ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của Nrf2 đã được chứng minh là góp phần làm tăng khả năng kháng thuốc trên tế bào ung thư.. Kết hợp với kết quả sắc ký lớp mỏng cho th

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ YẾN NHI

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÁT XẠ HUỲNH QUANG TRONG XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC DƯỢC LIỆU CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ Nrf2

Ở TẾ BÀO UNG THƯ GAN Huh7

Ngành: VẬT LÝ KỸ THUẬT Mã số: 8520401

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Minh Hiền Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: TS Phạm Tấn Thi

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Huỳnh Quang Linh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh ngày 28 tháng 01 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 TS Lý Anh Tú Chủ tịch hội đồng 2 PGS.TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú Phản biện 1 3 PGS.TS Huỳnh Quang Linh Phản biện 2 4 PGS.TS Phạm Thị Thu Hiền Ủy viên

5 TS Nguyễn Trung Hậu Thư ký hội đồng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TS Lý Anh Tú

TRƯỞNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ YẾN NHI MSHV: 2170966 Ngày, tháng, năm sinh: 06/10/1999 Nơi sinh: Gia Lai

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

‐ Xây dựng mô hình đánh giá biểu hiện Nrf2 trên tế bào ung thư gan Huh7 ứng dụng phát huỳnh quang sinh học

‐ Thu thập cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn của các dược liệu và cây thuốc tiềm năng

‐ Sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 của các cao chiết trên mô hình đã xây dựng ‐ Định tính thành phần chính của các cao chiết có tiềm năng dựa vào kĩ thuật sắc kí lớp

mỏng

‐ Kết hợp kết quả sàng lọc và kết quả định tính thành phần để đưa ra định hướng thực hiện các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra hợp chất có khả năng hỗ trợ trong điều trị ung thư

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/06/2023

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 24/12/2023

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):

1 TS Nguyễn Minh Hiền 2 TS Phạm Tấn Thi

(Họ tên và chữ ký)

TS Phạm Tấn Thi

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn có thể được hoàn thành như hiện tại là kết quả của quá trình nghiên cứu và học hỏi từ thầy cô, sự giúp đỡ từ các anh chị đi trước và sự chia sẻ, hỗ trợ và động viên từ gia đình và bạn bè

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Minh Hiền và TS Phạm Tấn Thi, là người đã đồng hành, dạy hỗ và hướng dẫn tôi từ những ngày tháng bắt đầu làm quen với nghiên cứu khoa học Cảm ơn cô và thầy đã cho con nguồn cảm hứng, động lực và những bài học bổ ích để bắt đầu theo đuổi và tiếp tục trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bộ giáo dục Đài Loan đã tài trợ cho Chương trình Giáo dục Trải nghiệm Đài Loan (Taiwan Experience Education Program - TEEP), và cho tôi cơ hội được đến học tập và thực hiện luận văn tại Trường Dược, Đại học Y Cao Hùng, Đài Loan Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Giáo sư Chia-Hung Yen và thành viên của nhóm nghiên cứu từ Phòng thí nghiệm Natural Product Libraries and High-Throughput Screening Core, Trường Dược, Đại học Y Cao Hùng, Đài Loan đã hết lòng hướng dẫn và hỗ trợ tôi thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS.DS Lê Minh Trí, Phó trưởng Khoa Y – Đại học Quốc gia TP.HCM đã tạo điều kiện cho tôi có cơ hội thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – Hóa dược

Tôi xin cảm ơn Đề tài “Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế hoạt động Nrf2” mã số B2023-44-01 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Cảm ơn Tập đoàn Toshiba đã trao cho tôi cơ hội nhận được học bổng Toshiba năm học 2022-2023, đây thực sự là một sự động viên, khích lệ tinh thần tôi để tôi có thể tiến xa hơn trên chặng đường học tập và nghiên cứu

Cảm ơn hai em Lê Nguyễn Thiên Hân và Lê Thị Ngọc Tâm đã hỗ trợ, đồng hành cùng tôi trong suốt quãng thời gian thực hiện đề tài Những chia sẻ và kiến thức chuyên ngành của các em đã mang lại cho tôi kiến thức cần thiết và bổ ích để thuận lợi thực hiện các thí nghiệm

Cảm ơn gia đình, bạn bè, những người yêu thương đã luôn đồng hành, tin tưởng, thấu hiểu và động viên, ủng hộ tôi trên chặng đường học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, cảm ơn tôi vì đã không từ bỏ và dũng cảm theo đuổi mục tiêu của mình đến cùng

Trân trọng./

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Kháng thuốc hoá trị từ lâu đã là mối lo ngại trên toàn cầu, với hơn 90% trường hợp bệnh nhân ung thư tử vong có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến tình trạng kháng thuốc Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) – một yếu tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ tế bào chống lại tình trạng căng thẳng oxy hóa và viêm nhiễm Nrf2 thực hiện chức năng bảo vệ tế bào trên cả tế bào khỏe mạnh và tế bào ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của Nrf2 đã được chứng minh là góp phần làm tăng khả năng kháng thuốc trên tế bào ung thư Nghiên cứu này đã xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu Việt Nam về khả năng ức chế biểu hiện Nrf2 trên tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Huh7 ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang Thực hiện sàng lọc trên 44 cao chiết methanol toàn phần từ 23 dược liệu Việt Nam được sử dụng trong dân gian để hỗ trợ điều trị ung thư, kết quả cho thấy 5/44 cao chiết có thể ức chế hơn 60% biểu hiện Nrf2 trên Huh7 Năm cao

chiết này tiếp tục được chiết phân đoạn bằng n-Hexan (Hex), cloroform (CHCl3), ethyl acetat (EA), n-Butanol (BuOH) và nước cất (DW), và tiếp tục sàng lọc khả năng

ức chế biểu hiện Nrf2 trên tế bào Huh7 Kết quả cho thấy dịch chiết Hex từ lá An xoa cho thấy khả năng ức chế Nrf2 mạnh nhất trong số các mẫu được thử nghiệm, với nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 (IC50) là 42,22 ± 2,10 µg/mL Phân đoạn EA từ rễ Lá lốt và Hex từ thân rễ Gừng gió cũng cho kết quả đáng chú ý, với giá trị IC50 lần lượt là 58,29 ± 3,79 và 49,16 ± 0,56 µg/mL Kết hợp với kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy các phân đoạn Hex và EA có thể phù hợp để sử dụng dịch chiết để phân lập các hoạt chất có khả năng ức chế biểu hiện Nrf2 trong tế bào ung thư với sự hiện diện của các nhóm sterol

iv

ABSTRACT

Drug resistance has long been a global concern, as evidenced by over 90% of patients experiencing treatment failure due to inadequate response to therapeutic drugs Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) plays a crucial role in cellular defense mechanisms against oxidative stress and inflammation Nrf2 acts as a cellular protector in both normal cells and cancer cells The overexpression of Nrf2 in cancer cells contributes to increased drug resistance This study established a model to screen Vietnamese medicinal herbs for their ability to inhibit Nrf2 expression in Huh7 hepatocellular carcinoma cells using luminescence The results found that 5/44 total methanol extracts from 23 Vietnamese medicinal herbs could inhibit more than 60% of Nrf2 expression on Huh7 These five promising extracts

were further fractionated with n-Hexane (Hex), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EA), n-Butanol (BuOH), and distilled water (rDW), and continued screening for the Nrf2 inhibition capacity The results showed that the Hex extract from Helicteres

hirsuta leaves showed the most potent Nrf2 inhibition ability among the samples

tested, with an inhibitory concentration 50% (IC50) value of 42.22 ± 2.10 µg/mL EA

fraction from Piper sarmentosum roots and Hex from Zingiber zerumbet rhizomes

also had remarkable results, with IC50 values of 58.29 ± 3.79 and 49.16 ± 0.56 µg/mL, respectively Combining thin-layer chromatography and in vitro screening suggests that Hex and EA fractions may be suitable for using extracts to isolate active substances capable of inhibiting Nrf2 expression in cancer cells

v

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn thạc sĩ ngành Vật lý kỹ thuật, chuyên ngành Kỹ thuật

Y sinh với đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô

hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế Nrf2 ở tế bào ung thư gan Huh7” là

công trình khoa học do tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Minh Hiền và TS Phạm Tấn Thi Những kết quả nghiên cứu của luận văn là hoàn toàn trung thực và minh bạch

Nguyễn Thị Yến Nhi

2.1.3 Phân loại sự phát quang 9

2.1.4 Một số ứng dụng phát quang trong nghiên cứu về ung thư 11

2.2 Tổng quan về Nrf2 và vai trò của Nrf2 trong tế bào 18

2.2.1 Tổng quan về Nrf2 18

2.2.2 Hoạt động của Nrf2 trong tế bào 19

2.2.3 Một số hợp chất làm giảm biểu hiện của Nrf2 có nguồn gốc thiên nhiên202.3 Mô hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 22

2.3.1 Một số mô hình sàng lọc trên thế giới 22

vii

2.3.2 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu trong nước 23

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 263.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 33

3.5.1 Nuôi cấy tế bào và cấy truyền DNA 33

3.5.2 Mô hình xác định hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 33

3.5.3 Xác định khả năng sống của tế bào và hoạt động tương đối của Nrf2363.5.4 Sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên dòng tế bào Huh7373.5.5 Xác định nồng độ gây độc 50% tế bào và nồng độ ức chế 50% hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 37

3.5.6 Định tính thành phần hóa học chính trong cao chiết dược liệu 38

3.5.7 Xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Mô hình sàng lọc hoạt động của Nrf2 40

viii

4.2 Kết quả sàng lọc tác dụng của 44 cao chiết MeOH từ các bộ phận khác nhau

của 23 loài dược liệu đến biểu hiện của Nrf2 41

4.3 Kết quả khảo sát tác dụng của cao chiết phân đoạn tiềm năng đến biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 46

4.4 Kết quả xác định nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 và nồng độ gây độc 50% tế bào Huh7 49

4.5 Kết quả định tính các hợp chất chính có trong các cao chiết phân đoạn 51

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 57

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 80

PL-01 Cấu trúc vector gen được sử dụng 80

PL-02 Danh mục dược liệu có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư 81

PL-03 Sắc ký lớp mỏng các cao chiết phân đoạn 89

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31].

5

Hình 2.2 Phản ứng của luciferase và luciferin 12

Hình 2.3 Xét nghiệm định lượng bằng gen chỉ thị luciferase dựa trên tương tác của enzyme luciferase với cơ chất phát quang luciferin, giải phóng ánh sáng thông qua phát quang sinh học 13

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của resazurin và resorufin 14

Hình 2.5 Phổ phát xạ huỳnh quang của resazurin (màu xanh) và resorufin (màu đỏ) [44] 15

Hình 2.6 Minh họa hiện tượng truyền cộng hưởng huỳnh quang 16

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 3.2 Sơ đồ chiết suất phân đoạn 28

Hình 3.3 Thiết bị Synergy HT Multi-Mode Reader Nguồn: Agient 29

x

Hình 4.2 Kết quả xác định IC50 và CC50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng 49

xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 33Bảng 3.2 Các hệ dung môi và thuốc thử 39Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 của 44 cao chiết MeOH toàn phần 41Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc tác dụng của cao chiết các phân đoạn đối với biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 và khả năng gây độc tế bào HaCaT 46Bảng 4.3 Kết quả xác định IC50 và CC50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng 50Bảng 4.4 Tổng hợp kết quả khảo sát thành phần chính có trong các cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn tiềm năng 51

xii

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

ARE Antioxidant response element Yếu tố phản ứng chống oxi hóa

BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học

CC50 Concentration of cytotoxicity 50% Nồng độ gây độc 50% tế bào

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang

HaCaT Human keratinocyte cells Tế bào sừng ở người

Huh7 Hepatocellular Carcinoma Dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan

IC50 Half-maximal inhibitory concentration

Nồng độ ức chế 50%

Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1

-

Nrf2 Nuclear factor erythroid-2 related factor 2

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Ung thư là tình trạng tăng sinh bất thường và mất kiểm soát của các tế bào và lan sang các bộ phận khác của cơ thể [1] Ung thư được xem là mối lo ngại hàng đầu trên toàn cầu, với hơn 19,3 triệu ca mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư theo thống kê vào năm 2020 [2] Đây cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới tại 57/127 quốc gia [3] Tại Việt Nam, hằng năm ước tính có khoảng 165.000 ca mắc ung thư và 115.000 ca tử vong do ung thư [4]

Hiện nay, có nhiều hướng tiếp cận được áp dụng trong điều trị ung thư, trong đó phổ biến nhất đó là sử dụng thuốc hóa trị Tuy nhiên, tình trạng kháng thuốc dẫn đến việc điều trị bằng thuốc không hiệu quả là nguyên nhân gây ra tới 90% trường hợp điều trị thất bại và gây tử vong [5] Kháng thuốc ung thư là tình trạng tế bào ung thư hình thành khả năng kháng lại tác dụng của thuốc hóa trị, qua đó khiến việc điều trị bằng thuốc trở nên kém hiệu quả hoặc hoàn toàn mất đi hiệu quả như mong đợi [6] Kháng thuốc có thể phát sinh thông qua các cơ chế khác nhau, có thể phân loại thành kháng nội tại và kháng mắc phải [7] Để khắc phục tình trạng này, các nghiên cứu hiện nay trên thế giới là hướng đến phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu để hướng đến tác động lên các con đường gây ra kháng thuốc và xác định các dấu ấn sinh học dự đoán để cá nhân hóa các phương pháp điều trị

Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) - một yếu tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa và tình trạng viêm nhiễm, đồng thời giúp duy trì cân bằng nội môi và ức chế quá trình lão hóa tế bào [8, 9] Nrf2 có thể điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều gen liên quan để bảo vệ tế nào chống lại quá trình sản sinh ung thư khi tiếp xúc với các gốc tự do, stress oxi hóa [10] Nrf2 giữ vai trò điều hòa chính của tế bào, vì vậy nó cũng liên quan đến sự hình thành, tiến triển và di căn của tế bào [11] Sự biểu hiện quá mức ổn định của Nrf2 ở tế bào ung thư lại làm tăng cường sức đề kháng của chúng đối với các tác nhân hóa trị liệu [12-14], qua đó làm tăng khả năng kháng thuốc của tế bào [15] Vì vậy, ức chế biểu hiện của Nrf2 hiện nay được xem là một mục tiêu đầy hứa hẹn trong chiến lược chống lại hiện tượng kháng thuốc ung thư Việc ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp biểu hiện của

Nguồn dược liệu phong phú với hơn 4.700 loài thực vật được sử dụng làm thuốc, là ưu thế rất lớn cho Việt Nam trong việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên từ cây dược liệu Nhu cầu sử dụng dược liệu ở Việt Nam rất lớn, quy mô của ngành dược Việt Nam năm 2020 ước tính đạt khoảng 6,4 tỷ USD [21] Tuy nhiên, việc sử dụng dược liệu Việt Nam hiện nay chủ yếu vẫn dựa trên kinh nghiệm dân gian và lưu truyền qua nhiều thế hệ mà chưa có những bằng chứng khoa học cụ thể Các nghiên cứu tại Việt Nam được thực hiện trên quy mô nhỏ và thiếu tính thống nhất [22] Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu sàng lọc hiện tại chỉ xác định khả năng gây độc tế bào ung thư mà chưa hướng đến sàng lọc hoạt chất nhắm mục tiêu trong hỗ trợ điều trị ung thư Sự đa dạng của dược liệu và hợp chất thiên nhiên đòi hỏi những mô hình sàng lọc thông lượng lớn, từ đó đưa ra định hướng nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất thiên nhiên, hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ dược liệu Nhiều mô hình khác nhau đã được áp dụng trong sàng lọc các hợp chất ức chế biểu hiện gen, gồm sàng lọc thông lượng cao (High throughput screening), sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc hợp chất (structure-based virtual screening), phương pháp tiếp cận phân mảnh

và một số phương pháp khác, trong đó thực nghiệm trên mô hình in vitro trên tế bào

3

để tiến hành sàng lọc các hợp chất tiềm năng là phương pháp phổ biến nhất [23] Trong khi đó, phát xạ huỳnh quang và huỳnh quang sinh học là kỹ thuật được ứng dụng nhiều trong những năm gần đây với khả năng phát hiện nhanh chóng cho độ nhạy cao đối với mẫu có thể tích nhỏ và phù hợp với số lượng mẫu lớn [24, 25] Do

vậy, đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình

sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế Nrf2 ở tế bào ung thư gan Huh7” được

thực hiện nhằm góp phần cung cấp những bằng chứng khoa học, làm căn cứ cho các nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của dược liệu Việt Nam trong việc hỗ trợ và điều trị tình trạng kháng thuốc trong ung thư thông qua việc ức chế biểu hiện của gen Nrf2 trên tế bào ung thư

2.1.2 Cơ chế phát quang

Ánh sáng là một dạng bức xạ điện từ, gồm một điện trường dao động có từ trường dao động vuông góc với nó Ánh sáng được đặc trưng bởi bước sóng λ và tần số ν, và liên hệ với nhau bởi phương trình ν = c / λ, trong đó c = 3 x 10⁸ m/s là vận tốc ánh sáng Khi ánh sáng chiếu vào vật chất, nó có thể đi qua vật chất mà không xảy ra sự hấp thụ, bị hấp thụ hoàn toàn hoặc bị hấp thụ một phần Trong trường hợp bị hấp thụ bởi vật chất, năng lượng ánh sáng được truyền cho các phân tử trong quá trình hấp thụ Sự hấp thụ năng lượng phải xảy ra theo đơn vị tích phân gọi là lượng tử Mối quan hệ lượng tử-năng lượng có thể được biểu thị bằng phương trình E = hν = hc / λ trong đó E là năng lượng, h là hằng số Planck (6,626 x 10⁻³⁴ J/s)

5

Theo cơ học lượng tử, các phân tử chỉ có thể tồn tại ở một số trạng thái xác định nhất định với các giá trị nội năng xác định Phân tử có thể thay đổi trạng thái của nó từ trạng thái này sang trạng thái khác chỉ khi được cung cấp một phần năng lượng bằng sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái từ bên ngoài hoặc nếu nó được giải phóng hoặc mất đi ra bên ngoài Đối với quá trình quang phát quang, sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng có thể được giải thích bằng sự chuyển tiếp của các electron giữa các trạng thái xác định nhất định Sự chuyển đổi giữa hai trạng thái của phân tử có thể được coi là sự chuyển đổi của một electron từ một quỹ đạo phân tử này đến quỹ đạo phân tử khác

Hình 2.1 Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31] Quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử được minh họa bằng giản đổ Jablonski (Hình 2.1) Trên sơ đồ, các đường in đậm biểu thị năng lượng cơ bản của từng trạng thái υ₀ Các trạng thái năng lượng rung động bổ sung (υ₁, υ₂, υ₃, v.v.) được thể hiện bằng các đường mỏng hơn Sự chuyển đổi đầu tiên trong hầu hết các sơ đồ Jablonski là sự hấp thụ một photon có năng lượng cụ thể của phân tử quan tâm, được biểu thị bằng một mũi tên thẳng hướng lên, màu xanh lam Hấp thụ là phương pháp mà một electron bị kích thích từ mức năng lượng thấp hơn đến mức năng lượng cao hơn Chỉ có những

6

bước sóng ánh sáng có năng lượng tương ứng với sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái riêng khác nhau của phân tử mới có thể được hấp thụ Năng lượng của photon được truyền cho electron Electron đó sau đó chuyển sang trạng thái kích thích ở mức tương ứng với mức lượng năng lượng đã nhận Khi một electron đi vào trạng thái kích thích, nó có thể có bội số spin khác nhau, tùy thuộc vào việc tổng xung lượng góc spin có được bảo toàn hay không Nếu spin được bảo toàn thì electron được gọi là ở trạng thái kích thích đơn (S₁) Nếu xung lượng góc không được bảo toàn thì electron chuyển sang trạng thái năng lượng bậc ba (T₁)

Phân tử ở trạng thái kích thích không bền và có xu hướng trở về trạng thái có năng lượng thấp hơn qua nhiều con đường khác nhau Đầu tiên là thông qua phục hồi dao động (vibrational relaxation - vr), một quá trình không bức xạ [31] Điều này được biểu thị trên sơ đồ Jablonski dưới dạng mũi tên cong giữa các mức rung động Sự phục hồi dao động là quá trình năng lượng từ photo mà được electron hấp thụ chuyển sang các dạng dao động khác dưới dạng động năng Động năng này có thể tồn tại trong cùng một phân tử hoặc có thể được truyền sang các phân tử khác xung quanh phân tử bị kích thích Vì đây là quá trình chuyển đổi rất nhanh nên rất có khả năng xảy ra ngay sau quá trình hấp thụ Sự phục hồi dao động này xảy ra giữa các mức rung động, vì vậy nhìn chung các electron sẽ không thay đổi từ mức điện tử này sang mức điện tử khác thông qua phương pháp này

Tuy nhiên, nếu các mức năng lượng rung động trùng lặp mạnh với các mức năng lượng điện tử, thì có khả năng là electron bị kích thích có thể chuyển từ mức rung động ở trạng thái điện tử này sang mức rung động khác ở trạng thái điện tử thấp hơn Quá trình này được gọi là chuyển đổi bên trong (internal conversion – ic) và về mặt cơ học giống hệt với sự phục hồi dao động Chuyển đổi bên trong xảy ra do sự chồng chéo của trạng thái năng lượng rung động và năng lượng điện tử Khi năng lượng tăng lên, sự đa dạng của các trạng thái riêng rung động và điện tử trở nên phân bố chặt chẽ hơn bao giờ hết Ở các mức năng lượng lớn hơn trạng thái kích thích đầu tiên, có nhiều mức năng lượng rung động trùng lặp với các mức điện tử Sự chồng chéo này làm tăng xác suất chuyển đổi giữa các mức dao động của electron để trở về

7

trạng thái kích thích với mức năng lượng thấp hơn Do đó, sự chuyển đổi bên trong xảy ra trong cùng khung thời gian với sự hồi phục rung động, do đó, rất có thể là một cách để các phân tử tiêu tán năng lượng Tuy nhiên, do thiếu sự chồng chéo trạng thái năng lượng điện tử và dao động cũng như sự chênh lệch năng lượng lớn giữa trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích đầu tiên, quá trình chuyển đổi bên trong rất chậm để một electron trở về trạng thái cơ bản Việc quay trở lại trạng thái cơ bản chậm này cho phép các quá trình chuyển tiếp khác cạnh tranh với quá trình chuyển đổi bên trong ở trạng thái kích thích điện tử đầu tiên Cả sự phục hồi rung động và sự chuyển đổi bên trong đều xảy ra ở hầu hết các nhiễu loạn, tuy nhiên hiếm khi xảy ra sự chuyển tiếp cuối cùng

Một con đường khác để phân tử trở về trạng thái cơ bản hoặc trạng thái kích thích với mức năng lượng thấp hơn là phát ra một photon Quá trình này được gọi là huỳnh quang Nó được biểu thị trên sơ đồ Jablonski dưới dạng một đường thẳng đi xuống màu xanh lá trên trục năng lượng giữa các trạng thái điện tử (Hình 2.1) Huỳnh quang là một quá trình diễn ra chậm trong khoảng từ 10-9 đến 10-7 giây; do đó, đó không phải là con đường có nhiều khả năng xảy ra để một electron tiêu tán năng lượng, đặc biệt là ở các trạng thái năng lượng điện tử cao hơn trạng thái kích thích đầu tiên Mặc dù quá trình chuyển đổi này diễn ra chậm nhưng nó là một quá trình chuyển đổi được phép với electron vẫn ở trong cùng một đa tạp Huỳnh quang thường được quan sát thấy nhiều nhất giữa trạng thái electron kích thích đầu tiên và trạng thái cơ bản đối với bất kỳ phân tử cụ thể nào vì ở mức năng lượng cao hơn, nhiều khả năng năng lượng sẽ bị tiêu tán thông qua chuyển đổi bên trong và phục hồi rung động Ở trạng thái kích thích đầu tiên, huỳnh quang có thể cạnh tranh về mặt thời gian với các quá trình không bức xạ khác Năng lượng của photon phát ra trong huỳnh quang bằng năng lượng chênh lệch giữa các trạng thái riêng của quá trình chuyển đổi; tuy nhiên, năng lượng của photon huỳnh quang luôn nhỏ hơn năng lượng của photon kích thích Sự khác biệt này là do năng lượng bị mất đi trong quá trình chuyển đổi bên trong và sự hồi phục dao động, nơi nó được truyền ra khỏi electron Do có số lượng lớn các mức rung động có thể kết hợp với sự chuyển đổi giữa các trạng thái điện tử, nên phát

8

xạ đo được thường được phân bố trên một phạm vi bước sóng Nó được biểu thị trên sơ đồ Jablonski như một đường thẳng đi xuống trên trục năng lượng giữa các trạng thái điện tử Huỳnh quang thường được quan sát thấy nhiều nhất giữa trạng thái electron kích thích đầu tiên và trạng thái cơ bản đối với bất kỳ phân tử cụ thể nào vì ở mức năng lượng cao hơn, nhiều khả năng năng lượng sẽ bị tiêu tán thông qua chuyển đổi bên trong và phục hồi rung động Ở trạng thái kích thích đầu tiên, huỳnh quang có thể cạnh tranh về mặt thời gian với các quá trình không bức xạ khác Năng lượng của photon phát ra trong huỳnh quang bằng năng lượng chênh lệch giữa các trạng thái riêng của quá trình chuyển đổi; tuy nhiên, năng lượng của photon huỳnh quang luôn nhỏ hơn năng lượng của photon kích thích Sự khác biệt này là do năng lượng bị mất đi trong quá trình chuyển đổi bên trong và sự hồi phục dao động, nơi nó được truyền ra khỏi electron Do có số lượng lớn các mức rung động có thể kết hợp với sự chuyển đổi giữa các trạng thái điện tử, nên phát xạ đo được thường được phân bố trên một phạm vi bước sóng Trên thực tế, số phân tử có thể phát huỳnh quang tương đối ít vì có nhiều quá trình cạnh tranh với huỳnh quang

Một con đường khác mà một phân tử có thể thực hiện để tiêu tán năng lượng được gọi là sự giao thoa giữa các hệ thống (intersystem crossing – isc), trong đó electron chuyển đổi từ singlet sang triplet khi trạng thái T₁,𝑣₁ có cùng mức năng lượng với S₁,𝑣0, chuyển từ trạng thái thái S₁ sang trạng thái kích thích bậc ba, T₁ Đây là nơi electron thay đổi bội số spin từ trạng thái bộ ba bị kích thích sang trạng thái bộ ba bị kích thích Nó được biểu thị bằng một mũi tên ngang, cong từ cột này sang cột khác Ứng với trạng thái này, phân tử có thể thực hiện quá trình isc hoặc phát xạ lân quang để hồi phục về trạng thái cơ bản

Đối với phát quang hóa học và phát quang sinh học, cơ chế phát quang phức tạp hơn so với quang phát quang Phát quang hóa học là một quá trình phát sáng dựa trên phản ứng hóa học trong đó sản phẩm có chất trung gian bị kích thích Chất trung gian này phát ra ánh sáng khi rơi vào trạng thái cơ bản Không giống như huỳnh quang, các electron trong vật liệu phát quang hóa học bị kích thích bởi một phản ứng hóa học chứ không phải do sự hấp thụ các photon

9

2.1.3 Phân loại sự phát quang

2.1.3.1 Phân loại phát quang dựa trên độ trễ thời gian

Dựa trên thời gian phát xạ, có thể phân loại phát quang thành:

- Phát xạ huỳnh quang: là đặc tính của một số nguyên tử và phân tử để hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng cụ thể và sau đó phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn sau một khoảng thời gian ngắn [32]

+ Khi các nguyên tử ở trạng thái cơ bản tiếp xúc với tia cực kím hoặc bức xạ khả kiến, chúng sẽ hấp thụ các photon và chuyển sang trạng thái năng lượng cao hơn được gọi là trạng thái singlet bị kích thích Trạng thái này có thời gian tồn tại khoảng 10−8 giây

+ Các electron bị kích thích sau một thời gian sẽ giải phóng năng lượng dư thừa này dưới dạng photon, từ đó chuyển ngược lại về trạng thái cơ bản (trạng thái bền), phát ra năng lượng kích thích dưới dạng huỳnh quang

+ Trong quá trình chuyển tiếp điện tử này, spin của electron không bị thay đổi; trạng thái cơ bản của singlet và trạng thái singlet bị kích thích có bội số như nhau

+ Do đó, huỳnh quang là một hiệu ứng gần như tức thời, trong đó sự phát xạ ánh sáng được kết nối với sự chuyển đổi điện tử giữa các mức bội số giống nhau kết thúc trong khoảng 10−8 giây sau khi kích thích

- Lân quang: là hiện tượng phát quang mà vật liệu phát quang không phát xạ lại ngay bức xạ mà nó hấp thụ mà diễn ra chậm hơn [33] Sự dịch chuyển của electron từ trạng thái kích thích về trạng thái có mức năng lượng thấp hơn hoặc trạng thái bền bị giới hạn bởi một số quy tắc lượng tử Sự trở về trạng thái cơ bản chỉ có thể xảy ra khi dao động nhiệt đẩy electron sang trạng thái không bền gần đó, để từ đó nó rơi về trạng thái cơ bản Điều này khiến hiện tượng lân quang phụ thuộc vào nhiệt độ, nhiệt độ càng lạnh thì trạng thái kích thích càng được bảo tồn lâu hơn Bức xạ hấp thụ được phát lại ở cường độ thấp hơn và có thể kéo dài trong vài giờ

10

2.1.3.2 Phân loại phát quang dự trên nguồn kích thích

Ngoài ra, sự phát xạ ánh sáng thông qua quá trình phát quang có thể được phân loại dựa trên nguồn kích thích được sử dụng để kích hoạt các electron [34], bao gồm: - Phát quang sinh học (Bioluminescence): là hiện tượng các sinh vật sống tạo ra và

phát ra ánh sáng, bắt nguồn từ hai loại hệ thống chính – hệ thống phát quang sinh học bao gồm các enzyme luciferase và các gốc luciferin riêng biệt, và các protein phát quang trong đó nhiễm sắc thể phát sáng là một phần của chính protein và sự phát xạ ánh sáng được kích hoạt bởi những thay đổi trong môi trường của protein - Nhiệt phát quang (Thermoluminescence): là một trong những loại phát quang được kích hoạt bằng nhiệt sau đó do sự chiếu xạ sơ cấp ban đầu thông qua các nguồn năng lượng thay thế bổ sung dưới dạng chùm tia hoặc tia như tia α, tia β, tia γ, tia cực tím hoặc tia X Ở đây, sự nhiễu loạn nhiệt giảm chỉ gây ra sự giải phóng năng lượng khi tác động vào chất hoặc vật liệu phát ra từ nguồn gốc thay thế hoặc nguồn cung cấp kích thích khác

- Phát quang cơ học (Mechanoluminescence) / Phát quang ba chiều (Triboluminescence): một số quá trình như hoạt động xé, dùng lực làm trầy xước hoặc nghiền nát hoặc mài mòn có thể dẫn đến tác động vào các liên kết hóa học bên trong vật chất gây ra sự phóng ra ánh sáng như trong các tinh thể nguyên tố silic hoặc đường

- Quang phát quang (Photoluminescence): là hiện tượng phát xạ ánh sáng xảy ra từ bất kỳ dạng vật chất nào sau khi hấp thụ các photon

- Điện phát quang (Electroluminescence): Trong quá trình này, ánh sáng/sự phát sáng được tạo ra để đáp ứng với điện trường hoặc điện áp tác động lên một vật chất/chất cụ thể Các thiết bị phát quang điện được phát triển hàng đầu trong cuộc sống hàng ngày thực sự là điốt phát ra ánh sáng (đèn LED)

- Phát quang vô tuyến (Radio-luminescence): ánh sáng này được hình thành hoặc phát triển trong một chất do sự xâm nhập đặc biệt của các bức xạ ion hóa trong tự nhiên như phân tử β, tia X hoặc tia γ

11

- Phát quang hóa học (Chemoluminescence): Sự phóng ra ánh sáng/chùm ánh sáng thông qua sự phóng điện hoặc tiết ra hiệu lực từ một quá trình hoặc kỹ thuật hóa học được gọi hoặc đặt tên là phát quang hóa học

- Phát quang siêu âm (Sono-luminescence): Đó là phương pháp, quá trình hoặc hiện tượng sử dụng ánh sáng được tạo ra hoặc phát triển hoặc hình thành do sự khuấy động bằng cách sử dụng sóng siêu âm

- Phát quang Cathodo (Cathodo-luminescence): Đây là quá trình phóng ra ánh sáng do năng lượng của chùm tia điện tử

2.1.4 Một số ứng dụng phát quang trong nghiên cứu về ung thư

Phát quang sinh học là một dạng phát quang trong đó năng lượng ánh sáng được giải phóng bằng phản ứng hóa học tạo ra bởi sinh vật sống [35] Hiện tượng phát quang sinh học là phổ biến nhất ở các sinh vật biển, dù thực tế là các sinh vật phát sáng được tìm thấy ở các loài sống trên cạn (vi khuẩn, nấm, giun và đom đóm) [36] Nghiên cứu về phản ứng phát quang sinh học của các sinh vật thuộc các loài khác nhau đã tiết lộ nhiều cơ chế đáng kinh ngạc làm cơ sở cho sự phát xạ ánh sáng cũng như các chất nền và đồng yếu tố tham gia vào các phản ứng, cũng như các enzyme xúc tác cho các phản ứng này Điểm chung của tất cả các hệ thống phát quang sinh học là sự hiện diện của oxy và không có ngoại lệ

2.1.4.1 Nghiên cứu biểu hiện gen

Reporter gene assays (tạm dịch: xét nghiệm định lượng bằng gen chỉ thị) được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và di truyền học để nghiên cứu sự biểu hiện và điều hòa gen Nguyên lý của xét nghiệm này dựa trên phản ứng huỳnh quang sinh học của enzyme huỳnh quang và cơ chất tương ứng, chẳng hạn luciferase và luciferin Enzyme luciferase là enzyme đơn phân, với kích thước 61 kDa [37] có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa hai bước [38, 39] để tạo ra ánh sáng ở vùng màu xanh lá cây đến màu vàng với bước sóng nằm trong khoảng 550 – 570 nm [40] Enzyme luciferase

đã được phân lập từ nhiều loài khác nhau như đom đóm Bắc Mỹ (Photinus pyralis),

12

hoa Renilla reniformis và bọ Pyrophorus plagiophthalamus, cũng như nhiều loại vi

khuẩn, giun phát sáng và cá

Hình 2.2 Phản ứng của luciferase và luciferin

luciferase + D-LH₂ + ATP-Mg²+  luciferase D-LH₂-AMP + PPi-Mg²+ (1)

luciferase D-LH₂-AMP + PPi-Mg²+  luciferase + AMP + CO₂ + oxyluciferin + hν (2)

Phương trình (1) mô tả bước thứ nhất - phản ứng adenyl hóa - trong đó chất trung gian D-luciferin adenylate (D-LH₂-AMP) gắn với enzyme được hình thành thông qua phản ứng của cơ chất luciferin (D-LH₂) với Adenosine 5'-triphosphate (ATP) Bước thứ hai liên quan đến quá trình oxy hóa và decarboxyl hóa, và chất trung gian phản ứng với oxy, tạo ra sản phẩm oxyluciferin và phát ra ánh sáng huỳnh quang (phương trình 2) Phản ứng sẽ tạo ra một chùm ánh sáng ban đầu phân rã trong khoảng vài giây và sau đó sự phát quang được duy trì ở mức thấp [39]

14

2.1.4.2 Đánh giá hoạt động sống của tế bào

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của resazurin và resorufin

Xét nghiệm resazurin còn được gọi là xét nghiệm alamarblue là một phương pháp được sử dụng nhằm xác định khả năng tồn tại của tế bào động vật có vú và vi khuẩn Resazurin là một chất chỉ thị oxy hóa khử có thể thấm qua tế bào có thể được sử dụng để theo dõi số lượng tế bào sống sót [41] Resazurin có thể được hòa tan trong dung dịch đệm sinh lý, tạo ra dung dịch có màu xanh lam đậm và được thêm trực tiếp vào tế bào trong môi trường nuôi cấy ở định dạng đồng nhất Các tế bào sống có hoạt động trao đổi chất tích cực và có thể khử thông qua enzyme reductase của ty thể, thuốc nhuộm không huỳnh quang resazurin bị khử thành resorufin – một chất phát huỳnh quang mạnh [42] Resorufin phát huỳnh quang với bước sóng cực đại phát xạ ở 584 nm và bước sóng kích thích cực đại là 571 nm, trong khi đó resazurin không phát huỳnh quang (Hình 2.5) Lượng resorufin được tạo ra tỷ lệ với số lượng tế bào sống sót có thể được định lượng bằng cách sử dụng máy đo huỳnh quang được trang bị bộ lọc phát xạ kích thích 560/590 nm Các phép đo tăng sinh với resazurin có thể được theo dõi bằng máy quang phổ kế, máy đo quang phổ huỳnh quang tiêu chuẩn hoặc máy đọc đĩa giếng vi quang phổ Bên cạnh đó, vì alamarblue không độc hại nên các tế bào tiếp xúc với nó có thể được đưa trở lại nuôi cấy hoặc sử dụng cho các mục đích khác [43] Vì vậy chúng có thể được kết hợp với một số thí nghiệm khác, chẳng hạn như đo hoạt động caspase để thu thập thêm thông tin về cơ chế dẫn đến hiện tượng gây độc tế bào

15

Hình 2.5 Phổ phát xạ huỳnh quang của resazurin (màu xanh) và resorufin (màu đỏ) [44] Mũi tên màu đỏ biểu thị sự phát xạ do dấu vết của resorufin trong mẫu

resazurin

2.1.4.3 Nghiên cứu tương tác protein-protein

Tương tác protein-protein là một trong những chủ đề rất quan trọng và được quan tâm nghiên cứu nhằm phát triển các ứng dụng trong sinh học và y tế Phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (Bioluminescence resonance energy transfer - BRET) thường được sử dụng để theo dõi tương tác protein-protein vì BRET xảy ra khi khoảng cách giữa miền protein (donor) và cơ chất của nó (acceptor) dưới 10nm Hiệu quả BRET của nó tỷ lệ nghịch với lũy thừa thứ sáu của khoảng cách, nên nó đã trở nên phổ biến như một xét nghiệm dựa trên độ gần để theo dõi các tương tác protein-protein và sắp xếp lại hình dạng trong cơ thể sống tế bào [45] Trong một thí nghiệm nghiên cứu tương tác protein-protein, các nhà nghiên cứu kết hợp về mặt di truyền một protein cho phát quang sinh học (ví dụ, Renilla luciferase) với một trong các thụ thể tương tác và protein nhận huỳnh quang (ví dụ, protein huỳnh quang màu xanh lá cây, green fluorescent protein - GFP) với thụ thể còn lại Khi hai protein này tương giác với nhau, năng lượng sẽ được truyền từ chất cho phát quang sinh học sang chất nhận huỳnh quang, dẫn đến sự phát xạ huỳnh quang có thể được phát hiện và định lượng Một ưu điểm chính của BRET trong các

16

nghiên cứu tương tác protein-protein là khả năng cung cấp dữ liệu tế bào sống trong môi trường sinh lý thông thường theo thời gian thực mà không cần nguồn kích thích bên ngoài và không xâm lấn [46] Các nhà nghiên cứu có thể sử dụng BRET để khám phá các khía cạnh không gian và thời gian của tương tác protein-protein, hiểu rõ hơn về động học, nội địa hóa dưới tế bào và điều chỉnh các tương tác này

Hình 2.6 Minh họa hiện tượng truyền cộng hưởng huỳnh quang

Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) cũng là một phương pháp được sử dụng để theo dõi tương tác giữa protein và protein với nguyên lý tương tự với BRET, nhưng thay vì protein được sử dụng là protein phát quang sinh học thì các protein huỳnh quang được sử dụng (ví dụ: cyan fluorescent proteins - CFP và yellow fluorescent proteins - YFP) thay vì các protein phát quang sinh học [47] FRET mô tả sự truyền năng lượng giữa hai chất phát huỳnh quang: chất cho hấp thụ năng lượng (thường là photon) và truyền năng lượng tiềm năng của nó cho chất nhận, sau đó phát huỳnh quang (Hình 2.6) Khi không có tương tác giữa chất cho và chất nhận, fluorophore của chất cho sẽ hấp thụ photon và phát ra huỳnh quang màu xanh lam Nếu có liên kết giữa chất cho và chất nhận, fluorophore của chất cho sẽ được truyền cho chất nhận, làm sinh ra huỳnh quang của chất nhận (màu xanh lá cây) Thông qua việc xác định tín hiệu huỳnh quang sinh ra, ta có thể theo dõi được tương tác của chất cho và chất nhận

17

Nghiên cứu của Schaap và cộng sự (2013) đã phát triển mô hình sàng lọc chất ức chế tương tác giữa Nrf2 và Kelch-like ECH-associated protein (Keap1) – yếu tố đóng vai trò như một cảm biến stress oxi hóa gây ra do hóa chất hoặc bức xạ trong tế bào, điều chỉnh các phản ứng liên quan đến bảo vệ tế bào chống lại stress oxi hóa – dựa trên FRET [48] FRET có độ ổn định và cho tín hiệu tốt, chứng tỏ là đây là một phương pháp có giá trị để nghiên cứu tương tác Keap1−Nrf2 và có thể hỗ trợ việc xác định và thiết kế các tác nhân hóa học hiệu quả Zhou và cộng sự (2019) đã xây dựng mô

hình in vitro và in vivo sàng lọc thuốc có khả năng ức chế tương tác Nrf2 và

Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), bằng cách gắn thẻ huỳnh quang cho gen Nrf2 và Keap1, sau đó xác định tương tác của chúng bằng cách áp dụng kĩ thuật FRET và BiFC - bimolecular fluorescence complementation) [49] Kết quả đã thiết lập thành công mô hình để phát hiện sự tương tác giữa Nrf2 và Keap1, cung cấp các phương pháp đơn giản và kinh tế để sàng lọc các chất ức chế tiềm năng của con đường Keap1 và Nrf2

2.1.4.4 Theo dõi quá trình chết tế bào theo chương trình

Chu trình chết tế bào theo chương trình (hay apoptosis) đóng vai trò chính trong quá trình tạo, cân bằng nội môi và sinh bệnh học và nhiều liệu pháp điều trị ung thư hiện nay cũng được thực hiện nhằm mục đích gây ra quá trình này [50] Để theo dõi quá trình apoptosis, người ta sử dụng các tế bào biến đổi gen chứa đoạn gen phát quang sinh học, chẳng hạn như luciferase, được kiểm soát bởi yếu tố kích thích phản ứng apoptosis Khi quá trình apoptosis diễn ra, việc kích hoạt yếu tố kích thích này dẫn đến tăng biểu hiện của luciferase Sau đó, các tín hiệu phát quang sinh học phát ra sẽ được ghi nhận lại, cung cấp thông tin theo thời gian, không gian và thời gian thực về sự tiến triển của quá trình apoptosis trong tế bào hoặc sinh vật sống Cách tiếp cận này cung cấp một phương tiện linh hoạt và nhạy cảm để nghiên cứu quá trình apoptosis, cho phép dễ dàng quan sát đối tượng thí nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho việc đánh giá quá trình apoptosis trong các mô hình sinh học khác nhau Những cân nhắc về độ đặc hiệu và độ nhạy, cùng với việc xác nhận thông qua các xét nghiệm

Hình 2.7 Cấu trúc miền Nrf2

19

2.2.2 Hoạt động của Nrf2 trong tế bào

Tất cả các tế bào sống đòi hỏi cân bằng nội môi tế bào cho quá trình trao đổi chất và khả năng phản ứng nhanh chóng với các căng thẳng khác nhau do tiếp xúc với chất độc hại Phản ứng chống oxy hóa qua trung gian Nrf2 là một trong những cơ chế bảo vệ tế bào chính giúp bảo vệ chống lại stress oxy hóa [60] Hoạt động của Nrf2 được điều hòa trực tiếp bởi protein Keap1 (Hình 2.8), là một protein có khả năng cảm ứng với các chất gây stress oxy hóa [61] Nrf2 khi gắn với Keap1 sẽ bị ubiquitin hóa bởi ligase E3 hình thành từ protein Cullin3 và RBX1 (Cul3/RBX1), sau đó Nrf2 bị thoái hóa bởi proteasome 26S Ở điều kiện bình thường khi tế bào ở trạng thái cân bằng nội môi, Nrf2 liên tục bị Keap1 bắt giữ, ức chế và bị phân hủy [62] Trong điều kiện stress oxy hóa, các chất cảm ứng làm biến đổi nhóm thiol cystein của Keap1, dẫn đến phá vỡ liên kết giữa các phức hợp Keap1–Nrf2–Cul3 Kết quả là Nrf2 không bị ubiquitin hóa và được giải phóng tự do [62] Nrf2 tự do di chuyển vào nhân, tạo phức hợp phiên mã với sMaf và kích hoạt sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa thông qua ARE [63]

Hình 2.8 Con đường điều hòa Nrf2 và yếu tố phản ứng oxi hóa trong điều kiện môi trường bình thường và stress oxy hóa

20

Biểu hiện của Nrf2 có thể được xem là “con dao hai lưỡi” đối với bệnh nhân mắc ung thư Một số bằng chứng cho thấy việc kích hoạt Nrf2 có thể ngăn chặn quá trình gây ung thư, đặc biệt là ở giai đoạn đầu [60] Nrf2 duy trì cân bằng nội môi oxy hóa khử của tế bào và thực hiện các chức năng chống viêm cũng như các hoạt động chống ung thư khác, do đó hỗ trợ sự sống của tế bào Tuy nhiên, đối với việc điều trị ung thư, biểu hiện quá mức của Nrf2 trên tế bào ung thư được chứng minh rằng có sự liên quan mật thiết đến việc hình thành tình trạng kháng thuốc của tế bào [64] do cơ chế bào vệ tế bào chống lại tác nhân độc hại từ thuốc hóa trị làm tăng cường sức đề kháng của chúng đối với các tác nhân hóa trị liệu [13, 14, 65] Trên lâm sàng, sự biểu hiện quá mức của Nrf2 luôn được quan sát thấy với tiên lượng xấu đối với bệnh nhân ung thư [66]

2.2.3 Một số hợp chất làm giảm biểu hiện của Nrf2 có nguồn gốc thiên nhiên

Luteolin là một flavone đã được báo cáo có khả năng hoạt động như một chất ức chế mạnh với Nrf2 Luteolin làm giảm nồng độ ức chế hiệu quả Nrf2 mRNA xuống 34% khi điều trị đồng thời với Actinomycin D trong 30 phút và 43% sau 1,5 giờ trong tế bào ung thư biểu mô phổi ở người A549 [20] Nghiên cứu của Tssai và cộng sự đã báo cáo kết quả luteolin làm giảm đáng kể các dấu ấn sinh học của ung thư vú bằng các điều chỉnh giảm các biểu hiện qua trung gian Nrf2, cho thầy tiềm năng của nó như tác nhân điều trị nhắm đích hiệu đối với ung thư vú [67] Luteolin cũng làm tăng quá trình quá trình chết tế bào theo chương trình, kích hoạt các con đường truyền tín hiệu ATR/Chk2/p53 và ức chế con đường truyền tín hiệu NF-κB trong các tế bào kháng mitoxantrone ung thư vú, theo báo cáo của Rao và cộng sự [68] Ngoài ra, luteolin còn cho thấy khả năng thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình và điều hòa giảm EGFR, đường truyền tín hiệu PI3K/AKT/mTOR; do đó, các tế bào

khối u kháng erlotinib nhạy cảm hơn với erlotinib [69] Nghiên cứu in vivo trên chuột

cho thấy điều trị đơn lẻ với liều luteolin tăng dần và điều trị bằng luteolin và cisplatin cho thấy khối lượng khối u giảm đi đáng kể so với chỉ dùng cisplatin [70]

21

Hình 2.9 Cấu trúc của một số hợp chất được ghi nhận có khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2

Brusatol, một hợp chất chiết xuất từ Brucea javanica, cho thấy khả năng khắc phục

tình trạng kháng thuốc là khả năng ức chế hoạt hóa Nrf2 trong tế bào ung thư [71] Nghiên cứu được công bố bởi Ren và cộng sự chỉ ra rằng brusasol ức chế cơ chế bảo vệ qua trung gian Nrf2 trong tế bào ung thư phổi [72] Nhiều nghiên cứu cũng báo cáo khả năng phục hồi hoạt động Nrf2 trong tế bào của nó, gây ra các đường truyền tín hiệu khác và gây ra tác dụng ức chế tăng trưởng hoặc gây chết tế bào [73, 74] Ngoài ra, brustatol còn thể hiện tác dụng hiệp đồng khi sử dụng cùng với thuốc chống ung thư Brusatol đã được phát hiện là có tác dụng nâng cao hiệu quả của gemcitabine bằng cách ức chế sự phát triển của tế bào và gây ra apoptosis trong tế bào ung thư tuyến tụy ở người so với các loại khác thông qua việc ức chế con đường Nrf2 khi kết hợp 1 μM brusatol và 20 μM gemcitabine trong 48 giờ điều trị [73] Tuy nhiên, khả năng ức chế Nrf2 của brustatol được báo cáo là không đặc hiệu, đồng thời nó còn làm làm giảm khả năng sống sót của tế bào đại tràng khỏe mạnh của con người [75, 76] Các hợp chất tự nhiên khác như ochratoxin A [77] và trigonelline trong cà phê [78] cũng được báo cáo ngăn chặn sự tích lũy Nrf2 trong hạt nhân của tế bào Trong các tế bào bạch cầu, malabaricone-A, một chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật, ức chế hiệu quả hoạt động phiên mã Nrf2 được phản ánh bằng việc giảm mức protein

22

HO-1 và dẫn đến tích lũy ROS và tiếp theo là quá trình chết theo chương trình của tế bào [79] Ascorbic acid, một chất ức chế Nrf2, đã được báo cáo với khả năng khôi phục một phần độ nhạy cảm của tế bào với imatinib bằng cách điều chỉnh giảm Nrf2 [17], đồng thời tăng độ nhạy cảm của tế bào HeLa với cisplatin và adriamycin [18] Nhìn chung, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm chứng minh khả năng của hợp chất thiên nhiên trong việc hỗ trợ tình trạng kháng thuốc điều trị ung thư thông qua ức chế biểu hiện của Nrf2 Tuy nhiên tính chọn lọc của các hợp chất này đối với việc ức chế Nrf2 vẫn là một hạn chế để có thể ứng dụng trên lâm sàng hay thử nghiệm điều trị cho bệnh nhân ung thư vì một số hợp chất có khả năng gây ức chế Nrf2 cũng như gây độc trên cả tế bào khỏe mạnh

2.3.1 Một số mô hình sàng lọc trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu sàng lọc in vitro và in vivo đã được tiến hành nhằm

tìm ra dược liệu hoặc hoạt chất có khả năng chống lại hiện tượng kháng thuốc trên tế bào ung thư thông qua ức chế một hoặc các tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình kháng thuốc

Gale và cộng sự (2016) đã tiến hành sàng lọc các hợp chất ức chế lysine demethylase 5A (KDM5A) – một histone lysine demethylase được báo cáo có biểu hiện quá mức đối với một số bệnh ung thư ở người bao gồm ung thư phổi, dạ dày, vú và gan KDM5A vai trò quan trọng trong các quá trình ung thư quan trọng bao gồm tạo khối u, di căn và dung nạp thuốc, khiến nó trở thành mục tiêu điều trị ung thư tiềm năng Nghiên cứu áp dụng phát quang đồng nhất (homogeneous luminescence-based assay)để tiến hành sàng lọc trên khoảng 9.000 phân tử, nhằm tìm ra ức chế KDM5A Kết

quả đã xác định được có 34 hợp chất ức chế KDM5A in vitro với nồng độ ức chế

50% (IC50) nhỏ hơn 5 μM [80]

Li và cộng sự (2020) đã thực hiện nghiên cứu nhằm sàng lọc hoạt chất có khả năng ức chế enzyme uracil-DNA glycosylase (UDG), một loại enzyme gây ra tình trạng kháng thuốc điều trị ung thư 5-fluorouracil (5-FU) Nghiên cứu này đã sử quang phổ phát xạ theo thời gian (Time-resolved emission spectroscopy - một kỹ thuật đo sự

23

phát xạ ở những thời điểm riêng biệt trong quá trình phân rã huỳnh quang) để tiến hành sàng lọc trên 400 hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Kết quả tìm thấy 2 hợp chất là dẫn xuất indole giống như sản phẩm tự nhiên và thuốc kháng sinh nifuroxazide được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê chuẩn có khả năng ức chế đáng kể UDG trên mô hình sàng lọc Thử nghiệm phản ứng theo liều lượng cho thấy hai hợp chất này có khả năng ức chế đến 80% biểu hiện của UDG, đồng thời cũng cho thấy tác dụng hiệp đồng đầy hứa hẹn với 5-FU trong việc gây tổn thương DNA và làm suy yếu sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [81]

Song và cộng sự (2023) đã dựa trên quang phát quang theo thời gian (robust resolved photoluminescence) để xây dựng mô hình sàng lọc các chất có khả năng ức chế alkyladenine DNA glycosylase (AAG) AAG là một enzyme kích hoạt quá trình sửa chữa cắt bỏ base bằng cách cắt bỏ các tổn thương N3-methyladenine và N7-methylguanine do temozolomide (TMZ), một chất chống ung thư được sử dụng để điều trị u nguyên bào thần kinh đệm, thường là sau xạ trị và/hoặc phẫu thuật cắt bỏ, gây ra Tuy nhiên, ít nhất 50% bệnh nhân không đáp ứng với TMZ liên quan đến việc sửa chữa và/hoặc dung nạp các tổn thương DNA do TMZ gây ra AAG được báo cáo có biểu hiện quá mức trong các mô u nguyên bào thần kinh đệm so với các mô bình thường Kết quả nghiên cứu đã xác định được sunitinib là chất chất ức chế AAG tiềm năng và hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị u nguyên bào thần kinh đệm trong số 1440 loại thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt [82]

time-2.3.2 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu trong nước

Việt Nam là một đất nước có nguồn tài nguyên phong phú, nhiều loài đặc hữu quý hiếm nhờ vào vị trí địa lý thuận lợi và khí hậu được thiên nhiên ưu đãi Nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời và ghi nhận 5.117 loài thuộc 1.823 chi của 360 họ thực vật có giá trị làm thuốc, chữa bệnh, chăm sóc và bảo vệ sức khỏe [83] Nhiều loài dược liệu quý, hiếm, có công dụng chữa bệnh và giá trị kinh tế cao được ghi nhận như: sâm Ngọc linh, sâm Lai Châu, sâm vũ diệp, bảy lá một hoa, lan kim tuyến, tam thất hoang, bách hợp, thông đỏ, vàng đắng, hoàng liên ô rô, hoàng liên gai, thanh thiên quỳ, bình vôi, … [21] Một số loại dược liệu được ghi nhận với công dụng hỗ

24

trợ điều trị ung thư Bên cạnh đó, nhiều loại thảo dược còn có khả năng làm giảm tác dụng phụ do điều trị ung thư như nôn, chán ăn, mệt mỏi, thiếu máu, qua đó hỗ trợ tăng cường sức khỏe cho bệnh nhân ung thư

Trong những năm gần đây, nghiên cứu khoa học về cây thuốc cổ truyền ở Việt Nam ngày càng được quan tâm với những nghiên cứu về thành phần hóa học, tác động

dược lý và công dụng điều trị trên mô hình in vitro, in vivo Nghiên cứu

“Bioassay-guided discovery of potential partial extracts with cytotoxic effects on liver cancer

cells from vietnamese medicinal herbs” (Tạm dịch: Sàng lọc dược liệu định hướng

tác dụng gây độc tế bào ung thư gan từ cao chiết phân đoạn từ một số dược liệu Việt Nam) do TS Nguyễn Minh Hiền và cộng sự đã thực hiện đã tiến hành sàng lọc trên

52 cao chiết methanol (MeOH) toàn phần từ 24 loài dược liệu Việt Nam [84] Kết

quả cho thấy cao chiết MeOH toàn phần của Luvunga Scandens, Hyptis suaveolens và Solanum torvum thể hiện hoạt tính chống lại tế bào ung thư biểu mô tế bào gan mạnh Đáng chú ý, chiết xuất phân đoạn ethyl acetate (EA) và MeOH 90% từ rễ H

suaveolens có hàm lượng flavonoid toàn phần cao và khả năng chống oxy hóa mạnh,

có thể là nguồn dược liệu hứa hẹn cho các phương thức trị liệu mới trong điều trị ung

thư biểu mô tế bào gan Đối với lá của L scandens và S torvum, chiết xuất EA cho

thấy giá trị hàm lượng flavonoid toàn phần cao và hoạt động chống ung thư đầy hứa hẹn

Nhiệm vụ “Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam theo hướng diệt các tế bào ung thư và

phân lập các hoạt chất để nghiên cứu làm thuốc chữa bệnh” năm 2016 đã sàng lọc

330 mẫu dược liệu từ các cây thuốc dùng trong y học cổ truyền, y học dân gian Việt Nam và sàng lọc hoạt tính trên 8 dòng tế bào ung thư Kết quả lựa chọn được 10 cây thuốc đáng chú ý cho nghiên cứu về các hoạt chất có tác dụng [85] Quy trình phân

lập các chất CT1 từ khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis), baicalein từ vỏ thân núc nác (Oroxylum indicum), CO55 từ nụ vối (Cleistocalyx operculatus) và pristimerin ở quy

mô phòng thí nghiệm cũng đã được xây dựng dựa trên các kết qủa của nghiên cứu này

25

Đề tài “Điều tra, sàng lọc nguồn tài nguyên dược liệu thực vật tỉnh Lâm Đồng theo

định hướng hoạt tính sinh học nhằm phát triển các loài dược liệu có giá trị cao” do

TS Nguyễn Hữu Toàn Phan chủ nhiệm đã xây dựng danh mục của 1.003 loài cây thuốc, 3.009 tiêu bản, phát hiện 3 loài mới và thử hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxi hóa và gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư của 202 dịch chiết tổng MeOH của 202 loài chọn lọc, 104 hợp chất được phân lập từ 11 loài cây thuốc và sản xuất 3 loại thực phẩm chức năng [86]

Nghiên cứu của Bùi Thị Kim Ly và cộng sự (2015) sàng lọc trên 17 loại cây Việt

Nam dùng chữa nhiều loại bệnh liên quan đến ung thư, kết quả tìm thấy được A

vulgaris có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu với giá trị gây

độc 50% tế bào dao động từ 18,07±1,64 µg/ml đến 45,87±3,49 µg/mL trên 5 dòng tế bào ung thư bạch cầu gồm TCCY, KU-812, TCC-S, KOPB-26, và HL60 [87] Có thể thấy, các nghiên cứu hiện nay tại Việt Nam đang được thực hiện nhằm gây độc và làm chết tế bào ung thư mà chưa khai thác đến khía cạnh hỗ trợ kháng thuốc ung thư Do đó, tiến hành nghiên cứu sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có khả năng hỗ trợ kháng thuốc điều trị ung thư là hết sức cần thiết với nhu cầu hiện nay

26

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ được mô tả sơ đồ Hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Cao chiết methanol toàn phần

Cao chiết methanol tiềm năng

Cao chiết phân đoạn

Cao chiết phân đoạn tiềm năng

Phân đoạn chiết tiềm năng

Chiết phân đoạn

Sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên Huh7;

Khảo sát khả năng gây độc trên tế bào HaCaT;

Định tính hợp chất chính trong cao chiết phân đoạn

Xác định nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 trên Huh7

Xác định nồng độ gây độc 50% tế bào Huh7