Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí MinhPhân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp các chất ức chế vi khuẩn gây bệnh cho con người.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng là các vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tạo kháng sinh

Nghiên cứu được giới hạn trong các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc 6 đơn vị hành chính cấp xã của huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, thu thập trong thời gian từ tháng 02 đến tháng 4 năm 2019.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu và tiến hành phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh được thực hiện từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 Sau đó định danh vi khuẩn sợi từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021

Các nghiên cứu vi sinh vật được tiến hành tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ Một số phân tích GC-MS và hóa học chuyên sâu khác được thực hiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại Học Cần Thơ

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi bằng kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA, với cặp mồi đặc hiệu S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19 (Sun et al., 2015), so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi đồng thời xây dựng giản đồ phân nhóm di truyền bằng phần mềm MEGA

- Thu nhận hoạt chất kháng vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra hoạt tính và phân tích thành phần hóa chất theo các phương pháp phân tích phổ sử dụng máy sắc ký ghép khối phổ (GC-MS).

Đóng góp mới của luận án

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trong đó, có 10 chủng kháng lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm là Bacillus cereus (8 chủng), E coli (4 chủng), S aureus (6 chủng) và V parahaemolyticus (3 chủng) Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định danh ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau:

Streptomyces tendae, S tanashiensis, S parvulus, S celluloflavus, S aegytia, S africanus, S albogriseolus và S laurentii Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học trong 8 dòng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là 100% Đã chọn được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 Sáu hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane Đối với S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1,

11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được xác định bao gồm: 2-pentanone, 4- hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2- hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềm năng nhưng chưa được quan tâm nhiều Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bản địa; là công trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen chỉ thị kháng

4 sinh của vi khuẩn sợi trong đất ở rừng ngập mặn huyện Cần Giờ Đồng thời, chất kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tương lai.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh có đặc tính tổng hợp được kháng sinh Kết quả của luận án góp phần làm phong phú tư liệu vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đông Nam Á nói chung về thành phần loài và các lợi ích Trong đó, có những loài mang ý nghĩa kinh tế - xã hội, góp phần trong công cuộc tìm kiếm kháng sinh mới Ý nghĩa thực tiễn là những vi khuẩn sợi ức chế được nhiều loài vi khuẩn gây hại có thể sẽ là nguồn sản xuất chất kháng sinh, khắc phục hiện tượng kháng thuốc, làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam Hơn nữa, giá trị của các vi khuẩn sợi như vậy càng khẳng định vai trò của rừng ngập mặn trong hệ sinh thái toàn cầu Riêng đối với rừng ngập mặn Cần Giờ, thể hiện được sự tươngst đồng về các loài vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới

Sơ lược về rừng ngập mặn

2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng quan trọng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll,

2014, Ottoni et al., 2015) Rừng ngập mặn trên thế giới phân bố chủ yếu ở Châu Á

(42%), Châu Phi (20%), Bắc và Trung Mỹ (15%), Châu Đại Dương (12%) và Nam Mỹ (11%); tỷ lệ bao phủ khoảng 60% –75% vùng nhiệt đới toàn cầu và các đường bờ biển cận nhiệt đới (Giri et al., 2011) Cây rừng ngập mặn chủ yếu là những loài cây thân gỗ, có hạt và một số cây bụi Trên thế giới có gần 70 loài cây rừng ngập mặn với chiều cao thay đổi từ 1,5 m đến 50 m Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là chi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera) (Miththapala, 2008) Cây rừng ngập mặn hình thành hai cơ chế thích nghi với điều kiện sống trong môi trường có nồng độ muối cao: một là trên lá cây có tuyến muối để bài tiết lượng muối thừa; hai là tích lũy muối thừa vào tế bào thịt lá hoặc vỏ cây sau đó sẽ được thải ra ngoài khi lá rụng hoặc khi tróc vỏ (Miththapala, 2008; Spelchan và Nicoll, 2014) Tổng diện tích rừng ngập mặn trên toàn thế giới vào khoảng 11 – 18 triệu hecta (Spelchan và Nicoll, 2014) Rừng ngập mặn đóng vai trò quan trọng khi cung cấp các sản phẩm sinh khối động-thực vật cho con người, điều tiết lũ, tích lũy phù sa và chuyển hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewel et al., 1998) Đất rừng ngập mặn là nơi có độ ẩm cao, độ mặn cao và chịu được tình trạng thiếu oxy, là một hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wu et al., 2016)

Trên thế giới chủ yếu có 3 loại rừng ngập mặn (Miththapala, 2008), bao gồm:

• Rừng ngập mặn ven sông, như tên gọi của nó, xuất hiện dọc theo sông suối và bị ngập bởi thủy triều hàng ngày Loại rừng ngập mặn này có thể được tìm thấy ở Kuraburi và Kapoe, Ranong, Thái Lan

• Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy dọc theo khu bảo vệ các đường bờ biển, các đảo và vùng nước lộ thiên của các vịnh và đầm phá Các rừng này bị ngập theo thủy triều nhưng không phải chu kỳ ngày đêm như loại ven sông Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy ở Vịnh Honda, Palawan, Philippine

• Rừng lưu vực: loại rừng này nằm sâu trong đất liền, trong vùng trũng kênh chảy từ nội địa ra bờ biển Chúng bị ngập không theo quy luật thủy triều Rừng ngập mặn lưu vực được tìm thấy ở Maduganga, Galle, Sri Lanka

2.1.2 Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Theo Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ có tên đầy đủ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Rừng ngập mặn (DTSQTG RNM) Cần Giờ,

6 là Khu DTSQTG đầu tiên của Việt Nam, được UNESCO công nhận vào ngày 21/1/2000, thuộc thuộc khu vực hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm ở phía Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha Rừng ngập mặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng như sau:

1 Vùng lõi, diện tích 6.134,43 ha, có chức năng bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên; bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước; bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả thực vật lẫn động vật; nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái có giới hạn

2 Vùng đệm, diện tích 29.152,10 ha đất rừng và 12.763,56 ha diện tích mặt nước), có chức năng phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ưu thế; bảo vệ vùng lõi; tạo không gian lớn hơn cho thú hoang hã ngoài vùng lõi; tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái; tạo điều kiện cho các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường

3 Vùng chuyển tiếp có diện tích 13.227,79 ha đất rừng và 7.267,47 ha mặt nước, gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ Vùng chuyển tiếp có chức năng khuyến khích các mô hình phát triển kinh tế, hợp tác với sự tham gia của cán bộ quản lý, các cơ sở kinh tế, các tổ chức đoàn thể, tôn giáo, văn hóa, xã hội, các nhà khoa học, các tổ chức giáo dục…

Theo Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), về đa dạng sinh học, rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ động-thực vật rất phong phú, bao gồm:

+ Hệ thực vật: có 318 loài thực vật bậc cao

- Nhóm cây ngập mặn chủ yếu: 37 loài

- Nhóm cây tham gia rừng ngập mặn: 56 loài

- Nhóm cây du nhập: 225 loài + Hệ động vật:

- Thú: 35 loài + Phiêu sinh vật: 66 loài động vật nổi, 66 loài thực vật nổi

Bên cạnh đó, trong rừng ngập mặn Cần Giờ có 3 khu bảo tồn các loài động vật, bao gồm:

• Khu bảo tồn chim (Sân Chim Vàm Sát) là môi trường sống của khoảng 2.000 cá thể chim thuộc 33 loài, trong đó có 26 loài định cư và 07 loài di cư

• Khu bảo tồn dơi (Đầm Dơi) tại tiểu khu 15a là nơi trú ngụ của hơn 500 cá thể dơi, chủ yếu là loài Dơi ngựa (Pteropus lylei);

• Khu bảo tồn khỉ (Khu Đảo Khỉ), với đàn Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis) phát triển trên 1.000 con

Ngoài ra, rừng ngập mặn Cần Giờ còn là nơi sinh sống của nhiều loài động-thực vật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007 Về thực vật có 2 loài là Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Chùm lé (Azima sarmentosa); về động vật có 9 loài bao gồm:

• Thú: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis);

• Chim: Bồ nông chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn (Anhinga melanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringa guttifer),

• Bò sát: Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah),

• Cá: Cá mang rổ (Toxotes chatareus)

(Nguồn: Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ, 2021) Để có được sự đa dạng sinh học như trên, rừng ngập mặn Cần Giờ phải trải qua 40 năm phục hồi kể từ khi bị tàn phá bởi chiến tranh trong những năm 1970 Đồng thời, áp lực ô nhiễm môi trường từ các khu công nghiệp và kinh tế năng động của thành phố Hồ Chí Minh vẫn là một nguy cơ cần kiểm soát để bảo vệ sự ổn định của hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ (Thanh-Nho và ctv., 2019).

Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn

Mật số vi sinh vật trong đất thường rất dồi dào và đa dạng, ước tính có đến 10 9 CFU/g đất, thuộc 10.000 loài (Griffiths và Philippot, 2013) Quần xã vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn và nấm mốc, đảm trách rất nhiều chức năng (80 – 90% các phản ứng trong đất thông qua trung gian vi sinh vật), hình thành mùn đất, tuần hoàn các yếu tố dinh dưỡng, cải thiện cấu trúc đất và ảnh hưởng đến cây trồng (Grzadiel et al., 2018) Đối với đất rừng ngập mặn, nhờ nguồn carbon và dinh dưỡng đầy đủ, các quần xã vi sinh vật rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyên sinh (Thatoi et al., 2012) Vi sinh vật đất rừng ngập mặn có khả năng chịu mặn và tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh (Sivakumar et al., 2007; Thatoi et al., 2012)

Rừng ngập mặn rất giàu các loại tảo phù du, tảo đáy và tảo nhu động Chúng thường tập trung ở khu vực gốc, rễ của cây ngập mặn và trong lớp đất bùn mềm Các loài tảo này có tính chống chịu khá đối với sự thay đổi độ mặn của môi trường và tạo được những chất chống đông máu, kháng ung thư (Thatoi et al., 2012) Đất rừng ngập mặn trên thế giới sở hữu đến 1500 loài vi nấm Trong số đó, có loài là tác nhân ký sinh gây bệnh cho cây rừng ngập mặn, nhưng có loài sản sinh ra acid hữu cơ tham gia vào cơ chế hòa tan lân cung cấp dinh dưỡng cho cây (Thatoi et al., 2012)

Vi khuẩn là quần xã nổi bật và tạo nhiều sinh khối cho rừng ngập mặn, bao gồm các loài với nhiều tính năng khác biệt như cố định đạm, hòa tan lân, oxy hóa lưu huỳnh, phân giải cellulose và vi khuẩn sinh methane (Thatoi et al., 2012)

Các loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia được ghi nhận khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh vi khuẩn Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương (Hong et al., 2009 và Retnowati, 2010) Sivakumar et al (2007) khẳng định chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc biển (rừng ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi trong đất liền Các hợp chất đó phức tạp về cấu trúc và đa năng về hoạt tính sinh học (Hong et al., 2009 và Li et al., 2010) Có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học được báo cáo do vi khuẩn sợi tổng hợp và 80% các hoạt chất này được thu nhận từ

Streptomyces (Berdy, 2005) Môi trường rừng ngập mặn như vị trí địa lý, pH, nhiệt độ, độ mặn, độ ẩm và dinh dưỡng rất biến động ở các vùng khác nhau nên vi khuẩn sợi rừng ngập mặn rất đa dạng và độc đáo; theo thống kê của Amrita et al (2012) có 24 chi của

11 họ và 8 phân ngành dưới bộ Actinomycetales được phân lập và định danh từ rừng ngập mặn Có đến 2.000 dòng vi khuẩn sợi được phân lập từ rừng ngập mặn và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễm trùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), các enzyme phân giải… (Hong et al., 2009) Tuy nhiên, vì những khó khăn khi nuôi cấy nên chỉ mô tả xác định được rất ít (5%) số lượng chủng loài, chưa tương xứng với tiềm năng sẵn có (Thatoi et al., 2012) Do vậy, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác trong tương lai.

Vi khuẩn sợi

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)

Về nguồn gốc danh xưng “vi khuẩn sợi” (actinobacteria), theo Dworkin (2006), nhóm vi sinh vật này có nhiều tên gọi và được phân loại không rõ ràng thành nấm hoặc vi khuẩn Danh từ “xạ khuẩn” - Actinomycete, được dùng từ năm 1870 đến 1921, (thậm chí hiện nay vẫn dùng ở Việt Nam) Từ sau năm 1980, nhờ những thành tựu trong việc so sánh trình tự 16S rDNA kết hợp với các tiêu chí phân loại hóa học (chemotaxonomic), cùng với đặc điểm những vi sinh vật Gram dương có thể có hoặc không có cấu trúc “tia xạ”, Dworkin (2006) đề xuất một tên phân loại mới là Actinobacteria – vi khuẩn sợi (VKS) Do vậy, đây sẽ là từ được dùng trong luận án này

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên

Vi khuẩn sợi là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong những cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được Số lượng vi khuẩn sợi trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất bề mặt thường có mật số vi khuẩn sợi lớn trong đất Số lượng vi khuẩn sợi trong đất thay đổi theo thời gian trong năm Trong đất vùng rễ, vi khuẩn sợi thể hiện tỷ lệ cao về sinh khối vi sinh vật Mật số của chúng thường chiếm hơn 30% (khoảng 10 6 đến 10 9 CFU/g) và thông thường hai chi Streptomyces và Nocardia chiếm ưu thế, thậm chí Streptomyces có thể chiếm khoảng 95% (Ventura et al., 2007)

Vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như hải miên (bọt biển) và san hô (Shamar et al., 2014) Vi khuẩn sợi ở biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những loài Streptomyces spp có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaC l 10%, chi Micromonospora spp và Salinospora spp đều có khả năng chịu mặn cao (Solano et al., 2009)

2.3.3 Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi a Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện nuôi cấy Khuẩn lạc của vi khuẩn sợi không trơn, ướt như ở vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có thể có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo (Hình 2.1) Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)

Hình 2.1: Hình dạng các khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường tinh bột-casein đặc (Starch casein agar) (Ranjani et al., 2016)

Vi khuẩn sợi giống có hệ sợi giống nấm mốc, nhưng lại đơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn Vi khuẩn sợi có 3 lớp khuẩn ty, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ, có thể tích lũy trong sinh khối của tế bào vi khuẩn sợi hay được tiết ra môi trường (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)

Trên môi trường đặc, hệ sợi của vi khuẩn sinh trưởng thành hai hướng tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh (Hình 2.2) Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty khí sinh còn được gọi là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp là loại khuẩn ty sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm Nhiều loài vi khuẩn sợi chỉ có khuẩn ty cơ chất mà không có khuẩn ty khí sinh, nhưng có loài vi khuẩn sợi thuộc chi

Sporichthya lại chỉ có khuẩn ty khí sinh Khi đó, khuẩn ty khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)

Hình 2.2: Khuẩn ty ở vi khuẩn sợi (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001)

Khuẩn ty của vi khuẩn sợi thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính từ 0,2 - 3 àm, khụng cú vỏch ngăn và khụng tự đứt đoạn Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu cỏc khuẩn ty khí sinh thường hình thành các sợi bào tử Khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Đặc điểm này phân biệt với nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc cú đường kớnh rất lớn thay đổi từ 5 – 50 àm, dễ quan sỏt bằng mắt thường (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001) c Thành thế bào

Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2001) thành tế bào vi khuẩn sợi có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin Thuộc nhóm này có các chi:

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin Thuộc nhóm này có các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm các chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose Gồm các chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora

Thành tế bào vi khuẩn sợi chủ yếu gồm 03 lớp: lớp ngoài dày 60 – 120 Å, khi già có thể dày tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dày 50 Å và lớp trong dày 50 Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptide gồm các gốc N-acetylglucosamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glycoside Lớp ngoài thành tế bào vi khuẩn sợi có cấu tạo bằng lipid Thành tế bào vi khuẩn sợi không chứa cellulose hay chitin Vi khuẩn sợi phân lập từ các vùng ngập mặn có thành tế bào dày hơn và độ bền cơ học cao hơn, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35 o C) Thành tế bào của nhóm vi khuẩn sợi chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều acid như acid galacturonic, acid glutamic, acid aspartic và acid phosphoric Với điện tích âm, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na + , H + , ngược lại thải các ion OH - Bên cạnh đó, tuy nhóm vi khuẩn sợi trung tính và nhóm chịu kiềm có lớp peptidoglycan giống nhau về cấu trúc nhưng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, vi khuẩn sợi ưa kiềm chứa nhiều hesoamin và acid amin (Kamekura và Kates, 1999) d Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại vi khuẩn sợi là dựa vào hình thái và kích thước của cuống sinh bào tử (Barka et al., 2016) Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (retiflexibilis), xoắn (spirales) hoặc có móc, vòng (retinaculiaperti)… có loại mọc vòng một cấp, có loại mọc vòng hai cấp Một số vi khuẩn sợi có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang Bề mặt của bào tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài vi khuẩn sợi Sự hình thành bào tử bắt nguồn từ sự hình thành khuẩn ty khí sinh Bào tử vi khuẩn sợi được hình thành theo ba phương thức sau đây: (1) phương thức sinh trưởng toàn bộ (toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra bào tử); (2) phương thức sinh trưởng trong thành ( bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty), trường hợp này gặp ở chi Planomonospora; (3) phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật (thành khuẩn ty không tham gia vào quá

12 trình hình thành bào tử), trường hợp này gặp ở chi Thermoactinomycetes (Barka et al., 2016) Có mối quan hệ giữa sự hình thành bào tử và môi trường nghèo dinh dưỡng trong nuôi cấy vi khuẩn sợi (Barka et al., 2016) Việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trường sẽ kích thích sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định Nếu môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình hình thành bào tử thường sẽ bị kìm hãm Độ ẩm và nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử (Schmidt et al., 2005)

Bào tử vi khuẩn sợi được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å chia làm 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH,… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử, cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại vi khuẩn sợi Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau (Shamar et al., 2014; Barka et al., 2016) e Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỷ lệ G – C cao (xấp xỉ 70% hoặc hơn) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45% (Ventura et al., 2007; Verma et al., 2013) Ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các plasmid có thể tự nhân đôi Các plasmid này đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng khuẩn (Ventura et al., 2007) Vi khuẩn sợi không ổn định về di truyền và thường xảy ra đột biến trong phân tử DNA Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc

Sự tự nhân lên của các đoạn DNA làm cho việc nghiên cứu di truyền ở vi khuẩn sợi phức tạp hơn (Ventura et al., 2007)

Vi khuẩn sợi thuộc loại sinh vật dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon đa dạng gồm đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrate Khả năng đồng hoá các chất thay đổi tùy theo chủng, loài khác nhau (Barka et al., 2016) f Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩn sợi

Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp

2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh

Theo Zaffiri et al (2012), hợp chất có tính kháng khuẩn đầu tiên được Ehrlich giới thiệu vào những năm 1909 - 1911 là Arsphenamine (sau đó gọi là Salvarsan), có chứa arsen Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh Penicillin từ loài nấm mốc

Penicillium notatum Năm 1932, khám phá ra các kháng sinh thuộc nhóm sulfanilamide

Năm 1943, Waksman và Albert Schatz thu nhận được chất Streptomycin từ loài vi khuẩn sợi Streptomyces griseus Năm 1949, chất Cephalosporin được thu nhận từ vi nấm Cephalosporium acremonium Xuất phát từ nhu cầu khắc phục hiện tượng vi khuẩn đề kháng lại kháng sinh, vào các năm 1961 và 1972 lần lượt có Ampicillin và Amocixillin là những kháng sinh thế hệ hai, được cải biến từ Penicillin Đến nay, có nhiều kháng sinh thuộc thế hệ ba và bốn với phổ kháng khuẩn rộng hơn, ứng dụng vào điều trị nhiều bệnh hơn và vẫn tiếp tục được cải tiến để đương đầu với vấn đề phát sinh những chủng loài vi sinh vật kháng thuốc Công thức phân tử của một số kháng sinh được trình bày trong Hình 2.5

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của (a) arsphenamine với 2 nguyên tử Arsen, (b) penicillin, (c) streptomycin, và (d) cephalosporin C Trong đó, streptomycin có cấu trúc phức tạp nhất Còn penicillin và cephalosporin có gốc R thay đổi để đáp ứng với sự đề kháng

Cơ chế tác động của một vài nhóm kháng sinh được Zaffiri et al (2012) tóm tắt như sau:

• Sulfonamide: ức chế sự hình thành folate, từ đó ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh này có phổ rộng, tác động lên cả vi khuẩn Gram âm và dương

• Penicillin: trong cấu trúc hóa học có vòng β-lactam Kháng sinh nhóm này ức chế sự hình thành peptidoglycan trong vách tế bào, bám vào những enzyme của vi khuẩn gây bệnh, từ đó thúc đẩy quá trình tự phân giải vách tế bào Đây là kháng sinh phổ rộng nhưng dễ bị đề kháng

• Streptomycin: là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn sợi, mở ra bước phát triển quan trọng trong điều trị y khoa Nó gắn vào tiểu phần 30S trong ribosome của vi khuẩn gây bệnh, dẫn tới đọc sai mã và ức chế quá trình tổng hợp protein Kháng sinh này phổ rộng nhưng đạt hiệu quả tốt trên vi khuẩn Gram âm

• Cephalosporin: có vòng β-lactam như penicilin nhưng hiệu quả tùy thuộc vào nhiều yếu tố Nó có hiệu quả điều trị với vi khuẩn Gram âm nhưng kém với vi khuẩn Gram dương và cho tới nay trải qua cải biến bốn thế hệ

2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp:

Mặc dù chất kháng sinh đầu tiên được khám phá ở vi khuẩn sợi là Actinomycin, khi nuôi cấy loài Streptomyces antibioticus trong năm 1940 (Barka et al., 2016), nhưng chất thường được nhắc đến là Streptomycin (1943-1944) vì theo Clardy et al (2009), danh từ kháng sinh – (antibiotics) do Waksman đề xuất sau khi thu nhận chất này từ loài

Streptomyces gryseus phân lập trong hệ vi sinh vật đất (Zaffiri et al., 2012) Bên cạnh đó, chất kháng nấm từ vi khuẩn sợi là Nistatin được thu nhận từ dịch nuôi cấy loài

Streptomyces noursei (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Y học hiện nay thu nhận được nhiều chất kháng sinh hơn, phần lớn (70%) có nguồn từ vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces (Ningthoujam et al., 2009 và Sharma et al., 2014) Các kháng sinh này thuộc các nhóm chất như: aminoglycoside, anthracyclin, macrolide, β-lactam, cloramphenicol, tetracyclin, nhóm polyene và griseofulvin (Barka et al., 2016) Các macrolide được xếp loại theo kích cỡ vòng genin, quan trọng nhất là các chất có vòng mang 14 đến 16 nguyên tử carbon Riêng vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương đủ khả năng tổng hợp khá nhiều nhóm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u và độc tố tế bào (Manivasagan et al., 2013)

Theo Xu et al (2014), hiện có 122 chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau bao gồm 49 hợp chất phổ biến và 73 chất mới thu được từ vi khuẩn sợi rừng ngập mặn, bao gồm các alkaloid, benzen và các dẫn xuất cyclopentenon, dilactone, macrolite, 2-pyranones, sesquiterpenes và một số chất đặc biệt như salinosporamides, xiamycins và indolocarbazoles Chi Streptomyces tiếp tục được Xu et al (2014) đánh giá là nguồn sản xuất phong phú nhất Mặc dù các hợp chất được phát hiện lại nhiều lần, nhưng chúng vẫn được ghi nhận có hoạt tính sinh học mới tiềm năng (Xu et al., 2014)

Manivasagan et al (2013) tổng kết các kháng sinh trên thế giới, trong đó nhấn mạnh vai trò của nhóm vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương, bao gồm:

1 Aminoglycoside: như Streptomycin là kháng sinh được khám phá từ vi khuẩn sợi Streptomyces griseus (Hình 2.6)

2 Chloramphenicol (Hình 2.7), được phát hiện từ vi khuẩn sợi Streptomyces venezuelae; Tetracycline và Anthrocycline…đều là sản phẩm của vi khuẩn sợi Streptomyces sp

3 Glycopeptides, β-lactams, polyenes và actionomycins: Vancomycin (Hình

2.8) là kháng sinh điều trị nhiễm trùng ức chế vi khuẩn Gram dương

4 Peptides đa phân tử ngắn: Hầu hết peptide của Streptomyces dạng vòng và chứa những phân tử hiếm như chromophores hay những acid amin Piperazimycins A–

C là hexadepsipeptides độc phân lập từ sự lên men dung dịch Streptomyces sp

Piperazimycin A ngăn chặn tổng hợp protein ở tế bào khối u làm khối u không phân cắt được (Hình 2.9 và 2.10)

Hình 2.6: Các kháng sinh thuộc nhóm amino - glycosides

Hình 2.7: Các kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol

Hình 2.8: Các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptide, β-lactams và các dẫn xuất

Hình 2.9: Các kháng sinh thuộc nhóm peptides (Manivasagan et al., 2013)

5 Polyesters: Bonactin (Hình 2.11), một ester kháng khuẩn, phân lập từ

Streptomyces sp BD21-2 ở mẫu đất trầm tích ven biển Hawaii, có khả năng kháng lại cả vi khuẩn Gram-dương, Gram-âm và kháng nấm (Schumacher et al., 2003)

Hình 2.11: Cấu trúc hóa học của polyester (Nguồn: Schumacher et al., 2003)

6 Các hợp chất sinh học mới: Salinipyrones A và B (Hình 2.12) là những polyketides mới, phân lập từ vi khuẩn sợi biển Salinispora paciﬁca; tuy chưa được xác định làm dược phẩm cho người nhưng salinipyrone A có tác dụng như interleukin-5 ở nồng độ 10 àg/ml mà khụng ảnh hưởng đến dũng tế bào HCT-116 ở người (Oh et al., 2008) Newman và Crag (2004) báo cáo rằng loài Micromonospora marina thu thập từ ngoài khơi Mozambique tổng hợp được chất ức chế DNA α-polymerase, có tác dụng với khá nhiều dòng tế bào ung thư

Hình 2.10: Cấu trúc hóa học của các polypeptides

Loài Streptomyces coeliolor là hình mẫu để nghiên cứu sự tổng hợp kháng sinh với hơn 20 cụm gene mã hóa cho các chất trao đổi trung gian Hình thái của vi khuẩn sợi (phân mảnh hay nén chặt) có mối liên hệ phức tạp đến việc tạo thành kháng sinh (Barka et al., 2016) Có thuyết cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn sợi (Manivasagan et al., 2014); có ý kiến cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia vào quá trình cạnh tranh của vi khuẩn sợi trong môi trường sống tự nhiên (van der Heul et al., 2018) Nhìn chung, các con đường sinh ra chất kháng sinh từ vi khuẩn sợi được tóm tắt như sau (Clardy et al., 2009):

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozide)

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc 1 khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin)

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polymer hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác Có 4 dạng polymer hóa:

+ Chất kháng sinh nhóm polypeptide theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin

+ Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polymer hóa các đơn vị acetate, propionate: chất kháng sinh nhóm macrolide, tetracilin, rifamicin

+ Chất kháng sinh aminoglycozide được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacaride: neomicin, streptomycin

Hình 2.12: Cấu trúc hóa học của 1 số hợp chất sinh học mới (Oh et al., 2008)

+ Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonide từ các đơn vị acetate,…

Nghiên cứu về các chất chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn sợi rừng ngập mặn vẫn còn ở giai đoạn bắt đầu và rất cần khai thác khẩn cấp như một nguồn sản phẩm tự nhiên có giá trị Theo Giri et al (2011) và Xu et al (2014), các nghiên cứu và kỹ thuật bao gồm sàng lọc dựa trên trình tự, khai thác bộ gen hoặc phân lập các loài mới có thể nâng cao hiệu quả của việc khám phá các sản phẩm từ vi khuẩn sợi rừng ngập mặn Mặc dù thu được khá nhiều kết quả quan trọng, nhưng những thách thức vẫn tồn tại vì các lý do sau: (1) sản phẩm hoạt chất bị trùng lặp; (2) chưa có kỹ thuật phân tích và nhận biết cấu trúc hóa học hiệu quả hơn; (3) sự suy giảm diện tích nghiêm trọng của rừng ngập mặn; (4) có những loài không thể nuôi cấy trong môi trường thí nghiệm; (5) chi phí tài chính cao (Giri et al., 2011 và Xu et al., 2014).

Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh

Polyketide là một nhóm các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đa dạng, bao gồm polyketide týp 1 và týp 2, được tạo thành do quá trình trùng ngưng các đơn vị acid carboxylic (giống như tổng hợp acid béo) Các polyketide có ứng dụng trong nông nghiệp lẫn y học, có thể kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tác nhân ung thư (Zhao et al., 2009, 2011, 2018) nhưng theo Manivasagan et al (2013) đa số polyketide có khả năng kháng khuẩn, ngược lại độc tính gây chết tế bào và khả năng kháng nấm không cao Những thuốc có chất polyketide bao gồm: aurantimycin, chartreusin, cocanamycin, kirromycin, lisolipin và polyketomycin (Weber et al., 2003) Các vi khuẩn sợi phân lập từ biển sâu (hoặc nói chung là có nguồn gốc từ biển/đại dương – marine actinobacteria) thường có những enzyme tổng hợp polyketide (PKS – polyketide synthases) và enzyme tổng hợp polyketide không phải ribo-thể (NRPS – nonribosomal polyketide synthase) (Zhao et al., 2009; Sun et al., 2015) Theo nghiên cứu của Ayuso et al (2005), mã hóa cho enzyme tổng hợp polyketide (chỉ thị kháng sinh) gồm các gen là pksI, pksII và nrps Ở vi khuẩn sợi các gen tổng hợp polyketide thường phân bố theo từng cụm (Manivasagan et al., 2013)

Theo Jenke-Komada et al (2006), các enzyme tổng hợp polyketide týp 1, tương ứng với PKS-I của vi khuẩn sợi là các enzyme đa chức năng để lắp ráp các cấu trúc phức tạp từ các khối cấu tạo carbon đơn giản Các vị trí hoạt động của PKS týp 1 được tổ chức tuyến tính thành các khối, mỗi khối xúc tác một chu kỳ kéo dài Một khối tối thiểu chứa một enzyme ketosynthase (KS), một acyltransferase (AT) và một miền protein mang gốc acyl (ACP) Tính đặc hiệu của AT đối với malonyl-CoA, methylmalonyl-CoA, hoặc các α-alkylmalonyl-CoA khác có vai trò xác định chất kéo dài mạch carbon Hơn nữa, vì methylmalonyl-CoA và α-alkylmalonyl-CoA có tâm bất đối xứng, nên sự kết hợp của chúng tạo ra các đồng phân lập thể khác nhau của chuỗi polyketide kéo dài

Sau khi trùng ngưng, trạng thái oxy hóa của β-carbon hoặc được giữ dưới dạng nhóm ceto hoặc được biến đổi thành nhóm hydroxyl, methine hoặc metylene bằng hoạt động tùy chọn của enzyme ketoreductase (KR), khử nước (DH) và enoylreductase (ER) Sự biến đổi khác xuất phát từ sự tồn tại của hai loại miền KR tạo ra các đồng phân lập thể khác nhau liên quan đến β-carbon bất đối Khả năng kết hợp các biến thể khác nhau theo cách hoán vị tạo ra sự đa dạng rất lớn về cấu trúc polyketide Về mặt lý thuyết, một hệ thống PKS bao gồm sáu khối kéo dài có thể tạo ra hơn 100.000 cấu trúc (Jenke-Komada et al., 2006)

Như vậy, các khối tổng hợp polyketide (PKS) của vi khuẩn sợi là một nguồn dự trữ khổng lồ các hợp chất thiên nhiên Nghiên cứu con đường sinh tổng hợp những chất này có thể hỗ trợ việc thiết kế gen để thu nhận các hợp chất hoạt tính sinh học mới Qua khảo sát quan hệ di truyền của các đoạn mã hóa enzyme ketosynthase (KS) trên PKS của chi vi khuẩn sợi Streptomyces cho thấy phần lớn các khối tham gia vào quá trình sinh tổng hợp một hợp chất được phát triển bằng cách nhân đôi một khối đầu tiên duy nhất Sử dụng loài Streptomyces avermitilis làm sinh vật mẫu, Jenke-Kodama et al

(2006) tái tạo lại các mối quan hệ tiến hóa của những miền KS khác nhau Phân tích này cho thấy 65% các khối bị thay đổi bởi sự thay thế tái tổ hợp xảy ra trong và giữa các cụm gen sinh tổng hợp Các thay thế này bao gồm thay thế trên đoạn mã hóa cho acyltransferase (AT), ketoreductase (KR), và khử nước (DH) –KR tự nhiên Kết quả nghiên cứu của Jenke-Kodama et al (2006) chỉ ra sự tái tổ hợp tương đồng dựa vào tính lắp ráp theo khối của miền PKS, là cơ chế quan trọng nhất làm cơ sở cho sự đa dạng polyketide ở vi khuẩn sợi

Việc xác định sự có mặt của các gen mã hóa cho enzyme tổng hợp kháng sinh rất quan trọng để nhận diện và khẳng định khả năng tổng hợp kháng sinh của các vi khuẩn sợi (Ayuso et al., 2005) Các kỹ thuật sinh học phân tử như khuếch đại trình tự gen, lấy dấu phân tử và phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) thường được áp dụng trên các gen pks và nrps để đánh giá khả năng tạo kháng sinh của vi khuẩn sợi

(Ayuso et al., 2005; Zhao et al., 2009) Tuy nhiên, Ayuso et al (2005) cho rằng kỹ thuật PCR sàng lọc các gen liên quan đến chuyển hóa thứ cấp được sử dụng để đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của vi khuẩn sợi đều có hạn chế là không hiệu quả trong việc "chống sao chép” hoặc định danh các dòng phân lập, bắt buộc phải giải trình tự tăng cường của sản phẩm PCR Vì vậy, kết hợp dữ liệu thu được từ các phương pháp lấy dấu phân tử truyền thống và các phương pháp lấy dấu mới sẽ giúp các tập trung quá trình tuyển chọn vào các nhóm tiềm năng, làm tăng cơ hội tìm thấy các chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị Ayuso et al (2005) nghiên cứu kỹ thuật lấy dấu phân tử (finger printing) mới, dựa trên phân tích đoạn cắt giới hạn của các mảnh khuếch đại gen pks, nrps ở các chủng vi khuẩn sợi phân lập từ đảo ở biển Trung Mỹ, nhằm đánh giá hiệu năng và mối liên hệ giữa sự tồn tại của các gen này với khả năng tổng hợp kháng sinh Bên cạnh đó, so sánh trình tự những vùng KS (khoảng 700 bp trên gen pksI) (Zhao et al., 2009) và KSα, KSβ

(trên gen pksII) phản ánh được sự đa dạng chủng loài và dùng làm tiêu chí xây dựng cây phân loại (hoặc cây phả hệ) Kết quả nhận ra được 7 vùng KS của loài Streptomyces avermitilis và ghi nhận tần số xuất hiện cao của các gen pksI, pksII, nrps trong các quẩn thể chi Streptomyces, Micromonospora và Nocardiaceae Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện cao nhất ở nhóm Streptomyces, đồng thời tỷ lệ phần trăm dương tính khi tầm soát PKS-I và NRPS cao gấp đôi ở nhóm vi khuẩn sợi hoạt hóa so với nhóm bất hoạt (Ayuso et al., 2005) Như vậy, ở chi này, sự hiện diện của các gen sinh tổng hợp có mối liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn Bên cạnh đó, sử dụng cây phả hệ để so sánh trình tự vùng KS của những dòng vi khuẩn sợi phân lập được với dữ liệu công bố trước cho thấy chi Streptomyces còn nhiều hoạt chất sinh học tiềm năng khác nữa (Ayuso et al., 2005) Điều này vẫn đúng với những loài vi khuẩn sợi khác, polyketide không chỉ có tính kháng khuẩn mà còn bảo vệ tế bào thần kinh, chống khối u và ức chế miễn dịch (Zhao et al., 2009)

Sự phát hiện các gen pksI, pksII và nrps phụ thuộc vào việc sử dụng cặp mồi trong phản ứng PCR có tương hợp hay không tương hợp (Weber et al., 2003) Bên cạnh đó, gen nrps không nhất thiết phải liên quan đến sinh tổng hợp chất thứ cấp, mà có thể liên quan đến chức năng khác như trao đổi sắt hoặc chưa rõ chức năng Tuy nhiên, chiến lược sàng lọc bằng PCR vẫn được đánh giá là hiệu quả trong việc tìm kiếm những chất thứ cấp có ích lợi mới (Jiang et al., 2007)

Kích thước của các gen pksI, pksII, nrps và trình tự các cặp mồi dùng để khuếch đại tương ứng được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng 2.3: Những cặp mồi dùng để khuếch đại các trình tự 16S rDNA, PKS-KS và NRPS-A của vi khuẩn sợi (Liu et al., 2019)

Cặp mồi Trình tự đích Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch đại (bp)

AGA GTTTGA TCM TGG CTC AG GGY TAC CTT GTT ACG ACT T

ATG GAY CCS CAR CAR CGB CT GCY TCG ATS GGR TCN CCS A

TSG CST GYT TCG AYG CSA T GCR TAG AAC CAS GCG AWS GAC

Vùng Adenyl hóa của NRPS

Qua bảng trên, có thể thấy các gen pksI và nrps có kích thước giống nhau (khoảng

700 bp), ngược lại cụm gen pksII có kích thước lớn hơn gần gấp rưỡi (khoảng 1070 bp) (Liu et al., 2019) Số liệu này so với nghiên cứu của Meena et al (2019) có sai lệch nhỏ (613 bp và 680 bp, tương ứng cho pksI và pksII) vì sử dụng cặp mồi khác Như vậy, việc khuếch đại gen có thể sử dụng những cặp mồi khác nhau, và dẫn đến sản phẩm PCR có kích thước không giống nhau ở mỗi nghiên cứu Tương tự, cặp mồi K1F/M6R dùng khuếch đại gen pksI sẽ cho ra đoạn khuếch đại có kích thước 1200-1400 bp (không còn là 700 bp và lớn hơn gen pksII, Jiang et al., 2007)

Sự biểu hiện của các gen chỉ thị kháng sinh như pksI và nrps được Passari et al (2017) khảo sát bằng kỹ thuật Realtime-qPCR Lượng mRNA của các gen này được tầm soát trong những khoảng thời gian từ 5 đến 15 ngày Kết quả cho thấy pksI được phiên mã tăng dần trong khoảng từ 5 đến 12 ngày nuôi cấy, sau đó giảm mạnh vào ngày thứ

15 Gen nrps có biểu hiện theo chu kỳ tương tự nhưng đến ngày thứ 15 vẫn ổn định Trong các chủng thu được, thì ngày thứ 12 đạt giá trị biểu hiện gen cao nhất Thông tin này có thể được lưu ý cho việc nghiên cứu lựa chọn thời gian sản xuất và thu nhận hợp chất sinh học từ vi khuẩn sợi Đất rừng ngập mặn Ấn Độ qua phân lập và giải trình tự 16S rRNA thu được nhiều loài trong chi Streptomyces Kumar et al (2018) tiến hành khảo sát các gen pksI, pksII và nrps trên 31 chủng vi khuẩn sợi phân lập; cùng với phân tích hóa học bằng phương pháp GC-MS (khối phổ) các sinh chất Kết quả nhóm chất PKS-I xuất hiện ở 6 chủng, nhóm chất PKS-II xuất hiện ở 4 chủng và nhóm chất NRPS có ở 11 chủng (trong số này có 1 chủng không thuộc chi Streptomyces); các chất sinh tổng hợp thuộc nhóm dị vòng, polyketide và peptide có khả năng kháng nấm Candida albicans Bên cạnh đó, nghiên cứu này kết luận các cụm gen thuộc dạng “gen ngủ” (cryptic-silent)

* Các gen chỉ thị kháng sinh khác của vi khuẩn sợi

Theo Barka et al (2016), sự hình thành kháng sinh liên quan đến giai đoạn khuẩn ty cơ chất bị biệt hóa thành các dạng cấu trúc sinh bào tử để đáp ứng lại điều kiện sống ngặt nghèo, thiếu hụt dinh dưỡng Những gen cần thiết cho sự hình thành cấu trúc khuẩn ty khí sinh (sinh bào tử) được đặt tên là các gen bld và whi Gen bld thấy ở những dòng đột biến khuẩn lạc không có dạng bông xù, còn gen whi thấy ở những dòng đột biến không tạo được sắc tố bào tử màu xám (Barka et al., 2016) Hầu hết những gen này được ghi nhận mã hóa cho nhiều yếu tố phiên mã và có chức năng điều hòa trong quá trình phiên mã và dịch mã Ví dụ gen bldD là một yếu tố phiên mã có tính đa hiệu cao, kiểm soát hàng trăm gen liên quan đến sự phát triển; hoặc gen whiH lại kiểm soát quá trình phân bào hình thành bào tử Từ đó có thể suy luận các gen quy định cho tính trạng cấu trúc khuẩn ty có mối liên hệ gián tiếp đến sự tổng hợp kháng sinh ở vi khuẩn sợi (Presson et al., 2013)

Bên cạnh đó, Sun et al.(2015) nghiên cứu thấy các chủng vi khuẩn sợi thuộc chi

Streptomyces và Sacchoropolyspora phân lập từ hải miên của biển Hoa Nam, Trung

Quốc là nguồn tiềm năng để thu nhận các polyketide mang vòng thơm (polyketide týp

2, ví dụ tetracycline thế hệ mới) được tổng hợp bởi enzyme β-ketoacyl synthase Enzyme này do vùng gen KSα mã hóa Sun et al.(2015) thu được một hợp chất angucycline Do vậy, vùng gen KSα này có thể dùng để đánh giá khả năng tổng hợp polyketide vòng thơm và qua đó gián tiếp làm điểm đánh dấu (marker) nhận diện các chủng tạo kháng sinh, hỗ trợ hiệu quả cho việc tuyển chọn vi khuẩn sợi Ngoài ra, khi so sánh tương đồng giữa các trình tự vùng gen KSα và phân tích phả hệ di truyền còn cho thấy sự đa dạng trong cấu trúc của các polyketide vòng thơm (Sun et al., 2015) Trên các gen pksI của những vi khuẩn sợi trong đất đều có vùng gen mã hóa KS- ketosynthase (Ayuso et al., 2005)

So sánh dấu phân tử của các gen pksI, pksII và nrps sử dụng enzyme cắt giới hạn

Hinf I kết hợp vẽ sơ đồ nhánh cây phả hệ thể hiện sự đa dạng di truyền trong các chủng loài vi khuẩn sợi hoang dại Đồng thời, có khả năng xuất hiện sự chuyển gen theo chiều ngang giữa các dòng hoang dại với nhau trong quần xã (Ayuso et al., 2005)

Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn

Vi khuẩn sợi là sinh vật tạo được các hợp chất có giá trị sinh học khác như chất kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế sự hình thành khối u (Zhao et al., 2009; Barka et al., 2016) và cả các sắc tố dùng trong nhiều lĩnh vực (Gu et al., 2018) Các nghiên cứu thường tập trung theo hướng phân lập, sàng lọc từ các nguồn như mẫu đất, mẫu sinh vật biển, mẫu trầm tích biển và trên đối tượng chủ yếu là các chủng loài thuộc chi

Streptomyces với tiềm năng được cho là lên đến hàng ngàn kháng sinh (Manivasagan et al., 2013) Việc khám phá ra các phân tử mới từ vi khuẩn sợi đánh dấu một giai đoạn trong tiến trình nghiên cứu kháng sinh vì kháng sinh của vi khuẩn sợi rất phức tạp, khó tổng hợp bằng con đường hóa học (Velho-Pereira et al., 2011) a Nghiên cứu về kỹ thuật phân lập: vi khuẩn sợi được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như đất, thực vật, động vật và cả trên con người (Okafor, 2007) Những yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn sợi (Zhao et al., 2011)

Phương pháp cấy trên dĩa thường sử dụng để phân tích những đặc tính hình thái của vi khuẩn sợi Hình dạng, màu sắc của khuẩn ty và bào tử có thể là cơ sở phân loại đến cấp độ họ và chi Việc chọn môi trường nuôi cấy thích hợp rất quan trọng vì nguồn dinh dưỡng và mật số vi khuẩn liên quan lẫn nhau (Gil et al., 2009) Có nhiều môi trường chuyên dành cho phân lập vi khuẩn sợi, tương ứng với từng nguồn lấy mẫu khác nhau như Agar Triplicase Soy, Blood Agar, Brain Heart Infusion… (Sharma et al., 2014)

Hầu hết vi khuẩn sợi phát triển trên môi truờng nuôi cấy, nhưng không sản xuất chất mucopolysaccharides như vi khuẩn, không bài tiết hay chịu khô như khuẩn lạc kem (creamy colonies) Sự phát triển bào tử thường xuất hiện màu (pigments), là dấu hiệu đặc trưng khi gặp một môi trường nuôi cấy bổ sung chitin, lúa mạch, tinh bột, muối vô cơ, và nước cứng Khuẩn lạc của những loài Streptomyces có dạng cứng sáng và nhợt nhạt trên môi trường Nutrient Agar, nhưng trong môi trường chứa lúa mạch hay môi trường có nguồn tinh bột kèm theo muối vô cơ, khuẩn lạc có màu sáng, vàng; khuẩn ty có thể phát triển thành cụm với màu sắc khác nhau (Bergey et al., 2000) Sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường đặc có thể quan sát bằng mắt thường sau 3 đến 4 ngày ủ nhưng sự phát triển bắt đầu có khuẩn ty khí sinh với những bào tử phải đợi từ 7 đến 14 ngày tiếp theo Ở một số vi khuẩn sợi khác thì sự phát triển của khuẩn lạc còn kéo dài cả tháng (Letek et al., 2012) Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, vi khuẩn sợi hình thành bề mặt phim hay một lớp mỏng trên bề mặt môi trường, dễ dàng phân biệt với sự nhiễm khuẩn làm cho môi trường trở nên đục hơn (Hình 2.13) Khi có sự khuấy động với tốc độ 200 - 220 rpm (vòng/phút), vi khuẩn sợi sẽ phát triển thành thể viên (pellets) hay sợi (filament) (Araujo-Melo et al., 2016)

Hình 2.13: Sự tăng trưởng của vi khuẩn sợi trong môi trường lỏng: A: phát triển bình thường, trong và rõ; B: Vi khẩn sợi bị đặc (thành phần phù sa); C: nuôi cấy vi khuẩn sợi bị nhiễm tạp (Araujo-Melo et al., 2016)

Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, hình thể của vi khuẩn sợi thay đổi tuỳ theo các chi Ví dụ, chi Arthrobacter và chi Rhodococcus, có kết quả là vi khuẩn hình cầu (coccobacillus shape), chi Nocardia cho thấy những mảnh của khuẩn ty và chi Streptomyces lại khác biệt rõ rệt với khuẩn ty phân nhánh (branched aerial mycelium)

Khuẩn ty có thể mang nhiều bào tử, khác nhau về số lượng và sự sắp xếp của chuỗi bào tử Trong chi Microbispora và Streptomyces, hình thành cặp dài có chuỗi mang bào tử, thẳng đứng, hay đính; trong khi ở chi Actinoplanes và Streptosporangio, bào tử thường có cọng mang bọc bào tử (sporangium) Sử dụng kính hiển vi điện tử có thể quan sát được bề mặt của bào tử như trơn láng, nhăn nheo (wrinkled), có gai (prickly) hay lông tơ (downy) (Bull et al., 2005, Bull và Stach, 2007 và Barka et al., 2016) b Các phương pháp nhận diện vi khuẩn sợi: Phối hợp phân tích đa hình thể và vi hình thể cùng với những phản ứng sinh hoá học và dinh dưỡng thường không cho thấy rõ sự khác biệt giữa vi khuẩn sợi với những nhóm vi khuẩn Gram-dương khác Như vậy, phân tích hệ gene bằng phương pháp sinh học phân tử là kỹ thuật cao nhất để định danh, phân loại chi tiết và xác định mối quan hệ di truyền với mỗi nhóm của vi khuẩn sợi (Cook và Meyers, 2003)

Trình tự của nucleotides ở 16S rDNA của một số loài biến động khá cao nhưng tỷ lệ đột biến thường thấp Một số lớn trình tự tích lũy trong ngân hàng dữ liệu giúp dễ dàng xác định tên phân loại bằng cách so sánh (alignments) với trình tự của những loài khác Thêm vào đó, ngoài những trình tự có tính cố định cao (đoạn bảo tồn), gene 16S rDNA còn có vùng biến động, mà có thể dùng để đo gần và đo xa mối quan hệ di truyền (phylogenetic relationships), cho phép xác định Giới (Domain), Ngành (Division), Lớp (Class), Bộ (Order), Họ (Family), Chi (genus) và Loài (species) của vi sinh vật được phân tích (Peters et al., 2000) Do vậy, trình tự 16S rDNA cho tới nay vẫn được sử dụng trong nhận diện vi khuẩn sợi

Ngoài ra, tuy vi khuẩn sợi mang thành phần guanine và cytosine (GC) trong DNA khá cao nhưng lại thay đổi trong khoảng khá rộng từ 51% như ở chi Corynebacterium, đến hơn 70% trong những loài của chi Streptomyces và Frankia, ngoại lệ lại kém hơn 50% ở loài Tropheryma whipplei (Chater và Chandra, 2006) Vì vậy, hàm hượng G+C chỉ là một trong những tiêu chí phân loại với mức chính xác tương đối không cao c Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sợi: thường dùng một số phương pháp như cấy đĩa đơn của Bauer được Velho-Pereira và Kamat (2011) cải tiến, hoặc giếng thạch (Palla et al., 2018) Theo nghiên cứu của Palla et al (2018), khi phân lập vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn Koringa, Ấn Độ, thu được dòng KMFA-1 (Koringa Mangrove Forest - Actinomycete) có tiềm năng đối kháng lớn với loài nấm C albicans và P llenense bằng chất đối kháng ngoại bào (Vi khuẩn sợi được chọn nuôi trong 7 loại môi trường khác nhau trên máy lắc 150 rpm ở 28°C trong 7 ngày để tạo chất kháng khuẩn thích hợp Sau đó, được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy dịch nổi, thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp dung hợp giếng thạch (well diffusion method) cho thấy tính năng kháng nấm Candida albicans và Pectinotrichum llanense)

Sử dụng phương pháp phân tích hóa học (MS – khối phổ) để định tính và định lượng các hợp chất sinh học của những dòng vi khuẩn sợi phân lập được từ mô thực vật họ cây tai voi Ấn Độ (Rhynchotoechum ellipticum), Passari et al (2017) phát hiện 16 hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm 6 loại kháng sinh (fluconazole, chloramphenicol, erythromycin, ketoconazole, rifampicin và miconazole), 8 hợp chất phenolic (catechin, kaempferol, acid chebulagic, acid chlorogenic, acid ferulic, acid arjunic, acid gallic và acid boswellic) và Paclitaxel, một hợp chất chống ung thư Trong số các kháng sinh được phát hiện, có ba loại kháng nấm (ketoconazol, fluconazole và miconazole) và ba loại khác là kháng khuẩn (chloramphenicol, erythromycin và rifampicin) Lượng chất khỏng nấm rất cao (trờn 270 àg/g dịch chiết) trong khi lượng chất chống ung thư hơi thấp (khoảng 10-23 àg/g dịch chiết) Hoạt tớnh khỏng khuẩn đạt mức trung bỡnh với kớch thước vòng vô khuẩn từ 10 – 12 mm, thể hiện ở 81 trên tổng số 169 dòng vi khuẩn sợi phân lập đuợc Tương tự, Sriragavi et al (2023) công bố kết quả phân lập, định danh và khảo sát tính kháng khuẩn của 9 chủng vi khuẩn sợi trong đó có một dòng thuộc chi

Streptomyces từ đất vùng rễ tre Ấn Độ: hoạt tính kháng khuẩn vượt trội đối với 3 loài vi khuẩn gây bệnh là Staphylococcus aureus (19 mm), Bacillus subtilis (12 mm) và Streptococcus pyogenes (10 mm), thành phần hoạt chất của cao chiết bằng ethyl acetate được phân tích GC-MS gồm có các hợp chất gốc phthalate và một số acid hữu cơ khác Ấn Độ là quốc gia tích cực hàng đầu trong khía cạnh tìm kiếm kháng sinh từ vi khuẩn sợi, với rất nhiều bài báo được công bố Trong thời gian 40 năm, thu thập được

41 loài thuộc 8 chi vi khuẩn sợi từ những vùng cửa sông, ven biển và rừng ngập mặn khắp Ấn Độ, trong đó có 34/41 loài thuộc vào chi Streptomyces (Sivakumar et al., 2007)

Tiềm năng to lớn của chi Streptomyces tiếp tục được Barka et al (2016) khẳng định với

34 những trích dẫn rằng còn hàng chục cụm gene mã hóa cho các chất trung gian chưa được khai thác

Bên cạnh đó, Ventola et al (2015), cho rằng gần đây hiện tượng các dòng vi khuẩn kháng lại kháng sinh trở nên báo động Suốt 30 năm qua dù có nhiều chi loài vi khuẩn sợi có khả năng tạo kháng sinh mới được phát hiện, số kháng sinh tổng hợp rất đáng kể nhưng vẫn chưa được xem là thế hệ kháng sinh mới hoàn chỉnh Do đó, càng thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các kháng sinh mới với tác dụng mạng mẽ hơn, hiệu quả hơn Các loài vi khuẩn sợi có nguồn gốc từ đại dương được đánh giá cao hơn vi khuẩn sợi trong đất liền (Sivakumar et al., 2007, Landwehr et al., 2016; Kumar et al., 2011) Lý do của sự ưu việt này là sự ảnh hưởng của môi trường sống khác biệt rất nhiều so với đất liền (Rosmine et al., 2016) Hệ sinh thái rừng ngập mặn, các cửa sông trở thành nguồn phân lập vi khuẩn sợi cung cấp kháng sinh mới đầy tiềm năng (Thatoi et al., 2012; Rosemine et al., 2016) Một số chi và loài vi khuẩn sợi mới được phân lập từ những môi trường này (Ningthoujam et al., 2009) Do đó các nhà khoa học Ấn Độ đang quan tâm nhiều đến vi khuẩn sợi ở biển và có xu hướng mở rộng nguồn phân lập vi khuẩn sợi ở những nguồn sinh học khác nữa như cá, sò, rong tảo biển, trầm tích … (Sivakumar et al., 2007) Trung Quốc đang nỗ lực nghiên cứu vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển Trong những năm 2007-2012, phân lập được vi khuẩn sợi từ hải miên ở biển Hoa Nam (Sun et al., 2015) và từ mẫu trầm tích biển ở Đại Liên (Zhao et al., 2009) thu được các chi hiếm gặp như chi Marihabitans, Polymorphosopora, Streptomonospora (Sun et al., 2015) Cả hai nghiên cứu đều cho thấy chi Streptomyces chiếm ưu thế, xuất hiện nhiều nhất trong các dòng vi khuẩn sợi thu được (14/40 loài ở biển Hoa Nam và 9/11 loài từ các loài ở biển Đại Liên) Vi khuẩn sợi phân lập từ trầm tích biển Đại Liên, Trung Quốc còn có sự tương đồng cao về trình tự giữa gen mã hóa cho PKS-I và gen mã hóa cho sự tổng hợp meridamycin, càng làm rõ tiềm năng tổng hợp kháng sinh của những dòng vi khuẩn sợi có mang gen pksI (Zhao et al., 2009) Đối với gen pksII, Li và Piel (2002) chuyển gen pksII của một loài Streptomyces phân lập từ động vật thân mềm ở biển vào loài Sreptomyces lividans để thu nhận kháng sinh rubromycin đạt hiệu suất cao hơn

Các nhà khoa học của Mỹ, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Đức và Ai Cập có xu hướng chuyển dần nghiên cứu từ vi khuẩn sợi trong nội địa sang nhóm đại dương, thể hiện qua các công trình của Ayuso et al (2005) với mẫu đất ven biển, Abdelmohsen et al (2010) với mẫu hải miên và Kumar et al (2018) với mẫu trầm tích biển; trong đó số lượng chi, loài liên kết với hải miên có phần phong phú hơn Vịnh California và Vịnh Mexico lại cho thấy sự đa dạng sinh học của vi khuẩn sợi (Maldonado et al., 2009) Ngoài ra, còn có những khảo cứu, phân lập từ những mẫu đất ở Nam Cực, thu được 39 chủng thuộc 9 chi có chất kháng nấm (Lee et al., 2012) Những dữ kiện này tiếp tục khẳng định tính phong phú và phân bố rộng của vi khuẩn sợi trong thiên nhiên

Mặc dù rất giàu tiềm năng nhưng điều kiện môi trường khắc nghiệt khiến cho các loài vi khuẩn sợi rừng ngập mặn chưa được khảo sát sâu rộng đầy đủ Có 40,2% các

35 chủng phân lập từ rừng ngập mặn Malaysia là những chi vi khuẩn sợi hiếm ngoài chi

Streptomyces và chỉ mới biết được 25% các hợp chất sinh học của chúng (Azman et al.,

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện các nội dung thí nghiệm bắt đầu từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 12 năm 2021 và phân tích dữ liệu đến tháng 01 năm 2022

Thu thập mẫu đất tại rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, nghiên cứu, sử dụng các dụng cụ, trang thiết bị và cơ sở vật chất có tại Phòng thí nghiệm

Vi sinh vật Môi trường và Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ

Chương trình nghiên cứu toàn thể theo các giai đoạn như Hình 3.1

Hình 3.1: Sơ đồ chương trình nghiên cứu toàn thể đề tài

Phương tiện nghiên cứu

Mẫu đất được thu trải rộng trên địa bàn 6 xã của huyện Cần Giờ là xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Lý Nhơn, xã Tam Thôn Hiệp, xã Cần Thạnh và xã Thạnh An

1 Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ 2 Phân lập, sàng lọc vi khuẩn sợi

3 Kiểm tra và thu nhận VKS có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh

4 Định danh dòng VKS căn cứ theo trình tự đoạn gen 16S rDNA, lập giản đồ phân nhóm

5 Khảo sát sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps)

6 Chọn dòng VKS để thu nhận sinh chất và phân tích thành phần bằng CG-MS

Mẫu đất chuyển về Đại học Sài Gòn trong ngày để trữ trong tủ lạnh - 4 o C, trước khi chuyển về Cần Thơ để phân lập vi khuẩn sợi Trong thời gian chuyễn mẫu về Cần Thơ, mẫu đất luôn được trữ trong các thùng trữ lạnh với nước đá xay nhỏ để đảm bảo mẫu đất được tốt đồng thời hạn chế tác động bất lợi đến hệ vi sinh vật trong mẫu (Các xã có mẫu đất thu thập được liệt kê trong Bảng 3.1 Vị trí địa lý trên bản đồ như Hình 3.3)

*Dòng vi khuẩn gây bệnh trên người

Các dòng vi khuẩn gây bệnh dùng để thử nghiệm được cung cấp bởi Trung tâm

Kỹ thuật, Tiêu chuẩn và Chất lượng (Sở Khoa học Công nghệ) Cần Thơ, Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, Trung tâm Xét nghiệm Động Thực vật xuất khẩu vùng 6 (trụ sở tại Thành phố Cần Thơ) và lưu trữ tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, Viện NCPT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ:

- Vibrio paraheamolyticus (từ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ)

Bảng 3.1: Danh sách mẫu đất theo tên các xã tại huyện Cần Giờ

STT Tên mẫu (xã) Loại cây STT Tên mẫu (xã) Loại cây

1 Tam Thôn Hiệp Đước 20 An Thới Đông 4 Chà Là

2 Tam Thôn Hiệp Đước 21 An Thới Đông 5 Mắm

3 Tam Thôn Hiệp Đước 22 An Thới Đông 6 Dá

4 Tam Thôn Hiệp Đước 23 An Thới Đông 7 Vẹt

5 Tam Thôn Hiệp Đước 24 Long Hòa 1 Đước

6 Thạnh An Đước 25 Long Hòa 2 Đước-Dà

7 Thạnh An 3 Đước 26 Long Hòa 3 Đước

8 Thạnh An 4 Đước 27 Long Hòa 4 Đước Dà

9 Thạnh An Đước 28 Long Hòa 5 Dà

10 Thạnh An Đước-Mắm 29 Long Hòa 6 Đước

11 Lý Nhơn 2 Bần 30 Cần Thạnh 1 Đước-Mắm

12 Lý Nhơn 3 Chà Là 31 Cần Thạnh 2 Bần

13 Lý Nhơn 5 Giá 32 An Thới Đông 8 Đước

14 Lý Nhơn 6 Dà 33 An Thới Đông 9 Đước

15 Lý Nhơn 7 Cóc Trắng 34 AnThới Đông 10 Đước

16 Lý Nhơn 8 Đước 35 AnThới Đông 11 Đước

17 An Thới Đông 1 Đước 36 AnThới Đông 12 Đước

18 An Thới Đông 2 Bần 37 AnThới Đông 13 Đước

Thiết bị - dụng cụ: buồng đếm hồng cầu Thoma (Isolab, Đức), kính mang vật (lame) và kính đậy vật (lammelle) (Greetmed, Trung Quốc); kính hiển vi (Olympus BH2, BX41TF, Japan); pH kế (Schott, Đức), máy vortex (IKA Shakers 3MS, Đức), máy đo OD (Hitachi, Nhật), máy lắc ủ Eppendorf (ThermoStatPlus, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ ủ vi sinh (SANYO, Japan); cân điện tử (Sartorius, Đức); microwave (SANYO, Japan); nồi thanh trùng nhiệt ướt (PBI, Italia); tủ cấy vô trùng (TELSTAR, Spain); tủ lạnh (SANYO, Japan) Máy nghiền mẫu Retsch MM 200 (Đức), máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức), máy hút chân không Concentrator 5301 (Đức), tủ lạnh giữ mẫu LC-743H (Alaska, Việt Nam), bộ điện di một chiều BioRad, máy đọc và chụp hình gel BioRad UV 2000 (Mỹ), cân điện tử Sartorius (Đức), máy PCR Perkin Elmer 9700 (Mỹ), máy đo quang phổ Beckman Coulter DU 640B (Mỹ), máy giải trình tự ABI 3130, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu, hệ thống sắc ký với máy GCMS QP2010 Shimadzu (Nhật) và một số dụng cụ phổ biến khác trong phòng thí nghiệm vi sinh vật

Môi trường SCA dùng để nuôi cấy vi khuẩn sợi, đồng thời có bổ sung kháng sinh Aginalxic (0,5 mg/L) và Nystatin (0,5 mg/L) vào môi trường để hạn chế nhiễm nấm Bảng 3.2: Thành phần cho 1 Lít môi trường Starch Casein Agar (SCA)

Thêm nước biển qua lọc cho vừa đủ 1 Lít pH: 6,9 - 7,1

Môi trường LB là môi trường dùng để nuôi các dòng vi khuẩn ly trích DNA và vi khuẩn thử nghiệm

Bảng 3.3: Thành phần cho 1 lít môi trường Luria Bertani (LB)

Thêm nước cất cho vừa đủ 1 Lít

Môi trường Mueller-Hinton Agar được dùng để kiểm tra khả năng kháng của các dòng vi khuẩn sợi đối với các vi khuẩn thử nghiệm

Bảng 3.4: Thành phần cho 1 Lít môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA)

Thêm nước cất cho vừa đủ 1 Lít

Agar (môi trường thạch) 20 pH: 7,2-7,4

Crystal violet, Lugol, cồn 96%, safranin

Hóa chất để tinh sạch DNA của vi khuẩn sợi

Hóa chất tinh sạch DNA gồm: TE pH8, SDS 10%, isopropanol 100%, ethanol 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7 M, proteinase K (10 mg/mL), nước cất hai lần vô trùng, chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1)

Hóa chất dùng trong phản ứng PCR (bộ kit của hãng BioLine, Mỹ)

PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4), polymerisation MgCl2 (25 mM), dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), BSA (10 mg/mL), Taq DNApolymerase (500 u, 5 u/L), nước cất khử ion

Hóa chất dùng trong điện di sản phẩm PCR

Agarose 1,5%, TAE buffer 1X, loading buffer, Safe view, thang chuẩn 100bp (Invitrogen TM 15628019)

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu

Các mẫu đất thu thập một cách ngẫu nhiên, cách gốc cây ngập mặn (đước, sú, vẹt, mắm) từ 50-70 cm với trọng lượng ít nhất 1 kg/mẫu bằng cây bay thợ hồ, đất được cho vào bọc nylon vô trùng, trước và sau khi lấy mẫu, dụng cụ lấy mẫu được rửa sạch và khử trùng bằng cồn 90% để tránh nhiễm chéo Bọc chứa mẫu đất được ghi ký hiệu (thông tin về địa điểm thu mẫu và đất vùng rễ của loại cây ngập mặn), bọc chứa mẫu đất được trữ trong thùng trữ lạnh với nước đá xay nhỏ để bảo vệ các vi sinh vật sống sót tốt trong đất (Hình 3.2)

Hình 3.2: Một khu vực lấy mẫu: Cây đước với đất vùng rễ

Hình 3.3: Bản đồ huyện Cần Giờ và vị trí lấy mẫu (các điểm màu tím đỏ theo định vị của Ban

Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ)

3.3.2 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi

Phân lập được các dòng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ

3.3.2.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

Mẫu đất được lấy ra khỏi tủ bảo quản lạnh, cân lấy 1g mẫu đất ướt (sau khi đo độ ẩm trong đất) cho vào bình tam giác với 99 ml nước cất vô trùng, lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 60 phút Dung dịch trên được tiến hành pha loãng theo hệ số 10 -1 đến

Hình 3.4: Quy trình pha loãng mẫu đất với nước cất vô trùng Để lắng khoảng 3 giờ, lần lượt hỳt lấy 20 àL dung dịch ở cỏc độ pha loóng 10 -3 đến 10 -5 trải đều trên đĩa petri có môi trường SCA Các đĩa petri được để khô và ủ ở

Sau 24 – 48 giờ, các khuẩn lạc của nhiều vi sinh vật khác nhau bắt đầu xuất hiện trên bề mặt môi trường Sau 7 – 10 ngày, khuẩn lạc của vi khuẩn sợi xuất hiện Các khuẩn lạc này được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường mới nhiều lần đến khi xuất hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc rõ ràng nhất (3 - 6 tuần), kiểm tra bằng cách quan sát dưới kính hiển vi Sau đó, tách cấy vi khuẩn sợi vào môi trường trên ống nghiệm để trữ ở tủ lạnh 4 - 5 o C và tồn trữ dài hạn với glycerol 15% ở - 80 o C và xem như 1 chủng (isolate) (Hình 3.5)

Hình 3.5: Quy trình cấy chuyển để tạo 1 khuẩn lạc riêng và trữ như 1 chủng

3.3.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi

Nuôi cấy vi khuẩn sợi trên môi trường phân lập, sau 7-10 ngày, tiến hành đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bằng mắt thường bao gồm các chỉ tiêu như sau: màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nổi và dạng bìa

- Màu sắc khuẩn lạc (trắng, nâu, xám, cam…);

- Hình dạng khuẩn lạc (tròn, thoi…);

- Kích thước khuẩn lạc (đường kính trung bình của khuẩn lạc);

- Dạng bìa (nguyên, răng cưa…)

Khi khuẩn lạc vi khuẩn sợi nuôi trên môi trường phân lập đạt mức ròng (thuần), tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần bằng phương pháp giọt ép đồng thời ghi nhận hình thái tế bào với các tiêu chí sau:

- Sự chuyển động (có chuyển động, không chuyển động)

- Hình dạng tế bào (cầu, que, kết chuỗi, …)

- Que ngắn: nếu dài 1-3 àm, que dài: nếu > 3 àm

Sau khi quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc, tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn sợi và quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần Cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn sợi giống với vi khuẩn Gram dương nên khi nhuộm Gram sẽ cho kết quả màu xanh hoặc tím (Hình 3.6)

Hình 3.6: Phân loại khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn

3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.3.3.1 Mục tiêu thí nghiệm Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi phân lập từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, tuyển chọn được các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với vi sinh vật thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo phương pháp của Galindo (2004)

3.3.3.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn sợi phân lập được:

Cấy chuyển các dòng vi khuẩn sợi từ môi trường thạch sang ống nghiệm có chứa

15 mL môi trường Starch Casein lỏng tương ứng

Các ống nghiệm nuôi cấy các dòng vi khuẩn sợi được ủ trên máy lắc với tốc độ lắc là 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30 o C, trong thời gian là 14 ngày

Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA cho các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm

- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm:

Nhân nuôi các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm trên môi trường LB (trong 24-

48 giờ) để thu sinh khối;

Pha loãng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm để được mật độ là 10 6 CFU/mL

- Chuẩn bị kháng sinh đối chứng:

Các dòng vi khuẩn gây bệnh chỉ thị khác nhau cần những loại kháng sinh khác nhau; 2 loại kháng sinh được sử dụng là streptomycine và tetracycline

Cõn và pha loóng khỏng sinh với nước cất vụ trựng đến nồng độ là 15 àg/mL

- Tiến hành trải các vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm với mật độ 10 6 CFU/mL lên môi trường MHA bằng tăm bông vô trùng

- Dùng 1 corer thép không rỉ tiệt trùng bằng cách hơ trên ngọn đèn cồn để khoan lỗ, tạo các giếng thạch có đường kính 6 mm trên các đĩa có trải vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm

- Hút 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn sợi trong ống falcon cho vào tube 2,2 mL vô trùng Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

- Lọc bỏ phần cặn, lấy phần dịch nổi cho vào tube mới

- Hỳt 50 àL dịch nổi từ tube trờn, nhỏ vào giếng khoan lỗ sẵn trờn mụi trường cú trải các dòng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm; mỗi dòng vi khuẩn sợi lặp lại 3 lần (tương ứng 3 giếng)

- Hỳt 50 àL khỏng sinh pha loóng nhỏ vào 1 giếng thạch làm đối chứng dương

- Hỳt 50 àL nước cất (vụ trựng) nhỏ vào 1 giếng thạch làm đối chứng õm;

Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn sợi phân lập được thông qua sự hiện diện vòng vô khuẩn xung quanh các giếng thạch có chứa dịch nuôi cấy của các dòng vi khuẩn sợi thử nghiệm Chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn (thông qua kích thước của vòng vô khuẩn) để tiến hành đánh giá, tuyển chọn

Quan sát, ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ trên đĩa thạch theo công thức sau đây: Đường kính vòng kháng khuẩn = D - d (mm)

Với: “D”: đường kính vòng kháng trên đĩa thạch và lỗ, “d”: đường kính của lỗ đục sẵn trên đĩa thạch

So sánh tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng căn cứ vào quy ước của Galindo (2004) (Bảng 3.5) và khả năng kháng được nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn (Galindo, 2004)

TT Vòng kháng khuẩn (mm) Mức độ kháng Ký hiệu

Số liệu kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab

3.3.4 Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử

Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao được tuyển chọn với cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-

0878-a-A-19 chuyên biệt cho vi khuẩn sợi (Stach et al., 2003; Sun et al., 2015) Thông qua trình tự đoạn gen, so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, kết hợp với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, các đặc điểm về hình thái tế bào, đặc điểm sinh học của tế bào, đề xuất được tên của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn và khảo sát mối liên hệ di truyền của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn

Theo Breugelmans et al (2004), trích DNA vi khuẩn sợi theo các bước sau:

- Nuôi từng dòng vi khuẩn sợi trong môi trường LB ở nhiệt độ 30 o C, trên máy lắc với tốc độ lắc 150 vòng/phút, sau 3 ngày

- Chuyển dịch vi khuẩn từ ống nghiệm nuôi cấy sang 2 tuýp Eppendorf 2 mL

- Ly tâm tuýp Eppendorf trên với tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 10 phút, loại bỏ phần nước

- Hỳt 250 àL dung dịch TE pH = 8,0 cho vào tuýp trờn Dựng tay xoay trũn ống nghiệm để đánh tan sinh khối

- Thờm vào 50 àL SDS 10% để phỏ vỡ màng tế bào

- Tiếp theo thờm 10 àL proteinase K/10 mg/mL để tỏch protein khỏi DNA

- Ủ ở 65 0 C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp một lần

- Thờm vào 400 àL CTAB 10% 0,7 M NaCl, trộn đều

- Thờm vào 600 àL chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1) để tủa protein và tạo màng ngăn giữa DNA và protein, trộn đều

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 10 phút

- Chuyển phần dịch trong phía trên sang tuýp Eppendorf 1,5 mL mới, nhẹ nhàng cẩn thận tránh làm vỡ màng ngăn

- Kế tiếp thêm vào 1 mL isopropanol để kết tủa DNA, trộn đều Giữ tuýp ở

- Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần nước

- Sau đó, rửa DNA với 1 mL ethanol 70% , ly tâm ở 12.000 vòng trong 5 phút Tiến hành rửa lần 2

- Ly tâm chân không 15-20 phút ở 4 o C để loại bỏ hết ethanol

- Hũa tan DNA trong 30 àL nước cất 2 lần (Bi - H2O)

- Đo nồng độ DNA hoặc điện di trên gel agarose 0,8 % để kiểm tra chất lượng DNA

- Trữ lạnh -20 o C để bảo quản DNA

*Phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA (sử dụng bộ Kit PCR BioLine, Mỹ)

Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn sợi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act- 0878-a-A-19 (Stach et al., 2003; Sun et al., 2015):

Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C- Act-0878-a-A-19

PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4) 2,5

Polymerisation MgCl2 (25 mM) 2 dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 4

Thực hiện phản ứng PCR theo chu kỳ như sau: 95°C trong 4 phút, 30 chu kỳ gồm 95°C trong 45 giây, ở 68°C trong 45 giây, 72°C trong 1 phút và hoàn tất cuối cùng trong

Hình 3.7: Chương trình nhiệt độ của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA

Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di một chiều trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, ở hiệu điện thế 150 V trong khoảng 30 phút, quan sát dưới đèn UV và chụp hình Sử dụng thang chuẩn 100 bp plus để ước lượng kích thước của các sản phẩm PCR (lưu giữ ở nhiệt độ 4 o C nếu chưa sử dụng)

Các mẫu DNA sau khuếch đại được gửi để phân tích trình tự nucleotide, do Công ty CP Công nghệ TBR, TP.Hồ Chí Minh thực hiện

Kết quả phân lập vi khuẩn sợi

4.1.1 Số lượng, nguồn gốc vi khuẩn sợi phân lập được:

Từ 37 mẫu đất thu từ 6 xã có rừng ngập mặn trong huyện Cần Giờ phân lập được

231 khuẩn lạc đại diện cho các chủng vi khuẩn sợi trên môi trường thạch SCA (Bảng 4.1) Môi trường SCA được Mohseni et al (2013) và các tác giả khác sử dụng để phân lập, nghiên cứu vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển và cả trên cạn (Ramesh et al., 2009; Kumar et al., 2014)

Bảng 4.1 Nguồn gốc (xã) và số lượng khuẩn lạc vi khuẩn sợi phân lập được

Tên mẫu đất Loại cây Số khuẩn lạc

An Thới Đông 4 Chà Là 8

Tên mẫu đất Loại cây Số khuẩn lạc

Vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn từng được ghi nhận có số lượng phong phú, Takizawa et al.(1993), ước tính số lượng vi khuẩn sợi trong đất ngập triều tối đa là 9.10 5 CFU/g đất Tương tự, Zhao et al (2009) phân lập được 239 chủng vi khuẩn sợi thuộc hai chi là Streptomyces và Micromonospora từ mẫu trầm tích ven biển Trung Quốc

4.1.2 Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn sợi phân lập được

Các khuẩn lạc đại diện cho các chủng vi khuẩn sợi được tiếp tục làm tăng độ ròng (thuần) bằng cách cấy trên đĩa môi trường thạch, ủ ở nhiệt độ 30°C trong thời gian từ 3 đến 6 tuần để phát triển và có hình thái khuẩn lạc rõ (Hình 4.1)

Hình 4.1: Hình thái của một số khuẩn lạc vi khuẩn sợi (mẫu LONGHOA 4.2, ANTHOIDONG 7.1 ANTHOIDONG 3.1 và ANTHOIDONG 6.1) phân lập trên môi trường

SCA, chụp cận cảnh (trên) và toàn đĩa (dưới)

Tuy nhiên, vi khuẩn sợi là nhóm vi sinh vật có rất nhiều khó khăn trong quá trình nuôi cấy (Kang et al., 2017 và Hui et al., 2021) Do đó, sau quá trình tách ròng với thời gian khá dài cùng với nhiều yếu tố ảnh hưởng chưa được khảo sát như độ mặn của môi trường, nguyên tố kích thích tăng trưởng…, thu nhận được 48 dòng vi khuẩn sợi còn sinh trưởng và duy trì hình thái khuẩn lạc rõ ràng

Hầu hết các khuẩn lạc có dạng hình tròn; màu sắc phong phú gồm trắng đục hoặc trắng trong và nâu, nâu vàng, có rìa mỏng hoặc dày Hình thái và màu sắc khuẩn lạc là một trong những cơ sở để phân biệt các dòng vi khuẩn sợi (Barka et al., 2016) Kích thước đường kính của các khuẩn lạc này thay đổi từ 0,2 đến 3,0 mm Sau khi nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi cho thấy 48 dòng khuẩn lạc vi khuẩn sợi đều bắt màu

Gram dương (tỷ lệ 100%) Theo nhiều tài liệu và Shamar et al (2014) xác định vi khuẩn sợi thuộc nhóm Gram dương Kết quả đặc điểm của 48 dòng vi khuẩn sợi được mô tả chi tiết trong Bảng 4.2

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn sợi phân lập được

STT Dòng Màu Hình dạng Bìa Độ nổi D KL D tia

Vàng kem Tròn, dạng vôi

2 THANHAN 3.4 Vàng kem Tròn, dạng phấn

3 THANHAN 4.1 Vàng kem Tròn, dạng vôi

4 THANHAN 4.2 Nâu Bề mặt phấn Tia dài 1 hướng

5 THANHAN 4.3 Nâu Bề mặt dạng phấn

6 THANHAN 4.4 Trắng sữa Những vòng tròn đồng tâm, bề mặt như dạng vôi

7 THANHAN 4.5 Nâu Bề mặt dạng vôi dày

8 THANHAN 5.1 Nâu Bề mặt dạng vôi

9 LYNHON 6.1 Nâu Bề mặt dạng nhung màu sẫm

Tia dày bao quanh khuẩn lạc

Nâu Bề mặt dạng vôi, có nhiều vòng tròn đồng tâm

Trắng Bề mặt nhung, không có tâm

Trắng Bề mặt dạng vôi dày, có vòng tròn đồng tâm

Nâu nhạt Bề mặt dạng nhung dày

Tia ngắn theo một hướng

Trắng Bề mặt dạng vôi dày, có vòng tròn đồng tâm

Tia bao quanh, tia dạng phấn nhuyễn

Trắng Bề mặt dạng vôi

STT Dòng Màu Hình dạng Bìa Độ nổi D KL D tia phấn bao quanh

Trắng Bề mặt dạng nhung, có 1 vòng tròn đồng tâm

Trắng Bề mặt dạng vôi

Tia mỏng dày theo 1 hướng

Trắng Khuẩn lạc nhỏ dạng vôi dày

Tia ngắn dạng hạt mỏng

Nâu Bề mặt dạng vôi

Trắng Bề mặt dạng vôi, không có tâm

Tia cực ít không đáng kể

Nâu Bề mặt dạng phấn nhuyễn, có vòng tròn đồng tâm

Trắng Bề mặt dạng vôi không có tâm

Tia dạng phấn theo 1 hướng

Trắng sữa Tròn Gợn sóng Mô 0,3 0,4

Trắng đục Vòng tròn Răng cưa Mô 0,4

27 LONGHOA 1.1 Hồng Tròn Răng cưa Mô 0,7 0,3

30 LONGHOA 4.1 Trắng sữa Tròn Răng cưa Mô 0.3 0.7

34 LONGHOA 5.1 Trắng sữa Tròn Gợn sóng Mô 0.2 1.0

35 LONGHOA 5.2 Trắng sữa Vòng tròn Rang cưa Mô 0.3 0.8

36 CANTHANH 1.1 Trắng ngã vàng Đốm Răng cưa Mô 0.1 0.2

STT Dòng Màu Hình dạng Bìa Độ nổi D KL D tia

38 CANTHANH 2.1 Nâu vàng Tròn Vòng tròn Mô 0.7 0.6

Vàng nâu Gần tròn Gợn sóng Mô 0.4 0.4

Trắng sữa Tròn Rang cưa Mô 0.3 0.4

9.2 nâu Tròn Gợn sóng, tạo cầu vòng

Trắng sữa Tròn Gợn sóng Mô 0.3 0.9

Trắng sữa Vòng tròn Răng cưa Mô 0.2 1.1

Nâu đen Tròn Vòng tròn Mô 0.1 0.1

(Ghi chú: D KL : đường kính khuẩn lạc, D tia : đường kính tia)

Từ bảng trên, thống kê cho thấy số lượng khuẩn lạc có màu nâu chiếm 25%, màu trắng chiếm 23% và trắng sữa chiếm 21%, còn lại là những màu pha sắc khác (Hình 4.2)

Hình 4.2: Tỷ lệ các màu sắc của khuẩn lạc vi khuẩn sợi phân lập được

Về hình dạng và kết cấu bề mặt, khuẩn lạc có dạng tròn chiếm 40%, dạng tròn vôi chiếm 27%, dạng tròn phấn chiếm 10%, dạng tròn nhung chiếm 8%, còn lại là các dạng khác (Hình 4.3)

19% vàng kem nâu trắng trắng sữa nâu đen khác

Hình 4.3: Tỷ lệ hình dạng của các khuẩn lạc vi khuẩn sợi phân lập được

Về đặc điểm dạng bìa, có 27% khuẩn lạc có bìa răng cưa, các khuẩn lạc có bìa với tia dài một hướng, tia ngắn mỏng hoặc gợn sóng đều chiếm 15% Còn lại là những dạng vòng tròn, tia bao quanh hoặc không rõ bìa (với tỷ lệ tương ứng lần lượt là 8%, 12% và 8%) (Hình 4.4)

Tròn dạng vôi Tròn dạng phấn Tròn dạng nhung Tròn Khác

Hình 4.4a: Tỷ lệ theo dạng bìa của các khuẩn lạc vi khuẩn sợi phân lập được

Hình 4.4b: Số lượng theo dạng bìa của các khuẩn lạc vi khuẩn sợi phân lập được

Các kết quả về phân lập và hình thái được so với đặc điểm sinh học của vi khuẩn sợi: thuộc nhóm Gram dương, đa dạng về hình thái, màu sắc Các chủng phân lập có khuẩn lạc với nhiều màu, có bìa dạng răng cưa, bề mặt không trơn ướt, khác với vi khuẩn Kết luận 48 chủng phân lập là vi khuẩn sợi, được sử dụng làm đối tượng trong các nội dung nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Bốn mươi tám chủng vi khuẩn sợi, sau khi làm thuần (ròng), được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp trình bày ở Chương 3 và thực hiện trên 4 dòng vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus sereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus và Staphylococcus aureus Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch được sử dụng bởi

Tia 1 hướng Tia bao quanh Tia ngắn mỏng Răng cưa Gợn sóng Vòng tròn Không rõ rìa

Tia 1 hướng Tia bao quanh Tia ngắn mỏng

Răng cưa Gợn sóng Vòng tròn Không rõ rìa

Pandey et al (2011) và Yu et al (2017) trên đối tượng là vi khuẩn sợi, và không khác biệt nhiều so với mô tả của Galindo (2004) Kết quả khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh ghi nhận được trình bày ở Bảng 4.3

Bảng 4.3: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi với 4 dòng vi khuẩn gây bệnh (đường kính vòng vô khuẩn tính bằng mm theo Galindo, 2004)

STT Dòng vi khuẩn sợi

48 ANTHOIDONG 13.3 - - - - Đối chứng (15 àg/mL) 8,7 c streptomycin

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo kiểm định LSD và phân tích ANOVA một biến, “-“: dưới 1mm)

Bảng 4.3 cho thấy có 10/48 dòng vi khuẩn sợi, chiếm 20,83 %, có khả năng kháng ít nhất 1 dòng vi sinh vật gây bệnh, với kích thước vòng vô khuẩn >1 mm xung quanh giếng thạch có trải vi sinh vật thử nghiệm theo quy ước của Galindo (2004), quy ước này từng được sử dụng để khảo sát tính kháng khuẩn của vi khuẩn sợi (Đỗ Thu Hà, 2004) và cả nấm (Nguyễn Thị Hà, 2014)

Theo quy ước này, các dòng vi khuẩn sợi phân lập được trong luận án đều có tính kháng khuẩn từ yếu đến mạnh, trong đó mức trung bình chiếm đa số Các dòng vi khuẩn sợi có tính kháng mang kí hiệu là: THANHAN 4.4, THANHAN 4.5, ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 3.2, ANTHOIDONG 3.4, ANTHOIDONG 4.1, ANTHOIDONG 6.1, ANTHOIDONG 7.1, LONGHOA 4.2 và ANTHOIDONG 11.1

Số lượng các dòng vi khuẩn sợi kháng với từng loại vi sinh vật khảo sát có sự khác nhau, tùy thuộc vào loại vi sinh vật khảo sát Có 8 dòng kháng lại vi khuẩn gây bệnh

Bacillus cereus (nhiều nhất), 6 dòng kháng lại vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus, 4 dòng kháng lại vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli và số lượng ít nhất là kháng lại vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolytycus (3 dòng) (Hình 4.5) Tương tự, mức độ kháng từ “không kháng” đến “kháng mạnh”, thay đổi theo loại vi khuẩn khảo sát gây bệnh truyền nhiễm ở người (Hình 4.6)

Trong đó có 3 dòng mang ký hiệu ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng được cả 4 loài vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, dòng ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng mạnh hai loại vi khuẩn gây bệnh cho người Bacillus cereus và Staphylococcus aureus (kích thước vòng vô khuẩn tương ứng lần lượt là 15 mm và 35 mm) đồng thời kháng mạnh cả vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên cá tra nuôi với kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là 21 mm và 17 mm (Hình 4.7, Hình 4.8)

Hình 4.5: Số lượng dòng vi khuẩn sợi kháng được các vi sinh vật thử nghiệm

Hình 4.6: Số lượng dòng vi khuẩn sợi theo độ kháng với các vi sinh vật thử nghiệm

Bacillus cereus Escherichia coli Vibrio parahaemolytycus

Không Yếu Trung bình Mạnh

A: Staphylococcus areus, B: Bacillus cereus, C: Vibrio parahaemolyticus, D: Escherichia coli

A B C D Đối chứng: A: Staphylococcus areus (Streptomycin), B: Bacillus cereus (Streptomycin), C: Vibrio parahaemolyticus (Tetracyclin), D: Escherichia coli (Tetracyclin)

Hình 4.7: Hoạt tính kháng khuẩn của dòng ANTHOIDONG 7.1 ức chế các vi khuẩn:

Staphylococcus areus (A), Bacillus cereus (B), V parahaemolyticus (C) và E coli (D)

Hình 4.8: Hoạt tính kháng khuẩn của dòng ANTHOIDONG 4.1 ức chế các vi khuẩn

Bacilus cereus, E coli và S.aureus (lần lượt từ trái sang phải)

Các dòng vi khuẩn sợi này (10 dòng) được chọn để tiếp tục nhận diện bằng kỹ thuật PCR và tiếp đến giải trình tự gen 16S rDNA, so sánh với ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng phần mềm BLAST N để tìm mức độ (%) tương đồng với dòng vi khuẩn chuẩn, song song đó là quan sát hình thái hiển vi bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Kết quả định danh và cây phả hệ di truyền

4.3.1 Định danh các dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn mạnh

Các đoạn gen 16S rDNA (1050-1225 bp) của 10 dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn tốt được chọn để tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự Qua kiểm tra sự tương đồng cao nhất về trình tự gen 16S rDNA của các dòng được chọn so với Ngân hàng gen của NCBI (bằng ứng dụng BLAST) cho thấy hầu hết chúng (8 trên 10 dòng phân lập) có sự tương đồng với trình tự của chi Streptomyces còn lại 2 dòng phân lập

69 thuộc chi khác (Stenotrophomonas) nên được loại trừ trong các thí nghiệm tiếp theo (Bảng 4.4)

Bảng 4.4: Mức tương đồng di truyền dựa trên trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn sợi, sử dụng chương trình BLAST trong cơ sở dữ liệu GenBank

Dòng vi khuẩn sợi Loài tương đối gần nhất Độ tương đồng (%)

ANTHOIDONG 4.1 KP235209 Streptomyces celluloflavus strain D4-17 99,6

MN116554 Kitasatospora sp strain SKW16 99,6 ANTHOIDONG 6.1 MT505707 Streptomyces aegyptia strain 7 97,8

ANTHOIDONG 11.1 MT072138 Streptomyces laurentii strain QT214 98,7

EU593580 Streptomyces tanashiensis strain 173004 97,6 ANTHOIDONG 7.1 HQ607433 Streptomyces albogriseolus strain 1168 99,4

MK281547 Streptomyces albogriseolus strain SCAU-

ANTHOIDONG 3.1 MW217198 Streptomyces parvulus strain DSD2596 98,8

MW217191 Streptomyces sp strain DSD1692 98,8 LONGHOA 4.2 MH472998 Streptomyces africanus strain E3SQ 97,7

MK368443 Streptomyces sp strain MUM203J 97,6 THANH AN 4.4 HM594286 Streptomyces tendae strain M23 97,4

MN339840 Streptomyces sp strain MGB 2769 97,4

Bên cạnh đó, giản đồ phân nhóm di truyền (cây phả hệ) được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood (Hình 4.9) để khảo sát mối liên hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn sợi Kết quả cho thấy, cây phả hệ của 8 dòng vi khuẩn sợi trong bảng trên có hai cụm (cluster) Cụm A có 6 dòng, trong đó lại có 2 cụm nhỏ hơn là cụm A1 với 4 dòng được chia tiếp thành 2 nhóm nhỏ hơn nữa: cụm A1.1 gồm Streptomyces

70 tendae THANHAN 4.4 và Streptomyces tanashiensis ANTHOIDONG 3.2 và cụm A1.2 gồm 2 chủng: Streptomyces aegyptia ANTHOIDONG 6.1 và Streptomyces laurentii

ANTHOIDONG 11.1; còn lại 2 nhánh riêng với 2 dòng là Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và Streptomyces africanus LONGHOA 4.2 Cụm B chỉ có 2 dòng:

Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 và Streptomyces parvulus

Hình 4.9: Giản đồ phân nhóm được dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood căn cứ theo đoạn trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn sợi được phân lập từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ Các giá trị bootstrap được tính toán cho 1000 lần lặp lại

Kết quả trình bày ở cây phả hệ cho thấy các dòng vi khuẩn sợi có khả năng phân nhóm theo vị trí địa lý Các dòng phân lập từ trong một phạm vi là xã An Thới Đông có quan hệ di truyền gần nhau, thể hiện ở cùng cụm phát sinh hoặc cụm gần nhau Một dòng phân lập từ xã Long Hoa xuất hiện ở một nhánh riêng của cụm A, xã Long Hoa có tiếp giáp địa lý với xã An Thới Đông Trong khi đó, có một dòng vi khuẩn sợi phân lập tại xã đảo Thạnh An, cách xa khu vực nội địa, xuất hiện ở nhánh riêng của cụm phụ A1, có thể có ít quan hệ di truyền với các dòng còn lại

Các dòng vi khuẩn sợi có tính kháng khuẩn phân lập được đều cho kết quả định danh thuộc chi Streptomyces Chi Streptomyces và các chi vi khuẩn sợi có quan hệ di truyền gần với chi này được nhiều tài liệu (Bérdy, 2005 và Hong et al., 2009) ghi nhận có khả năng tạo ra nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp, là một nguồn phong phú cho sự

71 phát triển thành công của thuốc kháng sinh mới Ngoài tính năng kháng khuẩn, các hợp chất thứ cấp được nghiên cứu khác chứng minh là chất ức chế miễn dịch (FK-506, rapamycin, ascomycin), làm thuốc chống ung thư hợp chất (bleomycin, dactinomycin, doxorubicin, staurosporin), các hợp chất chống nấm (amphotericin B, nystatin), chất diệt cỏ (phosphinothricin), kể cả điều trị bệnh tiểu đường (acarbose) và chất tẩy giun sán (avermectin, milbemycin) (Hong et al., 2009) Trong số 12.000 thứ cấp chất chuyển hóa có hoạt tính kháng sinh được biết có 55% được sản xuất bởi Streptomycetes và 11% do vi khuẩn sợi khác (Demain và Lancini, 2001) Tiềm năng của chi này vẫn rất lớn vì chỉ mới báo cáo được 3% trong số tất cả các tác nhân kháng khuẩn được tổng hợp bởi

Streptomycetes (Watve et al., 2001) Như vậy, còn lại một lượng lớn các loại thuốc mới chưa được phát hiện và sẽ được tạo ra bằng các phương pháp mới

Kết quả của đề tài thể hiện rừng ngập mặn Cần Giờ của Việt Nam là nguồn tài nguyên Streptomyces như các địa phương khác trên thế giới Rừng ngập mặn ở Sabah, Malaysia phân lập được 76,9% (20 trên 26 dòng vi khuẩn sợi) là thuộc chi Streptomyces và có 1 dòng thuộc loài Streptomyces albogriseolus (Png và Lee, 2020) Tại bờ biển nam Trung Quốc, thu nhận được 17 loài thuộc chi Streptomyces, chiếm ưu thế hơn các chi khác trong đất rừng ngập mặn (Gong et al., 2018) Kết quả này tương đồng với nghiên cứu trước đây (Liao et al., 2016), luôn có sự xuất hiện và chiếm đa số của chi

Streptomyces trong các dòng vi khuẩn sợi (7 trên 9 dòng) phân lập được dù nguồn phân lập khác biệt hoàn toàn (nước biển sâu ở Bắc Cực)

Về khả năng kháng khuẩn, các nghiên cứu từ trước theo thống kê của Barka et al (2016) xác định chi Streptomyces là nguồn sản xuất kháng sinh nhiều nhất so với các vi sinh vật khác Những hợp chất có cấu trúc độc đáo thu được từ các vi khuẩn sợi của rừng ngập mặn là nguồn tài nguyên tiềm năng cho việc tìm kiếm, xác nhận và sản xuất các chất kháng khuẩn và chất ức chế khối u (ung thư) (Li et al., 2013)

4.3.2 Hình thái của các chủng vi khuẩn sợi được chọn

Tám dòng vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces có tính kháng khuẩn được chọn quan sát hình thái bằng kính hiển vi điện tử (SEM), kết quả như sau:

1) Vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, trên môi trường nuôi cấy khuẩn lạc của chúng có màu trắng xám, hình tròn, nhiều tia xung quanh Bào tử có nhiều gai trên bề mặt và các ô nối thành chuỗi dưới kính hiển vi điện tử phóng đại

Vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus lần đầu tiên được phân lập tại đất Nhật Bản và vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus tổng hợp aureothricin và đồng thời chúng có khả năng phân giải cellulose (Haseena et al., 2016) Trong đề tài, vi khuẩn sợi

Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 có khả năng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh cho người như Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Bacillus cereus và đây là chủng vi khuẩn sợi có khả năng

72 phân hủy CMC mạnh nhất (thí nghiệm không được trình bày vì ngoài nội dung nghiên cứu của luận án)

Hình 4.10: Khuẩn lạc (A) và chuỗi bào tử (B) của dòng Streptomyces celluloflavus

ANTHOIDONG 4.1 dưới kính hiển vi điện tử

2) Dòng vi khuẩn sợi Streptomyces aegyptia ANTHOIDONG 6.1 trên môi trường nuôi cấy có khuẩn lạc màu trắng, hình tròn, nhiều tia xung quanh Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét, vi khuẩn sợi Streptomyces aegyptia có bề mặt bào tử nhẵn, nối thành chuỗi (Hình 4.11)

Hình 4.11: Khuẩn lạc (A) và các chuỗi bào tử (B và C) của dòng S aegyptia ANTHOIDONG

6.1 dưới kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn sợi Streptomyces aegyptia được phân lập từ đất của tỉnh Dakahliyah, Ai Cập, chúng có khả năng phân giải cellulose cao (El-Naggar et al., 2011) Đồng thời chúng tạo ra enzyme cholesterol oxidase, chống ung thư ở mức độ thử nghiệm, chống nhiễm trùng, ức chế ung thư vú và hiện tượng tự chết của tế bào (apoptosis) trong điều kiện in vivo (El-Naggar et al., 2018) Vi khuẩn sợi Streptomyces aegyptia tổng hợp các hạt nano-Ag ức chế vi khuẩn là hạt nano thân thiện với môi trường (Osama et al., 2014)

Trong nghiên cứu này, vi khuẩn sợi Streptomyces aegyptia ANTHOIDONG 6.1 có khả năng đối kháng tốt với vi khuẩn gây bệnh Bacillus cereus

3) Dòng vi khuẩn sợi Streptomyces laurentii ANTHOIDONG 11.1 có khuẩn lạc dạng hình tròn đồng tâm bao quanh bởi các tia Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn sợi Streptomyces laurentii ANTHOIDONG 11.1 có bề mặt bào tử nhẵn, nối thành chuỗi (Hình 4.12)

Hình 4.12: Khuẩn lạc (A) và chuỗi bào tử (B và C) của dòng S laurentii ANTHOIDONG

11.1 dưới kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn sợi Streptomyces laurentii phân lập từ đất lần đầu tiên tại bang New

Jersy, Hoa Kỳ và chúng có khả năng sản xuất kháng sinh Thiostrepton (Trejo-Astreda et al., 1998) có tác dụng hỗ trợ điều trị sốt rét và ung thư (Zhang et al., 2016) Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn sợi Streptomyces laurentii ANTHOIDONG 11.1 có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Bacillus cereus

Sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh

Những hợp chất polyketide đều có hoạt tính sinh học và tầm quan trọng trong y khoa (Zhao et al., 2018) Việc sàng lọc, tìm những trình tự gen mã hóa cho enzyme tổng hợp polyketide (gọi tắt là “quy định sự tổng hợp nhóm chất polyketide”) có thể được dùng để dự đoán sự hình thành các chất trao đổi thứ cấp (Zhao et al., 2009 và Sun et al., 2015) Do đó, khảo sát sự hiện diện của các gen như pksI, pksII và nrps rất cần thiết trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của 8 dòng vi khuẩn sợi Kết quả nghiên cứu cho thấy có 4/8 (chiếm 50%) dòng vi khuẩn sợi sở hữu gen pksI

(quy định sự tổng hợp nhóm chất PKS-I), và tất cả 8/8 (100%) dòng đều có gen nrps (quy định sự tổng hợp NRPS) Tuy nhiên, không tìm thấy gen pksII (quy định sự tổng hợp PKS-II) trong các dòng vi khuẩn sợi này

Sự hiện diện của các gen mã hóa enzyme tổng hợp polyketide cho thấy vi khuẩn sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ thật sự có tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn Gen nrps có mặt ở tất cả các dòng vi khuẩn sợi của nghiên cứu là cơ sở vững chắc cho vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn; tương đồng với các nghiên cứu quốc tế Như trường hợp kháng sinh Noursamycin thu nhận từ vi khuẩn sợi dòng Streptomyces noursei

NTRSR4 (lưu trữ ở Đức) nằm trong số các chất chuyển hóa do cụm gen nrps quy định

Noursamycin này có tính kháng nấm và kháng khuẩn phổ rộng (tác động lên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương) (Mudalungu et al., 2019)

Kết quả này nhấn mạnh rằng môi trường rừng ngập mặn đại diện cho một quần xã vi sinh vật phong phú trong đó có các loài vi khuẩn sợi, là nguồn tài nguyên sinh học tiềm năng để khám phá các chất chuyển hóa thứ cấp có tính kháng khuẩn Tám dòng vi khuẩn sợi kháng lại vi khuẩn Gram dương gây bệnh (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus) đều có gen mã hóa cho NRPS; trong khi bốn dòng kháng lại vi khuẩn Gram âm gây bệnh (E coli và Vibrio parahaemolyticus) có gen mã hóa cho PKS-I (bốn dòng mang cả hai loại gen là vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1,

Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1, Streptomyces parvulus

ANTHOIDONG 3.1 và Streptomyces tanashiensis ANTHOIDONG 3.2) (Bảng 4.5,

Bảng 4.5: Sự hiện diện các gen chỉ thị cho NRPS, PKS-I, và PKS-II trong 8 dòng Streptomyces

STT Dòng vi khuẩn sợi NRPS

(Ghi chú: NRPS: nonribosomal polyketide synthetase, “+”: có sự hiện diện của gen, “-“: không có sự hiện diện của gen)

Hình 4.18: Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA kích thước 700–800 bp sử dụng cặp mồi A3F/A7R đặc hiệu cho trình tự adenyl hóa NRPS của các chủng vi khuẩn sợi (Kí hiệu: M: thang chuẩn 100 bp code Invitrogen™ 15628019 , 1: THANHAN 4.4, 2: ANTHOIDONG 3.1, 3: ANTHOIDONG 3.2; 4: ANTHOIDONG 4.1; 5: ANTHOIDONG 6.1; 6: ANTHOIDONG 7.1; 7: LONGHOA 4.2; 8: ANTHOIDONG 11.1).

Hình 4.19: Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA 1200–1400 bp sử dụng K1F/K2R và K1F/M6R cho gen pksI của các chủng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn (Kí hiệu: M: thang chuẩn 100 bp code Invitrogen™ 15628019, 1: THANHAN 4.4, 2: ANTHOIDONG 3.1, 3: ANTHOIDONG 3.2; 4: ANTHOIDONG 4.1; 5: ANTHOIDONG 6.1; 6: ANTHOIDONG 7.1; 7: LONGHOA 4.2; 8: ANTHOIDONG 11.1)

Như vậy, tần số xuất hiện của gen nrps và pksI lần lượt là 100% và 50% ở các dòng vi khuẩn sợi được chọn lọc Nghiên cứu của Ayuso-sacido et al (2005) khẳng định sự phân bổ của gen nrps trong hầu hết các loài thuộc chi Streptomyces, còn sự hiện diện của gen pksI có phần ít hơn và khá biến động theo loài (tần số xuất hiện gen nrps ở chi

82 này là 97%, trong khi gen pksI đạt 78,8%) Tương tự, nghiên cứu của Gong et al (2018) cho rằng 20/29 các chủng vi khuẩn sợi phân lập (68,9%) có mang gen nrps, trong khi pksI chỉ được ở 16/29 dòng vi khuẩn sợi phân lập; tuy nhiên, có sự khác biệt khi gen pksII lại xuất hiện ở 100% các dòng vi khuẩn sợi Số lượng các vi khuẩn sợi mang 2 gen mã hóa enzyme tổng hợp kháng sinh không nhiều (từ 6 - 7 trong tổng số 29 dòng vi khuẩn sợi thu được)

Sự xuất hiện nhiều hơn của gen pksI so với gen pksII thể hiện trong nghiên cứu của Weber et al (2003) khi khảo sát sự tồn tại của các gen chỉ thị chất kháng sinh trong các dòng vi khuẩn sợi phân lập thấy rằng, gen quy định tổng hợp PKS-I được phát hiện ở 2–10 các cụm gen khác nhau trong mỗi dòng vi khuẩn sợi; còn gen mã hóa cho PKS-

II thì tỷ lệ thấp rõ hơn, xuất hiện chỉ ở 1 - 3 cụm gen khác nhau trong mỗi dòng Để xác định rõ ràng các cụm gen cụ thể, cần thiết phải kết hợp các cặp mồi và các mẫu dò khác nhau Ngoài ra, có nghiên cứu khác cho thấy rằng ở trong tế bào vi khuẩn sợi, gen pksII ít biểu hiện hoặc tạo được hàm lượng chất kháng sinh ít hơn, cần có hệ thống biểu hiện kích hoạt (Li và Piel, 2002)

Từ đó, giải thích cho sự khác biệt trong kết quả của Gong et al (2018), căn cứ theo Weber et al (2003) cho rằng tỷ lệ dò ra gen pksII cao có thể do việc sử dụng cặp mồi hoặc đoạn dò khác nhau (ở đây, cặp mồi KsaF (5’-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3’) và KsaR (5’-TGGAANCCGCCGAABCCGCT-3’ được sử dụng để nhận diện gen pksII) Tương tự như vậy, khi sử dụng những cặp mồi khác ((KS1F-KS1R; KSα–KSβ;

540F-1100R), nghiên cứu mới nhất của Sabido et al (2021) khảo sát 15 dòng vi khuẩn sợi phân lập từ các đảo thuộc Philippines cho thấy gen pksII lại xuất hiện ở tất cả các dòng vi khuẩn sợi, trong khi gen pksI và gen nrps xuất hiện ở mức độ tuy thấp hơn nhưng là đại đa số (chỉ có 1 dòng không mang một trong hai gen này) Đặc biệt, Sabido et al (2021) khẳng định rằng mặc dù không phát hiện được gen pksI trong 1 dòng vi khuẩn sợi nhưng dòng này vẫn có cơ chế để sản xuất các polyketide týp I Như vậy, giả thiết “phụ thuộc vào cặp mồi” của Weber et al (2003) có thể dùng để giải thích và hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn sợi Streptomyces rõ ràng không quá lệ thuộc vào 1 gen duy nhất mà do nhiều cụm gen quy định Điều này cho thấy kết quả không tìm thấy sự hiện diện của gen pksII trong các dòng vi khuẩn sợi của nghiên cứu này rất có thể do việc lựa chọn sử dụng cặp mồi có tính đặc hiệu chưa cao, nhưng không mâu thuẫn với khả năng kháng khuẩn chung của chi Streptomyces được ghi nhận từ trước đến nay

Tỷ lệ phát hiện cao các gen pksI và nrps trong những dòng vi khuẩn sợi phân lập được đều thuộc vi khuẩn sợi Streptomyces, một lần nữa cung cấp thông tin mạnh mẽ về tiềm năng lớn của chi Streptomyces này trong việc tạo ra nhiều chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học Do đó, việc phát hiện gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp các hợp chất hoạt tính sinh học vẫn là một cách tiếp cận hiệu quả và có giá trị để chọn trước các dòng vi khuẩn sợi phân lập nhằm mục đích sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích

(Mets¨a-Ketel¨a et al., 1999; Ginolhac et al., 2004; Hornung et al., 2007;; Schneemann et al., 2010)

Bên cạnh đó, việc xuất hiện những dòng vi khuẩn sợi mang cùng lúc 2 gen mã hóa cho sự tổng hợp nhiều loại polyketide (pksI và nrps) là chỉ thị rõ rệt cho khả năng thu nhận những hợp chất mới, với tính năng ưu việt hơn, ngoài tính kháng khuẩn Shen et al., (2002) nghiên cứu cơ sở phân tử của giao tiếp liên mô-đun giữa NRPS và PKS trong hợp chất lai sinh học giữa peptide và polyketide tạo được những hợp chất sinh học lai có nhiều tác dụng độc đáo hơn Trong số các hợp chất lai đó, Bleomycins (BLM) là một kháng sinh dẫn xuất từ glycopeptide được tổng hợp bởi nhiều loài vi khuẩn sợi

Streptomyces có nguồn gốc từ vùng ngập thủy triều Chất BLM thể hiện mạnh mẽ hoạt động chống khối u và hiện đang được sử dụng trong lâm sàng kết hợp với một số tác nhân khác để điều trị một số bệnh ung thư Trong số các chất chống ung thư, BLM không gây suy tủy, nên đang được ứng dụng rộng rãi trong hóa trị liệu Tuy nhiên, hiện tượng dễ bị kháng thuốc và tích lũy độc tố ở phổi là những hạn chế chính của BLM trong liệu pháp hóa trị Do đó, nảy sinh thêm xu hướng phát triển các dẫn xuất BLM mới để tìm kiếm các loại thuốc chống ung thư với khả năng lâm sàng tốt hơn, và độc tính thấp hơn Shen et al (2002) tiến hành nhân bản, giải trình tự và xác định đặc điểm sinh hóa của cụm gen sinh tổng hợp BLM từ vi khuẩn sợi Streptomyces verticillus

Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi được chọn

Căn cứ vào tiêu chí “mang cả 2 gen chỉ thị kháng sinh và mức độ kháng khuẩn (biểu hiện qua kích thước vòng kháng khuẩn) đều trội hơn so với các dòng còn lại” (mang 1 hoặc 2 gen nhưng kích thước vòng kháng khuẩn nhỏ hơn), kết quả cho thấy rằng có 2 dòng vi khuẩn sợi là Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 đáp ứng được tiêu chí này: dòng vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 có khả năng kháng khá mạnh đối với Bacillus cereus (vòng vô khuẩn 27,6 mm), Vibrio parahaemolyticus (17,7 mm) và Staphylococcus aureus (35,1 mm) nhưng kháng E coli hơi yếu (5,6 mm) Tương tự, dòng vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 có khả năng kháng lại Bacillus cereus (vòng vô khuẩn 12,3 mm), Vibrio parahaemolyticus (21,7 mm), Staphylococcus aureus (15,7 mm) và E coli (11,7 mm) Cả hai dòng vi khuẩn sợi này đều mang 2 gen chỉ thị kháng sinh là gen pks-I và gen nrps Tuy nhiên, khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 nhìn chung trội hơn dòng vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 (ngoại trừ khả năng kháng vi khuẩn E coli)

Vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus được Maleki et al (2013) ghi nhận là một trong những loài có tiềm năng sản xuất kháng sinh cao, kể cả ức chế được nhóm vi khuẩn đa kháng thuốc (Odumosu et al., 2017) Bên cạnh đó, nghiên cứu của Takehara et al (2008) cho rằng loài vi khuẩn sợi S celluloflavus thể hiện tính kháng khuẩn không mạnh nhưng ức chế nấm men tốt.Do đó, đây là 2 dòng vi khuẩn sợi được chọn để tiến hành nhân nuôi, thu nhận chất kháng khuẩn và phân tích xác định thành phần cấu trúc các hợp chất kháng khuẩn

4.5.1 Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vi khuẩn sợi

Dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 được tách chiết hoạt chất bằng dung môi ethyl acetate, thu được 1,01 g cao chiết thô Tương tự, dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 được tách chiết hoạt chất và thu được 1,02 g cao chiết

Cao chiết của 2 dòng vi khuẩn sợi này (Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trước khi phân tích thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khối phổ - GCMS, nhằm khẳng định sự hiện diện và bảo toàn tính năng của các chất kháng khuẩn (Hình 4.20)

Hình 4.20: Vòng kháng khuẩn của cao chiết từ 2 dòng vi khuẩn sợi: S albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 (trái) và S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 (phải) Giếng có dấu “+” là giếng chứa kháng sinh đối chứng

*Khả năng kháng khuẩn của cao chiết của vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1

Cao chiết thô của vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 được khảo sát khả năng kháng khuẩn với 3 dòng vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus,

Escherichia coli, và Staphylococcus aureus Kết quả trong Bảng 4.6 cho thấy cao chiết có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Bacillus cereus với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 18 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 10 mm); kháng vi khuẩn gây bệnh E.coli với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 3,5 mm (so với đối chứng là kháng sinh tetracyclin với đường kính vòng vô khuẩn là 9 mm); kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm (tương đương với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm)

Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus

Vi khuẩn sợi Kích thước vùng ức chế

Bacillus cereus E coli Staphylococcus aureus

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phương pháp LSD và phân tích ANOVA một biến)

* Khả năng kháng khuẩn của cao chiết của vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1

Cao chiết thô của vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 được khảo sát khả năng kháng khuẩn với 3 dòng vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus,

Escherichia coli, và Staphylococcus aureus Kết quả trong Bảng 4.7 cho thấy cao chiết có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Bacillus cereus với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 10 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 8 mm); kháng vi khuẩn gây bệnh E.coli với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 9,5 mm (so với đối chứng là kháng sinh tetracyclin với đường kính vòng vô khuẩn là 9 mm); kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus với trung bình đường kính vòng vô khuẩn là 11 mm (so với đối chứng là kháng sinh streptomycin với đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm)

Bảng 4.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus

Vi khuẩn sợi Kích thước vùng ức chế

Bacillus cereus E coli Staphylococcus aureus

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phương pháp LSD và phân tích ANOVA một biến)

Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của cao chiết từ hai dòng vi khuẩn sợi Streptomyces albogriesolus ANTHOIDONG 7.1 và Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 thể hiện qua kích thước vòng kháng khuẩn nhỏ hơn so với nuôi cấy vi khuẩn sợi trực tiếp trên môi trường thạch có thể do quá trình chiết tách không thu được hết các chất trao đổi thứ cấp và còn nhiều yếu tố ảnh hưởng chưa

87 được khảo sát như thời gian ủ, mật độ vi khuẩn kiểm định… và kể cả chất lượng thạch nền

Trước đây, Lakshmipathy và Kannabiran, (2009) sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy các dòng vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces (phân lập từ đất ruộng muối ven bờ vịnh Ấn Độ) để kiểm tra tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho kết quả kích thước vùng ức chế to hơn (20 mm) Rajan và Kannabiran (2014) phân lập được một chủng vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces từ đất trầm tích biển Ấn Độ, sử dụng dịch nuôi cấy trực tiếp có khả năng kháng lại các dòng vi khuẩn đa kháng thuốc thuộc loài Staphylococcus aureus với kích thước vùng ức chế từ 12 đến 21 mm

Theo Nandhini và Selvam (2013) nghiên cứu thấy dòng vi khuẩn sợi Streptomyces coelicolor SU6 phân lập từ đất ven biển Ấn Độ có khả năng ức chế 3 loài vi khuẩn gây bệnh là Bacillus subtilis, E coli và Staphylococcus aureus với kích thước vòng kháng khuẩn tương ứng lần lượt là 14, 15 và 12 mm Bên cạnh đó, Bhavana et al (2014) ghi nhận cao chiết của dòng vi khuẩn sợi Streptomyces carpaticus MTCC-11062 thể hiện tính kháng với vi khuẩn Bacillus cereus mạnh hơn so với kháng lại vi khuẩn E coli (kích thước vòng vô khuẩn khoảng 10 -12 mm) Nandhini et al (2018) sử dụng ethyl acetate thu nhận cao chiết thô của một chủng vi khuẩn sợi Streptomyces phân lập từ đất Ấn Độ và kiểm tra tính kháng khuẩn của cao chiết cho thấy kích thước vùng kháng lại vi khuẩn

Staphylococcus aureus là 13 mm Ngoài ra, trong nghiên cứu của Gopal et al (2013) ghi nhận dịch nuôi cấy sau khi ly tâm của dòng vi khuẩn sợi Streptomyces sp VITDDK3 phân lập từ bờ biển Ấn Độ có khả năng kháng khuẩn không cao; sau khi xử lý với HAuCl4 để hình thành các hạt nano vàng lại đạt tính kháng nấm rất mạnh

Khattab et al (2016) khẳng định việc sử dụng ethyl acetate làm dung môi để chiết xuất các hợp chất sinh học của vi khuẩn sợi cho kết quả kháng khuẩn rõ ràng hơn so với các dung môi khác, và đề xuất tỷ lệ phối trộn là 1:1 (sử dụng lượng ethyl acetate nhiều hơn so với nghiên cứu này) Tương tự, Awla et al (2016) khi khảo sát tính kháng nấm của cao chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi thấy rằng dung môi ethyl acetate đem lại kết quả tốt hơn

Từ kết quả trên cho thấy đặc tính của những hoạt chất sinh học (bioactive) trong việc ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn gây bệnh cho người không thay đổi theo tình trạng của vi khuẩn sợi: “các chất này được sinh tổng hợp từ trong tế bào khi vi khuẩn sợi còn hoạt động rồi phóng thích ra bên ngoài để đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, nhưng khi vi khuẩn sợi bị xử lý bằng ethyl acetate (để chiết tách sinh chất) thì các hoạt chất này vẫn giữ nguyên được tính kháng khuẩn”, mở ra triển vọng ứng dụng những hợp chất có hoạt tính sinh học, (các chất trao đổi thứ cấp) vào sản xuất thành dược phẩm sau khi chúng được tinh sạch và những bước cần thiết khác trong qui trình chế biến của các công ty dược, tạo thành những viên thuốc (để uống) hay ống thuốc (để tiêm) sử dụng trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên người

4.5.2 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi

Cao chiết được pha loãng lần lượt qua các bậc 10 ppm, 1 ppm và 0,1 ppm; tiến hành phân tích GC-MS (với chất mang là khí Heli) để xác định cấu trúc các hợp chất sinh học Kết quả phổ phân tích cho ra 25 đỉnh (peak) chất, chi tiết được trình bày trong Bảng 4.8 (công thức cấu tạo trình bày trong Phụ Lục)

Bảng 4.8: Các đỉnh chất trong phổ GCMS thành phần cao chiết của vi khuẩn sợi S albogriseolus

STT RT Tên hóa chất

3 6,63 Acetic acid, trifluoro, decyl ester C12H21F3O2

Kết luận

Rừng ngập mặn huyện Cần Giờ có vai trò sinh thái quan trọng, hiện đang là nguồn cung cấp nhiều vi sinh vật tiềm năng cho công nghệ sinh học Đề tài phân lập được 48 dòng vi khuẩn sợi Qua tuyển chọn, thu được 10 dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn, chiếm tỷ lệ 20,83 %, với khả năng kháng lại ít nhất 1 dòng vi sinh vật gây bệnh, với đường kính vòng vô khuẩn >1mm Số lượng dòng vi khuẩn sợi có tính kháng và mức độ kháng thay đổi tùy theo loại vi sinh vật kiểm định Nhiều nhất là kháng lại vi khuẩn Bacillus cereus (8/10 dòng), độ kháng mạnh lại thể hiện đối với vi khuẩn Vibrio parahaemonlytycus và Staphylococcus aureus Trong đó có 3 dòng mang ký hiệu

ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng được cả 4 loài vi khuẩn gây bệnh Đặc biệt là dòng vi khuẩn sợi ANTHOIDONG 3.1 và ANTHOIDONG 7.1 kháng lại hai loài vi khuẩn gây bệnh cho người Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus và kháng được cả vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên thủy sản

Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19 chuyên biệt cho vi khuẩn sợi và so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, cho thấy 8 dòng vi khuẩn sợi thể hiện tính kháng khuẩn tốt đều thuộc chi Streptomyces, thuộc họ

Actinomycetaceae, với 8 loài khác nhau, bao gồm: Streptomyces tendae, S tanashiensis,

S parvulus, S celluloflavus, S aegytia, S africanus, S albogriseolus và S laurentii

Qua khảo sát sự hiện diện của các gen pksI, pksII, và nrps mã hóa cho các enzyme tổng hợp polyketides trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh, ghi nhận được gen nrps tồn tại ở tất cả 8 dòng vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces, chiếm tỷ lệ 100% Có 4 dòng vi khuẩn sợi (50%) mang gen pksI Các dòng vi khuẩn sợi ANTHOIDONG 3.1, ANTHOIDONG 3.2, ANTHOIDONG 4.1 và ANTHOIDONG 7.1 mang cả 2 gen nrps và pksI Không tìm thấy sự xuất hiện của gen pksII

Nghiên cứu chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi là Streptomyces albogriseolus

ANTHOIDONG 7.1 và S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 để nhân nuôi, thu nhận chất kháng khuẩn, và xác định thành phần hóa học, cấu trúc phân tử của chúng bằng phương pháp phân tích hóa học khối phổ GC-MS Kết quả ở dòng vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 xác định tối thiểu 6 hợp chất tiêu biểu gồm:

Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; acid 2,6 dihydroxybenzoic dẫn xuất 3TMS; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane,1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15- Hexadec; và Tetracosamethyl,

108 cyclododecasiloxane Ở dòng vi khuẩn sợi S celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 có sự hiện diện tối thiểu 7 hợp chất tiêu biểu gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5- bis(trimethylsiloxy)tetrasiloxane; acid Benzoic, 2-hydroxy-1-methylethyl ester; 1- Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl Trong những chất này, có Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl là 2 chất cùng xuất hiện ở cả hai dòng vi khuẩn sợi, thể hiện tính ổn định trong khả năng kháng khuẩn của hai dòng dòng vi khuẩn sợi này Các hợp chất mà đề tài nhận diện được thế giới nghiên cứu khẳng định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kể cả chống oxy hóa, nhất là hợp chất siloxane, làm cơ sở cho nghiên cứu tiếp theo nhằm khai thác tiềm năng dược liệu của vi khuẩn sợi đất rừng ngập mặn, góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người Kết quả của đề tài có ý nghĩa cho thấy sự tương đồng của đất rừng ngập mặn Cần Giờ so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới cả về chủng loài vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất.

Đề xuất

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chất kháng khuẩn, quy trình tinh sạch nhằm hướng đến sản xuất kháng sinh thành phẩm từ 2 dòng vi khuẩn sợi

Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S celluloflavus ANTHOIDONG

4.1 Khảo sát thêm các đặc tính y khoa của những hợp chất do 2 dòng vi khuẩn sợi này tổng hợp như khả năng kháng các vi khuẩn đa kháng thuốc, độc tính hoặc khả năng ức chế khối u và chống oxy hóa trên nhiều đối tượng bệnh khác nhau Bên cạnh đó, nghiên cứu liên ngành những hợp chất chưa nhận diện được trong quá trình phân tích bằng GC-

MS để xác định hoạt chất mới

Giải trình tự hoặc khảo sát sự biểu hiện của các gen hoặc cụm gen mã hóa enzyme tổng hợp polyketides ở các dòng vi khuẩn sợi để đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền vi sinh vật Việt Nam và khả năng thu nhận hợp chất mới

Kết quả của đề tài góp phần thể hiện tầm quan trọng sinh thái của rừng ngập mặn Cần Giờ Trong đó, vi sinh vật với vi khuẩn sợi là nguồn tài nguyên đáng lưu ý của đất ngập nước, nhiễm mặn Đồng thời nhấn mạnh đối tượng này để những nhà khoa học trẻ, tài năng nghiên cứu tiếp theo làm phong phú hơn và khai thác nguồn dược liệu quí này trong đất rừng ngập mặn của thành phố Hồ Chí Minh nói riêng và của cả nước nói chung mà chúng ta chưa lưu ý đến

Tiêu đề	Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh
Tác giả	Nguyễn Tuấn Hải
Người hướng dẫn	GS.TS. Cao Ngọc Điệp
Trường học	Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Cần Thơ

Định dạng
Số trang	203
Dung lượng	5,57 MB