khảo sát quần thể tế bào lympho tcd4 treg và th17 ở bệnh nhân nhiễm hbv mạn

Thật vậy, mặc dù các thuốc diệt vi rút rất hiệu quảđã được phát triển và các chương trình quốc gia phòng tránh được bệnh ganmạn nặng, mục tiêu điều trị khỏi vẫn chưa khả thi; khả năng lồ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quảnghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưatừng được công bố ở bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án

Lê Thị Thuý Hằng

Lê Thị Thuý Hằng

MỤC LỤC

Danh mục các chữ viết tắt và thuật ngữ Anh-Việt v

1.4 Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi với nhiễm HBV 11

1.6 Phương pháp đếm tế bào miễn dịch và đo mức độ biểu hiện yếutố phiên mã

1.7 Các nghiên cứu đã được thực hiện về tế bào Treg và Th17 ở cáthể nhiễm HBV

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.5 Các biến số chính của nghiên cứu 342.6 Kỹ thuật đo lường biến số, thu thập dữ liệu 36

3.2 Đặc điểm tế bào Treg và Th17 của các nhóm nghiên cứu 543.3 Các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt của các nhóm nghiên

3.4 Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện FOXP3 vàRORγt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chứcnăng gan ở các nhóm nhiễm HBV mạn

4.2 Đặc điểm tế bào Treg và Th17 của các nhóm nghiên cứu 874.3 Các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORt ở các nhóm nghiên cứu 994.4 Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiện FOXP3 và

RORγt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chứcnăng gan ở các nhóm nhiễm HBV mạn

105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN

TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT

ACLF Acute on chronic liver failure Suy gan cấp trên nền mạn

ALT Alanine aminotransferase Men gan ALT

Anti-HBc Hepatitis B core antibody Kháng thể kháng khángnguyên lõi HBV

Anti-HBe Hepatitis B e antibody Kháng thể kháng khángnguyên e HBV

Anti-HBs Hepatitis B surface antibody Kháng thể kháng khángnguyên bề mặt HBVAPC Allophycocyanin

APRI AST to Plalete Ratio Index Tỉ số AST so với tiểu cầu

cAMP cyclic adenosine monophosphate

cccDNA covalently closed circular DNA DNA vòng đóng đồng hoá trịCD Cluster differentiation

cGAS cyclic GMP AMP SynthaseCRP C reactive protein

CT Cycle threshold Ngưỡng chu kỳ

CTLA Cytotoxic T lymphocyte antigen Kháng nguyên lympho T độctế bào

DNA Deoxyribonucleic acid∆∆CT Delta delta cycle threshold

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bòFOXP3 Forkhead box protein 3

GAPDH glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase

GzB Granzyme B

HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi HBVHBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên e HBVHBsAg Hepatitis B surface antibody Kháng nguyên bề mặt HBsHBV Hepatitis B virus Vi rút viêm gan B

HBV DNA Hepatitis B virus deoxyribonucleicacid

DNA của HBV

HBV polymerase/reversetranscriptase

men sao chép ngược HBVHBx HBV-encoded X Protein Kháng nguyên biểu mô của

HSP Heparin sulfate proteoglycanIFN Interferon

IL Interleukin

INR International normalized ratio

IQR Interquartile range Khoảng tứ phân vị

MAIT Mucosal associated invariant T Tế bào T bất biến liên quanvới niêm mạc

MELD Model for end stage of liverdisease

Mô hình bệnh gan giai đoạncuối

MHC Major histocompatibility complex Phức hợp phù hợp mô chính

NAs Nucleoside analogues Các thuốc tương tựnucleos(t)ide

qPCR Quantitative polymerase chainreaction

Phản ứng chuỗi polymeraseđịnh lượng

rc DNA relaxed circular DNA DNA vòng duỗiRIG-I Retinoic acid inducible gene I

RNA Ribonucleic acid

RORγt Retinoic acid related orphanreceptor gamma t

RT-PCR Reverse transcription polymerasechain reaction

Phản ứng chuỗi polymerasesao chép ngược

RT-qPCR quantitative Reverse transcriptionpolymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerasesao chép ngược định lượng

STAT Signal tranducer and activator oftranscription

T CD4+ CD4+ T cell Tế bào lympho T CD4+T CD8+ CD8+ T cell Tế bào lympho T CD8+

Tfh T follicular helper cellTGF Transforming growth factor

Th17 T helper 17 cell Tế bào lympho T giúp đỡ 17TLR Toll like receptor Thụ thể giống Toll

TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử bướu

Treg regulatory T cell Tế bào lympho T điều hoàtTreg thymic regulatory T cell Tế bào Treg từ tuyến ứcULN Upper limit of normal Giới hạn trên bình thường

VGMe+ Viêm gan B mạn HBeAgdương

VIF Variance Inflation Factor Hệ số phóng đại phương sai

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 2.1: Lượng RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA (25 ng/1)

phản ứng)

Bảng 2.3: Trình tự của các mồi sử dụng cho phản ứng PCR địnhlượng

Bảng 2.4: Thành phần trong 1 phản ứng PCR đo mức độ biểu hiệngen của FOXP3 và RORγt

Bảng 2.5: Chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR 45

Bảng 3.1: Đặc điểm lúc vào của các nhóm nghiên cứu (n = 159) 52

Bảng 3.2: Đặc điểm lúc vào nghiên cứu của hai nhóm bùng phát (n =

Bảng 3.7: Mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt

của các nhóm nghiên cứu (n = 80)

Bảng 3.8: Mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt

của 2 nhóm bùng phát nhẹ và nặng (n =30)

67

Bảng 3.9: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiệnFOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT trong toàn dân sốnghiên cứu

Bảng 3.10: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiệnFOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT ở nhóm nhiễmHBV mạn HBeAg dương

Bảng 3.11: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiệnFOXP3, RORγt với HBV DNA, AST và ALT ở nhóm viêm ganB mạn HBeAg dương

Bảng 3.12: Tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17, mức độ biểu hiệnFOXP3, RORγt với HBV DNA và chức năng gan ở nhóm bùngphát

Bảng 3.15: Các yếu tố tương quan với Treg trong nhóm bùng phát:

Phân tích đa biến (n = 61)

85

DANH MỤC CÁC HÌNH

TrangHình 1.1: Cấu trúc tiểu thể Dane và các tiểu phần của HBV 6Hình 1.2: Các quan niệm về diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn theo

Hình 1.4 Những cơ chế hoạt động của tế bào Treg 19

Hình 1.6: Hình phân bố tế bào T có biểu hiện FOXP3 và IL-17 trênmáy đếm tế bào dòng chảy

Hình 3.1: Biểu hiện tế bào Treg và Th17 của một người đại diện mỗinhóm nghiên cứu trên máy đếm tế bào dòng chảy

54

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 của các nhóm nghiên

Biểu đồ 3.11: Tỉ lệ Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 của 2 nhóm tuổi ở

nhóm bùng phát (n = 61)

79Biểu đồ 3.12: Tỉ lệ Treg tiết IL-17A của 2 nhóm tuổi ở nhóm bùng

phát (n = 61)

80Biểu đồ 3.13: Mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt của 2 nhóm bùng

phát HBeAg dương và âm (n = 30)

81Biểu đồ 3.14: Tỉ số FOXP3/RORγt của 2 nhóm bùng phát HBeAg

dương và âm (n = 30)

82Biểu đồ 3.15: Mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt của 2 nhóm tuổi ở

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi rút viêm gan B (HBV) vẫn còn là một trong những tác nhân gây tửvong hàng đầu ở nhiều nước trên thế giới do các bệnh lý gan giai đoạn cuối vàung thư biểu mô tế bào gan Thật vậy, mặc dù các thuốc diệt vi rút rất hiệu quảđã được phát triển và các chương trình quốc gia phòng tránh được bệnh ganmạn nặng, mục tiêu điều trị khỏi vẫn chưa khả thi; khả năng lồng ghép các đoạngen của HBV vào bộ DNA của người nhiễm1 gây khó khăn cho việc thải trừhoàn toàn HBV ngay cả ở người đã kiểm soát vi rút lâu dài bằng thuốc.

Khác với nhiễm HBV ở người trưởng thành, HBV nhiễm từ mẹ trongthời kỳ chu sinh thường lưu lại suốt đời sống, trải qua nhiều giai đoạn khácnhau do tương quan giữa phản ứng miễn dịch với HBV.2 Ngày nay nhiễm HBVmạn được thừa nhận liên quan với phản ứng không hiệu quả của miễn dịch đặchiệu và không đặc hiệu, đặc biệt là của tế bào lympho T;3,4 với tình trạng miễndịch dung nạp đối với các kháng nguyên của HBV; và với sự cân bằng giữamiễn dịch thải trừ vi rút và phản ứng ức chế tiêu huỷ tế bào.5 Trong xu thế trịliệu đa phương nhằm điều trị khỏi HBV hiện nay, vai trò của các tế bào miễndịch chuyên biệt và không chuyên biệt với HBV đang ngày càng được hiểunhiều hơn.3,4,6,7

Trong phản ứng miễn dịch tế bào với HBV, hai quần thể tế bào lymphoT được biệt hoá từ T CD4+ gồm tế bào T điều hoà (T regular−Treg) với vai tròức chế phản ứng miễn dịch và tế bào T trợ giúp (T helper−Th)17 với vai tròkích thích phản ứng viêm gây tổn thương mô cùng tồn tại.8,9 Sự tương tác giữahai phản ứng ức chế và kích thích miễn dịch này diễn ra suốt quá trình nhiễmHBV mạn,10 dẫn đến khỏi bệnh khá hiếm xảy ra, nhưng thường gặp nhất làbệnh gan mạn, xơ gan, ung thư gan và tử vong.

Từ đầu thập kỷ 20, tế bào Treg và Th17 đã được nhận diện ở người nhiễmHBV mạn nhiều hơn so với người khoẻ mạnh.11 Ở người viêm gan B mạn đợt

bùng phát với suy gan cấp, số lượng tế bào Treg ít hơn và Th17 lại trội hơn.12,13

Vài nghiên cứu mới đây lại ghi nhận sự gia tăng phản ứng của cả hai nhóm tếbào này ở người tổn thương gan nặng, viêm gan bùng phát.14,15 Vì vậy, phảnứng và sự cân bằng của hai quần thể Treg và Th17 trong nhiễm HBV mạn, nhấtlà trong đợt bùng phát rất cần được khảo sát thêm Một vấn đề được đặt ra thêmsau khi Treg tiết IL-17A được tìm thấy là: phản ứng miễn dịch nào khởi pháttrước và phản ứng nào là đáp ứng bù trừ; có hay không vai trò kép vừa kíchthích vừa ức chế miễn dịch của các tế bào này.16,17

Tuy liên quan giữa quá trình biệt hoá T CD4+ thành các tế bào miễn dịchvới các yếu tố phiên mã như FOXP3 với Treg,18 RORt với Th17,19,20 nhưngkết quả về biểu hiện của 2 yếu tố phiên mã này ở bệnh nhân viêm gan B mạnvẫn còn được bàn cãi Một số nghiên cứu trên bệnh nhân viêm gan mạn nặnghay suy gan cấp trên nền mạn tìm thấy có tương xứng giữa RORt và Th17nhưng không tìm được tương xứng giữa FOXP3 với Treg và mức độ tổn thươnggan.12,15,21

Theo trên, liên quan giữa phản ứng tế bào hay giữa các yếu tố phiên mãcủa tế bào với tổn thương gan ở người nhiễm HBV và có khác nhau ở các giaiđoạn của nhiễm HBV hay không còn cần được nhận biết thêm Do đó, câu hỏiđặt ra cho nghiên cứu này là “Phản ứng của tế bào Treg, Th17 và mức độ biểuhiện các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORt của các tế bào này trên bệnh nhânViệt Nam nhiễm HBV mạn HBeAg dương, viêm gan B mạn HBeAg dương vàviêm gan B mạn đợt bùng phát khác nhau như thế nào”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát

Phân tích đặc điểm quần thể tế bào lympho Treg, Th17 và yếu tố phiên mãFOXP3 và RORt trong máu ngoại vi của bệnh nhân ở các giai đoạn khác nhaucủa nhiễm HBV mạn.

Mục tiêu chuyên biệt

1 Xác định tỉ lệ tế bào Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBVmạn thuộc các nhóm: nhiễm HBV mạn HBeAg dương, viêm gan B mạnHBeAg dương và viêm gan B mạn đợt bùng phát.

2 Đánh giá mức độ biểu hiện FOXP3, RORt và tỉ số FOXP3/RORt ở cácnhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn.

3 Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17 và mức độ biểu hiện FOXP3,RORt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chức năng gan ở cácnhóm nhiễm HBV mạn.

Chương 1TỔNG QUAN

Nhiễm HBV mạn là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan giai đoạn cuốinhư xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) Theo dữ liệu của Tổ chức Ytế Thế giới vào năm 2019, HBV gây nhiễm mạn tính cho 296 triệu người, 1,5triệu trường hợp nhiễm mới mỗi năm và 820000 trường hợp tử vong vì bệnhgan mạn giai đoạn cuối do HBV.22 Tỉ lệ mang HBsAg trên thế giới khác nhautừ < 2% (vùng lưu hành thấp) đến > 8% (vùng lưu hành cao).23 Phần lớn các canhiễm ở vùng lưu hành cao như Đông Nam Á, Tây Địa Trung Hải,… do lây từmẹ sang con, xâm mình, quan hệ tình dục hay dùng chung kim tiêm.22 ViệtNam thuộc vùng lưu hành cao của HBV Trong một phân tích gộp tổng hợp 72nghiên cứu từ năm 1999 đến năm 2021 ghi nhận tỉ lệ HBsAg dương tính ởngười trưởng thành tại Việt Nam là 10,5%.24

Nhiễm HBV mạn ở các nước thuộc vùng lưu hành cao của HBV cóđường lây chủ yếu từ mẹ sang con Hậu quả quan trọng nhất ở nhiễm HBV chusinh tức truyền dọc từ mẹ sang con là 95% trẻ nhiễm vi rút sẽ mang HBV suốtđời sống,25 nguy cơ bệnh gan mạn và ung thư biểu mô tế bào gan cao hơn nhiềuso với lây truyền ngang ở tuổi trưởng thành Cho đến nay, các tác giả đều ghinhận quá trình nhiễm HBV ở người là quá trình tương tác phức tạp giữa vi rútvà phản ứng của hệ thống miễn dịch của cơ thể Quá trình này có thể dẫn tớinhiễm HBV cấp tính và tự hồi phục hoặc dẫn tới nhiễm HBV mạn tính Trongnhiễm HBV cấp tính xảy ra ở tuổi trưởng thành, hệ thống miễn dịch thích nghinhanh chóng nhận diện và tiêu huỷ tế bào nhiễm HBV gây tổn thương gan cấpgiúp thải trừ sạch hoàn toàn vi rút sau khỏi bệnh.26 Ngược lại, phản ứng miễn

dịch chuyên biệt đã được chứng minh hoạt động không hiệu quả ở người mangHBV mạn dù có hay không có triệu chứng,27 dẫn đến tập trung kéo dài các tếbào viêm không chuyên biệt, tích luỹ dần các vùng tổn thương tế bào xen lẫnvới các vùng tân sinh tế bào và phản ứng xơ hoá Ngoài ra ở người nhiễm HBVmạn, DNA vòng đóng đồng hoá trị (cccDNA) của HBV có thể lồng ghép trênbộ DNA người gây các đột biến gen sinh HCC.

HBV gây bệnh cho người thuộc gia đình Hepadnaviridae (bộ gen DNA),

có ái tính với gan và có vỏ bọc Bộ gen của vi rút được sắp xếp cực kì nhỏ gọn(hình 1.1) DNA vòng duỗi (relaxed circular DNA, rc DNA), chuỗi đôi khônghoàn toàn và nhỏ (3.2kb) có 4 vùng đọc mã mở, vùng C, P, S và X mã hoá tổnghợp các protein: HBcAg (kháng nguyên lõi HBV, protein nhân capsid), HBeAg(kháng nguyên e của HBV), HBV Pol/RT (polymerase, hoạt tính sao chépngược), 3 kháng nguyên bề mặt HBsAg (nhỏ, trung bình và lớn), và HBx(kháng nguyên x của HBV).28,29 Sau khi HBV xâm nhập vào gan, virion củaHBV được chuyển vào nhân, sản xuất các chất liệu di truyền của HBV, tạo nêncấu trúc virion và các tiểu phần không có virion, hoàn tất chu trình của HBV.Cấu trúc DNA vòng duỗi (rcDNA) được tạo nên trước tiên, sau đó sẽ chuyểnthành cấu trúc DNA vòng đóng đồng hoá trị (cccDNA) để đảm nhiệm vai tròlàm khuôn DNA cho hoạt động dịch mã thành cấu trúc RNA tiền gen(pregenomic RNA) và đưa ra ngoài nhân để tổng hợp tiếp thành 4 protein chínhS/preS, core (protein capsid), polymerase (P) và X.30 Cấu trúc DNA nhâncapsid trong bào tương tiếp tục được đóng gói và đưa vào mạng lưới nội bàohoặc đưa trở lại nhân để duy trì nguồn cccDNA.28 Ngoài ra, sợi RNA tiền gencòn được sao chép ngược thành sợi rcDNA mới cho vỏ capsid của vi rút.28Cùng với các virion hoàn chỉnh (đường kính 42 nm) được phóng thích ra khỏitế bào gan, gây nhiễm cho tế bào mới, tế bào gan nhiễm HBV còn sản xuất rất

nhiều phần tử hình cầu hoặc hình sợi đường kính 22 nm và không chứa capsid.Hoạt động lồng ghép bộ gen của HBV vào bộ gen kí chủ hiếm xảy ra nhưng cóthể có ảnh hưởng quan trọng trên quá trình tân sinh tế bào, gây ung thư biểumô tế bào gan.31 Mặc khác, sự khiếm khuyết khả năng kiểm tra lỗi trong quátrình sao chép của men sao chép ngược gây ra các đột biến điểm, thay đổi trìnhtự đoạn, thêm hay mất đoạn trên bộ gen của HBV là nguyên nhân hình thànhnên tính đa dạng của quẩn thể vi rút, đặc biệt nhất là tạo nên các chủng đột biếnmang ý nghĩa bệnh lý Thật vậy, HBV được phân loại thành kiểu gen và dướikiểu gen dựa trên trình tự nucleotide khác nhau ở một mức độ nhất định vàkhông có ý nghĩa bệnh lý và được thừa nhận như một quá trình tiến hoá của virút Tuy nhiên, nhiều đột biến kèm theo các biến đổi bệnh lý và thường diễn radưới áp lực điều trị hay miễn dịch như các đột biến kháng thuốc, các đột biếngây trốn thoát miễn dịch hay tăng sinh không kiểm soát cho tế bào gan.

Hình 1.1: Cấu trúc tiểu thể Dane và các tiểu phần của HBV

“Nguồn: Tsukada S, 2020” [32]

1.3 Các giai đoạn diễn biến ở người nhiễm HBV mạn theo quan điểm miễndịch

Nhiễm HBV mạn là quá trình tương tác kéo dài, liên tục giữa phản ứngmiễn dịch của ký chủ với HBV Trước đây người ta chưa rõ cơ chế nào khiếnnhiễm HBV mạn tuần tự diễn biến theo các giai đoạn Năm 1981, nhiễm HBVmạn được biết gồm 2 giai đoạn: viêm gan hoạt động (HBeAg dương, hiện diệnHBV DNA và bệnh gan hoạt tính) và người lành mang trùng (HBeAg chuyểnhuyết thanh, HBV DNA dưới ngưỡng phát hiện và bệnh gan không hoạtđộng).33 Cho đến năm 2005, quá trình diễn biến này được mô tả tuần tự trải qua4 giai đoạn theo tương quan giữa miễn dịch và HBV, khởi đầu từ dung nạpmiễn dịch, thải trừ miễn dịch, kiểm soát miễn dịch và trốn thoát miễn dịch.25Đến năm 2017, các giai đoạn lại được định nghĩa dựa trên kết hợp 2 tiêu chí“có hay không có tổn thương gan (tăng ALT)” và “có hay không có hoạt độngsao chép” (hình 1.2).10 Điểm quan trọng nhất ở cách phân loại mới này là kháiniệm “dung nạp miễn dịch” không còn được thừa nhận do trên cá thể được cholà ở thời kỳ dung nạp miễn dịch vẫn ghi nhận được trong gan có hiện diện cáctế bào miễn dịch, các tế bào này vẫn có phản ứng đầy đủ khi được kích thích từcác kháng nguyên chuyên biệt của HBV.2 Điểm mới cũng được phát hiện cuốithập niên 2010 là tình trạng kiệt quệ miễn dịch (giảm chức năng và số lượng)đặc biệt là của tế bào T chuyên biệt với HBV do tiếp xúc kéo dài với lượngkháng nguyên HBV cao.3 Ngoài ra các cytokine được tiết ra từ môi trường viêmmạn tính cũng có tác dụng ức chế các tế bào T và ngăn cản đáng kể việc thanhthải HBV.3 Diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn theo quan niệm mới nhấtđược mô tả như sau.

Hình 1.2 Các quan niệm về diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạntheo thời gian

1.3.1 Giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg dương

Trước đây được gọi là giai đoạn dung nạp miễn dịch,25 do giai đoạn nàymen gan trong giới hạn bình thường, HBeAg dương, tải lượng HBV DNA cao,không có tổn thương mô học gan Về miễn dịch, thời kỳ này từng được đánh giálà không có phản ứng miễn dịch của tế bào với kháng nguyên của HBV Tuy vậy,các khảo sát gần đây đã tìm thấy vẫn có hiện diện nhiều tế bào lympho T chuyênbiệt với HBV nhưng không kèm theo các tế bào viêm không chuyên biệt như bạchcầu đơn nhân và đa nhân.2 Các tế bào chuyên biệt này vẫn kích hoạt và biệt hoákhi tiếp xúc với các kháng nguyên HBV cho thấy từ ngữ dung nạp với HBV làkhông đúng Vì vậy, “giai đoạn dung nạp miễn dịch” được thống nhất thay thếbởi “nhiễm HBV mạn HBeAg dương” nhằm mục đích nhấn mạnh 2 tiêu chí “HBVcó sao chép mạnh” và không có phản ứng tích tụ tế bào viêm”.10 Mặc dù phản ứngviêm hoại tử hoặc xơ hoá gan chỉ hiện diện tối thiểu hay không có nhưng sự lồng

ghép HBV DNA và sự tăng sinh tế bào gan tạo dòng (clonal hepatocyteexpansion) nhắc nhở rằng quá trình sinh ung thư biểu mô tế bào gan có thể đãdiễn ra trong giai đoạn sớm này.10

Thuốc kháng vi rút ở giai đoạn này không giúp giảm nồng độ kháng nguyênHBsAg và HBeAg Tuy nhiên, việc lưu hành lượng lớn và kéo dài kháng nguyêncó thể dẫn đến kiệt quệ miễn dịch, kéo dài tình trạng nhiễm HBV HBeAg dươngvà có liên quan với xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan do tích tụ phản ứng xơhoá, đột biến trên bộ gen hay tân sinh tế bào gan bất thường Các liệu pháp miễndịch nhằm phục hồi tế bào T đang được nghiên cứu như liệu pháp vắc xin, thuốckháng PD-1 bước đầu đã được thử nghiệm trên chuột chũi, còn đang được nghiêncứu trên người nhiễm HBV giai đoạn HBeAg dương này.34

1.3.2 Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương

Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương trước đây được gọi là giaiđoạn thải trừ miễn dịch hay giai đoạn hoạt tính miễn dịch.25 Trong giai đoạnnày, phản ứng miễn dịch được kích hoạt thể hiện bằng sự hiện diện của tế bàoT chuyên biệt với HBV, bạch cầu đơn nhân và đa nhân không chuyên biệt cùngvới hình ảnh tổn thương tế bào gan.2 Phản ứng này gây ly giải tế bào được thừanhận là qua trung gian miễn dịch Kháng nguyên HBeAg vẫn còn dương, khángnguyên HBsAg và HBV DNA vẫn chưa đủ thời gian giảm đáng kể Mô họcgan có viêm hoại tử trung bình hoặc nặng và xơ hoá gan tiến triển nhanh so vớitrước đó Giai đoạn này thường xuất hiện từ 30 tuổi trở đi ở người nhiễm HBVchu sinh Qua nhiều đợt phản ứng miễn dịch như trên, còn được gọi là đợt cấpviêm gan B mạn hay đợt bùng phát (có ALT tăng trên 5 đến 1000 lần và có khikèm theo suy gan cấp, nặng), HBsAg và HBeAg giảm nhiều và có thể dẫn đếnchuyển huyết thanh HBeAg, HBV DNA âm tính hay ở mức rất thấp Sau vàithập niên, bệnh nhân sẽ chuyển sang giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg âmvới ALT bình thường, HBV DNA thấp (< 4 log copies/mL), HBsAg < 3 log

IU/mL, chức năng và mô học gan ổn định Một số ít bệnh nhân kiểm soát HBVkhông hiệu quả và tiến triển thẳng sang giai đoạn viêm gan mạn HBeAg âm.

1.3.3 Giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg âm

Trước đây gọi là giai đoạn kiểm soát miễn dịch hay nhiễm HBV giaiđoạn không hoạt tính.25 HBeAg chuyển âm tính và có kháng thể anti-HBe tronghuyết thanh, HBV DNA âm tính hoặc ở mức thấp (< 2000 IU/mL), HBsAg <1000 IU/mL), không tăng ALT, mô học gan không hoặc rất ít phản ứng tụ tậptế bào viêm và mô xơ, xơ hoá gan sẵn có không tiến triển thêm Giai đoạnnhiễm HBeAg âm càng kéo dài thường kèm giảm dần, mất HBsAg diễn ra 1-3% mỗi năm cùng với có hay không có xuất hiện anti-HBs tức chuyển đổi huyếtthanh HBsAg.10

1.3.4 Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg âm

Trước đây gọi là giai đoạn trốn thoát miễn dịch hay viêm gan tái hoạt dovi rút hoạt hoá trở lại sau thời kỳ ngưng hoạt động.25 Một số ít cá thể đượcchuyển trực tiếp từ giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương sang viêm gan Bmạn HBeAg âm do quần thể vi rút đột biến precore và hoặc basal core promoterxuất hiện và dần dần trở thành chủng HBV ưu thế có đặc tính không sản xuấtđược HBeAg Giai đoạn này ngoài dấu ấn HBeAg âm và anti-HBe dương, HBVDNA trở lại mức cao (thường thấp hơn giai đoạn HBeAg dương), cùng nhiềuđợt dao động ALT tăng > 5 lần giới hạn bình thường được gọi là đợt cấp haybùng phát viêm gan B mạn với HBeAg âm, mô học gan có phản ứng viêm hoạitử hoặc xơ hoá tiến triển, bệnh gan không còn ổn định dẫn đến suy tế bào gantrên nền bệnh gan mạn.35 Biểu hiện lâm sàng rất thay đổi từ không triệu chứng,có triệu chứng nhưng không suy gan, cho đến suy gan (vàng da, rối loạn đôngmáu) Nhiều tác giả giả định rằng việc biến mất chủng HBeAg dương và thaythế bằng chủng HBeAg âm được ký chủ nhận diện như là tiếp xúc với chủngHBV mới, kích hoạt các phản ứng nhận diện và thải trừ vi rút, gây tổn thương

gan và tiến triển bệnh gan vốn đã ổn định ở giai đoạn trước Giai đoạn này đượcxem là do phản ứng miễn dịch mạnh mẽ của tế bào T CD8+ và việc tăng sảnxuất các cytokine viêm nhằm đào thải vi rút.36 Tế bào T CD4+ sản xuất IL-17tăng trong máu và trong gan37 trong khi đó tế bào Treg chuyên biệt với HBcAggiảm trong giai đoạn tăng men gan và tổn thương gan này.38

1.3.5 Giai đoạn khỏi bệnh

Giai đoạn khỏi bệnh được đặc trưng bởi ALT bình thường liên tục, sựâm hoá gần tất cả các dấu ấn của HBV như HBsAg và HBV DNA, chỉ còn hiệndiện lâu dài và duy nhất dấu ấn kháng thể với HBcAg (anti-HBc) khẳng địnhtình trạng nhiễm HBV trong quá khứ Có khi còn có xuất hiện kháng thể anti-HBs khẳng định tình trạng khỏi bệnh và có miễn dịch bảo vệ với nhiễm HBVmới Tuy vậy, cccDNA vẫn còn phát hiện được trong nhân tế bào gan và lànguồn gen dự trữ của vi rút, giải thích sự tái hoạt vi rút ở cá thể suy giảm miễndịch mắc phải hay được điều trị ức chế miễn dịch.

Mất HBsAg trước khi xuất hiện xơ gan có nguy cơ xơ gan, bệnh gan mấtbù và HCC thấp nhất và tỉ lệ sống còn cải thiện Tuy nhiên, nếu xơ gan xuấthiện trước khi mất HBsAg, bệnh nhân vẫn có nguy cơ HCC, vì vậy tầm soátHCC nên được thực hiện thường qui Ức chế miễn dịch có thể dẫn đến tái hoạtHBV ở bệnh nhân này.39

1.4 Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi với nhiễm HBV

Ngay từ lần tiếp xúc đầu tiên với tác nhân ngoại lai, hệ miễn dịch bẩmsinh (innate immunity) tức thì ngăn chặn sự xâm nhập của tác nhân gây nhiễmtrùng; sau đó, hệ miễn dịch thích nghi (adaptive immunity) sẽ đảm nhiệm vaitrò kiểm soát và loại trừ tình trạng nhiễm trùng ở các giai đoạn kế tiếp Đặc biệttrong nhiễm HBV mạn, miễn dịch bẩm sinh đóng vai trò cả gián tiếp lẫn trựctiếp và phản ứng diễn ra xuyên suốt quá trình nhiễm mạn tính; miễn dịch thíchnghi giữ vai trò sản xuất kháng thể bảo vệ, hình thành các dòng tế bào chuyên

biệt và trí nhớ nhằm duy trì hàng rào miễn dịch nhanh và mạnh hơn khi tiếpxúc với sự tái xâm nhập của các tác nhân gây bệnh.3 Phản ứng miễn dịch bẩmsinh hoạt động tương tác với đáp ứng miễn dịch thích nghi nhằm điều hòa miễndịch và kiểm soát tình trạng nhiễm trùng Hệ thống miễn dịch bẩm sinh gồmcác cảm biến (sensor) chuyên biệt, các cytokine và các tế bào miễn dịch (tế bàogiết tự nhiên NK, tế bào đơn nhân, tế bào Kupffer và các tế bào có nguồn gốctuỷ xương).

1.4.1 Miễn dịch bẩm sinh

Ở giai đoạn sớm của nhiễm HBV, hệ thống miễn dịch bẩm sinh sẽ đượckích hoạt khi các cấu trúc chuyên biệt của HBV được nhận dạng thông qua cáccảm biến thụ thể giống Toll (TLR),40 gen I tạo retinoic axit (RIG-I) (nhận diệnRNA)41 hoặc cảm biến cGAS (nhận diện DNA).42 Ở giai đoạn này, phản ứngcủa hệ thống miễn dịch bẩm sinh gồm các cytokine giữ vai trò ngăn chặn sựtăng sinh và lan rộng của HBV Tuy nhiên, theo Bertoletti, các cytokine (nhưIFN nhóm I) chưa được tiết ra đáng kể trong giai đoạn sớm này.43 Tuy vậy,nhận định của các tác giả về mức độ tiết các cytokine ở các giai đoạn của nhiễmHBV cũng chưa đồng nhất Một số thấy IFN nhóm I được tạo ra nhiều hơn ởgiai đoạn dung nạp miễn dịch44 hoặc giai đoạn thải trừ miễn dịch.45 Ngoài ra,phản ứng tiết IL-10, từ các tế bào giết tự nhiên, tế bào lympho T,46 lympho B47

hoặc từ tế bào Kupffer ở gan48 có thể được kích hoạt ở bệnh nhân nhiễm HBV.Trong giai đoạn mới nhiễm HBV, các tế bào giết tự nhiên, tế bào đơnnhân, tế bào Kupffer và các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương cũng đóng vaitrò trực tiếp tiêu diệt tế bào nhiễm HBV và tiết cytokine gián tiếp kiểm soátnhiễm trùng Tế bào giết tự nhiên có vai trò nhận diện và tiêu diệt các tế bàonhiễm vi rút hoặc sản xuất cytokine hỗ trợ cho phản ứng thải trừ vi rút Hoạtđộng kiểm soát HBV của tế bào giết tự nhiên đã được mô tả trên mô hìnhchuột49 và người nhiễm HBV cấp tính.50 Năm 2013, Peppa và cộng sự chứng

minh tế bào NK điều hòa phản ứng chống HBV của tế bào lympho T có thểlàm trung gian để tiêu diệt các thụ thể tiếp xúc của tế bào T chuyên biệt vớiHBV.51

Bạch cầu đơn nhân trong cơ thể được chia thành 2 nhóm chính gồm:bạch cầu đơn nhân thường trú giữ nhiệm vụ tuần tra các mô trong điều kiệnbình thường,52 và tế bào đơn nhân gây viêm gồm tế bào đơn nhân xâm nhậpđầu tiên vào nơi viêm.53 Gehring và Boltjes đã nhận xét không có khác biệt vềsố lượng các quần thể bạch cầu đơn nhân khác nhau trong máu ngoại biên ởngười nhiễm HBV mạn có tải lượng HBV DNA, HBsAg hay dấu ấn HBeAgkhác nhau.54,55 Các nghiên cứu cũng đã phát hiện rằng ở bệnh nhân nhiễm HBVmạn không có hoạt tính viêm, khả năng tiết cytokine, biệt hoá tế bào lympho Tkhi được kích thích bởi TLR của bạch cầu đơn nhân gần như vẫn nguyên vẹn.Ở bệnh nhân giai đoạn có hoạt tính miễn dịch hay có viêm gan hoạt động,Zhang ghi nhận bạch cầu đơn nhân gia tăng cả số lượng và tần số.56 Điều nàyphù hợp với kết quả của Bility và cộng sự về tương quan thuận giữa bạch cầuđơn nhân và ALT, chứng minh vai trò của bạch cầu đơn nhân trong phản ứngviêm và xơ hoá gan.57

1.4.2 Miễn dịch thích nghi

Sau các phản ứng ban đầu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, miễn dịchthích nghi tiếp tục điều khiển các phản ứng miễn dịch chuyên biệt để chống lạisự xâm nhập của tác nhân gây bệnh hữu hiệu hơn Tế bào lympho B và T tăngsố lượng và khả năng chống lại mầm bệnh, tế bào lympho B sản xuất kháng thểchuyên biệt gắn trực tiếp lên tác nhân gây bệnh hoặc gắn với các protein trênbề mặt tế bào.

Trong nhiễm HBV, phản ứng miễn dịch bẩm sinh giữ vai trò kiểm soátnhanh sự xâm nhập của vi rút,4 phản ứng miễn dịch thích nghi của tế bào

lympho T chuyên biệt với HBV (T CD4+ hay T CD8+) và sản xuất kháng thểchuyên biệt của tế bào lympho B sẽ quyết định nhiễm HBV cấp hay mạn tính.3

Phản ứng miễn dịch với HBV của tế bào lympho B

Các phản ứng sinh kháng thể được tạo ra từ tế bào lympho B trong quátrình tiếp xúc với các protein của HBV như protein S/preS, core (proteincapsid), polymerase (P) và X Sự hiện diện hay biến mất của các kháng thể này,đặc biệt kháng thể với kháng nguyên bề mặt (anti-HBs) và kháng nguyên lõinucleocapsid (anti-HBc, anti-HBe) được dùng để nhận diện giai đoạn lâm sàngcủa nhiễm HBV.58

Thụ thể polypeptide đồng vận chuyển Natri-taurocholate (NTCP) vớiHBV và cấu trúc HSP (heparin sulfate proteoglycan) được phát hiện trên tế bàogan59 đã xác định đoạn protein preS1 có tương tác trực tiếp với NTCP, vùnglặp kháng nguyên HBs giữa I và II trên protein S tương tác với với cấu trúcHSP Do NTCP và HSP có vai trò làm gia tăng mật độ virion HBV trên bề mặttế bào gan, các nghiên cứu đã chứng minh kháng thể chống lại hai vùng này(preS1 và vùng lặp trên S) có vai trò hữu hiệu ngăn chặn nhiễm HBV.60,61

Ngoài ra, kháng thể trung hoà không những ngăn ngừa nhiễm HBV cấpmà còn ảnh hưởng đến quá trình nhiễm HBV mạn vì sự của xâm nhập HBVvào tế bào gan chưa nhiễm qua cơ chế phụ thuộc thụ thể NTCP Trong nghiêncứu của Petersen trên một loại chuột dùng tế bào gan người bình thường, peptitMyrcludex B có tác dụng khoá các thụ thể tiếp nhận HBV trên chuột vì vậyngăn ngừa sự lây lan HBV trên gan chuột nhiễm HBV.62 Mặc dù tế bào lymphoT chuyên biệt với HBV là tế bào chính chịu trách nhiệm kiểm soát lượng vi rútnhỏ tồn tại trong một ít tế bào gan sau khi viêm gan B cấp hồi phục,63 khángthể cũng đóng vai trò kiểm soát HBV lâu dài Phản ứng tế bào T CD8+ chuyênbiệt với HBV giảm dần sau khi mất HBsAg và hiếm khi phát hiện được nhiềuthập kỹ sau đó,64 nhưng tái hoạt HBV vẫn xảy ra khi thiếu hụt tế bào B do dùng

rituximab.65,66 Vai trò của tế bào lympho B trong nhiễm HBV không chỉ giớihạn trong việc tạo kháng thể mà tế bào lympho B còn hoạt động như những tếbào trình diện kháng nguyên, đặc biệt trình diện kháng nguyên cho tế bàolympho T giúp đỡ67 và đóng vai trò điều hoà miễn dịch Tế bào lympho B tăngsản xuất IL-10 ở các đợt viêm gan B bùng phát, điều hoà phản ứng viêm và cảphản ứng của tế bào lympho T chuyên biệt HBV.47

Đáp ứng miễn dịch với HBV của tế bào lympho T

Tế bào lympho T chuyên biệt với HBV đóng vai trò kích thích chínhtrong viêm gan và quá trình thanh thải vi rút Tế bào lympho T CD8+ chuyênbiệt với HBV hiện diện nhiều trong gan, có vai trò ly giải tế bào gan nhiễmHBV,68,69 hoặc tiết cytokine (chủ yếu IFN) kích hoạt quá trình thanh thảikhông ly giải tế bào.70 Tuy vậy, phản ứng chuyên biệt của T CD8+ cũng đồngthời chiêu mộ các tế bào viêm không chuyên biệt gây nên phản ứng viêm vàtổn thương tế bào gan.71 Tế bào lympho T CD4+ chuyên biệt với HBV điều hoàquá trình ly giải tế bào và tiết cytokine của tế bào lympho T CD8+.72 Tỉ lệ vàchức năng của tế bào lympho T CD4+ chuyên biệt tương quan với chức năngvà hiệu quả thanh thải HBV.73

Tỉ lệ hai tế bào T CD8+ và T CD4+ khác nhau ở các giai đoạn lâm sàngdiễn biến của nhiễm HBV mạn3 và thường được thừa nhận thấp hơn ở nhómviêm gan B mạn tính so với nhóm viêm gan B cấp.74 Tế bào lympho T CD8+

và T CD4+ có phản ứng chuyên biệt với các thành phần kháng nguyên khácnhau của HBV gồm nhân,75 vỏ76 và men polymerase.77

Tình trạng viêm gan mạn tính ở người nhiễm HBV mạn đã được chứngminh do tế bào T chuyên biệt hạn chế khả năng tiếp cận mô hay tế bào gan bịnhiễm HBV78 và giảm hiệu quả kháng vi rút của các cytokine.79 Tuy nhiên, cáckhiếm khuyết về số lượng và chức năng của tế bào lympho T mới là yếu tố giữvai trò chính gây tồn tại kéo dài của vi rút ở gan Thật vậy, trạng thái phản ứng

chuyển hóa và năng lượng giảm thấp của tế bào T chuyên biệt với HBV đượcghi nhận qua nghiên cứu yếu tố phiên mã của các tế bào lympho T CD8+ chuyênbiệt và kiểu hình cạn kiệt tế bào lympho T.80 Theo các tác giả sự tiếp xúc kéodài của các lympho T với lượng kháng nguyên quá tải của HBV gây suy nhượcchức năng tế bào lympho T Sự phục hồi hoạt tính của tế bào lympho T với cácmức độ khác nhau đã được ghi nhận ở bệnh nhân được điều trị thuốc tương tựnucleos(t)ide (NAs) có kiểm soát hoàn toàn vi rút và thanh thải HBsAg hoặcvẫn còn HBsAg với các nồng độ khác nhau Tuy vậy, chức năng tế bào lymphoT không phải luôn luôn tương quan với nồng độ kháng nguyên trong huyếtthanh, ngay cả sau khi có chuyển đổi huyết thanh HBsAg.81 Trên các tế bàolympho T chuyên biệt bị kiệt quệ đã tìm thấy biểu hiện nhiều phân tử đồng ứcchế ngược như PD1 và 2B4,82 đặc biệt là có tác giả đã tìm thấy hơn 90% tế bàolympho T CD8+ chuyên biệt thâm nhiễm ở gan có hiện diện PD1 và 2B4.83

Nghiên cứu in-vitro sử dụng kháng thể kháng PDL1 có thể phục hồi một phần

chức năng tế bào T chuyên biệt HBV.83 Ngoài sự kiệt quệ tế bào lympho T, cácđợt viêm gan cấp hay bùng phát còn kích hoạt một loạt cơ chế ức chế khôngthuận lợi cho chức năng của tế bào lympho T Tế bào gan tổn thương có thểphóng thích các men arginase, tryptophan 2,3-dioxygenase và indoleamine 2,3-dioxygenase84 gây giảm các axit amin cần thiết (arginin, tryptophan) cho hoạtđộng của lympho T85 nhằm hạn chế tổn thương gan nhưng đồng thời làm suyyếu thêm chức năng của tế bào lympho T vốn đã kiệt quệ của tế bào lympho T.Trong đợt cấp viêm gan mạn, hoạt động của lympho T chuyên biệt không nhấtthiết ít kiệt quệ hơn so với giai đoạn nhiễm HBV không có viêm gan, vì viêmgan tỷ lệ thuận với mức độ thâm nhiễm của tế bào miễn dịch chuyên biệt khôngkháng nguyên.69 Tuy nhiên, trong một nghiên cứu với dân số lớn hơn được thựchiện gần đây không tìm thấy sự khác biệt trong phản ứng của tế bào lympho Tchuyên biệt trong những giai đoạn lâm sàng khác nhau.86

1.5 Tế bào miễn dịch Treg và Th17

1.5.1 Tế bào Treg và yếu tố phiên mã FOXP31.5.1.1 Biệt hoá và hình thái tế bào Treg

Th2, Treg và Th17

“Nguồn: Bunte K, 2019” [87]

Tế bào Treg là một quần thể thuộc tế bào T CD4+ có vai trò điều hoàmiễn dịch thông qua việc ức chế miễn dịch nhằm vào các tác nhân nhiễm trùnghay không nhiễm trùng như các kháng nguyên tự thân, kháng nguyên từ bênngoài Cytokine TGFß và yếu tố phiên mã FOXP3 và STAT5 đóng vai trò quan

trọng trong quá trình biệt hoá T CD4+ thànhtế bào Treg Trong các môi trườngcó cytokine khác nhau và sự hoạt hoá các yếu tố phiên mã khác nhau, lymphoT CD4+ còn có thể biệt hoá thành T helper 1 (Th1), T helper 2 (Th2), Th17 vàT follicular helper (Tfh) (hình 1.3).

Có 2 nhóm tế bào Treg khác nhau gồm tế bào Treg có nguồn gốc từtuyến ức được gọi là thymus-derived Treg (tTreg) và các tế bào có nguồn gốchạch bạch huyết ngoại biên được gọi là peripheral Treg (pTreg)

1.5.1.2 Cơ chế hoạt động của Treg

Treg đảm nhận vai trò ức chế miễn dịch thông qua 4 cơ chế: tiếp xúc tếbào với tế bào, tiết cytokine, cạnh tranh các yếu tố tăng trưởng, sản xuấtgranzyme B (GzB) và perforin (PRF)88,89 (hình 1.4).

Sự tiếp xúc tế bào với tế bào của Treg qua trung gian các dấu ấn bề mặtnhư CTLA4 và LAG3 hay cAMP.88 CTLA4 điều hoà men indoleamine 2,3-dioxygenase qua tương tác với phân tử đồng kích thích CD80/86 trình diện trêntế bào trình diện kháng nguyên, gây giảm các tryptophan tự do, cản trở hoạthoá và biệt hoá các tế bào T kích thích.90 Treg cũng cản trở hoạt động tế bàotua qua tương tác giữa LAG3 và MHC nhóm II Ngoài ra Treg còn gây tăngnồng độ cAMP ở tế bào đích gây ức chế tăng sinh và biệt hoá tế bào, ức chếtiết các cytokine IL-2, IFNγ cho phản ứng viêm.91

Hoạt động tiết TGFß và IL-10 cũng liên quan với việc duy trì hoạt tínhức chế của Treg TGFß đóng vai trò quan trọng duy trì hằng định nội môi, ứcchế biểu hiện yếu tố phiên mã T-bet của tế bào Th1 làm ngăn cản quá trình biệthoá tế bào IL-10 ức chế phản ứng tế bào T qua việc ức chế sản xuất IL-2,TNFγ.92 Ngoài ra IL-10 còn điều hoà chức năng tế bào B thúc đẩy dung nạpmiễn dịch trong phản ứng dị ứng.93

Cơ chế cuối cùng là gây chết theo chương trình các tế bào đích thông quahoạt tính ly giải tế bào của các granzyme GzB và PRF.

Hình 1.4: Những cơ chế hoạt động của tế bào Treg

“Nguồn: Pereira LMS, 2017” [94]

1.5.1.3 Yếu tố phiên mã FOXP3

Một trong những dấu ấn đặc trưng nhất của tế bào Treg là yếu tố phiênmã forkhead box protein 3 (FOXP3) Quá trình sản xuất yếu tố này liên quanchặt chẽ với sự phát triển và chức năng của hầu hết tế bào Treg ở tuyến giáp vàở ngoại biên.

Yếu tố phiên mã FOXP3 là một protein có trọng lượng 47 kDa gồm 431axit amin, là một thành phần của nhóm P thuộc gia đình FOX.95 Những proteinnày có cùng 1 đoạn gắn DNA được bảo tồn, được biết với tên là forkhead hay

helix có cánh gồm 3 helix α và 2 đoạn cong lớn giống cánh đôi của bươmbướm.96

FOXP3 là dấu ấn quan trọng cho sự phát triển và chức năng của Tregnguồn gốc tuyến ức hay cơ quan bạch huyết ngoại biên.18 Việc biểu hiệnFOXP3 được kích hoạt bởi sự hiện diện của các peptit có nguồn gốc từ các tựkháng nguyên của kí chủ thông qua tương tác giữa phức hợp phù hợp mô nhómII và thụ thể tế bào T.97,98

Khi chuyển FOXP3 vào tế bào T CD4+ với dấu ấnCD25-, tế bào nàythành kiểu hình điều hoà Như vậy, ngoài biểu hiện FOXP3, T CD4+ với dấuấnCD25- giảm tiết các cytokine IL-2, IL-4 và IFNγ khi được kích thích và điềuhoà tăng cường biểu hiện các dấu ấn bề mặt của Treg gồm CD25, CTLA4 vàCD103.

Ngoài nhóm tế bào Treg biểu hiện FOXP3 với vai trò ức chế phản ứngviêm như trên, một tiểu quần thể Treg khác mới được ghi nhận gần đây có cảtính chất biểu hiện FOXP3 và khả năng tiết IL-17A (hình 1.5) Các tác giả nhậnthấy những tế bào Treg biểu hiện FOXP3 nhưng đồng thời tiết IL-17A này lạicó vai trò kích thích miễn dịch.17 Các nghiên cứu trên một số bệnh lý do phảnứng miễn dịch như vảy nến, hội chứng ruột kích thích, ở bệnh ung thư và mộtsố bệnh nhiễm trùng đã nhận thấy có liên quan với tế bào Treg tiết IL-17Anày.17 Một nghiên cứu trên người nhiễm HBV mạn cũng chứng minh Treg cùngbiểu hiện FOXP3 và tiết IL-17A hiện diện nhiều ở bệnh nhân đợt bùng phát cósuy gan cấp; mật độ tế bào Treg tiết IL-17A liên quan ý nghĩa với mức độ tổnthương gan.37

Hình 1.5 : Tế bào Treg tiết IL-17A

“Nguồn: Jung MK, 2017” [17]

1.5.2 Tế bào miễn dịch Th171.5.2.1 Biệt hoá tế bào Th17

Tế bào Th17 (có đặc trưng tiết IL-17A) cùng với Th1, Th2 và Treg thuộcquần thể tế bào T CD4+. 99,100Tế bào Th17 đóng vai trò bảo vệ kí chủ trước tácnhân gây bệnh ngoài tế bào, đặc biệt tại hàng rào biểu mô và niêm mạc Tuynhiên, sự hoạt hoá bất thường của Th17 có liên quan với cơ chế bệnh sinh củacác bệnh tự miễn.

Tương tự các tế bào trong nhóm tế bào Th, Th17 biệt hoá từ T CD4+ sơkhai (naive T CD4+ ) ở ngoại biên khi có sự kích thích kháng nguyên với thụ

thể tế bào T và hoạt hoá cytokine được tiết ra từ các tế bào trình diện khángnguyên TGFß cùng với IL-6 là các cytokine quan trọng trong quá trình biệthoá Th17 RORγt, một thành viên của gia đình thụ thể hormon nhân (nuclearreceptor) liên quan axit retinoic, là yếu tố phiên mã đóng vai trò quan trọngtrong sự biệt hoá nên Th17 Sự hiện diện đồng thời của TGFß và IL-6 ức chếFOXP3 và hoạt hoá RORγt, bắt đầu cho quá trình biệt hoá nên tế bào Th17.101

Ngoài ra TNF và IL-1ß tác động cộng hưởng làm tăng sản xuất IL-6 và biệthoá nên tế bào Th17 Sau khi hoạt hoá, RORγt thúc đẩy biểu hiện IL-17 và thụthể IL-23.102 Khi không có mặt RORγt, RORα cũng có thể kích thích biểu hiệnIL-17.20 IL-23 được tạo ra từ tế bào trình diện kháng nguyên tế bào tua, tế bàođơn nhân hoặc đại thực bào IL-23 làm tăng biểu hiện RORγt và IL-17 quaSTAT3.103 Thụ thể IL-23 chỉ được biểu hiện khi đã bắt đầu quá trình biệt hoáT CD4+ thành Th17,104 có vai trò duy trì, mở rộng và tồn tại của Th17.105 Yếutố điều hoà interferon (IFN)-4 cũng góp phần vào quá trình biệt hoá tế bào TCD4+ Giảm yếu tố điều hoà IFN-4 liên quan với giảm mức độ biểu hiện RORγtvà tăng FOXP3.106

1.5.2.2 Chức năng của Th17

Phản ứng viêm do Th17 phụ thuộc loại cytokine được biểu hiện trongmôi trường cụ thể Ví dụ, Th17 sản xuất cytokine kháng viêm IL-10 dưới kíchthích bởi IFNα/ß.107 Ngược lại, IL-23 giảm biểu hiện IL-10 và giảm Th17 sảnxuất IL-17.108 Ngoài ra các nhóm TGF khác nhau cũng gây ra các chức năngkhác nhau của Th17 Th17 sản xuất IL-6 và TGFß1 không gây viêm não tựmiễn khi thiếu IL-23; ngược lại Th17 sản xuất TGFß3 có nhiều khả năng gâyviêm não tự miễn hơn Sự hiện diện của IL-6 ở giai đoạn sớm của quá trình biệthoá Treg, sản xuất TGFß, kích hoạt nhiều hơn sự chuyển đổi tế bào Treg thànhTh17.109

IL-17 là cytokine chính được sản xuất bởi Th17, có nhiều chức năng khácnhau Có 6 nhóm IL-17 từ IL-17A đến IL-17F được sản xuất bởi Th17 Thụ thểcủa các IL-17 biểu hiện trên nhiều loại tế bào như tế bào tạo xương, tế bào nộimô, tế bào biểu mô, đại thực bào.105,110 Ngoài nguồn gốc từ Th17, IL-17 cũngđược sản xuất bởi tế bào giết tự nhiên, tế bào đa nhân trung tính.111,112 Th17 cònsản xuất IL-21, IL-22, IFNγ, TNF.113 IL-17 là một cytokine viêm nên thườngchiêu mộ thêm vào mô nhiễm trùng các tế bào viêm khác như tế bào đa nhântrung tính để tăng hiệu quả gây viêm Tăng cường hoạt động điều hoà IL-17cùng với các cytokine viêm khác như IL-1ß có thể gây tái hoạt phản ứng viêm,sản xuất nhiều chemokine hơn, gây tổn thương mô nặng hơn.114

1.5.2.3 Yếu tố phiên mã RORγt

Các thụ thể nhân như thụ thể estrogen, glucocorticoid, axit retinoic,hormon tuyến giáp hình thành một gia đình lớn các yếu tố phiên mã điều hoàbiểu hiện gen phụ thuộc phối tử (ligand-dependent manner).115 Ở người, mộtsố thụ thể liên quan axit retinoic gama (RORγ) gồm 3 thành viên: RORα,116RORß117 và RORγ118 được sản xuất bởi gen RORA, RORB và RORC trênnhiễm sắc thể RORγt là yếu tố phiên mã chính của Th17, trung gian cho biểuhiện cytokine tiền viêm IL-17A và IL-17F.19

RORγt là yếu tố phiên mã chính của Th17 và các tế bào sản xuất IL-17khác Nhiều nhóm tế bào có biểu hiện RORγt sản xuất các cytokine tiền viêmIL-17A và IL-17F như Th17, tế bào T γ∂, tế bào T bất biến liên quan với niêmmạc (MAIT) và tế bào dạng lympho bẩm sinh nhóm 3 (ILC-3) Ở chuột thiếuRORγt, sản xuất IL-17 giảm đáng kể trong khi đó chuột thiếu cả RORγt vàRORα hoàn toàn không sản xuất IL-17.19,20

1.6 Phương pháp đếm tế bào miễn dịch và đo mức độ biểu hiện yếu tốphiên mã

1.6.1 Phương pháp đếm tế bào Treg và Th17

Đếm tế bào dòng chảy là một kĩ thuật phân tích nhanh chóng từng dòngtế bào hoặc phân tử khi chúng chảy qua nhiều hoặc một tia laser trong dungdịch muối đệm Từng phân tử được phân tích sự phân tán ánh sáng có thể nhìnthấy một hoặc nhiều thông số huỳnh quang Sự phân tán ánh sáng có thể nhìnthấy được đo hai hướng khác nhau gồm hướng phía trước đo kích thước tươngđối của tế bào và hướng 900 (còn gọi hướng bên) đo mức độ phức tạp và chitiết bên trong của tế bào Các mẫu được chuẩn bị để đo huỳnh quang thông quatruyền hoặc biểu hiện các protein huỳnh quang, thuốc nhuộm huỳnh quang hoặcnhuộm với liên hợp huỳnh quang kháng thể.

Máy đếm tế bào dòng chảy truyền thống gồm 3 phần: phần dịch, phầnkính và phần điện Hệ thống dịch gồm dịch vỏ bọc (thường dung dịch muốiđệm) tạo áp suất để phân phối và tập trung mẫu vào điểm chặn tia laser nơi mẫuđược phân tích Hệ thống kính gồm kính kích thích (laser) và kính thu thập Hệthống này tạo tín hiệu đèn huỳnh quang và có thể nhìn thấy để phân tích mẫu.

Nguyên tắc hoạt động của máy:

Mẫu được đưa vào hệ thống máy, các tế bào được bao quanh bởi dung dịchđệm sinh lý gọi là dung dịch vỏ bọc Hệ thống dịch gồm các ống, bơm và vangiúp huyền phù chứa mẫu chảy thành dòng đơn của các tế bào khi chúng đi quahệ thống máy để phân tích Nơi tế bào tương tác với ánh sáng laser được gọi làđiểm vấn hay điểm chặn laser Khi chùm ánh sáng chiếu vào một tế bào, mộtsố ánh sáng sẽ chiếu vào các cấu trúc vật chất bên trong tế bào, khiến ánh sángbị tán xạ Ánh sáng này có thể được đo và tương quan với kích thước tương đốicủa tế bào và cấu trúc bên trong tế bào qua tán xạ góc thẳng và tán xạ góc bên.Đồng thời ánh sáng từ tia laser sẽ kích thích huỳnh quang liên kết với tế bào