẩnsợilàcácenzymeđachứcnăngđểlắprápcáccấutrúcphức tạp từ các khối cấu tạo carbon đơn giản Các vị trí hoạt động của PKS týp 1 được tổ chứctuyếntínhthànhcáckhối,mỗikhốixúctácmộtchukỳkéodài.Mộtkhốitốithiểu chứa một enzyme ketosynthase (KS), một acyltransferase (AT) và một miền protein mang gốc acyl(ACP) Tính đặc hiệu của AT đối với malonyl-CoA, methylmalonyl- CoA,hoặccácα- alkylmalonyl-CoAkháccóvaitròxácđịnhchấtkéodàimạchcarbon Hơn nữa, vì methylmalonyl-CoA và α-alkylmalonyl-CoA có tâm bất đối xứng, nên sự kếthợpcủachúngtạoracácđồngphânlậpthểkhácnhaucủachuỗipolyketidekéodài.

Sau khi trùng ngưng, trạng thái oxy hóa của β-carbon hoặc được giữ dưới dạng nhóm ceto hoặc được biến đổi thành nhóm hydroxyl, methine hoặc metylene bằng hoạt động tùy chọn của enzyme ketoreductase (KR), khử nước (DH) và enoylreductase (ER) Sự biến đổi khác xuất phát từ sự tồn tại của hai loại miền KR tạo ra các đồng phân lập thể khácnhauliênquanđếnβ-carbonbấtđối.Khảnăngkếthợpcácbiếnthểkhácnhautheo cách hoán vị tạo ra sự đa dạng rất lớn về cấu trúc polyketide Về mặt lý thuyết, một hệ thốngPKSbaogồmsáukhốikéodàicóthểtạorahơn100.000cấutrúc(Jenke-Komadaet al.,2006).

Như vậy, các khối tổng hợp polyketide (PKS) của vi khuẩn sợi là một nguồn dự trữkhổnglồcáchợpchấtthiênnhiên.Nghiêncứuconđườngsinhtổnghợpnhữngchất nàycóthểhỗtrợviệcthiếtkếgenđểthunhậncáchợpchấthoạttínhsinhhọcmới.Qua khảo sát quan hệ di truyền của các đoạn mã hóa enzyme ketosynthase (KS) trên PKS của chi vi khuẩn sợiStreptomycescho thấy phần lớn các khối tham gia vào quá trình sinh tổng hợp một hợp chất được phát triển bằng cách nhân đôi một khối đầu tiên duy nhất Sử dụng loàiStreptomyces avermitilislàm sinh vật mẫu, Jenke-Kodamaet al. (2006)táitạolạicácmốiquanhệtiếnhóacủanhữngmiềnKSkhácnhau.Phântíchnày cho thấy 65% các khối bị thay đổi bởi sự thay thế tái tổ hợpxảyra trong và giữa các cụm gen sinh tổng hợp Các thay thế này bao gồm thay thế trên đoạn mã hóa cho acyltransferase (AT), ketoreductase (KR), và khử nước (DH) –KR tự nhiên Kết quả nghiêncứucủaJenke- Kodamaetal.(2006)chỉrasựtáitổhợptươngđồngdựavàotính lắp ráp theo khối của miền PKS, là cơ chế quan trọng nhất làm cơ sở cho sự đa dạng polyketide ở vi khuẩnsợi.

Việc xác định sự có mặt của các gen mã hóa cho enzyme tổng hợp kháng sinh rất quan trọng để nhận diện và khẳng định khả năng tổng hợp kháng sinh của các vi khuẩn sợi (Ayusoet al.,2005) Cáckỹthuật sinh học phân tử như khuếch đại trình tự gen,lấy dấu phân tử và phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) thường được áp dụng trên các genpksvànrpsđể đánh giá khả năng tạo kháng sinh của vi khuẩn sợi (Ayusoetal.,2005;Zhaoetal.,2009).Tuynhiên,Ayusoetal.(2005)chorằngkỹthuật PCR sàng lọc các gen liên quan đến chuyển hóa thứ cấp được sử dụng để đánh giátiềm năngsinhtổnghợpcủavikhuẩnsợiđềucóhạnchếlàkhônghiệuquảtrongviệc"chống sao chép” hoặc định danh các dòng phân lập, bắt buộc phải giải trình tự tăng cườngcủa sản phẩm PCR Vì vậy, kết hợp dữ liệu thu được từ các phương pháp lấy dấu phân tử truyềnthốngvàcácphươngpháplấydấumớisẽgiúpcáctậptrungquátrìnhtuyểnchọn vào các nhóm tiềm năng, làm tăng cơ hội tìm thấy các chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị Ayusoet al.(2005) nghiên cứukỹthuật lấy dấu phân tử (finger printing) mới, dựa trên phân tích đoạn cắt giới hạn của các mảnh khuếch đại genpks, nrpsở các chủng vi khuẩn sợi phân lập từ đảo ở biển Trung Mỹ, nhằm đánh giá hiệu năng và mối liên hệ giữasựtồntạicủacác gennàyvớikhảnăngtổnghợpkhángsinh.Bêncạnhđó,sosánh trìnhtựnhữngvùngKS(khoảng700bptrêngenpksI)(Zhaoetal.,2009)vàKSα,KSβ

(trêngenpksII)phảnánhđượcsựđadạngchủngloàivàdùnglàmtiêuchíxâydựngcây phân loại (hoặc câyphảhệ) Kết quả nhận ra được 7 vùng KS của loàiStreptomycesavermitilisvàghinhậntầnsốxuấthiệncaocủacácgenpksI,pksII,nrpstrongcá cquẩn thể chiStreptomyces, MicromonosporavàNocardiaceae Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện cao nhất ở nhómStreptomyces, đồng thời tỷ lệ phần trăm dương tính khi tầm soát PKS-IvàNRPScaogấpđôiởnhómvikhuẩnsợihoạthóasovớinhómbấthoạt(Ayusoet al.,2005) Như vậy, ở chi này, sự hiện diện của các gen sinh tổng hợp có mối liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn Bên cạnh đó, sử dụng cây phả hệ để so sánh trình tự vùngKScủanhữngdòngvikhuẩnsợiphânlậpđượcvớidữliệucôngbốtrướcchothấy chiStreptomycescònnhiềuhoạtchấtsinhhọctiềmnăngkhácnữa(Ayusoetal.,2005). Điềunàyvẫnđúngvớinhữngloàivikhuẩnsợikhác,polyketidekhôngchỉcótínhkháng khuẩn mà còn bảo vệ tế bào thần kinh, chống khối u và ức chế miễn dịch (Zhaoet al.,2009).

SựpháthiệncácgenpksI,pksIIvànrpsphụthuộcvàoviệcsửdụngcặpmồitrong phản ứng PCR có tương hợp hay không tương hợp (Weberet al., 2003) Bên cạnh đó, gennrpskhông nhất thiết phải liên quan đến sinh tổng hợp chất thứ cấp, mà có thể liên quan đến chức năng khác như trao đổi sắt hoặc chưa rõ chức năng Tuy nhiên, chiến lược sàng lọc bằng PCR vẫn được đánh giá là hiệu quả trong việc tìm kiếm những chất thứ cấp có ích lợi mới (Jianget al.,2007).

Kích thước của các genpksI, pksII, nrpsvà trình tự các cặp mồi dùng để khuếch đại tương ứng được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng2.3:Nhữngcặpmồidùngđểkhuếchđạicáctrìnhtự16SrDNA,PKS-KSvàNRPS-Acủa vi khuẩn sợi (Liuet al.,2019)

Cặp mồi Trình tự đích

Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch đại (bp)

27F 16S rDNA AGA GTTTGA TCM TGG CTC AG ∼1400 55

1492R gene GGY TAC CTT GTT ACG ACT T

KS1F1 Vùng KS ATG GAY CCS CAR CAR CGB CT ~700 60

KS1R1 týp 1 GCY TCG ATS GGR TCN CCS A

KS2aF1 Cụm KS TSG CST GYT TCG AYG CSA T ~1070 60

KS2bR1 týp 2 GCR TAG AAC CAS GCG AWS GAC

A7R Adenyl hóa của NRPS SASGTCVCCSGTSCGGTAS

Quabảngtrên,cóthểthấycácgenpksIvànrpscókíchthướcgiốngnhau(khoảng 700 bp), ngược lại cụm genpksIIcó kích thước lớn hơn gần gấp rưỡi (khoảng 1070bp) (Liuetal.,2019).SốliệunàysovớinghiêncứucủaMeenaetal.(2019)cósailệchnhỏ

(613bpvà680bp,tươngứngchopksIvàpksII)vìsửdụngcặpmồikhác.Nhưvậy,việc khuếch đại gen có thể sử dụng những cặp mồi khác nhau, và dẫn đến sản phẩm PCRcó kích thước không giống nhau ở mỗi nghiên cứu Tương tự, cặp mồi K1F/M6R dùng khuếch đại genpksIsẽ cho ra đoạn khuếch đại có kích thước 1200-1400 bp (không còn là 700 bp và lớn hơn genpksII, Jianget al.,2007).

Sự biểu hiện của các gen chỉ thị kháng sinh nhưpksIvànrpsđược Passariet al. (2017)khảosátbằngkỹthuậtRealtime-qPCR.LượngmRNAcủacácgennàyđượctầm soát trong những khoảng thời gian từ 5 đến 15 ngày Kết quả cho thấypksIđược phiên mãtăngdầntrongkhoảngtừ5đến12ngàynuôicấy,sauđógiảmmạnhvàongàythứ

15 Gennrpscó biểu hiện theo chu kỳ tương tự nhưng đến ngày thứ 15 vẫn ổn định. Trong các chủng thu được, thì ngày thứ 12 đạt giá trị biểu hiện gen cao nhất Thông tin này có thể được lưu ý cho việc nghiên cứu lựa chọn thời gian sản xuất và thu nhận hợp chất sinh học từ vi khuẩn sợi. ĐấtrừngngậpmặnẤnĐộquaphânlậpvàgiảitrìnhtự16SrRNAthuđượcnhiều loài trong chiStreptomyces Kumaret al.(2018) tiến hành khảo sát các genpksI, pksIIvànrpstrên

31 chủng vi khuẩn sợi phân lập; cùng với phân tích hóa học bằng phương pháp GC-

MS (khối phổ) các sinh chất Kết quả nhóm chất PKS-I xuất hiện ở 6 chủng, nhómchấtPKS-

IIxuấthiệnở4chủngvànhómchấtNRPScóở11chủng(trongsốnàycó1chủngkhôngthuộcchiStr eptomyces);cácchấtsinhtổnghợpthuộcnhómdịvòng, polyketide và peptide có khả năng kháng nấmCandida albicans.Bên cạnh đó, nghiên cứu này kết luận các cụm gen thuộc dạng “gen ngủ”(cryptic-silent).

*Các gen chỉ thị kháng sinh khác của vi khuẩn sợi

Theo Barkaet al.(2016), sự hình thành kháng sinh liên quan đến giai đoạn khuẩn ty cơ chất bị biệt hóa thành các dạng cấu trúc sinh bào tử để đáp ứng lại điều kiện sống ngặtnghèo,thiếuhụtdinhdưỡng.Nhữnggencầnthiếtchosựhìnhthànhcấutrúckhuẩn ty khí sinh (sinh bào tử) được đặt tên là các genbldvàwhi.Genbldthấy ở nhữngdòng đột biến khuẩn lạc không có dạng bông xù, còn genwhithấy ở những dòng đột biến khôngtạođượcsắctốbàotửmàuxám(Barkaetal.,2016).Hầuhếtnhữnggennàyđược ghi nhận mã hóa cho nhiều yếu tố phiên mã và có chức năng điều hòa trong quá trình phiên mã và dịch mã Ví dụ genbldDlà một yếu tố phiên mã có tính đa hiệu cao, kiểm soát hàng trăm gen liên quan đến sự phát triển; hoặc genwhiHlại kiểm soát quá trình phân bào hình thành bào tử Từ đó có thể suy luận các gen quy định cho tính trạng cấu trúckhuẩntycómốiliênhệgiántiếpđếnsựtổnghợpkhángsinhởvikhuẩnsợi(Pressonet al.,2013).

Bên cạnh đó, Sunet al.(2015) nghiên cứu thấy các chủng vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomycesvàSacchoropolysporaphân lập từ hải miên của biển Hoa Nam, Trung Quốc là nguồn tiềm năng để thu nhận các polyketide mang vòng thơm (polyketide týp 2,vídụtetracyclinethếhệmới)đượctổnghợpbởienzymeβ-ketoacylsynthase.Enzymenày do vùng gen

KSαmã hóa Sunet al.(2015) thu được một hợp chất angucycline Do vậy, vùng gen

KSαnày có thể dùng để đánh giá khả năng tổng hợp polyketide vòngthơm và qua đó gián tiếp làm điểm đánh dấu (marker) nhận diện các chủng tạo kháng sinh,hỗtrợhiệuquảchoviệctuyểnchọnvikhuẩnsợi.Ngoàira,khisosánhtươngđồnggiữa các trình tự vùng gen KSαvà phân tích phả hệ di truyền còn cho thấy sự đa dạngtrong cấu trúc của các polyketide vòng thơm (Sunet al.,2015) Trên các genpksIcủa những vi khuẩn sợi trong đất đều có vùng gen mã hóa KS- ketosynthase (Ayusoet al., 2005).

So sánh dấu phân tử của các genpksI,pksIIvànrpssử dụng enzyme cắt giới hạnHinfI kết hợp vẽ sơ đồ nhánh cây phả hệ thể hiện sự đa dạng di truyền trong cácchủng loàivikhuẩnsợihoangdại.Đồngthời,cókhảnăngxuấthiệnsựchuyểngentheochiều ngang giữa các dòng hoang dại với nhau trong quần xã (Ayusoet al.,2005).

Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừngngập mặn

Trênthếgiới

Vi khuẩn sợi là sinh vật tạo được các hợp chất có giá trị sinh học khác như chất kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế sự hình thành khối u (Zhaoet al.,2009; Barkaet al.,2016) và cả các sắc tố dùng trong nhiều lĩnh vực (Guet al., 2018) Các nghiên cứu thườngtậptrungtheohướngphânlập,sànglọctừcácnguồnnhưmẫuđất,mẫusinhvật biển, mẫu trầm tích biển và trên đối tượng chủ yếu là các chủng loài thuộc chiStreptomycesvớitiềmnăngđượccholàlênđếnhàngngànkhángsinh(Manivasaganetal., 2013) Việc khám phá ra các phân tử mới từ vi khuẩn sợi đánh dấu một giai đoạn trong tiến trình nghiên cứu kháng sinh vì kháng sinh của vi khuẩn sợi rất phức tạp, khó tổng hợp bằng con đường hóa học (Velho-Pereiraet al.,2011). a Nghiên cứu về kỹ thuật phân lập: vi khuẩn sợi được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như đất, thực vật, động vật và cả trên con người (Okafor, 2007) Những yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn sợi (Zhaoet al.,2011).

Phương pháp cấy trên dĩa thường sử dụng để phân tích những đặc tính hình thái của vi khuẩn sợi Hình dạng, màu sắc của khuẩn ty và bào tử có thể là cơ sở phân loại đến cấp độ họ và chi Việc chọn môi trường nuôi cấy thích hợp rất quan trọng vì nguồn dinhdưỡngvàmậtsốvikhuẩnliênquanlẫnnhau(Giletal.,2009).Cónhiềumôitrường chuyên dành cho phân lập vi khuẩn sợi, tương ứng với từng nguồn lấy mẫu khác nhau như Agar Triplicase Soy,Blood Agar, Brain Heart Infusion… (Sharmaet al.,2014) Hầu hết vi khuẩn sợi phát triển trên môi truờng nuôi cấy, nhưng không sản xuất chất mucopolysaccharides như vi khuẩn, không bài tiết hay chịu khô như khuẩn lạc kem (creamy colonies) Sự phát triển bào tử thường xuất hiện màu (pigments), là dấu hiệu đặc trưng khi gặp một môi trường nuôi cấy bổ sung chitin, lúa mạch, tinh bột, muối vô cơ, và nước cứng Khuẩn lạc của những loàiStreptomycescó dạng cứng sáng và nhợt nhạt trên môi trường NutrientAgar, nhưng trong môi trường chứa lúa mạch hay môi trường có nguồn tinh bột kèm theo muối vô cơ, khuẩn lạc có màu sáng, vàng; khuẩn ty có thể phát triển thành cụm với màu sắc khác nhau (Bergeyet al., 2000) Sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường đặc có thể quan sát bằng mắt thường sau 3 đến4ngàyủnhưngsựpháttriểnbắtđầucókhuẩntykhísinhvớinhữngbàotửphảiđợi từ 7 đến 14 ngày tiếp theo Ở một số vi khuẩn sợi khác thì sự phát triển của khuẩn lạc còn kéo dài cả tháng (Leteket al., 2012) Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, vikhuẩn sợi hình thành bề mặt phim hay một lớp mỏng trên bề mặt môi trường, dễ dàng phân biệt với sự nhiễm khuẩn làm cho môi trường trở nên đục hơn (Hình 2.13) Khi có sự khuấy động với tốc độ 200 - 220 rpm (vòng/phút), vi khuẩn sợi sẽ phát triển thành thể viên (pellets) hay sợi (filament) (Araujo-Meloet al.,2016).

Hình 2.13: Sự tăng trưởng của vi khuẩn sợi trong môi trường lỏng: A: phát triển bình thường, trong và rõ; B: Vi khẩn sợi bị đặc (thành phần phù sa); C: nuôi cấy vi khuẩn sợi bị nhiễm tạp (Araujo-Meloet al., 2016)

Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, hình thể của vi khuẩn sợi thay đổi tuỳ theo các chi Ví dụ, chiArthrobactervà chiRhodococcus,có kết quả là vi khuẩn hình cầu (coccobacillus shape), chiNocardiacho thấy những mảnh của khuẩn ty và chiStreptomyceslại khác biệt rõ rệt với khuẩn ty phân nhánh (branched aerial mycelium) Khuẩntycóthểmangnhiềubàotử,khácnhauvềsốlượngvàsựsắpxếpcủachuỗibào tử Trong chiMicrobisporavàStreptomyces, hình thành cặp dài có chuỗi mang bào tử, thẳng đứng, hay đính; trong khi ở chiActinoplanesvàStreptosporangio, bào tử thường có cọng mang bọc bào tử (sporangium) Sử dụng kính hiển vi điện tử có thể quan sát được bề mặt của bào tử như trơn láng, nhăn nheo (wrinkled), có gai (prickly) hay lông tơ (downy) (Bullet al., 2005, Bull và Stach, 2007 và Barkaet al.,2016). b Các phương pháp nhận diện vi khuẩn sợi:Phối hợp phân tích đa hình thể và vi hình thể cùng với những phản ứng sinh hoá học và dinh dưỡng thường không cho thấyrõsựkhácbiệtgiữavikhuẩnsợivớinhữngnhómvikhuẩnGram-dươngkhác.Như vậy, phân tích hệ gene bằng phương pháp sinh học phân tử làkỹthuật cao nhất để định danh, phân loại chi tiết và xác định mối quan hệ di truyền với mỗi nhóm của vi khuẩn sợi (Cook và Meyers,2003).

Trình tự của nucleotides ở 16S rDNA của một số loài biến động khá cao nhưngtỷ lệ đột biến thường thấp Một số lớn trình tự tích lũy trong ngân hàng dữ liệu giúp dễ dàng xác định tên phân loại bằng cách so sánh (alignments) với trình tự của những loài khác Thêm vào đó, ngoài những trình tự có tính cố định cao (đoạn bảo tồn),gene 16S rDNAcòncóvùngbiếnđộng,màcóthểdùngđểđogầnvàđoxamốiquanhệditruyền(phylogenetic relationships), cho phép xác định Giới (Domain), Ngành (Division), Lớp(Class), Bộ (Order), Họ (Family), Chi (genus) và Loài (species) của vi sinh vật được phântích(Petersetal.,2000).Dovậy,trìnhtự16SrDNAchotớinayvẫnđượcsửdụng trong nhận diện vi khuẩnsợi.

Ngoàira,tuyvikhuẩnsợimangthànhphầnguaninevàcytosine(GC)trongDNA khá cao nhưng lại thay đổi trong khoảng khá rộng từ 51% như ở chiCorynebacterium, đến hơn 70% trong những loài của chiStreptomycesvàFrankia,ngoại lệ lại kém hơn 50% ở loàiTropheryma whipplei(Chater và Chandra, 2006) Vì vậy, hàm hượng G+C chỉ là một trong những tiêu chí phân loại với mức chính xác tương đối khôngcao. c Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sợi: thường dùng một số phương pháp như cấy đĩa đơn của Bauer được Velho-Pereira và Kamat (2011) cải tiến, hoặc giếng thạch (Pallaet al., 2018) Theo nghiên cứu của Pallaet al.(2018), khi phân lập vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn Koringa, Ấn Độ, thu được dòng KMFA-1 (KoringaMangroveForest-

Actinomycete)cótiềmnăngđốikhánglớnvớiloàinấmC.albicansvàP llenensebằng chất đối kháng ngoại bào (Vi khuẩn sợi được chọn nuôi trong7loạimôitrườngkhácnhautrênmáylắc150rpmở28°Ctrong7ngàyđểtạochất khángkhuẩnthíchhợp.Sauđó,đượclytâmởtốcđộ5000vòng/phúttrong20phút,thu lấy dịch nổi, thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp dung hợp giếng thạch (well diffusion method) cho thấy tính năng kháng nấmCandida albicansvàPectinotrichumllanense).

Sử dụng phương pháp phân tích hóa học (MS – khối phổ) để định tính và định lượngcáchợpchấtsinhhọccủanhữngdòngvikhuẩnsợiphânlậpđượctừmôthựcvật họ cây tai voi Ấn Độ (Rhynchotoechum ellipticum), Passariet al.(2017) phát hiện 16 hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm 6 loại kháng sinh (fluconazole, chloramphenicol, erythromycin, ketoconazole, rifampicin và miconazole), 8 hợp chất phenolic (catechin, kaempferol, acid chebulagic, acid chlorogenic, acid ferulic, acid arjunic, acid gallic và acid boswellic) và Paclitaxel, một hợp chất chống ung thư Trong số các kháng sinh được phát hiện, có ba loại kháng nấm (ketoconazol, fluconazole và miconazole) và ba loại khác là kháng khuẩn (chloramphenicol, erythromycin và rifampicin) Lượng chất khỏng nấm rất cao (trờn 270 àg/g dịch chiết) trong khi lượng chất chống ung thư hơi thấp(khoảng10-23àg/gdịchchiết).Hoạttớnhkhỏngkhuẩnđạtmứctrungbỡnhvớikớch thước vũng vụ khuẩn từ 10 – 12 mm, thể hiện ở 81 trên tổng số 169 dòng vi khuẩn sợi phânlậpđuợc.Tươngtự,Sriragavietal.(2023)côngbốkếtquảphânlập,địnhdanhvà khảo sát tính kháng khuẩn của 9 chủng vi khuẩn sợi trong đó có một dòng thuộc chiStreptomycestừđấtvùngrễtreẤnĐộ:hoạttínhkhángkhuẩnvượttrộiđốivới3loàivi khuẩngâybệnh làStaphylococcus aureus(19 mm),Bacillus subtilis(12 mm) vàStreptococcuspyogenes(10mm),thànhphầnhoạtchấtcủacaochiếtbằngethylacetate được phân tích GC-MS gồm có các hợp chất gốc phthalate và một số acid hữu cơkhác. Ấn Độ là quốc gia tích cực hàng đầu trong khía cạnh tìm kiếm kháng sinh từ vi khuẩn sợi, với rất nhiều bài báo được công bố Trong thời gian 40 năm, thu thập được

41 loài thuộc 8 chi vi khuẩn sợi từ những vùng cửa sông, ven biển và rừng ngập mặn khắpẤnĐộ,trongđócó34/41loàithuộcvàochiStreptomyces(Sivakumaretal.,2007).TiềmnăngtolớncủachiStreptomycestiếptụcđượcBarkaetal.(2016)khẳngđịnhvới nhữngtríchdẫnrằngcònhàngchụccụmgenemãhóachocácchấttrunggianchưađược khaithác.

Bêncạnhđó,Ventolaetal.(2015),chorằnggầnđâyhiệntượngcácdòngvikhuẩn kháng lại kháng sinh trở nên báo động Suốt 30 năm qua dù có nhiều chi loài vi khuẩn sợi có khả năng tạo kháng sinh mới được phát hiện, số kháng sinh tổng hợp rất đáng kể nhưng vẫn chưa được xem là thế hệ kháng sinh mới hoàn chỉnh Do đó, càng thúcđẩynhucầutìmkiếmcáckhángsinhmớivớitácdụngmạngmẽhơn,hiệuquảhơn.Cácloài vi khuẩn sợi có nguồn gốc từ đại dương được đánh giá cao hơn vi khuẩn sợi trong đất liền (Sivakumaret al., 2007, Landwehret al., 2016; Kumaret al., 2011) Lý do của sự ưu việt này là sự ảnh hưởng của môi trường sống khác biệt rất nhiều so với đất liền (Rosmineetal.,2016).Hệsinhtháirừngngậpmặn,cáccửasôngtrởthànhnguồnphân lậpvikhuẩnsợicungcấpkhángsinhmớiđầytiềmnăng(Thatoietal.,2012;Rosemineet al.,

2016) Một số chi và loài vi khuẩn sợi mới được phân lập từ những môi trường này (Ningthoujamet al., 2009) Do đó các nhà khoa học Ấn Độ đang quan tâm nhiều đến vi khuẩn sợi ở biển và có xu hướng mở rộng nguồn phân lập vi khuẩn sợi ở những nguồnsinhhọckhácnữanhưcá,sò,rongtảobiển,trầmtích…(Sivakumaretal.,2007).

2012, phân lập được vi khuẩn sợi từ hải miên ở biển Hoa Nam (Sunet al., 2015) và từ mẫu trầm tích biển ở Đại Liên (Zhaoet al., 2009) thu được các chi hiếm gặp như chiMarihabitans, Polymorphosopora, Streptomonospora(Sunet al., 2015) Cả hai nghiên cứu đều cho thấy chiStreptomyceschiếm ưu thế, xuất hiện nhiều nhất trong các dòng vi khuẩn sợi thu được (14/40 loài ở biển Hoa Nam và 9/11 loài từ các loài ở biển Đại Liên) Vi khuẩn sợi phân lập từ trầm tích biển Đại Liên, Trung Quốc còn có sự tương đồng cao về trình tự giữa gen mã hóa cho PKS-I và gen mã hóa cho sự tổng hợp meridamycin, càng làm rõ tiềm năng tổng hợp kháng sinh của những dòng vi khuẩnsợi có mang genpksI(Zhaoet al., 2009) Đối với genpksII, Li và Piel (2002) chuyển genpksIIcủa một loàiStreptomycesphân lập từ động vật thân mềm ở biển vào loàiSreptomyces lividansđể thu nhận kháng sinh rubromycin đạt hiệu suất caohơn.

CácnhàkhoahọccủaMỹ,BồĐàoNha,TâyBanNha,ĐứcvàAiCậpcóxuhướng chuyểndầnnghiêncứutừvikhuẩnsợitrongnộiđịasangnhómđạidương,thểhiệnqua cáccôngtrìnhcủaAyusoetal.(2005)vớimẫuđấtvenbiển,Abdelmohsenetal.(2010) vớimẫuhảimiênvàKumaretal.(2018)vớimẫutrầmtíchbiển;trongđósốlượngchi, loài liên kết với hải miên có phần phong phú hơn Vịnh California và Vịnh Mexico lại cho thấy sự đa dạng sinh học của vi khuẩn sợi (Maldonadoet al., 2009) Ngoài ra, còn có những khảo cứu, phân lập từ những mẫu đất ở Nam Cực, thu được 39 chủng thuộc9 chi có chất kháng nấm (Leeet al., 2012) Những dữ kiện này tiếp tục khẳng định tính phong phú và phân bố rộng của vi khuẩn sợi trong thiênnhiên.

Mặc dù rất giàu tiềm năng nhưng điều kiện môi trường khắc nghiệt khiến cho các loài vi khuẩn sợi rừng ngập mặn chưa được khảo sát sâu rộng đầy đủ Có 40,2% các chủng phân lập từ rừng ngập mặn Malaysia là những chi vi khuẩn sợi hiếm ngoài chiStreptomycesv àchỉmớibiếtđược25%cáchợpchấtsinhhọccủachúng(Azmanetal., 2015). d Nghiên cứu về gen chỉ thị kháng sinh:Sự đa dạng trong trình tự các gen, khi phân tích trình tự vùng KS (ketosynthase) của genpksIphản ánh sự phân bố của gen nàytrongquầnthểvikhuẩnsợivàdùngđểvẽnênquanhệditruyềncủacácloạikháng sinh (Hình 2.14) Tuy nhiên, các phương pháp này có hạn chế là không thể nhận diện nhanh các chủng phân lập mà cần phải giải trình tự nhiều sản phẩn PCR (Ayusoet al., 2005).

Hình 2.14:Mối quan hệ di truyền trong trình tự của các vùng KS trên genpksI(Ayusoet al.,2005) Mặc dù chỉ số Bootstrap không cao, nhưng có thể thấy sự phức tạp, nhiều nhánh di truyền quan hệ xa nhau Vùng KS vừa mã chỉ thị cho kháng sinh erythromycin, vừa có chức năng khác (RapA3), lại xuất hiện ở nhiều chủngSaccharopolyspora erythraeakhác nhau.

Khi so sánh giữa các chủng trong chiStreptomyceshoạt hóa và bất hoạt thìtỷlệ phát hiện đoạn khuếch đại genpksIvànrpsở chủng hoạt hóa cao gấp 2 lần Trong khi đó,genpksIIkhôngcóbiểuhiệnnhưthếvàcácquầnthểtronghọMicromonosporaceae và Nocardiaceae không có sự khác biệt tương tự Như vậy có mối quan hệ giữa sự hiện diện của các genpksI, pksIIvànrpsvới khả năng tạo kháng sinh nhưng chủ yếu ởquần thểStreptomyces(Ayusoetal.,2005).Tươngtự,Jiangetal.(2007)pháthiệnsựtồntại của các genpksI, pksIIvànrpsvớitỷlệ tương ứng lần lượt là 54%, 71% và 92% trong các chủng vi khuẩn sợi phân lập từ các loài hải miên (ở biển Hoa Nam), và chiStreptomycesvẫnlànhómưuthế.Đặcbiệt,cácchủngtrongnhómStreptomycesnàytuy cùng loài, có phân tích đa hình RFLP giống nhau, nhưng bộ chất “PKS-I_PKS-II_NRPS”khácnhau,nênxếpthànhnhữngnhánhphảhệriêngnhau.Điềunàycàngcho thấy tính đa dạng di truyền ở mức độ phân tử và đa dạng trong sản phẩm sinh hóa của vi khuẩnsợi.

Nghiên cứutrongnước

Các nghiên cứu chưa tập trung vào kháng sinh của vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn, mục tiêu nghiên cứu không phải là chất kháng khuẩn như cellulase của các chủng thuộc chiStreptomycesphân lập từ phế thải rơm rạ, mùn gỗ ở Hà Nội (Nguyễn Thế Trangvàctv.,2015);nguồnphânlậpdàntrảinhưStreptomycesphânlậptừcâybưởicó khả năng kháng khuẩn (Phan Thị Hồng Thảo vàctv., 2016), phân lập và định danh loàiStreptomycesflaveuscóhoạttínhkhángkhuẩntừđấtvùngventhànhphốHồChíMinh (Phan Thị Huyền vàctv., 2015) Yếu tố biển thể hiện trong nghiên cứu của Trần Vũ Phương và Cao Ngọc Điệp (2021), phân lập từ hải miên, thu được 130/198 dòng vi khuẩn sợi có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Trong đó, có 23 dòng kháng được từ hailoạivikhuẩnthửnghiệmtrởlênvà69,6%cácdòngvikhuẩnsợinàymanggenpksI; thành phần chất kháng khuẩn được phân tích GC-MS phát hiện gồm có các hợp chất siloxane, phthalate và độc đáo là Thymine trước đây chỉ biết đến như một nucleotide bình thường nhưng được công bố tính năng kháng khuẩn bởi Bayehet al.(2019).

Như vậy, kháng sinh rất đa dạng về nguồn gốc, cấu trúc hóa học, và cơ chế tác dụng.P h ầ n lớnkhángsinhdovikhuẩnsợitạoratrongquátrìnhsinhtrưởngvàtraođổi chất có vai trò to lớn trong điều trị bệnh Vấn đề kháng thuốc đặt ra nhu cầu tìm kiếm cácchấtkhángkhuẩnmớimàtrongđócácloàivikhuẩnsợitừmôitrườngbiển,lànguồn nghiêncứurấttiềmnăng.ChivikhuẩnsợiStreptomycesvẫntiếptụcgiữvaitrònổibật, xuấthiệnnhiềunhấttrongcácphânlậpvàcungcấpnhiềuchấtmangtínhứngdụngcao.

1 Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ2 Phân lập, sàng lọc vi khuẩn sợi

3 Kiểm tra và thu nhận VKS có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh4 Định danh dòng VKS căn cứ theo trình tự đoạn gen 16S rDNA, lập giản đồ phân nhóm

5 Khảo sát sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps)

6 Chọn dòng VKS để thu nhận sinh chất và phân tích thành phần bằng CG-MS

Thời gian và địa điểmnghiêncứu

Thời gian thực hiện các nội dung thí nghiệm bắt đầu từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 12 năm 2021 và phân tích dữ liệu đến tháng 01 năm 2022.

Thu thập mẫu đất tại rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, nghiêncứu,sửdụngcácdụngcụ,trangthiếtbịvàcơsởvậtchấtcótạiPhòngthínghiệm Vi sinh vật

Môi trường và Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học CầnThơ.

Chương trình nghiên cứu toàn thể theo các giai đoạn như Hình3.1.

Hình 3.1: Sơ đồ chương trình nghiên cứu toàn thể đềtài

Phương tiệnnghiêncứu

Nguyênvậtliệu

Mẫu đất được thu trải rộng trên địa bàn 6 xã của huyện Cần Giờ là xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Lý Nhơn, xã Tam Thôn Hiệp, xã Cần Thạnh và xã Thạnh An.

Mẫu đất chuyển về Đại học Sài Gòn trong ngày để trữ trong tủ lạnh - 4 o C, trước khi chuyển về Cần Thơ để phân lập vi khuẩn sợi Trong thời gian chuyễn mẫu về CầnThơ, mẫu đất luôn được trữ trong các thùng trữ lạnh với nước đá xay nhỏ để đảm bảo mẫu đấtđượctốtđồngthờihạnchếtácđộngbấtlợiđếnhệvisinhvậttrongmẫu.(Cácxãcó mẫu đất thu thập được liệt kê trong Bảng 3.1 Vị trí địa lý trên bản đồ như Hình3.3).

*Dòng vi khuẩn gây bệnh trên người

Các dòng vi khuẩn gây bệnh dùng để thử nghiệm được cung cấp bởi Trung tâm

Kỹ thuật, Tiêu chuẩn và Chất lượng (Sở Khoa học Công nghệ) Cần Thơ, Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, Trung tâm Xét nghiệm Động Thực vật xuất khẩu vùng 6 (trụ sở tại Thành phố Cần Thơ) và lưu trữ tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, Viện NCPT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ:

- Vibrio paraheamolyticus(từ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học CầnThơ)

Bảng 3.1: Danh sách mẫu đất theo tên các xã tại huyện Cần Giờ

STT Tên mẫu (xã) Loại cây STT Tên mẫu (xã) Loại cây

1 Tam Thôn Hiệp Đước 20 An Thới Đông 4 Chà Là

2 Tam Thôn Hiệp Đước 21 An Thới Đông 5 Mắm

3 Tam Thôn Hiệp Đước 22 An Thới Đông 6 Dá

4 Tam Thôn Hiệp Đước 23 An Thới Đông 7 Vẹt

5 Tam Thôn Hiệp Đước 24 Long Hòa 1 Đước

6 Thạnh An Đước 25 Long Hòa 2 Đước-Dà

7 Thạnh An 3 Đước 26 Long Hòa 3 Đước

8 Thạnh An 4 Đước 27 Long Hòa 4 Đước Dà

9 Thạnh An Đước 28 Long Hòa 5 Dà

10 Thạnh An Đước-Mắm 29 Long Hòa 6 Đước

11 Lý Nhơn 2 Bần 30 Cần Thạnh 1 Đước-Mắm

12 Lý Nhơn 3 Chà Là 31 Cần Thạnh 2 Bần

13 Lý Nhơn 5 Giá 32 An Thới Đông 8 Đước

14 Lý Nhơn 6 Dà 33 An Thới Đông 9 Đước

15 Lý Nhơn 7 Cóc Trắng 34 AnThới Đông 10 Đước

16 Lý Nhơn 8 Đước 35 AnThới Đông 11 Đước

17 An Thới Đông 1 Đước 36 AnThới Đông 12 Đước

18 An Thới Đông 2 Bần 37 AnThới Đông 13 Đước

Thiết bị -dụngcụ

Thiết bị - dụng cụ: buồng đếm hồng cầu Thoma (Isolab, Đức), kính mang vật (lame) và kính đậy vật (lammelle) (Greetmed, Trung Quốc); kính hiển vi (Olympus BH2,BX41TF,Japan);pHkế(Schott,Đức),máyvortex(IKAShakers3MS,Đức),máy đoOD(Hitachi,Nhật),máylắcủEppendorf(ThermoStatPlus,Đức),tủlạnhđểtrữmẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ ủ vi sinh (SANYO, Japan); cân điện tử (Sartorius, Đức); microwave (SANYO, Japan); nồi thanh trùng nhiệt ướt (PBI, Italia); tủ cấy vô trùng (TELSTAR, Spain); tủ lạnh (SANYO, Japan) Máy nghiền mẫu Retsch MM

200 (Đức), máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức), máy hút chân khôngConcentrator5301(Đức),tủlạnhgiữmẫuLC-743H(Alaska,ViệtNam),bộđiện di một chiềuBioRad, máy đọc và chụp hình gel BioRad UV 2000 (Mỹ), cân điện tử Sartorius (Đức), máyPCR Perkin Elmer 9700 (Mỹ), máy đo quang phổ BeckmanCoulterDU640B(Mỹ),máygiảitrìnhtựABI3130,máyvitínhphântíchvàlưutrữsố liệu, hệ thống sắc ký với máy GCMS QP2010 Shimadzu (Nhật) và một số dụng cụ phổ biến khác trong phòng thí nghiệm vi sinhvật.

Hóa chất –môi trường

Môi trường SCA dùng để nuôi cấy vi khuẩn sợi, đồng thời có bổ sung kháng sinh Aginalxic (0,5 mg/L) và Nystatin (0,5 mg/L) vào môi trường để hạn chế nhiễm nấm. Bảng 3.2: Thành phần cho 1 Lít môi trường Starch Casein Agar (SCA)

Thêm nước biển qua lọc cho vừa đủ 1 Lít pH: 6,9 - 7,1

Môi trường LB là môi trường dùng để nuôi các dòng vi khuẩn ly trích DNA và vi khuẩn thử nghiệm.

Bảng 3.3: Thành phần cho 1 lít môi trường Luria Bertani (LB)

Thêm nước cất cho vừa đủ 1 Lít

Môi trường Mueller-Hinton Agar được dùng để kiểm tra khả năng kháng của các dòng vi khuẩn sợi đối với các vi khuẩn thử nghiệm.

Bảng 3.4: Thành phần cho 1 Lít môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA)

Thêm nước cất cho vừa đủ 1 Lít

Crystal violet, Lugol, cồn 96%, safranin.

Hóa chất để tinh sạch DNA của vi khuẩn sợi

Hóa chất tinh sạch DNA gồm: TE pH8, SDS 10%, isopropanol 100%, ethanol 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7 M, proteinase K (10 mg/mL), nước cất hai lần vô trùng, chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1).

Hóa chất dùng trong phản ứng PCR (bộ kit của hãng BioLine, Mỹ)

PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4), polymerisation MgCl2(25 mM),dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP), BSA (10 mg/mL), Taq DNApolymerase (500 u, 5 u/L), nước cất khửion.

Hóa chất dùng trong điện di sản phẩm PCR

Agarose 1,5%, TAE buffer 1X, loading buffer, Safe view, thang chuẩn 100bp(Invitrogen TM 15628019).

Phương phápnghiêncứu

Thu thập và xửlýmẫu

Cácmẫuđấtthuthậpmộtcáchngẫunhiên,cáchgốccâyngập mặn(đước,sú,vẹt, mắm) từ 50-70 cm với trọng lượng ít nhất 1 kg/mẫu bằng cây bay thợ hồ, đất được cho vào bọc nylon vô trùng, trước và sau khi lấy mẫu, dụng cụ lấy mẫu được rửa sạch và khửtrùngbằngcồn90%đểtránhnhiễmchéo.Bọcchứamẫuđấtđượcghikýhiệu(thông tin về địa điểm thu mẫu và đất vùng rễ của loại cây ngập mặn), bọc chứa mẫu đất được trữtrongthùngtrữlạnhvớinướcđáxaynhỏđểbảovệcácvisinhvậtsốngsóttốttrong đất (Hình 3.2).

Hình 3.2: Một khu vực lấy mẫu: Cây đước với đất vùng rễ

Hình 3.3: Bản đồ huyện Cần Giờ và vị trí lấy mẫu (các điểm màu tím đỏ theo định vị của Ban

Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ)

Phân lập và nuôi cấy vikhuẩn sợi

Phân lập được các dòng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ.

3.3.2.2 Các bước tiến hành thínghiệm

Mẫu đất được lấy ra khỏi tủ bảo quản lạnh, cân lấy 1g mẫu đất ướt (sau khi đo độ ẩm trong đất) cho vào bình tam giác với 99 ml nước cất vô trùng, lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 60 phút Dung dịch trên được tiến hành pha loãng theo hệ số 10 -1 đến

Hình 3.4: Quy trình pha loãng mẫu đất với nước cất vô trùng Để lắng khoảng 3 giờ, lần lượt hỳt lấy 20 àL dung dịch ở cỏc độ pha loóng 10 -

3đến 10 -5 trải đều trên đĩa petri có môi trường SCA Các đĩa petri được để khô và ủ ở

Sau 24 – 48 giờ, các khuẩn lạc của nhiều vi sinh vật khác nhau bắt đầu xuất hiện trên bề mặt môi trường Sau 7 – 10 ngày, khuẩn lạc của vi khuẩn sợi xuất hiện Các khuẩn lạc này được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường mới nhiều lần đến khi xuất hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc rõ ràng nhất (3 - 6 tuần),kiểm tra bằng cách quan sát dưới kính hiển vi Sau đó, táchcấyvi khuẩn sợi vào môi trường trênốngnghiệmđểtrữởtủlạnh4-5 o Cvàtồntrữdàihạnvớiglycerol15%ở-80 o Cvà xem như 1 chủng (isolate) (Hình3.5).

Hình 3.5: Quy trình cấy chuyển để tạo 1 khuẩn lạc riêng và trữ như 1 chủng.

Nuôi cấy vi khuẩn sợi trên môi trường phân lập, sau 7-10 ngày, tiến hành đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bằng mắt thường bao gồm các chỉ tiêu như sau: màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nổi và dạng bìa.

- Màu sắc khuẩn lạc (trắng, nâu, xám,cam…);

- Hình dạng khuẩn lạc (tròn,thoi…);

- Kích thước khuẩn lạc (đường kính trung bình của khuẩnlạc);

Khi khuẩn lạc vi khuẩn sợi nuôi trên môi trường phân lập đạt mức ròng (thuần), tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần bằng phương pháp giọt ép đồng thời ghi nhận hình thái tế bào với các tiêu chí sau:

- Sự chuyển động (có chuyển động, không chuyểnđộng)

- Hình dạng tế bào (cầu, que, kết chuỗi,…)

- Que ngắn: nếu dài 1-3 àm, que dài: nếu > 3àm.

Sau khi quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc, tiến hành nhuộm Gramcác dòngvikhuẩnsợivàquansátdướikínhhiểnviquanghọccóđộphóngđại400lần.Cấu tạothànhtếbàocủavikhuẩnsợigiốngvớivikhuẩnGramdươngnênkhinhuộmGram sẽ cho kết quả màu xanh hoặc tím (Hình3.6).

Hình 3.6: Phân loại khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn

Đánh giá khả năngkhángkhuẩn

3.3.3.1 Mục tiêu thínghiệm Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi phân lập từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, tuyển chọn được các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với vi sinh vật thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo phương pháp của Galindo (2004).

3.3.3.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn sợi phân lập được:

Cấy chuyển các dòng vi khuẩn sợi từ môi trường thạch sang ống nghiệm có chứa

15 mL môi trường Starch Casein lỏng tương ứng.

Cácốngnghiệmnuôicấycácdòngvikhuẩnsợiđượcủtrênmáylắcvớitốcđộlắc là 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30 o C, trong thời gian là 14ngày.

Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA cho các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm.

- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn gây bệnh thửnghiệm:

Nhân nuôi các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm trên môi trường LB (trong 24-

48 giờ) để thu sinh khối;

Pha loãng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm để được mật độ là 10 6 CFU/mL.

- Chuẩn bị kháng sinh đốichứng:

Các dòng vi khuẩn gây bệnh chỉ thị khác nhau cần những loại kháng sinh khác nhau; 2 loại kháng sinh được sử dụng là streptomycine và tetracycline.

Cõn và pha loóng khỏng sinh với nước cất vụ trựng đến nồng độ là 15 àg/mL.

- Tiến hành trải các vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm với mật độ 10 6 CFU/mL lên môi trường MHA bằng tăm bông vôtrùng.

- Dùng1corerthépkhôngrỉtiệttrùngbằngcáchhơtrênngọnđèncồnđểkhoan lỗ, tạo các giếng thạch có đường kính 6 mm trên các đĩa có trải vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm.

- Hút 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn sợi trong ống falcon cho vào tube 2,2 mL vô trùng Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15phút.

- Lọc bỏ phần cặn, lấy phần dịch nổi cho vào tubemới.

- Hỳt50àLdịchnổitừtubetrờn,nhỏvàogiếngkhoanlỗsẵntrờnmụitrườngcú trảicácdòngvikhuẩngâybệnhthửnghiệm;mỗidòngvikhuẩnsợilặplại3lần(tương ứng 3giếng).

- Hỳt 50 àL khỏng sinh pha loóng nhỏ vào 1 giếng thạch làm đối chứngdương.

- Hỳt 50 àL nước cất (vụ trựng) nhỏ vào 1 giếng thạch làm đối chứngõm;

Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn sợi phân lập được thông qua sự hiện diện vòng vô khuẩn xung quanh các giếng thạch có chứa dịch nuôi cấy của cácdòngvikhuẩnsợithửnghiệm.Chọncácdòngvikhuẩnsợicókhảnăngkhángkhuẩn (thông qua kích thước của vòng vô khuẩn) để tiến hành đánh giá, tuyểnchọn.

Quan sát, ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ trên đĩa thạch theo công thức sau đây: Đường kính vòng kháng khuẩn = D - d (mm).

Với: “D”: đường kính vòng kháng trên đĩa thạch và lỗ, “d”: đường kính của lỗ đục sẵn trên đĩa thạch.

So sánh tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng căn cứ vào quy ước của Galindo (2004) (Bảng 3.5) và khả năng kháng được nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh.

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn (Galindo, 2004)

TT Vòng kháng khuẩn (mm) Mức độ kháng Ký hiệu

Số liệu kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab

Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh họcphân tử

Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao được tuyển chọn với cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-

0878-a-A-19 chuyên biệt cho vi khuẩn sợi (Stachet al.,2003; Sunet al.,2015) Thông qua trình tự đoạn gen, so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, kết hợp với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, các đặc điểm về hình thái tế bào, đặc điểm sinh học của tế bào, đề xuất được tên của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn và khảo sát mối liên hệ di truyền của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn.

Theo Breugelmanset al (2004), trích DNA vi khuẩn sợi theo các bước sau:

- NuôitừngdòngvikhuẩnsợitrongmôitrườngLBởnhiệtđộ30 o C,trênmáylắc với tốc độ lắc

- Chuyển dịch vi khuẩn từ ống nghiệm nuôi cấy sang 2 tuýp Eppendorf 2mL.

- Ly tâm tuýp Eppendorf trên với tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 10 phút, loại bỏ phầnnước.

- Hỳt 250 àL dung dịch TE pH = 8,0 cho vào tuýp trờn Dựng tay xoay trũn ống nghiệm để đánh tan sinhkhối.

- Thờm vào 50 àL SDS 10% để phỏ vỡ màng tếbào.

- Tiếp theo thờm 10 àL proteinase K/10 mg/mL để tỏch protein khỏiDNA.

- Ủ ở 65 0 C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp mộtlần.

- Thờm vào 400 àL CTAB 10% 0,7 M NaCl, trộnđều.

- Thờm vào 600 àL chloroform: isoamyl alcohol(tỷlệ 24: 1) để tủa protein và tạo màng ngăn giữa DNA và protein, trộnđều.

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 10phút.

- Chuyển phần dịch trong phía trên sang tuýp Eppendorf 1,5 mL mới, nhẹ nhàng cẩn thận tránh làm vỡ màngngăn.

- Kế tiếp thêm vào 1 mL isopropanol để kết tủa DNA, trộn đều Giữ tuýp ở

- Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần nước.

- Sauđó,rửaDNAvới1mLethanol70%,lytâmở12.000vòngtrong5phút.

- Ly tâm chân không 15-20 phút ở 4 o C để loại bỏ hếtethanol.

- Hũa tan DNA trong 30 àL nước cất 2 lần (Bi -H 2 O).

- Đo nồng độ DNA hoặc điện di trên gel agarose 0,8 % để kiểm tra chất lượng DNA.

- Trữ lạnh -20 o C để bảo quảnDNA.

*Phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA (sử dụng bộ Kit PCR BioLine, Mỹ)

Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn sợi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act- 0878-a-A-19 (Stachet al.,2003; Sunet al.,2015):

Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C- Act-0878-a-A-19

PCR buffer (10X Taqbuffer (NH4)2SO4) 2,5

Polymerisation MgCl2(25mM) 2 dNTPs (dATP, dTTP,dGTP, dCTP) 4

Thực hiện phản ứng PCR theo chukỳnhư sau: 95°C trong 4 phút, 30 chukỳgồm 95°Ctrong45giây,ở68°Ctrong45giây,72°Ctrong1phútvàhoàntấtcuốicùngtrong 5 phút ở 72°C (Hình3.7).

Hình 3.7: Chương trình nhiệt độ của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA Điện di

Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di một chiều trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, ở hiệu điện thế 150 V trong khoảng 30 phút, quan sát dưới đèn UV và chụp hình Sử dụng thang chuẩn 100 bp plus để ước lượng kích thước của các sản phẩm PCR (lưu giữ ở nhiệt độ 4 o C nếu chưa sử dụng).

Các mẫu DNA sau khuếch đại được gửi để phân tích trình tự nucleotide, do Công ty CP Công nghệ TBR, TP.Hồ Chí Minh thực hiện.

Kết quả trình tự nucleotide các đoạn gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn sợi được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN Kết hợp với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc điểm sinh học của tế bào, để đề xuất têncủacácdòngvikhuẩnsợiđượctuyểnchọn.Đồngthời,khảosátcácmốiquanhệdi truyền bằng tính năng CLUSTALX, version 1.8 và phần mềm Mega với hệ số bootstrapping 1000lần.

Hình 3.8: Sử dụng hệ thống điện toán để giải trình tự và so sánh định danh vi khuẩn sợi

Khuếch đại gen mã hóa PKS-I,PKS-II,NRPS

Khảo sát sự hiện diện của các gen polyketide synthase týp I (pksI), polyketide synthase týp II (pksII) và gen nonribosomal polyketide synthetase (nrps) bằng kỹ thuật

PCRvớicáccặpmồichuyênbiệtlầnlượtlàA3F/A7Rchogennrps,K1F/M6RchogenpksIvà cặp mồi KSαF/KSαR cho genpksII Các genpksI, pksIIvànrpscó vai trò làm chỉthịchohoạtđộngsảnxuấtcáchợpchấtthứcấpcóhoạttínhsinhhọc,đặtbiệtlàcác chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi Vì vậy, việc sàng lọc và đánh giá sự có mặt của nhóm gen này là rất cần thiết để đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các dòng vi khuẩn sợi được tuyểnchọn.

Thực hiện giống như mục 3.3.4.2.

*Phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA (sử dụng Kit PCR BioLine, Mỹ) Gen pksI

Sử dụng cặp mồi K1F/M6R (Ayuso-Sacido và Genilloud, 2005):

Bảng 3.7: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi K1F/M6R

ThựchiệnphảnứngPCRtheochukỳsau:95°Ctrong5phút,30chukỳgồm94°C trong 1 phút, ở 57°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút và hoàn tất cuối cùng trong 5phút ở72°C.

Sử dụng cặp mồi KSαF và KSαR (Metsa-Ketelaet al.,2002):

Bảng 3.8:Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi KSαF và KSαR

Sử dụng cặp mồi A3F/A7R (Ayuso-Sacido và Genilloud, 2005):

Bảng 3.9: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi A3F/A7R

Tất cả các sản phẩm của các phản ứng PCR đều được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5% (lưu trữ ở nhiệt độ 4 o C nếu chưa sử dụng).

Phân tích hình ảnh kết quả điện di các sản phẩm của phản ứng PCR để nhận diện sự xuất hiện các gen khảo sát của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn.

GenpksI: Ghi nhận có sự xuất hiện (+) của genpksIkhi kết quả điện di sản phẩm PCR được thực hiện với cặp mồi K1F/M6R có xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 1200 - 1400 bp Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêu trên.

GenpksII:Ghinhậncósựxuấthiện(+)củagenpksIIkhikếtquảđiệndisảnphẩm PCR được thực hiện với cặp mồi KSαF/KSαR có xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 600 bp. Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêutrên.

Gennrps: Ghi nhận có sự xuất hiện (+) của gennrpskhi kết quả điện di sảnphẩmPCR được thực hiện với cặp mồi A3F/A7R có xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 700 - 800 bp Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêutrên.

Xácđịnhcáchợpchấtcóhoạttínhsinhhọcđượcsảnxuấttừvikhuẩnsợitiềm năng đượctuyểnchọn

Từnhữngkếtquảcủacácnộidungnghiêncứutrên,tuyểnchọn1-2dòngvikhuẩn sợi tiềm năng nhất với hai tiêu chí là kháng được nhiều loại vi sinh vật thử nghiệm và mangnhiềugenchỉthịkhángsinhđểnhânnuôithunhậnhoạtchất.Thựchiệnphântích, xácđịnhcácchấtcóhoạttínhsinhhọc,đặtbiệtlàhoạttínhkhángkhuẩn,đượcsảnxuất bởi dòng vi khuẩn sợi tiềm năng đượcchọn.

3.3.6.2 Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩnsợi.

Dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn được nuôi với trong môi trường Starch Caseinlỏng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, 30 o C trong 7ngày.

3.3.6.3 Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi với ethylacetate

Các hợp chất trong dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi được chiết theo phương pháp chiết tách lỏng – lỏng bằng dung môi ethyl acetate, thực hiện theo quy trình được trình bàyởHình3.9.

Bước 2: Tách mẫu lần 1:Thực hiện trong bình tách chiết quả lê

Lắc đều rồi để bình lên giá cho tách lớp, xả tách phần dung dịch mẫu bên dưới, thu phần dung môi ethyl acetate ở trên bình

Tách mẫu lần 2 và lần 3:Thực hiện trong bình tách chiết quả lê Lấy dịch mẫu sau tách chiết lần 1 tiếp tục thêm ethyl acetatetỷlệ2:1 Tiếp tục thực hiện chiết tách như lần1

Bước 3: Lọc phần dung môi tách được với giấy lọc

Bước 4: Cô quay phần dung môi sau lọc bằng hệ thống cô quay chân không, với nhiệt độ

1 mm xung quanh giếng thạch có trải vi sinh vật thử nghiệm theo quy ước của Galindo (2004), quy ước này từng được sử dụng để khảo sát tính kháng khuẩn của vi khuẩn sợi (Đỗ Thu Hà, 2004) và cả nấm (Nguyễn Thị Hà,2014).

Theo quy ước này, các dòng vi khuẩn sợi phân lập được trong luận án đều có tính khángkhuẩntừyếuđếnmạnh,trongđómứctrungbìnhchiếmđasố.Cácdòngvikhuẩn sợi có tính kháng mang kí hiệu là: THANHAN 4.4, THANHAN 4.5, ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 3.2, ANTHOIDONG 3.4, ANTHOIDONG 4.1,A N T H O I D O N G

Sốlượngcácdòngvikhuẩnsợikhángvớitừngloạivisinhvậtkhảosátcósựkhác nhau, tùy thuộc vào loại vi sinh vật khảo sát Có 8 dòng kháng lại vi khuẩn gây bệnhBacillus cereus(nhiều nhất), 6 dòng kháng lại vi khuẩn gây bệnhStaphylococcusaureus,4dòngkhánglạivikhuẩngâybệnhEscherichiacolivàsốlượngítnhấtlà kháng lại vi khuẩn gây bệnhVibrio parahaemolytycus(3 dòng) (Hình 4.5) Tương tự, mức độ kháng từ “không kháng” đến “kháng mạnh”, thay đổi theo loại vi khuẩn khảo sát gây bệnh truyền nhiễm ở người (Hình4.6).

Trong đó có 3 dòng mang ký hiệu ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng được cả 4 loài vi khuẩngâybệnh Ngoài ra, dòng ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng mạnh hai loại vi khuẩngâybệnh cho ngườiBacillus cereusvàStaphylococcus aureus(kích thước vòng vô khuẩn tương ứng lần lượt là 15 mm và 35 mm) đồng thời kháng mạnh cả vi khuẩnVibrioparahaemolyticusgâybệnhtrêncátranuôivớikíchthướcvòngvôkhuẩnlầnlượtlà2

1 mm và 17 mm (Hình 4.7, Hình4.8).

Hình 4.5: Số lượng dòng vi khuẩn sợi kháng được các vi sinh vật thử nghiệm

Hình 4.6: Số lượng dòng vi khuẩn sợi theo độ kháng với các vi sinh vật thử nghiệm.

A:Staphylococcus areus,B:Bacillus cereus,C:Vibrio parahaemolyticus,D:Escherichia coli

A B C D Đối chứng: A:Staphylococcus areus(Streptomycin), B:Bacillus cereus(Streptomycin),C:Vibrioparahaemolyticus(Tetracyclin),D:Escherichia coli(Tetracyclin)

Hình 4.7:Hoạt tính kháng khuẩn của dòng ANTHOIDONG 7.1 ức chế các vi khuẩn:

Staphylococcus areus(A),Bacillus cereus(B),V parahaemolyticus(C) vàE coli(D).

Hình 4.8: Hoạt tính kháng khuẩn của dòng ANTHOIDONG 4.1 ức chế các vi khuẩn

Bacilus cereus, E colivàS.aureus(lần lượt từ trái sang phải)

Các dòng vi khuẩn sợi này (10 dòng) được chọn để tiếp tục nhận diện bằng kỹ thuật PCR và tiếp đến giải trình tự gen 16S rDNA, so sánh với ngân hàng dữ liệu củaNCBI bằng phần mềm BLAST N để tìm mức độ (%) tương đồng với dòng vi khuẩn chuẩn, song song đó là quan sát hình thái hiển vi bằng kính hiển vi điện tử quét(SEM).

Kết quả định danh và cây phả hệdi truyền

Định danh các dòng vi khuẩn sợi khángkhuẩn mạnh

Các đoạn gen 16S rDNA (1050-1225 bp) của 10 dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn tốt được chọn để tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự Qua kiểmtra sựtươngđồngcaonhấtvềtrìnhtựgen16SrDNAcủacácdòngđượcchọnsovớiNgân hàng gen của NCBI (bằng ứng dụng BLAST) cho thấy hầu hết chúng (8 trên 10 dòng phânlập)cósựtươngđồngvớitrìnhtựcủachiStreptomycescònlại2dòngphânlập thuộc chi khác (Stenotrophomonas) nên được loại trừ trong các thí nghiệm tiếp theo (Bảng 4.4).

Bảng 4.4: Mức tương đồng di truyền dựa trên trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn sợi,sử dụng chương trình BLAST trong cơ sở dữ liệu GenBank Độ

Dòng vikhuẩn sợi Loài tương đối gầnnhất tương đồng (%)

ANTHOIDONG11.1 MT072138Streptomyces laurentiistrain QT214 98,7

EU593580Streptomyces tanashiensisstrain 173004 97,6 ANTHOIDONG7.1 HQ607433Streptomyces albogriseolusstrain1168 99,4

ANTHOIDONG3.1 MW217198Streptomyces parvulusstrain DSD2596 98,8

MH472998Streptomyces africanusstrainE3SQ 97,7 MK368443Streptomyces sp.strainMUM203J

97,6THANHAN4.4HM594286Streptomyces tendaestrainM23 97,4MN339840Streptomycessp strainMGB2769 97,4

Bên cạnh đó, giản đồ phân nhóm di truyền (cây phả hệ) được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood (Hình 4.9) để khảo sát mối liên hệ di truyền giữa cácdòngvikhuẩnsợi.Kếtquảchothấy,câyphảhệcủa8dòngvikhuẩnsợitrongbảng trên có hai cụm (cluster) Cụm A có 6 dòng, trong đó lại có 2 cụm nhỏ hơn là cụm A1 với 4 dòng được chia tiếp thành 2 nhóm nhỏ hơn nữa: cụm A1.1gồmStreptomyces tendaeTHANHAN4.4vàStreptomycestanashiensisANTHOIDONG3.2vàcụmA1.2 gồm 2 chủng:Streptomyces aegyptiaANTHOIDONG 6.1 vàStreptomyces laurentiiANTHOIDONG 11.1; còn lại 2 nhánh riêng với 2 dòng làStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 vàStreptomyces africanusLONGHOA 4.2 Cụm B chỉ có 2dòng:Streptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1 vàStreptomyces parvulusANTHOIDONG3.1.

Hình4.9:GiảnđồphânnhómđượcdựngbằngphươngphápMaximumLikelihoodcăncứtheo đoạn trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn sợi được phân lập từ đất rừng ngập mặnCần Giờ Các giá trị bootstrap được tính toán cho 1000 lần lặplại.

Kết quả trình bày ở cây phả hệ cho thấy các dòng vi khuẩn sợi có khả năng phân nhómtheovịtríđịalý.CácdòngphânlậptừtrongmộtphạmvilàxãAnThớiĐôngcó quan hệ di truyền gần nhau, thể hiện ở cùng cụm phát sinh hoặc cụm gần nhau Một dòngphânlậptừxãLongHoaxuấthiệnởmộtnhánhriêngcủacụmA,xãLongHoacó tiếp giáp địa lý với xã An Thới Đông Trong khi đó, có một dòng vi khuẩn sợi phân lập tạixãđảoThạnhAn,cáchxakhuvựcnộiđịa,xuấthiệnởnhánhriêngcủacụmphụA1, có thể có ít quan hệ di truyền với các dòng cònlại.

Các dòng vi khuẩn sợi có tính kháng khuẩn phân lập được đều cho kết quả định danh thuộc chiStreptomyces ChiStreptomycesvà các chi vi khuẩn sợi có quan hệ di truyền gần với chi này được nhiều tài liệu (Bérdy, 2005 và Honget al., 2009) ghi nhận có khả năng tạo ra nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp, là một nguồn phong phú cho sự phát triển thành công của thuốc kháng sinh mới Ngoài tính năng kháng khuẩn, cáchợp chất thứ cấp được nghiên cứu khác chứng minh là chất ức chế miễn dịch (FK-506, rapamycin, ascomycin), làm thuốc chống ung thư hợp chất (bleomycin, dactinomycin, doxorubicin,staurosporin),cáchợpchấtchốngnấm(amphotericinB,nystatin),chấtdiệt cỏ (phosphinothricin), kể cả điều trị bệnh tiểu đường (acarbose) và chất tẩy giun sán (avermectin,milbemycin)(Hongetal.,2009).Trongsố12.000thứcấpchấtchuyểnhóa có hoạt tính kháng sinh được biết có 55% được sản xuất bởiStreptomycetesvà 11% do vi khuẩn sợi khác (Demain và Lancini, 2001) Tiềm năng của chi này vẫn rất lớn vì chỉ mới báo cáo được 3% trong số tất cả các tác nhân kháng khuẩn được tổng hợp bởiStreptomycetes(Watveetal.,2001).Nhưvậy,cònlạimộtlượnglớncácloạithuốcmới chưa được phát hiện và sẽ được tạo ra bằng các phương phápmới.

Kết quả của đề tài thể hiện rừng ngập mặn Cần Giờ của Việt Nam là nguồn tài nguyênStreptomycesnhư các địa phương khác trên thế giới Rừng ngập mặn ở Sabah, Malaysiaphânlậpđược76,9%(20trên26dòngvikhuẩnsợi)làthuộcchiStreptomycesvà có 1 dòng thuộc loàiStreptomyces albogriseolus(Png và Lee, 2020) Tại bờ biển nam Trung Quốc, thu nhận được 17 loài thuộc chiStreptomyces, chiếm ưu thế hơn các chi khác trong đất rừng ngập mặn (Gonget al., 2018) Kết quả này tương đồng với nghiên cứu trước đây (Liaoet al., 2016), luôn có sự xuất hiện và chiếm đa số của chiStreptomycestrongcác dòngvikhuẩnsợi(7trên9dòng)phânlậpđượcdùnguồnphân lập khác biệt hoàn toàn (nước biển sâu ở BắcCực).

Về khả năng kháng khuẩn, các nghiên cứu từ trước theo thống kê của Barkaet al.

(2016)xácđịnhchiStreptomyceslànguồnsảnxuấtkhángsinhnhiều nhấtsovớicácvi sinh vật khác Những hợp chất có cấu trúc độc đáo thu được từ các vi khuẩn sợi của rừng ngập mặn là nguồn tài nguyên tiềm năng cho việc tìm kiếm, xác nhận và sản xuất các chất kháng khuẩn và chất ức chế khối u (ung thư) (Liet al.,2013).

Hình thái của các chủng vi khuẩn sợiđược chọn

Tám dòng vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomycescó tính kháng khuẩn được chọn quan sát hình thái bằng kính hiển vi điện tử (SEM), kết quả như sau:

1) Vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1, trên môi trường nuôi cấy khuẩn lạc của chúng có màu trắng xám, hình tròn, nhiều tia xung quanh Bào tửcónhiềugaitrênbềmặtvàcácônốithànhchuỗidướikínhhiểnviđiệntửphóngđại 8500 lần (Hình4.10).

Vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavuslần đầu tiên được phân lập tại đất Nhật Bản và vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavustổng hợp aureothricin và đồng thời chúngcókhảnăngphângiảicellulose(Haseenaetal.,2016).Trongđềtài,vikhuẩnsợiStreptomyc es celluloflavusANTHOIDONG 4.1 có khả năng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh cho người nhưVibrio parahaemolyticus,Escherichia coli,StaphylococcusaureusvàBacilluscereusvàđâylàchủngvikhuẩnsợicókhản ăng phân hủy CMC mạnh nhất (thí nghiệm không được trình bày vì ngoài nội dung nghiên cứu của luận án).

Hình 4.10: Khuẩn lạc (A) và chuỗi bào tử (B) của dòngStreptomyces celluloflavus

ANTHOIDONG 4.1 dưới kính hiển vi điện tử.

2) Dòng vi khuẩn sợiStreptomyces aegyptiaANTHOIDONG 6.1 trên môitrường nuôi cấy có khuẩn lạc màu trắng, hình tròn, nhiều tia xung quanh Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét, vi khuẩn sợiStreptomyces aegyptiacó bề mặt bào tử nhẵn, nối thành chuỗi (Hình4.11).

Hình 4.11: Khuẩn lạc (A) và các chuỗi bào tử (B và C) của dòngS aegyptiaANTHOIDONG

6.1 dưới kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn sợiStreptomyces aegyptiađược phân lập từ đất của tỉnh Dakahliyah, AiCập, chúng có khả năng phân giải cellulose cao (El-Naggaret al.,2011) Đồng thời chúng tạo ra enzyme cholesterol oxidase, chống ung thư ở mức độ thử nghiệm, chống nhiễm trùng, ức chế ung thư vú và hiện tượng tự chết của tế bào (apoptosis) trong điều kiệnin vivo(El-Naggaret al., 2018) Vi khuẩn sợiStreptomyces aegyptiatổng hợp các hạtnano-Agứcchếvikhuẩnlàhạtnanothânthiệnvớimôitrường(Osamaetal.,2014).

Trong nghiên cứu này, vi khuẩn sợiStreptomyces aegyptiaANTHOIDONG 6.1 có khả năng đối kháng tốt với vi khuẩn gây bệnhBacillus cereus.

3) Dòng vi khuẩn sợiStreptomyces laurentiiANTHOIDONG 11.1 có khuẩn lạc dạng hình tròn đồng tâm bao quanh bởi các tia Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩnsợiStreptomyceslaurentiiANTHOIDONG11.1cóbềmặtbàotửnhẵn,nốithành chuỗi (Hình4.12).

Hình 4.12: Khuẩn lạc (A) và chuỗi bào tử (B và C) của dòngS laurentiiANTHOIDONG

11.1 dưới kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn sợiStreptomyces laurentiiphân lập từ đất lần đầu tiên tại bang New Jersy, HoaKỳvà chúng có khả năng sản xuất kháng sinh Thiostrepton (Trejo-Astredaet al., 1998) có tác dụng hỗ trợ điều trị sốt rét và ung thư (Zhanget al.,2016) Trong nghiêncứunày,chủngvikhuẩnsợiStreptomyceslaurentiiANTHOIDONG11.1cókhả năng ức chế vi khuẩn gây bệnhBacilluscereus.

4) Dòng vi khuẩn sợiStreptomyces tanashiensisANTHOIDONG 3.2 có đặcđiểm khuẩn lạc màu trắng, hình tròn, mép cuộn tròn, cao, có gân, đường kính trung bình 6 mm; tế bào có hình tròn, nối với lò xo ngắn, không có chuyển động khi quan sát bằng kính hiển vi quang học thường; dưới kính hiển vi điện tử chuỗi bào tử hình dải, bề mặt của bào tử nhẵn (Hình4.13).

Hình 4.13: Khuẩn lạc (trái) và chuỗi bào tử (giữa và phải) của dòngStreptomyces tanashiensis

Vi khuẩn sợiStreptomyces tanashiensisđược phân lập từ đất rừng ngập mặn Maowei,TrungQuốc,cókhảnăngkhángtốtđốivớivikhuẩngâybệnhBacilluscereus(Luetal.,20 19).TheoJohnsonvàDietz(1968),vikhuẩnsợiStreptomycestanashiensistổng hợp và tiết ra luteomycin (kháng nấm), mithramycin (chống ung thư), phosphoramidon (ức chế enzym thermolysin từBacillusspp.) và kalafungin (kháng nấm, chống động vật nguyên sinh và kháng vi khuẩn Gram dương) Nghiên cứu của Singhetal.

(2009),chothấyvikhuẩnsợiStreptomycestanashiensiscókhảnăngứcchế cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, đồng thời kháng lại hai loài nấm bệnh làCandida albicansvàFusariummoniliform.

5) DòngvikhuẩnsợiStreptomycesalbogriseolusANTHOIDONG7.1cóđặcđiểm khuẩnlạchìnhtròn,mộtvòngđồngtâm,rìacuộntròn,caolênxungquanh,đườngkính khuẩnlạc5mm;tếbàocóhìnhtrònvàchuyểnđộngdướikínhhiểnviquanghọcthường; chuỗibàotửxoắn,bềmặtcủabàotửcógaikhiquansátdướikínhhiểnviđiệntử(Hình 4.14).

Hình 4.14: Khuẩn lạc (trái) và chuỗi bào tử của dòngStreptomyces albogriseolus

Vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseolusđược nhắc đến lần đầu tiên năm 1954, sauđó,Ikenakaetal.(1974)giảitrìnhtựacidamincủachấtứcchếungthưtừvikhuẩn sợiS. albogriseolus Ngoài ra, có nghiên cứu xác định vi khuẩn sợiS albogriseoluscó mộtenzymenhómproteasehỗtrợchoviệchoạthoáenzymetransglutaminasetáitổhợp được sản xuất bởi một vi sinh vật khác -Corynebacterium glutamicum(Kikuchiet al., 2003).Tươngtự,AryavàSharma(2016)chorằngvikhuẩnsợiS.albogriseoluskhikết hợp với vi khuẩn khác (Brevibacillus borstelensis) tạo được chất diệt nấm benzimidazole.VikhuẩnsợiStreptomycesalbogriseolusHA10002đượcphânlậptừđất rừng ngập mặn của Hải Nam, Trung Quốc có đặc tính nổi bật là vừa tạo được hợp chất gây chết tuyến trùng, từ đó vừa có thể bảo vệ cây trồng, vừa có hoạt tính kháng nấm men, nấm mốc (Zenget al.,2013).

Về khả năng kháng khuẩn, vi khuẩn sợiS albogriseoluscó khả năng sản xuấtMacrocyclicLactones,ứcchếvikhuẩngâybệnhStaphylococcusaureusvàEscherichia coli(Xuet al., 2014) Trong số những vi khuẩn sợi phân lập được tại rừng ngập mặn lưuvựcsôngMalta,ẤnĐộcóhoạttínhkhángkhuẩnđượcđịnhdanhcódòngvikhuẩn sợiS. albogriseolusNRRL B-1305 (Senguptaet al., 2015) Mặc dù Xieet al (2014) khẳng định bộ gen của vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseoluscó tiềm năng tổng hợp diterpenoid (một hợp chất có nhiều ứng dụng trong y học và cả nông nghiệp (Maet al., 2020) nhưng từ trước tới nay chỉ ghi nhận vi khuẩn sợiS albogriseolussản xuất polyketide và alkaloid và Maet al.(2020) lần đầu tiên thu nhận và phân tích được cấu trúc của diterpenoid từ loàinày.

Theo Qattan và Khattab (2019), vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseoluscòn có khảnăngsảnxuấtkhángsinhnhiềuhơnkhigặpđiềukiệnmôitrườngsốngbấtlợi.Bên cạnh đó, Shaoet al.(2019) xác định vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseoluscó khả năng sử dụng polyethylene làm nguồn carbon, điều này rất có ý nghĩa trong việc xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường Đặc biệt, Liet al.(2013) cho rằng dòng vi khuẩn sợiS.albogriseolusMGR072 mang cả gen mã hóa cho NRPS lẫn PKS-I, có khả năng tổng hợp ansamycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolide với nhiều đặc tính quý như kháng khuẩn, chống ung thu và chống cả virus Dòng vi khuẩn sợiStreptomycesalbogriseolusA2002 phân lập từ đất trầm tích biển vịnh Jiaozhou, Trung Quốc, được xác định có chứa 2 hợp chất echinosoprin, ức chế sự tăng sinh của nhiều dòng tế bào ungthư(2dòngtếbàoungthưởngườivà1dòngungthưtrênchuột)vàthậmchílàcó tác động lên quá trình tự chết của tế bào (Cuiet al.,2007).

Gần đây, dòng vi khuẩn sợiS albogriseolusECR64 (Thirumuruganet al.,2018) phân lập từ bờ biển phía đông của vùng Tamil Nadu, Ấn Độ, có năng lực kháng lại các vi khuẩn gây bệnh trên cá thuộc chiPseudomonas, Vibriovà cả chiAeromonas; hoạt tính ức chế rất mạnh thông qua việc sản sinh hợp chất methyl-4,8-dimethylundecanate, mởrakhảnăngứngdụngvàosảnxuấtthuốcphòngngừa,điềutrịbệnhtrongnuôitrồng thủy hải sản, mang lại lợi ích kinh tế cho ngành nông nghiệp Ngoài ra, nghiên cứu của Thirumuruganetal.(2018)cònghinhậnthêmmộtsốđặcđiểmsinhhóađángquýkhác của dòng vi khuẩn sợiS albogriseolusECR64 như phân giải được tinh bột, chitin, và khửnitrate.

Như vậy, loài vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseoluslà loài hữu ích cho nhiều lĩnhvựcliênquanđếnytế,nôngnghiệpvàmôitrường.Trongđềtàinày,dòngvikhuẩn sợiStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 ức chế được vi khuẩnVibrioparahaemolyticusgây bệnh trên thủy sản Kết quả này tiếp tục ghi nhận đặc tính kháng khuẩn tốt của loài vi khuẩn sợi này Rừng ngập mặn Cần Giờ, có sự tương đồng với những khu vực ngập mặn ven biển trên thế giới, sở hữu loài vi khuẩn sợi này, thật sựlà tiềmnăngtrongviệcthunhậncáchợpchấtthiênnhiênđểđiềutrịcácbệnhnhiễmtrùng, ung thư và rộng hơn nữa là có thể ứng dụng trong nhiều khía cạnh của đời sống Dòng vi khuẩn sợiS. albogriseolusANTHOIDONG 7.1 được quan tâm chọn lọc hàng đầu trong những thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứunày.

6) Dòng vi khuẩn sợiStreptomyces parvulusANTHOIDONG 3.1 có khuẩn lạccó màu nâu, hình tròn và 1 tia dài, rìa cong, cao, có gân, đường kính khuẩn lạc 5 mm; tế bào có hình cầu, có vân di động khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, bào tử kết thànhchuỗi;vikhuẩnsợiStreptomycesparvuluscóchuỗibàotửxoắnốc,bềmặtbàotử nhăn nheo dưới kính hiển vi điện tử (Hình4.15).

Hình 4.15: Khuẩn lạc (trái) và chuỗi bào tử của dòngStreptomyces parvulus

ANTHOIDONG 3.1 TrongcácmẫuphânlậptừrừngngậpmặnvùngTamilNaducủaẤnĐộ,vikhuẩn sợiStreptomyces parvulusđược ghi nhận là có khả năng kháng lại vi khuẩnBacillussubtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus fecalis, Pseudomonas aeruginosa, ProteusvulgaricusvàEscherichiacolikhithửhoạttínhkhángkhuẩnbằngphươngpháp khuếch tán giếng thạch (Ushaet al., 2010) Nghiên cứu của Ushaet al.(2010) cho thấy chủng vi khuẩn sợiS parvulusKUAP106 ngoài việc tạo được chất kháng khuẩn có thêm tính năng ức chế sự hình thành mạch máu, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư Hai nghiên cứu khác của Shettyet al.(2014) phân lập từ đất rừng ngập mặn Visakhapatnam, Bengal tại Ấn Độ, đều thu được 2 chủng vi khuẩn sợiStreptomycesparvulus Chủng vi khuẩn sợiS parvulusSSNP11 có khả năng tạo polypeptide kháng khuẩn(ActinomycinD)đểứcchế14loạivikhuẩngâybệnhchongười;chủngvikhuẩn sợiS. parvulusRSPSN2 tạo được Actinomycin D, kháng được cả vi khuẩn đề kháng vớistreptomycin.

Một số dòng của loài vi khuẩn sợiS parvulustừng được chọn làm đối tượng để thực hiện dung hợp tế bào trần, phục vụ cho nghiên cứu di truyền học cơ bản và ứng dụngtừcuốithếkỷXX:tếbàotrầncủacácchủngvikhuẩnsợiS.parvulusđượctáitạo thành khuẩn ty; sau khi dung hợp các chủng dị dưỡng được biến thành dạng tái tổ hợp tự dưỡng, và sự tái tổ hợp có thể đạt tần số cao hơn Do đó,kỹthuật dung hợp này có thể cung cấp thêm phương tiện để cải tiến các chủng vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh,thậmchílàthunhậnkhángsinhmớithôngquatáitổhợpgengiữacácchủngtrongcùng loài hoặc các loài trong cùng chi (Tanakaet al.,2009).

Sự hiện diện của các gen chỉ thịkhángsinh

Những hợp chất polyketide đều có hoạt tính sinh học và tầm quan trọng trong y khoa(Zhaoetal.,2018).Việcsànglọc,tìmnhữngtrìnhtựgenmãhóachoenzymetổng hợp polyketide (gọi tắt là “quy định sự tổng hợp nhóm chất polyketide”) có thể được dùngđểdựđoánsựhìnhthànhcácchấttraođổithứcấp(Zhaoetal.,2009vàSunetal.,2015) Do đó, khảo sát sự hiện diện của các gen nhưpksI, pksIIvànrpsrất cần thiết trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của 8 dòng vi khuẩn sợi Kết quả nghiên cứu cho thấy có 4/8 (chiếm 50%) dòng vi khuẩn sợi sở hữu genpksI(quy định sự tổng hợp nhóm chất PKS-I), và tất cả 8/8 (100%) dòng đều có gennrps(quy định sự tổng hợp NRPS) Tuy nhiên, không tìm thấy genpksII(quy định sự tổng hợp PKS-II) trong các dòng vi khuẩn sợinày.

Sự hiện diện của các gen mã hóa enzyme tổng hợp polyketide cho thấy vi khuẩn sợiởrừngngậpmặnCầnGiờthậtsựcótiềmnăngsinhtổnghợpchấtkhángkhuẩn.Gennrpscó mặt ở tất cả các dòng vi khuẩn sợi của nghiên cứu là cơ sở vững chắc cho vi khuẩnsợicókhảnăngkhángkhuẩn;tươngđồngvớicácnghiêncứuquốctế.Nhưtrường hợp kháng sinhNoursamycin thu nhận từ vi khuẩn sợi dòngStreptomyces nourseiNTRSR4 (lưu trữ ở Đức) nằm trong số các chất chuyển hóa do cụm gennrpsquyđịnh.

Noursamycinnàycótínhkhángnấmvàkhángkhuẩnphổrộng(tácđộnglêncảvikhuẩn Gram âm và Gram dương) (Mudalunguet al.,2019).

Kếtquảnàynhấnmạnhrằngmôitrườngrừngngậpmặnđạidiệnchomộtquầnxã vi sinh vật phong phú trong đó có các loài vi khuẩn sợi, là nguồn tài nguyên sinh học tiềm năng để khám phá các chất chuyển hóa thứ cấp có tính kháng khuẩn Tám dòng vi khuẩnsợikhánglạivikhuẩnGramdươnggâybệnh(BacilluscereusvàStaphylococcusaureus)đề ucógenmãhóachoNRPS;trongkhibốndòngkhánglạivikhuẩnGramâm gây bệnh (E. colivàVibrio parahaemolyticus) có gen mã hóa cho PKS-I (bốn dòng mang cả hai loại gen là vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1,Streptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1,Streptomyces parvulusANTHOIDONG3 1 v àS t r e p t o m y c e s t a n a s h i e n s i s A N T H O I D O

Bảng 4.5: Sự hiện diện các gen chỉ thị cho NRPS, PKS-I, và PKS-II trong 8 dòng Streptomyces

(Ghi chú: NRPS: nonribosomal polyketide synthetase, “+”: có sự hiện diện của gen,

“-“:không có sự hiện diện của gen)

Hình 4.18: Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA kích thước 700–800 bp sử dụng cặp mồi A3F/A7R đặc hiệu cho trình tự adenyl hóa NRPS của các chủng vi khuẩn sợi (Kí hiệu:M: thang chuẩn 100 bp code Invitrogen™ 15628019 , 1: THANHAN 4.4, 2: ANTHOIDONG 3.1, 3: ANTHOIDONG 3.2; 4: ANTHOIDONG 4.1; 5: ANTHOIDONG 6.1; 6: ANTHOIDONG 7.1; 7: LONGHOA 4.2; 8: ANTHOIDONG 11.1).

Hình 4.19: Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA 1200–1400bp sử dụng K1F/K2R và K1F/M6R cho genpksIcủa các chủng vi khuẩn sợi có hoạt tính khángkhuẩn.(Kíhiệu:M:thangchuẩn100bpcodeInvitrogen™15628019,1:THANHAN4.4,2: ANTHOIDONG3.1,3:ANTHOIDONG3.2;4:ANTHOIDONG4.1;5:ANTHOIDONG6.1;6: ANTHOIDONG 7.1; 7: LONGHOA 4.2; 8: ANTHOIDONG 11.1).

Như vậy, tần số xuất hiện của gennrpsvàpksIlần lượt là 100% và 50% ở các dòngvikhuẩnsợiđượcchọnlọc.NghiêncứucủaAyuso-sacidoetal.(2005)khẳngđịnh sựphânbổcủagennrpstronghầuhếtcácloàithuộcchiStreptomyces,cònsựhiệndiện của genpksIcó phần ít hơn và khá biến động theo loài (tần số xuất hiện gennrpsởc h i nàylà97%,trongkhigenpksIđạt78,8%).Tươngtự,nghiêncứucủaGongetal.(2018) cho rằng

20/29 các chủng vi khuẩn sợi phân lập (68,9%) có mang gennrps, trong khipksIchỉ được ở 16/29 dòng vi khuẩn sợi phân lập; tuy nhiên, có sự khác biệt khigenpksIIlạixuấthiệnở100%cácdòngvikhuẩnsợi.Sốlượngcácvikhuẩnsợimang2gen mã hóa enzyme tổng hợp kháng sinh không nhiều (từ 6 - 7 trong tổng số 29 dòng vi khuẩn sợi thuđược).

Sự xuất hiện nhiều hơn của genpksIso với genpksIIthể hiện trong nghiên cứu củaWeberetal.(2003)khikhảosátsựtồntạicủacácgenchỉthịchấtkhángsinhtrong các dòng vi khuẩn sợi phân lập thấy rằng, gen quy định tổng hợp PKS-I được phát hiện ở 2–10 các cụm gen khác nhau trong mỗi dòng vi khuẩn sợi; còn gen mã hóa cho PKS- IIt h ì tỷlệthấprõhơn,xuấthiệnchỉở1-3cụmgenkhácnhautrongmỗidòng.Đểxác địnhrõràngcáccụmgencụthể,cầnthiếtphảikếthợpcáccặpmồivàcácmẫudòkhác nhau.Ngoàira,cónghiêncứukhácchothấyrằngởtrongtếbàovikhuẩnsợi,genpksIIít biểu hiện hoặc tạo được hàm lượng chất kháng sinh ít hơn, cần có hệ thống biểu hiện kích hoạt (Li và Piel,2002).

Từđó,giảithíchchosựkhácbiệttrongkếtquảcủaGongetal.(2018),căncứtheo Weberet al. (2003) cho rằng tỷ lệ dò ra genpksIIcao có thể do việc sử dụng cặp mồi hoặc đoạn dò khác nhau (ở đây, cặp mồi KsaF(5’-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3’) và KsaR (5’- TGGAANCCGCCGAABCCGCT-3’ được sử dụng để nhận diện genpksII) Tương tự như vậy, khi sử dụng những cặp mồi khác ((KS1F-KS1R; KSα–KSβ; 540F-1100R), nghiên cứu mới nhất của Sabidoet al.(2021) khảo sát 15 dòng vi khuẩn sợi phân lập từ các đảo thuộc Philippines cho thấy genpksIIlại xuất hiện ở tất cả các dòng vi khuẩn sợi, trong khi genpksIvà gennrpsxuất hiện ở mức độ tuy thấp hơn nhưngl à đạiđasố(chỉcó1dòngkhôngmangmộttronghaigennày).Đặcbiệt,Sabidoet al.(2021) khẳng định rằng mặc dù không phát hiện được genpksItrong 1 dòng vi khuẩn sợi nhưng dòng nàyvẫn có cơ chế để sản xuất các polyketide týp I Như vậy, giả thiết“phụthuộcvàocặpmồi”củaWeberetal.(2003)cóthểdùngđểgiảithíchvàhoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn sợiStreptomycesrõ ràng không quá lệ thuộc vào 1 genduynhấtmàdonhiềucụmgenquyđịnh.Điềunàychothấykết quảkhôngtìmthấy sựhiệndiệncủagenpksIItrongcácdòngvikhuẩnsợicủanghiêncứunàyrấtcóthểdo việc lựa chọn sử dụng cặp mồi có tính đặc hiệu chưa cao, nhưng không mâu thuẫn với khả năng kháng khuẩn chung của chiStreptomycesđược ghi nhận từ trước đếnnay.

Tỷ lệ phát hiện cao các genpksIvànrpstrong những dòng vi khuẩn sợi phân lập đượcđềuthuộcvikhuẩnsợiStreptomyces, mộtlầnnữacungcấpthôngtinmạnhmẽvề tiềmnănglớncủachiStreptomycesnàytrongviệctạoranhiềuchấtchuyểnhóacóhoạt tính sinh học Do đó, việc phát hiện gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp các hợp chất hoạttínhsinhhọcvẫnlàmộtcáchtiếpcậnhiệuquảvàcógiátrịđểchọntrướccácdòng vikhuẩnsợiphânlậpnhằmmụcđíchsảnxuấtcácchấtchuyểnhóathứcấphữuích

(Mets¨a-Ketel¨aet al., 1999; Ginolhacet al., 2004; Hornunget al., 2007;; Schneemann et al., 2010).

Bêncạnhđó,việcxuấthiệnnhữngdòngvikhuẩnsợimangcùnglúc2genmãhóa cho sự tổng hợp nhiều loại polyketide (pksIvànrps) là chỉ thị rõ rệt cho khả năng thu nhận những hợp chất mới, với tính năng ưu việt hơn, ngoài tính kháng khuẩn Shenetal., (2002)nghiêncứucơsởphântửcủagiaotiếpliênmô-đungiữaNRPSvàPKStrong hợp chất lai sinh học giữa peptide và polyketide tạo được những hợp chất sinh học lai cónhiềutácdụngđộcđáohơn.Trongsốcáchợpchấtlaiđó,Bleomycins(BLM)làmột kháng sinh dẫn xuất từ glycopeptide được tổng hợp bởi nhiều loài vi khuẩn sợiStreptomycescó nguồn gốc từ vùng ngập thủy triều Chất BLM thể hiện mạnh mẽ hoạt động chống khối u và hiện đang được sử dụng trong lâm sàng kết hợp với một số tác nhân khác để điều trị một số bệnh ung thư Trong số các chất chống ung thư, BLM không gây suy tủy, nên đang được ứng dụng rộng rãi trong hóa trị liệu Tuy nhiên,hiện tượng dễ bị kháng thuốc và tích lũy độc tố ở phổi là những hạn chế chính của BLM trong liệu pháp hóa trị Do đó, nảy sinh thêm xu hướng phát triển các dẫn xuất BLM mới để tìm kiếm các loại thuốc chống ung thư với khả năng lâm sàng tốt hơn, và độc tính thấp hơn Shenet al. (2002) tiến hành nhân bản, giải trình tự và xác định đặc điểm sinh hóa của cụm gen sinh tổng hợp BLM từ vi khuẩn sợiStreptomyces verticillusATCC15003, tạo tiền đề cho việc tổng hợp các chất tương tự BLM mới bằng những kỹ thuật sinh học phân tử, tác động lên gen chi phối quá trình sinh tổng hợp BLM Nghiên cứu của Sabidoet al. (2021) ghi nhận hoạt tính kháng ung thư buồng trứng của các dòngvikhuẩnsợi,thậmchícónhữngdòngvikhuẩnsợimangđủcácgenpksI,pksIIvànrpsnhưng không biểu hiện tính kháng khuẩn mà lại biểu hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư. Ngược lại, nghiên cứu của Vũ Thị Hạnh Nguyên vàctv (2018) phân lập dòng vi khuẩn sợiStreptomyces cavourensisYBQ75 từ cây quế (Cinnamomum cassiaPresl) ở tỉnh Yên Bái, kháng được 5 loại vi sinh vật thử nghiệm gồmSalmonella enterica,Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus epidermidis,Enterobacter aerogenes,Proteus vulgaris; và dòng vi khuẩn sợiStreptomyces cavourensisYBQ75 này có mang cả ba loại gen mã hóa cho PKS-I, PKS-II và NRPS, không đề cập đến tính năng ức chế ung thư Từ đó cho thấy, sự có mặt của ba loại gen mã hóa chất thứ cấp trong cùngmột dòng vi khuẩn sợi sẽ đem lại những tính năng mới mà chúng ta chưa thể dự đoán chính xácđược.

Nhữngdữkiệntrêngópphầngiảithíchnănglựckhángkhuẩntốtcủanhữngdòng vi khuẩn sợi nhưStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 vàS. celluloflavusANTHOIDONG 4.1 mà nghiên cứunàyghi nhận được, tạo niềm tin về tiềm năng ứng dụngđiềutrịbệnhungthưcủacácdòngvikhuẩnsợi(hoặcrộngralàcácloài)trongchi vi khuẩn sợiStreptomycesnày.

Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợiđược chọn

Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vikhuẩnsợi

Dịch nuôi cấy vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1được tách chiết hoạt chất bằng dung môi ethyl acetate, thu được 1,01 g cao chiết thô Tương tự,dịchnuôicấyvikhuẩnsợiStreptomycescelluloflavusANTHOIDONG4.1đượctách chiết hoạt chất và thu được 1,02 g caochiết.

Cao chiết của 2 dòng vi khuẩn sợi này (Streptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 vàStreptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1) được kiểmtra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trước khi phân tích thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khối phổ - GCMS, nhằm khẳng định sự hiện diện và bảo toàn tính năng của các chất kháng khuẩn(Hình4.20).

Hình 4.20: Vòng kháng khuẩn của cao chiết từ 2 dòng vi khuẩn sợi:S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 (trái) vàS celluloflavusANTHOIDONG 4.1 (phải) Giếng có dấu “+” là giếng chứa kháng sinh đối chứng.

*Khả năng kháng khuẩn của cao chiết của vi khuẩn sợi Streptomycesalbogriseolus ANTHOIDONG 7.1

Cao chiết thô của vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 đượckhảosátkhảnăngkhángkhuẩnvới3dòngvikhuẩnkiểmđịnhlàBacilluscereus,Escherichi a coli, vàStaphylococcus aureus Kết quả trong Bảng 4.6 cho thấy cao chiết có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnhBacillus cereusvới trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 18 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycinvớiđường kính vòng vô khuẩn là 10 mm); kháng vi khuẩn gây bệnhE.colivới trung bình đường kính vòng vôkhuẩnlà3,5mm(sovớiđốichứnglàkhángsinhtetracyclinvớiđườngkínhvòngvô khuẩnlà9mm);khángvikhuẩngâybệnhStaphylococcusaureusvớitrungbìnhđường kính vòng vô khuẩn là 12 mm (tương đương với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 12mm).

Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1

Vikhuẩnsợi Kích thước vùng ứcchế

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệtcó ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phương pháp LSD và phân tích ANOVA một biến)

* Khả năng kháng khuẩn của cao chiết của vi khuẩn sợi Streptomycescelluloflavus ANTHOIDONG 4.1

Cao chiết thô của vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1 đượckhảosátkhảnăngkhángkhuẩnvới3dòngvikhuẩnkiểmđịnhlàBacilluscereus,Escherichi a coli, vàStaphylococcus aureus Kết quả trong Bảng 4.7 cho thấy cao chiết có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnhBacillus cereusvới trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 10 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycinvớiđường kính vòng vôkhuẩnlà8mm);khángvikhuẩngâybệnhE.colivớitrungbìnhđườngkínhvòngvô khuẩn là 9,5 mm (so với đối chứng là kháng sinh tetracyclin với đường kính vòng vô khuẩnlà9mm);khángvikhuẩngâybệnhStaphylococcusaureusvớitrungbìnhđường kính vòng vô khuẩn là 11 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 12mm).

Bảng 4.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1

Vikhuẩnsợi Kích thước vùng ứcchế

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệtcó ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phương pháp LSD và phân tích ANOVA một biến)

Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của cao chiết từ hai dòng vi khuẩn sợiStreptomyces albogriesolusANTHOIDONG 7.1 vàStreptomycescelluloflavusANTHOIDONG 4.1 thể hiện qua kích thước vòng kháng khuẩn nhỏ hơn so với nuôi cấy vi khuẩn sợi trực tiếp trên môi trường thạch có thể do quá trình chiết tách không thu được hết các chất trao đổi thứ cấp và còn nhiều yếu tố ảnh hưởng chưa được khảo sát như thời gian ủ, mật độ vi khuẩn kiểm định… và kể cả chất lượng thạch nền.

Trước đây, Lakshmipathy và Kannabiran, (2009)sửdụng trực tiếp dịch nuôi cấy các dòng vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomyces(phân lập từ đất ruộng muối ven bờ vịnh Ấn Độ) để kiểm tra tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho kết quảkíchthướcvùngứcchếtohơn(20mm).RajanvàKannabiran(2014)phânlậpđược một chủng vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomycestừ đất trầm tích biển Ấn Độ, sử dụng dịch nuôi cấy trực tiếp có khả năng kháng lại các dòng vi khuẩn đa kháng thuốc thuộc loàiStaphylococcus aureusvới kích thước vùng ức chế từ 12 đến 21mm.

TheoNandhinivàSelvam(2013)nghiêncứuthấydòngvikhuẩnsợiStreptomycescoelicolor SU6 phân lập từ đất ven biển Ấn Độ có khả năng ức chế 3 loài vi khuẩn gây bệnh làBacillus subtilis,E colivàStaphylococcus aureusvới kích thước vòng kháng khuẩn tương ứng lần lượt là 14, 15 và 12 mm Bên cạnh đó, Bhavanaet al.(2014) ghi nhận cao chiết của dòng vi khuẩn sợiStreptomyces carpaticusMTCC-11062 thể hiện tínhkhángvớivikhuẩnBacilluscereusmạnhhơnsovớikhánglạivikhuẩnE.coli(kích thước vòng vô khuẩn khoảng 10 -12 mm) Nandhiniet al.(2018) sử dụng ethyl acetate thu nhận cao chiết thô của một chủng vi khuẩn sợiStreptomycesphân lập từ đất Ấn Độ vàkiểmtratínhkhángkhuẩncủacaochiếtchothấykíchthướcvùngkhánglạivikhuẩnStaphylococ cus aureuslà 13 mm Ngoài ra, trong nghiên cứu của Gopalet al.(2013) ghinhậndịchnuôicấysaukhilytâmcủadòngvikhuẩnsợiStreptomycessp.VITDDK3 phân lập từ bờ biển Ấn Độ có khả năng kháng khuẩn không cao; sau khi xử lý vớiHAuCl 4 để hình thành các hạt nano vàng lại đạt tính kháng nấm rấtmạnh.

Khattabetal.(2016)khẳngđịnhviệcsửdụngethylacetatelàmdungmôiđểchiết xuấtcáchợpchấtsinhhọccủavikhuẩnsợichokếtquảkhángkhuẩnrõrànghơnsovới các dung môi khác, và đề xuất tỷ lệ phối trộn là 1:1 (sử dụng lượng ethyl acetate nhiều hơn so với nghiên cứu này) Tương tự, Awlaet al.(2016) khi khảo sát tính kháng nấm củacaochiếttừdịchnuôicấyvikhuẩnsợithấyrằngdungmôiethyl acetateđemlạikết quả tốthơn.

Từ kết quả trên cho thấy đặc tính của những hoạt chất sinh học (bioactive) trong việcngănchặnsựpháttriểnvikhuẩngâybệnhchongườikhôngthayđổitheotìnhtrạng của vi khuẩn sợi: “các chất này được sinh tổng hợp từ trong tế bào khi vi khuẩn sợicòn hoạt động rồi phóng thích ra bên ngoài để đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, nhưng khi vi khuẩn sợi bị xử lý bằng ethyl acetate (để chiết tách sinh chất) thì các hoạt chất này vẫn giữ nguyên được tính kháng khuẩn”, mở ra triển vọng ứng dụng nhữnghợp chất có hoạt tính sinh học, (các chất trao đổi thứ cấp) vào sản xuất thành dược phẩm sau khi chúngđượctinhsạchvànhữngbướccầnthiếtkháctrongquitrìnhchếbiếncủacáccông ty dược, tạo thành những viên thuốc (để uống) hay ống thuốc (để tiêm) sử dụng trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩngâybệnh trênngười.

Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợiStreptomycesalbogriseolusANTHOIDONG7.1

Cao chiết được pha loãng lần lượt qua các bậc 10 ppm, 1 ppm và 0,1 ppm; tiến hành phân tích GC-MS (với chất mang là khí Heli) để xác định cấu trúc các hợp chất sinhhọc.Kếtquảphổphântíchchora25đỉnh(peak)chất,chitiếtđượctrìnhbàytrong Bảng 4.8 (công thức cấu tạo trình bày trong PhụLục).

Bảng 4.8: Các đỉnh chất trong phổ GCMS thành phần cao chiết của vi khuẩn sợiS albogriseolus ANTHOIDONG 7.1

STT RT Tên hóa chất

3 6,63 Acetic acid, trifluoro, decyl ester C12H21F3O2

(C10H16)làthànhphầntrongdầuchiếttừvỏcáctráicâyhọcam,chanh.Limoneneđượcghinhậnhiện diệnvớitỷlệthấptrong thành phần hoạt chất kháng khuẩn của thảo mộc ở Iran và khu vực Tây Á (Zahraetal.,

2019 và Karimet al., 2021) Dẫn xuất của chất này là Limonene-1,2-diol có thể ức chế khối u, trong khi đó, bản thân Limonene được xếp vào nhóm chất ăn mòn sinh học, có thể ăn mòn kim loại (Unsalet al.,2022) Ngoài ra, Limonene giúp kéo dài sự sống của tuyến trùng (Shuklaet al., 2019).

ChấtAlloocimene,C10H16,cótrongthànhphầnchấtchiết(tinhdầu)từlácâytrâmmốcSyzygi um cuminiở Ai Cập, vớitỷlệ 13,55%, tinh dầu này mang tính năng diệt khuẩn và chống oxy hóa (Elansaryet al., 2012) Allocimene còn có trong thành phần chấtchiếtcủalákhuynhdiệpvớitínhnăngkhángkhuẩn(ứcchếmạnhđốivớiE.colivà

Chấtacidacetic,trifluoro,decylesterC12H21F3O2,cótrongthànhphầnchấtkhángkhuẩn của hoa đa lộc, có tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnhStaphylococcus aureusvà nhiều vi khuẩn Gram âm, Gram dương khác (Maseret al., 2022) Khả năng này được Krasnovet al.(2022) khẳng định rõ thêm như kháng với vi khuẩnBacillus subtilisvàMycobacterium smegmatis.Acid Trifluoro acetic chiếm mộttỷlệ nhỏ (0,1%) trong thành phần chất kháng khuẩn, kháng khối u của hoa trà (Sharmaet al.,2022).

Chất 1-Pentadecene C15H30, có trong tinh dầu vỏ trái sầu riêng ức chế mạnh 3loạivi khuẩn làBacillus subtilis,Staphylococcus aureus, vàPseudomonas aeruginosa(Zamakshshariet al., 2022) Trong nghiên cứu trước đó, dòng vi khuẩn nội sinh thực vậtPseudomonas putidaBP25 phân lập từ rễ cây tiêu đen ở Ấn Độ sinh tổng hợp được chấtnày,chất1-Pentadecenelàmộttrongsốcácchấtkhángkhuẩn,khángnấmgâybệnh trên thực vật (Sheoranet al., 2015) Đặc biệt, có dòng vi khuẩn sợi mã số AIA6 phân lập từ đất tại Ấn Độ với khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, qua phân tích GC-MS thành phần hoạt chất, ghi nhận sự tồn tại của chất 1-Pentadecene (Kumariet al.,2019).

Chất acid 1,2-Benzenedicarboxylic, dimethyl ester C10H10O4, xuất hiện khá phổbiến trong chiết xuất của nhiều loài sinh vật bao gồm thực vật (Beulahet al., 2018), vi khuẩn lam (Hidhayatietal., 2020) và cả vi khuẩn sợi (Hamedet al., 2021) thông qua phântíchGC-MS.Trongđó,vikhuẩnsợicókhảnăngkhángkhuẩn,khángnấmlàdòng vi khuẩn sợiStreptomyces mutabilisM3MT483919 phân lập từ đất rừng ngập mặn ven Biển Đỏ,

Ai Cập Ngoài ra, một số loài tảo chứa chất ester của acid 1,2- Benzenedicarboxylic tuy khác nhóm thế, nhưng vẫn có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, điều này cho thấy tính năng sinhhọccủa acid này có nhiều lợi ích cho con người.

Chất Phenol-3,5-bis(1,1-dimethylethyl) C14H22O, có trong thành phần các chấtkháng khuẩn chiết từ tảo (Dhanyaet al., 2016), thực vật (Selvarajuet al., 2021) và vi khuẩn lactic (Noureenet al., 2022) Trong những nghiên cứu này ghi nhận thêm tính năngchốngoxyhóa,khángvirus.TheonghiêncứucủaDhanyaetal.,(2016)dịchchiết nuôi cấy vi khuẩnPseudomonasnội sinh với tảo có chất Phenol -3,5-bis(1,1- dimethylethyl)làthànhphần chính,ứcchếm ạn h vikhuẩngâybệnhStaphylococc us aureusvàEscherichia coli, góp phần khẳng định sự hiện diện của chất này trong các hoạt chất kháng khuẩn có nguồn gốc vi sinh vật, tăng độ tin cậy cho kết quả củanghiên cứu.

Chất acid phthalic, monoethyl ester C10H10O4: đa số các ester của acid phthalic cótính kháng khuẩn (Huanget al., 2021) nhưng monoethyl ester của acid này khôngđược lưu ý vì chỉ tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh nên chất này không được tiếp tục nghiêncứu.

Chất acid 1,2-Benzenedicarboxylic, dibutyl ester C16H22O4: với tên gọi khác làDibutyl phthalate, là một thành phần trong các hoạt chất kháng khuẩn của chiết xuất thực vật, được ghi nhận trong nhiều tài liệu nghiên cứu (Singhet al., 2012, Alyet al.,

2013, Ingoleet al.,2016, và Beulahet al., 2018) Ngoài ra, Dibutyl phthalate chiếm tỷ lệ khá cao (6,82%) trong hỗn hợp các chất trao đổi thứ cấp có tính năng kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tuyến trùng của dòng vi khuẩn sợiStreptomyces cuspidosporusSA4 phân lập từ đất nông nghiệp (Sholkamyet al., 2020) Nghiên cứu của Khanet al (2019) bổ sung thêm tính năng chống oxy hóa của hợp chất có Dibutyl phthalate.

ChấtDi-n-octylphthalateC24H38O4:đượcpháthiệncótrongthànhphầndịchchiếtcủa một loài thực vật phân bố ở Pakistan, chất này mang tính năng kháng khuẩn,chống oxy hóa, chống ung thư và kể cả dùng làm thuốc bổ tim (Qureshiet al., 2020) Ngoài ra, chất Di-n-octyl phthalate nàycòn xuất hiện trong những hợp chất sinh học có nguồn gốc từ vi nấm với cùng tính năng kháng khuẩn (Yinet al.,2017; Abdel- Wahabet al.,2017) Đặc biệt, có hai nghiên cứu trên vi khuẩn sợi ở Ấn Độ và Ai Cập ghi nhận sự hiện diện của Di-n-octyl phthalate trong thành phần hoạt chất kháng khuẩn, kháng ung thư.HaitrongsốbavikhuẩnsợicủacácnghiêncứutrênthuộcchiStreptomyces(Abd- Elnabyet al.,2016 và Passariet al.,2018).

Qua những tra cứu, phân tích như trên, có nhiều chất bị trùng lặp và không mang hoạttínhkhángkhuẩn.Từ25đỉnhchất,ghinhậnđược15hoạtchấthiệndiệntrongcao chiếtcủadòngvikhuẩnsợiStreptomycesalbogriseolusANTHOIDONG7.1theoBảng 4.9.

Bảng 4.9: Các hoạt chất của vi khuẩn sợiS albogriseolusANTHOIDONG 7.1

3 6,63 Acid acetic, trifluoro, decyl ester C12H21F3O2

Trongsố15hoạtchấttrên,kếtquảphântíchGC-MSđềnghịchọn6chấtvớiđỉnh (peak) cao rõ rệt, không trùng lắp và hoạt tính được nhiều tài liệu ghi nhận, được thể hiện ở Hình 4.21. Đỉnh chất đầu tiên ở phút thứ 8,08 được xác định là Cyclohexasiloxane, dodecamethyl. Đỉnh chất thứ sáu ở phút 19,55 được xác định là Tetracosamethyl,cyclododecasiloxane.SáuđỉnhchấtcùnghoạttínhđượcliệtkêtrongBảng4.10.

Hình 4.21: Phổ GC-MS với 6 đỉnh chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợiS.albogriseolus

Bảng 4.10: Thành phần hóa chất kháng khuẩn tiêu biểu của S.albogriseolusANTHOIDONG 7.1 qua phân tích GC-MS

Tên hợp chất - Công thức - Phân tửlượng (g/mol) Hoạttính

Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl - C14H42O7Si7- kháng nấm

Khángkhuẩn,kh áng nấmvàchống oxihóa(Hassane tal.,2017) Đối với chất ở đỉnh 1 và đỉnh 2, lần lượt là Cyclohexasiloxane, dodecamethyl và Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl, trong nghiên cứu của Mebude và Adeniyi (2017) sửdụngGC-MSđểphântíchthànhphầnchấtchiếttừvỏthâncâyColanitidaSchott& Endl (một loài thực vật có hoa thuộc họ Cẩm quỳ , bản địa ở Tây Phi, theo Công viên quốcgiaSingapore,2022)chokếtquảxácđịnhcácchấtchiếtxuấtlàCyclohexasiloxane dodecamethyl (24,941%), Cycloheptasiloxane tetradecamethyl (35,287%), Cyclooctasiloxane hexadecamethyl

3 12.230 Acid 2,6-dihydroxybenzoic 3TMS - C16H30O4Si3- 370 (Shunmugapriya et al.,2017)

4 14.024 Heptasiloxane, hexadecamethyl - C16H48O6Si7- 532 (El-Din và El-

(17,574%), 1H-cycloprop (e) azulen-7-ol- decahydro-1,1,7- trimethyl-4-metylene (7,816%),Cycloconasiloxanoctadecamethyl

(6,995%), Benzimidazol-5-amine-1-4- ethoxyp (2,265%) và5-acetyl-2-benzylsulfanyl- 6- methyl-nicotinonitril (1,467%) Trongsốnày, Cyclohexasiloxane, dodecamethyl(C 12 H36O6Si6)đượcbáocáoứngdụngvàocácsảnphẩmchămsóccánhânnhưsảnphẩ mchăm sóc tóc / da, chất khử mùi mồ hôi, chất kháng nấm (Mebude và Adeniyiet al.,2017).

Obasekiet al.,(2016) nghiên cứu các đặc tính chống viêm củaHydrocotylebonariensisComm Ex Lam, một loại cây thuốc có lá giống lá rau má được các thầy lang bản địa châu Phi sử dụng để điều trị các bệnh viêm mãn tính, đặc biệt là bệnh thấp khớp và viêm khớp Chiết xuất lá câynàycho thấy sự hiện diện của saponine, phenol, flavonoid, tanin, terpenoid và sterol, thường có tác dụng chống viêm Trong số các hợp chấtchínhđượcphântíchbằngGC-

MScótrongchiếtxuấthexancủaláH.bonariensis, xuất hiện Cyclohexasiloxane dodecamethyl, Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl.

Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợiStreptomycescelluloflavusANTHOIDONG4.1

Cao chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sợiStreptomyces celluloflavusANTHOIDONG 4.1 được pha loãng lần lượt qua các bậc 10 ppm, 1 ppm và 0,1 ppm; tiến hành phân tích GC-MS (với chất mang là khí Heli) để xác định cấu trúc các hợp chất sinh học Kết quả phổ phân tích cho ra 31 đỉnh (peak) chất được trình bày trong Bảng 4.11 (công thức cấu tạo được trình bày trong Phụ Lục).

Bảng 4.11: Các đỉnh chất trong phổ GCMS thành phần dịch chiết củavi khuẩn sợiS.celluloflavusANTHOIDONG 4.1

5 14,49 Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethylidene) hoặc Terpinolene C10H16

19 24,59 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5- bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane C14H42O5Si6

20 25,02 Acid benzoic, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester

Theo bảng trên, các chất lần lượt được tra cứu, luận giải như sau:

- Chất 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl C 6 H12O2: Chất này còn được gọi là rượudiacetone alcohol Nó tham gia vào quá trình trao đổi chất của thực vật và được chiết tách từ loài cỏAchnatherum robustum(PubChem, 2022) Diacetone alcohol được sử dụng trong các sản phẩm dùng để kiểm soát nấmgâyhại trong nông nghiệp hoặc trong gia dụng (PubChem, 2022) Tính kháng khuẩn được thảo luận chi tiết thêm trong phần sau.

- Chất 4-Nonene, 5-methyl C 10 H20: không có tài liệu ghi nhận tính khángkhuẩn.

- Chất Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethenyl) C 10 H16là chất được ghi nhậntrongquátrìnhphântíchhợpchấtkhángnấmcủamộtsốloàivinấmnhưNodulisporiumsp (vi nấm nội sinh thực vật) vàBurkholderia gladioli pv agaricicola(vi nấm đối kháng) (Mendset al., 2012; Elshafieet al., 2012) bằngkỹthuật GC-MS Nghiên cứu của Elshafieet al.(2012) còn xem xét đây là đồng phân quang học của Limonene với tính năng kháng khuẩn, đặc biệt, khả năng kháng nấm rất cao, từ 31,7% đến57,6%.

- Chất 1-Hexanol, 2-ethyl C8H18O: có trong thành phần chất bay hơi ức chế nấmSclerotinia slerotiorumgây bệnh mốc trắng trên thực vật (cây hoa hướng dương), do loài vi khuẩnPseudomonas cholororaphisPA23 tổng hợp, với hiệu quả lên đến 100% (Athukoralaetal.,2010).Cruzetal.(2012)khẳngđịnhtínhkhángnấmcủa1-Hexanol, 2- ethyl trong nghiên cứu bệnh trên một số vụ hoamàu.

- Chất Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethylidene) và Terpinolen là hai chất cócùngcôngthứcphântửC 10 H16.Trongđó,TerpinolenecótínhkhángvikhuẩngâybệnhStaphylo coccus aureusnhưng có độc tính trên ruồi giấm (Scherfet al.,2020) trong khi đóCyclohexene,1-methyl-4-(1-methylethylidene)khôngcótàiliệughinhậntínhkháng khuẩn nên cả hai chất này không được đề cập đến trong nghiên cứunày.

- Chất 2,5-Heptadien-4-one, 2,6-dimethyl C 9 H14O: được ghi nhận là chất chiếm1,75%trongthànhphầnsinhchấtcótínhkhánglạicácvikhuẩnGramâmgâybệnhtrên đường tiết niệu ở người, do dòng vi khuẩn sợiStreptomyces griseofuscusPTCC1628 tổng hợp nên (Mansoriet al.,2013) Ngoài ra, Ahmedet al (2005) cho rằng 2,5- Heptadien-4- one, 2,6-dimethyl có tham gia vào quá trình tổng hợp hóa học những chất kháng khuẩn, kháng nấm Chất này được tìm thấy khi phân tích tinh dầu của loài thảo mộc tên là bạc hà mèoNepeta catariacho thấy chiếm một tỷ lệ nhỏ (0,1%) trongthành phần được dùng làm thuốc dân gian trị nhiễm khuẩn, nhiễm virus và diệt nấm ở vùng Trung và Nam Âu (Handjievaet al.,1996).

Chất 5-Tetradecene C14H28: được ghi nhận có trong thành phần tinh dầu của quảtiêu lốt, dầu này diệt ấu trùng muỗi ở mức trung bình (Trần Thị Ngọc Bích và Đỗ Thị Thúy Vân, 2022) Chất này được ghi nhận có tính kháng khuẩn trong tinh dầu của cây hoa đa lộc (Maseret al.,2022).

Chất Dimethyl phthalate C10H10O4: các dẫn xuất của acid phthalic đều được ghinhận là có tính kháng khuẩn (Huanget al., 2021) và hiện đang được dùng rộng rãi làm chất hóa dẻo và chất kháng khuẩn trong các sản phẩm vệ sinh ở HoaKỳ(Gaoet al., 2020) Trong thành phần của cây la bố ma, một loài thực vật dùng làm dược liệu cổ truyền ở Trung Quốc điều trị cao huyết áp và được công nhận thêm tính kháng khuẩn có Dimethyl phthalate (Liet al.,2012) Ngoài ra, theo Huanget al.(2021), Dimethyl phthalate còn có thể ngăn ngừa côn trùng cắn đốt và Liet al.(2012) cho rằngDimethyl phthalate hỗ trợ cho acid béo khángkhuẩn.

- Chất Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) C 14 H22O: Chất này được Teresaet al.

(2014) ghi nhận là thành phần chính trong các chất chiết từ cây bơ, có tính năng chống oxyhóavàkhángnấmAspergillus.Gầnđây,Devietal.(2021)khẳngđịnhkhảnăngức chếnấmbệnhcủacủahợpchấtnàykhinghiêncứuloàivikhuẩnsợiKutzneriasp.phân lập từ rừng ngập mặn Ngoài ra, Padmavathiet al.(2014) công bố Phenol, 2,4-bis(1,1- dimethylethyl) có khả năng tăng cường hiệu quả kháng khuẩn của kháng sinhkhác.

- Chất1-TridecanolC 13 H28O:thuộcnhómcácrượumạchdàicótínhkhángkhuẩn,kháng nấm được ghi nhận bởi Togashiet al.(2007) Chất 1-Tridecanol được tổng hợp bởi các vi khuẩn thuộc chiLysobacter(Lazazzaraet al.,2017) Chất này dễ tìm thấy trong tự nhiên, có trong thành thần của tảo biển và chất chiết từ lá của một thực vật giống với quả dưa leo (Chatterjeeet al., 2018; Godaet al.,2020).

- Chất Cyclopentane, 1-butyl-2-ethyl C 11 H22: được ghi nhận trong thành phần cácchất có tính kháng khuẩn của các loài vi sinh vật ưa muối (Corralet al., 2019), đặc biệt được ghi nhận có trong các chất kháng lại vi khuẩnVibrio parahaemolyticusvà kháng lạivirusgâybệnhtrêntômởẤnĐộ,đượctổnghợpbởivikhuẩnHalomonassalifodinae(Velmurugane t al., 2013).

- Chất 1-Pentadecene, 2-methyl C 16 H22: không có tính kháng khuẩn rõ rệt mặc dùchấtđồngđẳngkhôngcónhómmethyllà1-Pentadecenecótrongthànhphầnchấtkháng nấmgâybệnhchothựcvậtđượctổnghợpbởidòngvikhuẩnPseudomonasputidaBP25

(Sheoranetal.,2015vàKumarietal.,2019).Chất1-Pentadecenehiệndiệntrongthành phầndượcliệutríchtừcâydươngxỉDryopteriscochleatanhưngkhôngnêurõhoạttính khángkhuẩn(Dubaletal.,2015).Nhưvậy,dẫnxuất2-methylcủa1-Pentadecenekhông được đề cập tiếp tục trong nghiên cứunày.

- Chất Cyclopropane, 1-methyl-1-(1-methylethyl)-2-nonyl C 16 H32: được Godaetal.(2020) ghi nhận (cùng với 1-Tridecanol) có trong thành phần tảo biển ở Hồng Hải với tính năng khángkhuẩn.

- Chất 1- Octadecene C 18 H36: chất này có nguồn phân bố tương đối đa dạng, cótrong thành phần của nhựa (mủ) hạnh nhân được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa (Bouazizet al., 2017); hoặc dịch chiết nuôi cấy của chủng nấm đấtPericoniasp SSS-8có hiện diện chất 1-Octadecene thể hiện tính chống oxy hóa (SkandavàVijayakumar,2022).Ngoàira,nghiêncứuchothấytrong17hợpchấtkháng khuẩnchiếttừvitảoSpirulinaplatensisghinhậnsựhiệndiệncủa1-Octadecene(Kumaret al.,2011).

- Chất 2,6-Diisopropylnaphthalene C 16 H20: là thành phần chính có khả năng diệtnấm bệnh ngoài da cho gia súc, trích ly từ lá câyMitracarpus scaber, đượcNwoforetal (2022) ghi nhận Sự hiện diện của 2,6-Diisopropylnaphthalene trong số những hóa chất tạo nên tính kháng khuẩn của loài thực vậtEuphorbia golondrinađược ghi nhận bởiNdametal.

(2016).Ngoàira,chấtnàycònxuấthiệntrongthànhphầnvỏcâyhoa cảnhCordia sebestenaở Nigeria, được khảo sát chứng minh là có tính chống oxy hóa (Adeosunet al., 2013).

- Chất 3-Tetradecene C 14 H28: theo Williamset al (1998), các hydrocarbon có nốiđôi là thành phần chính trong tinh dầu của nhiều loài thảo dược như khuynh diệp (bạch đàn), sả, tràm trà, và oải hương (lavender)vớitính kháng khuẩn Những chất như 1- Tetradecene,3-Tetradecenevà5-Tetradeceneđềulàcácđồngphâncótínhkhángkhuẩn Nhận xét này được khẳng định bởi Sahibet al.(2019) khi khảo sát tinh dầu quả cam ruột đỏCitrus sinensis Trong chất chiết từ lá câyChromolaena odorate, qua phân tích GC-

MS,cóchất3-Tetradecenevớitỷlệ2,76%,gópphầntạonêndượctínhcholoàicây này (Aikoye,2020).

- Chất Octanal, 2-(phenylmethylene) C 15 H20O: tồn tại trong tinh chất keo ong, ứcchế dòng vi khuẩn gây bệnhStaphylococcus aureusđa kháng thuốc, hỗ trợ làm mau lành vết thương (Abdelsattaret al., 2022) Ngoài ra, Octanal, 2-(phenylmethylene) còn có trong thành phần tinh dầu hoa sen hồng được chứng minh là có khả năng bảo vệ tế bào gan (Sunet al.,2022).

- Chất Cyclopentane, 1-pentyl-2-propyl C 13 H26: không có tài liệu nghiên cứu ghinhận tính khángkhuẩn.

Kếtluận

RừngngậpmặnhuyệnCầnGiờcóvaitròsinhtháiquantrọng,hiệnđanglànguồn cung cấp nhiều vi sinh vật tiềm năng cho công nghệ sinh học Đề tài phân lập được 48 dòng vi khuẩn sợi Qua tuyển chọn, thu được 10 dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn, chiếm tỷ lệ 20,83 %, với khả năng kháng lại ít nhất 1 dòng vi sinh vật gâybệnh, với đường kính vòng vô khuẩn

>1mm Số lượng dòng vi khuẩn sợi có tính kháng và mức độ kháng thay đổi tùy theo loại vi sinh vật kiểm định Nhiều nhất là kháng lại vi khuẩnBacillus cereus(8/10 dòng), độ kháng mạnh lại thể hiện đối với vi khuẩnVibrioparahaemonlytycusvàStaphylococcus aureus Trong đó có 3 dòng mang ký hiệu ANTHOIDONG3.1,ANTHOIDONG4.1vàANTHOIDONG7.1khángđượccả4loài vi khuẩn gây bệnh Đặc biệt là dòng vi khuẩn sợi ANTHOIDONG 3.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng lại hai loài vi khuẩn gây bệnh cho ngườiBacillus cereus,Staphylococcus aureusvà kháng được cả vi khuẩnVibrio parahaemolyticusgây bệnh trên thủy sản.

Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA với cặp mồiSC-Act-0235-aS-20vàSC-Act-0878-aA-19chuyênbiệtchovikhuẩnsợivàsosánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, cho thấy 8 dòng vi khuẩn sợi thể hiện tính kháng khuẩn tốt đều thuộc chiStreptomyces, thuộc họ

Actinomycetaceae,với8loàikhácnhau,baogồm:Streptomycestendae,S.tanashiensis,

S parvulus, S celluloflavus, S aegytia, S africanus, S albogriseolusvàS laurentii.

QuakhảosátsựhiệndiệncủacácgenpksI,pksII,vànrpsmãhóachocácenzyme tổnghợppolyketidestrongconđườngsinhtổnghợpkhángsinh,ghinhậnđượcgennrpstồn tại ở tất cả

8 dòng vi khuẩn sợi thuộc chiStreptomyces, chiếm tỷ lệ 100% Có 4 dòng vi khuẩn sợi (50%) mang genpksI.Các dòng vi khuẩn sợi ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 3.2, ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 mangcả2 genn r p s vàpksI Không tìm thấy sự xuất hiện của genpksII.

Nghiên cứu chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi làStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG7.1vàS.celluloflavusANTHOIDONG4.1đểnhânnuôi,thunhậnchấ t khángkhuẩn,vàxácđịnhthànhphầnhóahọc,cấutrúcphântửcủachúngbằngphương pháp phân tích hóa học khối phổ GC-MS Kết quả ở dòng vi khuẩn sợiStreptomycesalbogriseolusANTHOIDONG 7.1 xác định tối thiểu 6 hợp chất tiêu biểu gồm: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; acid2,6 dihydroxybenzoic dẫn xuất 3TMS; Heptasiloxane, hexadecamethyl;Octasiloxane,1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15- Hexadec;vàT e t r a c o s a m e t h y l , cyclododecasiloxane Ở dòng vi khuẩn sợiS celluloflavusANTHOIDONG 4.1 có sự hiện diện tối thiểu 7 hợp chất tiêu biểu gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5- bis(trimethylsiloxy)tetrasiloxane; acid Benzoic, 2-hydroxy-1-methylethyl ester; 1- Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl Trong những chất này, có Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl là 2 chất cùng xuất hiện ở cả hai dòng vi khuẩn sợi, thể hiện tính ổn định trong khả năng kháng khuẩn của hai dòng dòng vi khuẩn sợi này Các hợp chất mà đề tài nhận diện được thế giới nghiêncứukhẳngđịnhhoạttínhkhángkhuẩn,khángnấmvàkểcảchốngoxyhóa,nhất làhợpchấtsiloxane,làmcơsởchonghiêncứutiếptheonhằmkhaitháctiềmnăngdược liệu của vi khuẩn sợi đất rừng ngập mặn, góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người Kết quảcủađềtàicóýnghĩachothấysựtươngđồngcủađấtrừngngậpmặnCầnGiờsovới cácvùngngậpmặnkháctrongkhuvựcvàtrênthếgiớicảvềchủngloàivikhuẩnsợivà thành phần hoạtchất.

Đềxuất

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chất kháng khuẩn, quy trình tinh sạch nhằm hướng đến sản xuất kháng sinh thành phẩm từ 2 dòng vi khuẩn sợiStreptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 vàS celluloflavusANTHOIDONG 4.1 Khảo sát thêm các đặc tính y khoa của những hợp chất do 2 dòng vi khuẩn sợinàytổng hợp như khả năng kháng các vi khuẩn đa kháng thuốc, độc tính hoặc khả năng ức chếkhốiuvàchốngoxyhóatrênnhiềuđốitượngbệnhkhácnhau.Bêncạnhđó,nghiên cứuliênngànhnhữnghợpchấtchưanhậndiệnđượctrongquátrìnhphântíchbằngGC- MS để xác định hoạt chấtmới.

Giảitrìnhtựhoặckhảosátsựbiểuhiệncủacácgenhoặccụmgenmãhóaenzyme tổng hợp polyketides ở các dòng vi khuẩn sợi để đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền vi sinh vật Việt Nam và khả năng thu nhận hợp chấtmới.

Kết quả của đề tài góp phần thể hiện tầm quan trọng sinh thái của rừng ngập mặnCần Giờ Trong đó, vi sinh vật với vi khuẩn sợi là nguồn tài nguyên đáng lưu ý của đất ngậpnước,nhiễmmặn.Đồngthờinhấnmạnhđốitượngnàyđểnhữngnhàkhoahọctrẻ, tài năng nghiên cứu tiếp theo làm phong phú hơn và khai thác nguồn dược liệu quí này trongđấtrừngngậpmặncủathànhphốHồChíMinhnóiriêngvàcủacảnướcnóichung mà chúng ta chưa lưu ýđến.

Abdelmohsen, U.R., Pimentel-Elardo, S.M., Hanora, A., Radwan, M., Abou-El-Ela, S.H., Ahmed, S., and Hentschel U (2010) Isolation, phylogenetic analysis and anti-infective activity screening of marine sponge-associated Actinomycetes.Mar.Drugs,(8), 399-412.

Abd-Elnaby, H., Abo-Elala, G., Abdel-Raouf, U., Abd-elwahab, A., and Hamed, M. (2016) Antibacterial and anticancer activity of marineStreptomyces parvus: optimization and application.Biotechnology & BiotechnologicalEquipment, 30(1),180-191.

Abdelsattar, A S., Makky, S., Nofal, R., Hebishy, M., Agwa, M M., Aly, R G., and El-Shibiny, A (2022) Enhancement of wound healing via topical application of natural products: In vitro and in vivo evaluations.Arabian JournalofChemistry, 15(6),103869.

Abdel-Wahab, M A., Bahkali, A H., El-Gorban, A M., and Hodhod, M S (2017). Natural products ofNothophoma multilocularissp nov an endophyte of the medicinal plantRhazya stricta.Mycosphere, 8(8), 1185-1199.

Abirami, M., Gopal, J V and Kannabiran, K (2015) Extraction and identification of antibacterial compound from marineStreptomycessp VITAK1 isolated from the coast of Andaman and Nicobar Islands, India.Applied Biochemistry andMicrobiology,51, 406-410.

Adeosun,C.B.,Olaseinde,S.,Opeifa,A.O.,andAtolani,O.(2013).Essentialoilfrom the stem bark ofCordia sebestenascavenges free radicals.Journal of

Ahmed, M G., Ahmed, S A., Uddin, M K., and Rahman, M T (2005) A facile synthesis of fused spiroketal skeleton: 2,20 -spirobi(4-aryl-7,7-dimethyl-5-oxo- 5,6,7,8-tetrahydrochroman).Tetrahedron Letters, 46, 8217-8220.

Ahsan,T.,Chen,J.,Zhao,X.,Irfan,M.,andWu,Y.(2017).Extractionandidentification of bioactive compounds (eicosane and dibutyl phthalate) produced byStreptomycesstrain KX852460 for the biological control ofRhizoctoniasolaniAG-3 strain KX852461 to control target spot disease in tobacco leaf.AMBExpress,7(1),1-9.

Ai, W., Lin, X P., Tu, Z., Tian, X P., Lu, X., Mangaladoss, F., and Liu, Y (2014). Axinelline A, a new COX-2 inhibitor fromStreptomyces axinellaeSCSIO02208.Natural Product Research,28(16),1219-1224.

Aikoye, A O (2020) Theoretical and biochemical information studies on compounds detected in GC-MS of ethanol extract ofChromolaena odorateleaf.Communication in Physical Sciences,6(1),635-648.

Alsaedi,F.B.,Ullah,I.,Al-Shaer,M.,Al-Hindi,R.R.,Al-Ghamd,K.M.S.,(2020).GC- MS profiling of anti-bacterial metabolic compounds from the extract ofAzadirachta indica.Abasyn

Aly, H I., El-Sayed, A B., Gohar, Y M., and Salem, M Z (2013) The value-added uses ofFicus retusaandDalbergia sissoogrown in Egypt: GC/MS analysis of extracts.J Forest Prod Ind, 2(3), 34-41.

Amrita,K.,Nitin,J.andDevi,C.S.(2012).Novelbioactivecompoundsfrommangrove derived actinomycetes.IRJP, 3(9),25-29.

Araujo-Melo, Rosilma, de O., Igor, F.A.C., Souza, Maria, C V., Vicalvi-Costa,J a n e t e

M de Araújo, Kêsia, X R F., de Sena, and Luana, C B B C (2016). Actinobacteria: versatile microorganisms with medical and pharmaceutical application.British Biotechnology Journal,15(4), 1-13.

Arya, R.K and Sharma, A (2016) Bioremediation of carbendazim, a benzimidazole fungicide usingBrevibacillus borstelensisandStreptomyces albogriseolustogether.Current Pharmaceutical Biotechnology,17(2), 185-189.

Athukorala, S N., Fernando, W D., Rashid, K Y., and De Kievit, T (2010) The role of volatile and non-volatile antibiotics produced byPseudomonas chlororaphisstrain PA23 in its root colonization and control of Sclerotinia sclerotiorum.Biocontrol Science and Technology, 20(8),875-890.

Awla,H K., Kadir, J., Othman, R., Rashid,T.S., andWong,M.Y.(2016) Bioactive compoundsproducedbyStreptomycessp.isolateUPMRS4andantifungalactivity againstPyricularia oryzae.American Journal of Plant Sciences,7(7),1077-1085.

Ayuso, A., Clark, D., González, I., Salazar, O., Anderson, A, and Genilloud, O.(2005) A novel actinomycete strain de-replication approach based on the diversity of polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase biosynthetic pathways.Appl Microbiol Biotechnol,(67),795–806.

Ayuso-Sacido, A., and Genilloud, O (2005) New PCR primers for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups.Microbial

Azman,A-S.,Othman,I.,Velu,S.S.,Chan,K-G.,andLee,L-H.(2015).Mangroverare actinobacteria: taxonomy, natural compound, and discovery of bioactivity.Front.Microbiol,(6), 856.

Bachir,R.G.,andBenali,M.(2012).Antibacterialactivityoftheessentialoilsfromthe leaves ofEucalyptus globulusagainstEscherichia coliandStaphylococcusaureus.Asian

Pacific journal of tropical biomedicine, 2(9),739-742.

Balachandar, R., Karmegam, N and Subbaiya, R (2018) Extraction, separation and characterization of bioactive compounds produced byStreptomycesisolated from vermicastsoil.ResearchJournalofPharmacyandTechnology,11(10),4569-4574.

Bardhan, S., Kundu, K., Das, S., Poddar, M., Saha, S K., and Paul, B K (2014). Formation, thermodynamic properties, microstructures and antimicrobial activity ofmixedcationic/non-ionicsurfactantmicroemulsionswithisopropylmyristateas oil.Journal of colloid and interface science, 430,129-139.

Barka, E.A., Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., Klenk, H-P., Clément, C., Ouhdouch, Y., and van Wezel, G.P (2016) Taxonomy, physiology, and naturalproducts of Actinobacteria.Microbiol Mol Biol Rev,(80), 1–43.

Bayeh,Y.,Abebe,A.,Thomas,M.,&Linert,W.(2019).Synthesis,characterizationand antimicrobial activities of new mixed ligand complexes of copper (II) with 1, 10- phenanthroline and thymine.Journal of Transition Metal Complexes,2,1-6.

Bentley, S D.,et al (2002) Complete genome sequence of the model actinomycete

Bacteriology.9 th ed Philadelphia: Editorial Lippincott Williams & Wilkins Co

Beulah,G.G.,Soris,P.T.,andMohan,V.R.(2018).GC-MSdeterminationofbioactive compounds ofDendrophthoe falcata(LF) Ettingsh: An epiphytic plant.Int J.Health Sci Res, 8,261-269.

Bhavana, M.,Talluri,V.P.,Kumar, K S., and Rajagopal, S.V.(2014) Optimization of culture conditions ofStreptomyces carpaticus(MTCC-11062) for the production of antimicrobial compound.Int J Pharm Pharm Sci,6(8), 281-5.

Bích, T T N., và Vân, Đ T T (2022) Thành phần hóa học và hoạt tính diệt ấu trùng muỗi loàiCulex quinquefasciatuscủa tinh dầu quả tiêu lốt (Piper longum) thu hái ở tỉnh Bình Định.Tạp chí Khoa học và Công nghệ-Đại học Đà Nẵng, 102-106).

Bouaziz, F., Koubaa, M., Chaabene, M., Barba, F J., Ghorbel, R E., and Chaabouni, S.

E (2017) High throughput screening for bioactive volatile compounds and polyphenols from almond (Prunus amygdalus) gum: assessment of their antioxidant and antibacterial activities.Journal of Food Processing andPreservation,41(4), e12996.

Braesel, J., Lee, J H., Arnould, B., Murphy, B T., and Eustáquio, A S (2019). Diazaquinomycin biosynthetic gene clusters from marine and freshwater actinomycetes.Journal of natural products,82(4), 937-946.

Breugelmans, P and Uyttebroek, M (2004).Protocol for DNA extraction andpurification Laboratory of soil and water management, K.U Leuven.

Bull, A.T (2004).Microbial Diversity and Bioprospecting 1st ed American Society for Microbiology ASM Press: Washington.

Bull, A.T and Stach, J.E.M (2007) Marine actinobacteria: new opportunities for natural product search and discovery.TRENDS in Microbiology,15(11),491-499.

Bull, A.T., Stach, J.E.M., Ward, A.C., and Goodfellow, M (2005) Marine actinobacteria: perspectives, challenges, future directions.Antonie vanLeeuwenhoek(87), 65–79.

Cardoso, V M., Solano, A G R., Prado, M A F., and de Aguiar Nunan, E (2006). Investigation of fatty acid esters to replace isopropyl myristate in the sterility test for ophthalmic ointments.Journal of pharmaceutical and biomedicalanalysis, 42(5),630-634.

Ceylan, O., Okmen, G., and Ugur, A (2008) Isolation of soilStreptomycesas source antibiotics active against antibiotic-resistant bacteria.EurAsia Journal ofBioSciences,(2), 73-82.

Chakraborty, B., Kumar, R S., Almansour, A I., Gunasekaran, P., and Nayaka, S.(2022) Bioprospection and secondary metabolites profiling of marineStreptomyces levisstrain KS46.Saudi journal of biological sciences,29(2),667- 679.

Chandrasekar, T., Rao, M R K., Kumar, R V., Prabhu, K., Kumar, S N., and Divya,

D (2015) GC-MS analysis, antimicrobial, antioxidant activity of an Ayurvedic medicine,Nimbapatradi choornam.Journal of chemical and pharmaceuticalresearch, 7(8), 124-136.

Chater, K F., & Chandra, G (2006) The evolution of development in Streptomyces analysed by genome comparisons.FEMS microbiology reviews,30(5), 651-672.

Chatterjee, S., Karmakar, A., Azmi, S A., and Barik, A (2018) Antibacterial activity of long-chain primary alcohols fromSolena amplexicaulisleaves.Proceedings ofthe Zoological Society, 71, 313-319.

Chen, Z., and Klessig, D F (1991) Identification of a soluble salicylic acid-binding protein that may function in signal transduction in the plant disease-resistance response.Proceedings of the National Academy of Sciences,88(18), 8179-8183.

Cheng, C., Othman, E M., Stopper, H., Edrada-Ebel, R., Hentschel, U., and Abdelmohsen, U R (2017) Isolation of petrocidin A, a new cytotoxic cyclic dipeptide from the marine sponge-derived bacteriumStreptomycessp.S B T 3 4 8 Marine drugs,15(12),383.

Citron, C A., Rabe, P., and Dickschat, J S (2012) The scent of bacteria: headspace analysisforthediscoveryofnaturalproducts.Journalofnaturalproducts,75(10), 1765- 1776.

Clardy, J., Fischbach M.A., and Currie C.R (2009) The natural history of antibiotics.

Cook,A.E.,andMeyersP.R.(2003).Rapididentificationoffilamentousactinomycetes to the genus level using genus-specific 16S rRNA gene restriction fragment patterns.J Syst

Corral, P., Amoozegar, M A., and Ventosa, A (2019) Halophiles and their biomolecules: recent advances and future applications in biomedicine.Marinedrugs, 18(1), 33.

Cruz, A F., Hamel, C., Yang, C., Matsubara, T., Gan, Y., Singh, A K., and Ishii, T. (2012) Phytochemicals to suppressFusariumhead blight in wheat–chickpea rotation.Phytochemistry,78, 72-80.

Cui, C B., Liu, H B., Gu, J Y., Gu, Q Q., Cai, B., Zhang, D Y., and Zhu, T J (2007). Echinosporins as new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers from marine- derivedStreptomyces albogriseolus.Fitoterapia,78(3), 238-240.

Daffodil, E D., Uthayakumari, F K., and Mohan, V R (2012) GC-MS determination of bioactive compounds ofCurculigo orchioidesgaertn.Science

Dastager, S., Dayanand, L.W.J.A., Tang, S.K., Tian, X.P., Zhi, X.Y., Xu, L.H., and Jiang, C (2006) Separation, identification and analysis of pigment (melanin) production inStreptomyces.Afr J Biotechnol,5, 1131–1134.

Demain, A L and Lancini, G (2001) Bacterial pharmaceutical products.TheProkaryotes: An Evolving Electronic Resource for the

Microbiological Community(257-281).New-York: Springer-Verlag.

Dev, S.R.S, Geetha, P., Orsat, V., Gariepy, Y., and Raghavan, G.S.V (2011) Effects ofmicrowave-assistedhotairdryingandconventionalhotairdryingonthedrying kinetics, color, rehydration, and volatiles ofMoringa oleifera,DryingTechnology:An

Devi, T S., Vijay, K., Vidyavathi, R M., Kumar, P., Govarthanan, M., and Kavitha,

T (2021) Antifungal activity and molecular docking of phenol, 2, 4-bis (1, 1- dimethylethyl)-produced by plant growth-promoting mangrove actinobacteria;Kutzneriasp strain TSII.Research Square,1-22.

Dhanya, K I., Swati, V I., Vanka, K S., and Osborne, W J (2016) Antimicrobial activity ofUlva reticulataand its endophytes.Journal of Ocean University ofChina, 15, 363-369.

Dharmaraj, S (2010) MarineStreptomycesas a novel source of bioactive substances.

World Journal of Microbiology and Biotechnology,26(12), 2123–2139.

Diacetone alcohol National library of medicine. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Diacetone-alcohol, truy cập ngày 12/5/2022. Định, T.T.M và Thủy, T.T (2013) Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủngAspergillus terreusĐ1 phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ sinh tổng hợp chất kháng sinh.Tạp chí khoa học ĐHSP TP.HCM,(47), 119 doi: 10.5772/62329

Du,H.,andKlessig,D.F.(1997).Identificationofasoluble,high-affinitysalicylicacid- binding protein in tobacco.Plant Physiology,113(4), 1319-1327.

Dubal, K N., Patil, S M., Dongare, M M., and Kale, M V (2015) Investigation of chemical composition fromDryopteris cochleata(D Don) C Chr. (Dryopteridaceae).Asian J Pharma Clin Res,8(4), 1-4.

Dũng, N.L., Quyến, N.Đ., và Ty, P.V (2001).Vi sinh vật học,NXB Giáo dục, Hà Nội. Dworkin, M (2006).The prokaryote 3 rd edition Springer USA.

Edwards, C (1993) Isolation properties and potential applications of thermophilic actinomycetes.Appl Biochem Biotechnol,(42), 161–179.

Eftekharivash, L and Hamedi, J (2020) Genome sequence and annotation ofStreptomycestendaeUTMC3329,acidandalkalinetolerantactinobacterium.Iran.J.

Elansary, H O., Salem, M Z., Ashmawy, N A., and Yacout, M M (2012) Chemical composition, antibacterial and antioxidant activities of leaves essential oils fromSyzygium cuminiL.,Cupressus sempervirensL andLantana camaraL from Egypt.Journal of Agricultural science, 4(10), 144.

El-Din, S M M., and El-Ahwany, A M (2016) Bioactivity and phytochemical constituents of marine red seaweeds (Jania rubens,Corallina mediterraneaandPterocladiacapillacea).JournalofTaibahUniversityforScience,10(4),

El-Naggar, N.E, Mohamedin, A., Hamza, S.S., Sherief, A.-D (2018) Extracellular biofabrication, characterization, and antimicrobial efficacy of silvernanoparticles loadedoncottonfabricsusingnewlyisolatedStreptomycessp.SSHH-

El-Naggar,N.E.,Sherief,A.A.,andHamza,S.S.(2011).Streptomycesaegyptiasp.nov., anovelcellulolyticstreptomyceteisolatedfromsoilinEgypt.AfrJMicrobiolRes,(29),5308– 15.

Elshafie, H S., Camele, I., Racioppi, R., Scrano, L., Iacobellis, N S., and Bufo, S A. (2012).InvitroantifungalactivityofBurkholderiagladiolipv.agaricicolaagainst somephytopathogenicfungi.InternationalJournalofMolecularSciences,13(12), 16291-

Ewel, K C., Twilley, R R and Ong, J E (1998) Different kinds of mangrove forests providedifferentgoodsandservice.GlobalEcologyandBiogeographyLetters.7:83-94.

Falowo, A B., Muchenje, V., Hugo, A., Aiyegoro, O A., and Fayemi, P O (2017). AntioxidantactivitiesofMoringaoleiferaL.andBidenspilosaL.leafextractsand their effects on oxidative stability of ground raw beef during refrigerationstorage.CyTA-Journal of

Galindo, A.B (2004).Lactobacillus plantarum 44A as a live feed supperlement forfreshwater fish - PhD thesis, Wageningen University, The Netherlands.

Gao, B., Paramanathan, R., and Gupta, R.S (2006) Signature proteins that are distinctive characteristics of Actinobacteria and their subgroups.Anton.

Gao,C.J.,andKannan,K.(2020).Phthalates,bisphenols,parabens,andtriclocarbanin femininehygieneproductsfromtheUnitedStatesandtheirimplicationsforhuman exposure.Environment international, 136,105465.

Ghazwani, S M S., Alhazmi, H A., Najmi, A., Ashraf, S E., and Rehman, Z (2020). Establishing gerger (Eruca sativa) leaves as functional food by GC-MS and in- vitroanti-lipidperoxidationassays.JournalofFoodandNutritionResearch,8(8), 441-449.

(2009).QuantitativeisolationofbiocontrolagentsTrichodermaspp.,Gliocladiumspp. and actinomycetes from soil with culture media.Microbiol Res,164(2), 196-205.

Ginolhac, A., Jarrin, C., Gillet, B.et al (2004) Phylogenetic analysis of polyketide synthase I domains from soil metagenomic libraries allows selection ofpromising clones.Applied and Environmental Microbiology,70(9),5522–5527.

Giri, C., Ochieng, E., Tieszen, L L., Zhu, Z., Singh, A., Loveland, T and Duke, N. (2011) Status and distribution of mangrove forests of the world using earth observation satellite data.Global Ecology and Biogeography, 20(1), 154-159.

Goda, M., Eltamany, E E., Hassanean, H., Abdelhameed, R F., and Ibrahim, A K. (2020) B: Gas Chromatography-Mass spectrometry analysis of marine seagrassThalassodendron ciliatumcollected from Red Sea.Records of

Gong,B.,Chen,S.,Lan,W.,Huang,Y.,andZhu,X.(2018).Antibacterialandantitumor potential of actinomycetes isolated from mangrove soil in the Maowei Sea of the Southern Coast of China.Iranian Journal of Pharmaceutical Research,17 (4), 1339-1346

Gopal, J.V.,Thenmozhi, M., Kannabiran, K., Rajakumar, G.,Velayutham,K., and Rahuman, A A (2013) Actinobacteria mediated synthesis of gold nanoparticles usingStreptomycessp.VITDDK3anditsantifungalactivity.MaterialsLetters,93, 360-362.

Griffiths,B.S.andPhilippot,L.(2013).Insightsintotheresistanceandresilienceofthe soil microbial community.FEMS microbiology reviews, 37(2),112-129.

Grządziel, J., Furtak, K and Gałązka, A (2018) Community-level physiological profiles of microorganisms from different types of soil that are characteristic to Poland—a long-term microplot experiment.Sustainability, 11(1), 56.

Gu,X.,Zhang,Y.,Lu,L.,Li,Z.andWang,C.(2018).AnEfficientMethodforIsolation and Separation of Pigments from Streptomyces alboflavus TD-1 InAdvances inApplied Biotechnology:

Proceedings of the 3rd International Conference on AppliedBiotechnology(ICAB2016),November25-27,2016,Tianjin,China3(pp 681- 691) Singapore: SpringerSingapore.

Guha-BakshiD.N,SensarmaP.,andPalD.C.(2001).ALexiconofMedicinalPlantsin India. Calcutta, India: NayaPrakash.

Hà, Đ T 2004.Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đấtQuảng Nam-Đà Nẵng Luận án tiến sĩ ĐHSP Hà Nội, Hà Nội.

Hà, N T (2014) Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng khuẩn từ đất ở quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ.Tạp chí Khoa học

Hamed,M.M.,Abdrabo,M.A.,Fahmy,N.M.,Abdelfattah,L.S.,Kelany,M.S.,Abd- El Latif, H. H., and Hassan, S W (2021) Distribution and characterization of actinomycetes in mangrove habitats (Red Sea, Egypt) with special emphasis onStreptomyces mutabilisM3MT483919.J Pure Appl Microbiol, 15(1),246-261.

Han, Z., Fing, A and Camino, G (2014) Organosilicon compounds as polymer fire retardants Polymer Green Flame Retardants,(389–418) Greece: Elsevier.

Handjieva, N V., Popov, S S., and Evstatieva, L N (1996) Constituents of Essential Oils fromNepeta catariaL.,N grandifloraMB andN nudaL.Journal ofEssential

Hằng, Đ.T và Triết, T (2009) Quá trình cố định nitrogen trong rừng ngập mặn Cần Giờ và các vi sinh vật tham gia.Tạp chí công nghệ sinh học,7(1), 101-106

Hào, Đ.M., và Thư, P.T (2010) Một số kết quả nghiên cứu về vi sinh vật tại vùng ven biển Hải Phòng.Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển, 10(1), 51-65

Haseena,A.,Nishad,V.M.andBalasundaran,M.(2016).Aconsortiumofthermophilic microorganisms for aerobic composting.IOSR J Environ Sci Toxicol FoodTechnol,10,49-56.

Hassan, S R., Zaman, N Q., and Dahlan, I (2017) Influence of seed loads on start up of modified anaerobic hybrid baffled (MAHB) reactor treating recycled paper wastewater.Engineering Heritage Journal, 1(2), 05-09.

Hassan, S W M (2016) Antibacterial, anticoagulant and anti-inflammatory activities of marineBacillus cereusS1.J Pure Appl Microbiol,10(4), 2593-2606.

Hidhayati, N., Agustini, N W S., and Widyagustina, D (2020) Antimicrobial activity ofethanolfractionfromCyanobacteriaChroococcusturgidus.In:IOPConferenceSeries:

Earth and Environmental Science(Vol 439, No 1, p 012046) IOP Publishing,

Hồng, H.T và Phương, N.N (2013) Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn từ rừng ngập mặn Cần Giờ kháng nấmFusariumsp.Tạp chí khoa học ĐHSP TP.HCM, 51, 59-71

Hong,K.,Gao,A.H.,Xie,Q.Y.,Gao,H.,Zhuang,L.,Lin,H.P.andRuan,J.S.(2009).

Actinomycetesformarinedrugdiscoveryisolatedfrommangrovesoilsandplants in China.Marine drugs, 7(1), 24-44.

Hop, D.V., Sakiyama, Y., Binh, C.T.T., Otoguro, M., Hang, D.T., Miyadoh, S., Luong, D.T., and Ando, K (2011) Taxonomic and ecological studies of actinomycetes from Vietnam: isolation and genus-level diversity.The Journal of

Hornung, A., Bertazzo, A., Dziarnowski, A.et al.(2007) A genomic screening approach to the structure-guided identification of drug candidates from natural sources.Chem Bio Chem,8(7), 757–766.

Huang, L., Zhu, X., Zhou, S., Cheng, Z., Shi, K., Zhang, C., and Shao, H (2021). Phthalic acid esters: Natural sources and biological activities.Toxins, 13(7), 495.

Hui,M.L.Y.,Tan,L.T.H.,Letchumanan,V.,He,Y.W.,Fang,C.M.,Chan,K.G., and Lee, L.

H (2021) The extremophilic actinobacteria: From microbes to medicine.Antibiotics, 10(6), 682.

Huyền, P.T., Thư, H., Phương, P.N.U., và Tao, V.T.L (2015) Xạ khuẩn phân lập từ đất vùng ven Thành phố Hồ Chí Minh: nguồn kháng sinh tiềm năng.Science

Ikenaka,T.,Odani,S.,Sakai,M.,Nabeshima,Y.,Sato,S.,andMurao,S.(1974).Amino acidsequenceofanalkalineproteinaseinhibitor(Streptomycessubtilisininhibitor) fromStreptomyces albogriseolusS-3253.The Journal of Biochemistry,76(6), 1191-

Inbar, L., Frolow, F and Lapidot, A (1993) The conformation of new tetrahydropyrimidine derivatives in solution and in the crystal.European journalof biochemistry,214(3), 897-906.

Ingole, S N (2016) Phytochemical analysis of leaf extract ofOcimum americanumL. (Lamiaceae) by GCMS method.World Scientific News, 37, 76-87.

Jaradat, N., Ghanim, M., Abualhasan, M N., Rajab, A., Kojok, B., Abed, R., and Arar,

M (2022) Chemical compositions, antibacterial, antifungal and cytotoxic effects ofAlhagi manniferafive extracts.Journal of Complementary and

Jenke-Kodama,H.,Bửrner,T.andDittmann,E.(2006).Naturalbiocombinatoricsinthe polyketide synthase genes of the actinobacterium Streptomyces avermitilis.PLoSComputational

Jiang, S., Sun, W., Chen, M., Dai, S., Zhang, L., Liu, Y., Lee, K J., and Li, X (2007). Diversity of culturable actinobacteria isolated from marine spongeHaliclonasp.Antonie van Leeuwenhoek,(92), 405–416.

Johnson, L.E., and Dietz, A (1968) Kalafungin, a new antibiotic produced by

Streptomyces tanashiensisStrain Kala.Appl Microbiol,16(12), 1815-1821.

Kamekura, M and Kates, M (1999) Structural diversity of membrane lipids in members of Halobacteriaceae.Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 63(6), 969-972.

Kang,I.,Kim,S.,Islam,M.,andCho,J.C.(2017).Thefirstcompletegenomesequences of the acI lineage, the most abundant freshwater Actinobacteria, obtainedbywhole-genome-amplification of dilution-to-extinction cultures.Scientificreports, 7(1),1-14.

Karim, A., M., Hamid, A M., and Hagr, T E (2021) Gas Chromatography/Mass Spectroscopy analysis, antibacterial activity of fixed oil fromAcacia polyacantha(Sudanese Kakamout) seeds.Sudan Online Research Journal, 21-7.

Kawuri, R., and Darmayasa, I B G (2019) Bioactive compound from extract filtratStreptomycessp Sp1 as biocontrol of vibriosis on larvae ofMacrobrachiumrosenbergiishrimps.Hayati Journal of Biosciences, 26(1), 15- 15.

Khan,I.H.,andJavaid,A.(2019).Antifungal,antibacterialandantioxidantcomponents of ethyl acetate extract of quinoa stem.Plant Protection, 3(3),125-130.

Khattab, A I., Babiker, E H., and Saeed, H A (2016).Streptomyces: isolation, optimization of culture conditions and extraction of secondary metabolites.International Current Pharmaceutical Journal,5(3), 27-32.

Kikuchi,Y.,Date,M.,Yokoyama,K.I.,Umezawa,Y.,andMatsui,H.(2003).Secretion of active- formStreptoverticillium mobaraensetransglutaminasebyCorynebacterium glutamicum: processing of the pro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin- like protease fromStreptomyces albogriseolus.Applied andEnvironmental

Kim, S.B., Lonsdale, J., Seong, C-N., and Goodfellow, M. (2003).Streptacidiphilusgen.nov.,acidophilicactinomyceteswithwallchemotypeIande mendationofthe family Streptomycetaceae.Antonie Van Leeuwenhoek,(83),107–116.

Kohanski,M.A.,DePristo,M.A.,andCollins,J.J.(2010).Sublethalantibiotictreatment leads to multidrug resistance via radical-induced mutagenesis.Mol Cell,(37),311–320.

Krasnov, V S., Kirsanov, R S., Khailova, L S., Firsov, A M., Nazarov, P A.,Tashlitsky, V N., and Antonenko, Y N (2022) Alkyl esters of umbelliferone-4- acetic acid as protonophores in bilayer lipid membranes and ALDH2-dependent soft uncouplers in rat liver mitochondria.Bioelectrochemistry, 145, 108081.

Krishnaveni, J., Radzom, M., Zeeck, A., and Kishan, V (2011) Taxonomy, fermentation, biological activities, isolation and characterization of metabolites obtained from a new strain ofStreptomyces noursei(KC46).Indian J

Kumar, A.K., Chalamaiah, M., Kumar, R.R., and Babu, K.N (2009) Preliminary studies on biotransformation of drumstick (Moringa oleifera) and watermelon (Citrullus lanatus) seed oils using Baker’s Yeast.Asian J Biol Sci., 2:118-123.

Kumar,J.G.S.P.,G o m a t h i , A , Vasconcelos,V.,and Gothandam K M (2018). Bioactivity Assessment of Indian Origin—Mangrove Actinobacteria againstCandida albicans.Mar.Drugs,(16), 60.

Kumar, K.S., Haritha, R., Jagan Y.S.Y.V.M., and Ramana, T (2011) Screening of marine actinobacteria for antimicrobial compounds.Research Journal ofMicrobiology,6(4), 385-393.

Kumar, P S., Duraipandiyan, V., and Ignacimuthu, S (2014) Isolation, screening and partial purification of antimicrobial antibiotics from soilStreptomycessp SCA 7.The Kaohsiung journal of medical sciences, 30(9), 435-446.

Kumar, V., Bhatnagar, A K., and Srivastava, J N (2011) Antibacterial activity of crude extracts ofSpirulina platensisand its structural elucidation of bioactive compound.Journal of Medicinal Plants Research,5(32), 7043-7048

Kumari, N., Menghani, E., and Mithal, R (2019) GCMS analysis of compounds extractedfromactinomycetesAIA6isolatesandstudyofitsantimicrobialefficacy.Indian

Laatsch,H.(2010).Antibase,adatabaseforrapidstructuraldeterminationofmicrobial natural products Wiley-VCH Weinheim, Germany.

Laidi, R.F., Kansoh, A.L., Elshafei, M.A, and Cheik, B (2006) Taxonomy, identification and biological activities of a novel isolate ofStreptomyces tendae.Arab J Biotech,9(3), 427-436.

Lakshmipathy, D T., and Kannabiran, K (2009) A morphological, biochemical and biological studies of halophilicStreptomycessp isolated from saltpan environment.American Journal of Infectious Diseases,5(3), 200-6.

Lalitharani, S., Mohan, V R., and Regini, G S (2010) GC-MS analysis of ethanolic extract ofZanthoxylum rhetsa(roxb.) dc spines.J Herbal Med Toxicol, 4, 191-2.

Lamichhane, S., Hussain, A., Paudel, M., and Jha, R N (2016) Phytochemical, antimicrobial and GC-MS analysis ofJuglans regiaLINN.Chem Sci Rev.Lett, 5(20), 147-156.

Landwehr, W., Wolf, C and Wink, J (2016) Actinobacteria and myxobacteria—two of the most important bacterial resources for novel antibiotics.How to overcomethe antibiotic crisis: facts, challenges, technologies and future perspectives(273- 302) Switzerland: Springer.

Law, J W F., Law, L N S.,et al (2020) Anticancer drug discovery from microbial sources: The unique mangrove streptomycetes.Molecules,25(22), 5365.

Lazazzara, V., Perazzolli, M., Pertot, I., Biasioli, F., Puopolo, G., and Cappellin, L. (2017) Growth media affect the volatilome and antimicrobial activity againstPhytophthora infestansin fourLysobactertype strains.MicrobiologicalResearch, 201, 52-62.

Lee, L H., Zainal, N., Azman, A S., Eng, S K., Goh, B H., Yin, W F and Chan, K.

G (2014) Diversity and antimicrobial activities of actinobacteria isolated from tropical mangrove sediments in Malaysia.The scientific world journal, 1, 1-14.

Lee, L.H., Cheah, Y.K., Sidik, S.M., Mutalib, N.S.A., Tang, Y.L., Lin, H.P., and Hong,

K (2012) Molecular characterization ofAntartic actinobacteria and screening for antimicrobial metabolite production.WorldJ Microbiol Biotechnol,(28), 2125- 2137.

Letek,M.,Fiuza,M.,Villadangos,A.F,Mateos,L.M,andGil,J.A.(2012).Cytoskeletal proteins of Actinobacteria.Int J Cell Bio,13(2),1-10.

Li, A., and Piel, J (2002) A gene cluster from a marineStreptomycesencoding the biosynthesis of the aromatic spiroketal polyketide griseorhodin A.Chemistry

Li, M., Han, G., Chen, H., Yu, J., and Zhang, Y (2012) Chemical compounds and antimicrobial activity of volatile oils from bast and fibers ofApocynumvenetum.Fibers and Polymers, 13(3),322-328.

Li, X., L., M.J Xu, Y.L Zhao, and Xu, J (2010) A novel benzo[f][1,7]naphthyridine produced byStreptomyces albogriseolusfrom mangrove sediments.Molecules,15, 9298-9307.

Li, X-G., Tang, X-M., Xiao, J., Ma, G-H., Xu, L., Xie, S-J., Xu, M.-J., Xiao, X., J Xu,

J (2013) Harnessing the potential of halogenated natural product biosynthesis by mangrove-derived actinomycetes.Mar Drugs, (11), 3875 – 3890.

Liang, J., Barnes, K., Akdag, A., Worley, S D., Lee, J., Broughton, R M., and Huang,

Liao, L., Chen, R., Jiang, M., Tian, X., Liu, H., Yu, Y., and Chen, B (2016). Bioprospecting potential of halogenases from Arctic marine actinomycetes.BMCmicrobiology, 16(1), 1-9.

Lis,M.andTew,G.N.(2012).PolymerScience:AComprehensiveReference.Polymer–membrane interactions, (289–315) Spain:Elsevier.

Liu, T., Wu, S., Zhang, R., Wang, D., Chen, J., and Zhao, J (2019) Diversity and antimicrobial potential of Actinobacteria isolated from diverse marine sponges along the Beibu Gulf of the South China Sea.FEMS Microbiology Ecology,(95),

Lu, Q P.,Ye, J J., Huang, Y M., Liu, D., Liu, L F., Dong, K and Sun, C H. (2019).

Maowei sea by combination of multiple discovery strategies.Antibiotics, 8(4), 236.

Ma,L.F.,Chen,M.J.,Liang,D.E.,etal.(2020).StreptomycesalbogriseolusSY67903 produces eunicellin diterpenoids structurally similar to terpenes of the gorgonianMuricellasibogae,thebacterialsource.JournalofNaturalProducts,83(5),164

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., and Clark, D.P. (2010).Microbiologiade Brock 12th ed Porto Alegre: Artmed.

Mahmud,P.I.A.M.,Yaacob,W.A.,Ibrahim,N.andBakar,M.A.(2018).Antibacterial activity and major constituents ofPolyalthia cinnamomeabasic fraction.SainsMalaysiana,

Maldonado, L.A., Fragoso-Yań˜ez, D., Pe´rez-Garcıá, A., Roselloń-Druker, J., and Quintana, E.T (2009) Actinobacterial diversity from marine sediments collected in Mexico.Antonie van Leeuwenhoek,(95), 111–120.

Maleki, H., Dehnad, A., Hanifian, S., and Khani, S (2013) Isolation and molecular identification ofStreptomycesspp with antibacterial activity from northwest of Iran.BioImpacts: BI,3(3), 129-134.

Manikandan,A.,Johnson,I.,Jaivel,N.,Krishnamoorthy,R.,SenthilKumar,M.,Raghu, R., and Anandham, R (2022) Gamma-induced mutants ofBacillusandStreptomycesdisplay enhanced antagonistic activities and suppression of the root rot and wilt diseases in pulses.Biomolecular Concepts,13(1),103-118.

Manivasagan, P., Venkatesan, J., Sivakumar, K., and Kim, S.K (2013) Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives.Microbiol Res, (168), 311–332.

Mansori, R., Issazadeh, K., Majid, K P M R., and Mirpour, M (2013) Antagonistic activity ofStreptomyces gresiofuscusPTCC1628 against isolated Gram negative bacteria from urinary tract infections.International Journal of Molecular andClinical Microbiology,2, 289-294.

Maser, W H., Purwoko, A., Yuliana, N D., Lubis, L M., and Khatib, A (2022).GC- MSbasedmetaboliteprofilingandantibacterialactivityoftorchginger(Etlingeraelatior) flowers extract.Indonesian Journal of Chemistry, 22(4):1014-1024.

Mebude, O.O., and Adeniyi B (2017) GC-MS Analysis of Phyto Components from the Stem Bark ofCola nitidaSchott & Endl.Journal of Plant Sciences 5(4), 99- 103.

Meena, B., Anburajana, L., Vinithkumara, N.V., Kirubagaranb, R., and Dharani, G. (2019) Biodiversity and antibacterial potential of cultivable halophilicactinobacteria from the deep sea sediments of active volcanic Barren Island.Microbial Pathogenesis,(132), 129–136

Mends, M T., Yu, E., Strobel, G A., Hassan, S R U., Booth, E., Geary, B., and Hadi,

M (2012) An endophyticNodulisporiumsp producing volatile organic compounds having bioactivity and fuel potential.Journal of Petroleum

Mets¨a-Ketel¨a, M., Salo, V., Halo, L.et al.(2002) Molecular evolution of aromatic polyketides and comparative sequence analysis of polyketide ketosynthase and 16S ribosomal DNA genes from variousStreptomycesspecies Applied andEnvironmental Microbiology,68(9),4472-4479.

Meyers, P.R., Goodwin, C.M., Bennett, J A., Aken, B L., Price, C E., and van Rooyen,

J M (2004).Streptomyces africanussp nov., a novel streptomycete with blue aerial mycelium.International journal of systematic and evolutionarymicrobiology,54(5), 1531–1535.

Miththapala, S (2008) Mangroves.Coastal Ecosystems Series.Volume 2, pp 1-28, Colombo, Sri Lanka: Ecosystems and Livelihoods Group Asia, IUCN.

Mohan, B., Saxena, H O., Parihar, S., and Kakkar, A (2020) Gas chromatography- mass spectrometry (GC-MS) determination of phytoconstituents from ethanolic and aqua-ethanolic root extracts ofUraria pictaDesv.(Fabaceae).The

Mohseni,M.,Norouzi,H.,Hamedi,J.,andRoohi,A.(2013).Screeningofantibacterial producingactinomycetesfromsedimentsoftheCaspiansea.Int.J.Mol.CellMed., 2:64-71

Mojsiewicz-Pieńkowska, K., Jamrógiewicz, M., Szymkowska, K andKrenczkowska,

D (2016) Direct Human Contact with Siloxanes (Silicones) - Safety or RiskPart

1 Characteristics of Siloxanes (Silicones).Frontiers in pharmacology,7,132.

Momin, K., and Thomas, S C (2020) GC-MS analysis of antioxidant compounds present in different extracts of an endemic plantDillenia scabrella(Dilleniaceae) leaves and barks.Int J Pharm Sci Res, 11, 2262-2273.

Mou, Y., Meng, J., Fu, X., Wang, X., Tian, J., Wang, M., and Zhou, L (2013). Antimicrobial and antioxidant activities and effect of 1-hexadecene addition on palmarumycin C2 and C3 yields in liquid culture of endophytic fungusBerkleasmiumsp Dzf12.Molecules,18(12), 15587-15599.

Moustafa, M.F., Alamri, S.A., Taha, T.H., and Alrumman, S.A (2013) In vitro antifungal activity ofArgemone ochroleucaSweet latex against some pathogenic fungi.African Journal of Biotechnology, 12(10), 1132-1137.

Moyo, B., Oyedemi, S., Masika, P J., and Muchenje, V (2012) Polyphenolic content andantioxidantpropertiesofMoringaoleiferaleafextractsandenzymaticactivity of liver from goats supplemented withMoringa oleiferaleaves/sunflower seed cake.Meat science, 91(4),441-447.

Mudalungu, C M., von Tửrne, W J., Voigt, K., Rückert, C., Schmitz, S., Sekurova, O. N., and Süssmuth, R D (2019) Noursamycins, chlorinated cyclohexapeptides identifiedfrommolecularnetworkingofStreptomycesnourseiNTR-SR4.Journalof natural products,82(6),1478-1486.

Mueller, J.H and Hinton, J (1941) A protein-free medium for primary isolation of theGonococcusandMeningococcus.Proceedings of the Society for

Nandhini, S U., and Selvam, M M (2013) Bioactive compounds produced byStreptomycesstrain.International Journal of Pharmacy and

Nandhini,S.U.,Sudha,S.,Jeslin,V.A.,andManisha,S.(2018).Isolation,identification and extraction of antimicrobial compounds produced byStreptomycessps from terrestrial soil.Biocatalysis and agricultural biotechnology,15,317-321.

Naragani, K., Mangamuri, U., Muvva, V., Poda, S., and Munaganti, K (2016). Antimicrobial potential of Streptomyces cheonanensis VUK-a from mangrove origin.Int J Pharm Pharm Sci,8, 53-57.

Ndam, L M., Mih, A M., Tening, A S., Fongod, A G N., Temenu, N A., and Fujii,

Y (2016) Phytochemical analysis, antimicrobial and antioxidant activities ofEuphorbia golondrinaLC wheeler (Euphorbiaceae Juss): an unexplored medicinal herb reported from Cameroon.Springerplus,5, 1-15.

Newman,D.J,andCragg,G.M.(2004).Marinenaturalproductsandrelatedcompounds in clinical and advanced preclinical trials.J Nat Prod.,(67), 1216 -1238

Ngọt, P.V., Bằng, P.X và Em, Q.V.T (2015) Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loài cây ngập mặn ở khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.Tạp chí khoa họcĐHSP TP.HCM,5(70), 140.

Nguyen,V.T.H.,Son,C.K.,andTien,P.Q.(2018).Classificationandcharacterization of endophytic actinomycetes isolated fromCinnamomum cassiaPresl.VietnamJournal of

Ningthoujiam, D.S., Sanasam, S., and Nimaichand, S (2009) Screening of actinomycete isolates from niche habitats in Manipur for antibiotic activity.American Journal of Biotechnology,5(4), 221-225.

Noureen,S.,Riaz,A.,Ali,E.,Sajid,I.,Zaman,W.,andArshad,N.(2022).Isolationand identification of antioxidant constituents from extracellular metabolites ofLactobacillus brevis.Journal of Animal & Plant Sciences, 32(2),604-608.

Nwofor, C N., Duru, C E., and Onyenwe, N E (2022) Computational identification of small molecules inMitracarpus scaberethanolic leaf extract with fungal keratinaseinhibitorypotentials.JournalofNaturalPesticideResearch,2,100010.

Obaseki, O., Adesegun, O., Anyasor, G.N., and Abebawo, O (2016) Evaluation of the anti-inflammatory properties of the hexane extract ofHydrocotyle bonariensisComm Ex Lam leaves.African Journal of Biotechnology,15, 2759-

Odumosu,B.T.,Buraimoh,O.M.,Okeke,C.J.,Ogah,J.O.,andMichelJr,F.C.(2017) Antimicrobial activities of theStreptomyces ceolicolorstrain AOB KF977550 isolated from a tropical estuary.Journal of Taibah University for Science,11(6), 836-841.

Oh, D.C., Gontang,, E.A., Kauffman C.A., Jensen, P.R., and Fenical, W (2008). Salinipyrones and pacificanones, mixed-precursor polyketides from the marine actinomyceteSalinispora pacifica J Nat Prod.,71(4), 570.

Okafor, N (2007).Modern industrial microbiology and biotechnology SciencePublishers: Enfield, New York.

Okunowo,W.O.(2017).Antimicrobial,antioxidantpotentialandchemicalcomposition of the methanolic extracts ofSpirogyra setiformisandNaviculaspecies.Journalof Scientific

Okwu, D E., and Ighodaro, B U (2010) GC-MS evaluation of bioactive compounds and antibacterial activity of the oil fraction from the leaves ofAlstonia booneiDe

Olano, C., Wilkinson, B., Sánchez, C., Moss, S J., Sheridan, R., Math, V and Salas, J.

A (2004) Biosynthesis of the angiogenesis inhibitor borrelidin byStreptomycesparvulusTü4055: cluster analysis and assignment of functions.Chemistry &biology,11(1),87-97.

Orchard,A.,Moosa,T.,Motala,N.,Kamatou,G.,Viljoen,A.,andVuuren,S.V.(2023) Commercially availableViola odorataoil, chemical variability and antimicrobial activity.Molecules,28(4), 1676.

Osama, S., Ayesha, S., and Mohammad, F.I (2014) Effects of papaya leaves on thrombocytecountsindengue:Acasereport.J.PakistMedAssoc,(64),364–366.

Ottoni, C.A., Amini, M.S., Alam, I., Alzubaidy, H., Mokhtar, N., Archer, J.A.C, and Bajic, V.B (2015) Soil and rhizosphere associated fungi in gray Mangroves (Avicennia marina) from the Red Sea - a metagenomic approach.Genom.

Padmavathi, A R., Abinaya, B., and Pandian, S K (2014) Phenol, 2, 4-bis (1, 1- dimethylethyl) of marine bacterial origin inhibits quorum sensing mediated biofilm formation in the uropathogen Serratia marcescens.Biofouling, 30(9), 1111-1122.

Palla, M.S., Guntukua G.S., Muthyalaa, M.K.K., Pingalia, S., and Sahu, P.K (2018). Isolation and molecular characterization of antifungal metabolite producing actinomycete from mangrove soil.Beni-Suef University Journal of Basic andApplied Sciences,(7), 250–256.

Pandey, I Ali, K S Butola, T Chatterji and Singh, V (2011) Isolation and characterization of actinomycetes from soil and evaluation of antibacterial activities of actinomycetes against pathogen.Int J Appl Biol Pharm Technol., 2(4), 384–392.

Paramanantham, M and Murugesan, A (2014) GC-MS analysis ofHolarrhenaantidysentricaWall flower.Int J Sci Eng Technol Res,3(3), 631-635.

Passari, A K., Yadav, M K., and Singh, B P (2018) In vitro evaluation of antimicrobial activities and antibiotic susceptibility profiling of culturable actinobacteria from fresh water streams.Indian Journal of Experimental

Passari, A.K., Mishra, V.K., Singh, G., Singh, P., Kumar, B., Gupta, V.K., Sarma, R.K., Saikia, R., Donovan, A O’, and Singh, B.P (2017) Insights into the functionality of endophytic actinobacteria with a focus on their biosynthetic potential and secondary metabolites production.Nature Scientific Reports,(7),11809.

Persson J, Chater KF, Flọrdh K 2013 Molecular and cytological analysis of the expression ofStreptomycessporulation regulatory genewhiH.FEMS

Peters, S., Koschinsky, S., Schwieger, F., and Tebbe, C.C (2000) Secession of microbial communities during hot composting as detected by PCR single-strand conformation polymorphism-based genetics profiles of small-subunit rRNA genes.Appl Environ Microbiol,66(3), 930-936.

Phú,N.T.vàThương,V.T.(2016).Phânlập,tuyểnchọncácchủngnấmsợicókhảnăng tạolovastatintừrừngngậpmặnCầnGiờ.TạpchíkhoahọcĐHSPTP.HCM,(47), 119

Phú, N.T và Thủy, T.T (2013) Phân lập, tuyển chọn chủngBacillus thuringiensistừ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu.Tạp chí khoa học ĐHSP TP.HCM, (51), 49

Phuong,T.V.and Diep, C N (2021) Screening of Sponge-associated Actinobacteria against Human Pathogenic Candida albicans in Kien Giang Sea, Vietnam‖.International Journal of Innovations in Engineering andTechnology,7(7),21-26.

Png,K.K.,andLee,P.C.(2020).Isolationandclassificationofantimicrobialproducing microroganisms from mangroves in Sabah.International Journal of

PubChem (2022), National Library of Medicine,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov,truy cập ngày 27/2/2022.

Qattan, S.Y.A., and Khattab, A.A (2019) Molecular characterizationof

Streptomycesalbogriseolusexcellent mutants for neomycin production.Journal of Pure andApplied Microbiology,13(3), 1489-1498.

Qureshi, M Z., Javed, S., Javaid, A., and Al-Taie, A H (2020) Identification of antimicrobialcompoundsfromn-hexanestemextractofKochiaindicabyGC-MS analysis.MYCOPATH, 16(2), 51-55

Rajan, B M., and Kannabiran, K (2014) Extraction and identification of antibacterial secondary metabolites from marineStreptomycessp.

VITBRK2.Internationaljournal of molecular and cellular medicine,3(3), 130.

Ramesh, S., and Mathivanan, N (2009) Screening of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal, India for antimicrobial activity and industrial enzymes.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25(12), 2103-2111.

Ranjani, A., Dhanasekaran, D., and Gopinath, P.M (2016) An Introduction to Actinobacteria Actinobacteria- Basics and Biotechnological Applications.

Rao,M.R.,andAnisha,G.(2018).PreliminaryphytochemicalandGCMSstudyofone medicinal plantCarissa spinarum.Indo Am J Pharm Res, 8,414-21.

Retnowati,W.(2010).IdentificationofStreptomycessp-MWS1producingantibacterial compounds.Indonesian Journal ofTropicaland Infectious Disease, 1(2),82-85.

Rizwana,H.,AlOtibi,F.,andAl-Malki,N.(2019).Chemicalcomposition,FTIRstudies and antibacterial activity ofPassiflora edulis f edulis(Fruit).Journal of Pure &Applied

Rosmine, E and Varghese, S.A (2016) Isolation of actinomycetes from mangroveand estuarine sediments of Cochin and screening for antimicrobial activity.Journal ofCoastal Life

Tiêu đề	Phân Lập Và Tuyển Chọn Các Vi Khuẩn Sợi (Actinobacteria) Tạo Kháng Sinh Trong Đất Rừng Ngập Mặn Cần Giờ, Thành Phố Hồ Chí Minh
Tác giả	Nguyễn Tuấn Hải
Người hướng dẫn	GS.TS. Cao Ngọc Điệp
Trường học	Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	226
Dung lượng	8,43 MB