1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7

116 2 0
Tài liệu đã được kiểm tra trùng lặp

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế Nrf2 ở tế bào ung thư gan Huh7
Tác giả Nguyễn Thị Yến Nhi
Người hướng dẫn Ts. Nguyễn Minh Hiền, Ts. Phạm Tấn Thi
Trường học Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành Vật Lý Kỹ Thuật
Thể loại Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản 2024
Thành phố Thành phố Hồ Chí Minh
Định dạng
Số trang 116
Dung lượng 2,43 MB

Cấu trúc

  • CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU (15)
  • CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN (18)
    • 2.1. Sự phát quang (18)
      • 2.1.1. Định nghĩa (18)
      • 2.1.2. Cơ chế phát quang (18)
      • 2.1.3. Phân loại sự phát quang (23)
      • 2.1.4. Một số ứng dụng phát quang trong nghiên cứu về ung thư (25)
    • 2.2. Tổng quan về Nrf2 và vai trò của Nrf2 trong tế bào (32)
      • 2.2.1. Tổng quan về Nrf2 (32)
      • 2.2.2. Hoạt động của Nrf2 trong tế bào (33)
      • 2.2.3. Một số hợp chất làm giảm biểu hiện của Nrf2 có nguồn gốc thiên nhiên 20 2.3. Mô hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước (34)
      • 2.3.1. Một số mô hình sàng lọc trên thế giới (36)
      • 2.3.2. Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu trong nước (37)
  • CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26 3.1. Sơ đồ nghiên cứu (40)
    • 3.2. Đối tượng (41)
      • 3.2.1. Dược liệu (41)
      • 3.2.2. Dòng tế bào (42)
    • 3.3. Thiết bị (42)
      • 3.3.1. Synergy HT Multi-Mode Reader (42)
      • 3.3.2. Đèn soi sắc ký bản mỏng (45)
      • 3.3.3. Một số thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu (46)
    • 3.4. Hóa chất (46)
    • 3.5. Phương pháp nghiên cứu (47)
      • 3.5.1. Nuôi cấy tế bào và cấy truyền DNA (47)
      • 3.5.2. Mô hình xác định hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 (47)
      • 3.5.3. Xác định khả năng sống của tế bào và hoạt động tương đối của Nrf2 36 3.5.4. Sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên dòng tế bào Huh7 37 3.5.5. Xác định nồng độ gây độc 50% tế bào và nồng độ ức chế 50% hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 (50)
      • 3.5.6. Định tính thành phần hóa học chính trong cao chiết dược liệu (52)
      • 3.5.7. Xử lý số liệu (53)
  • CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (54)
    • 4.1. Mô hình sàng lọc hoạt động của Nrf2 (54)
  • của 23 loài dược liệu đến biểu hiện của Nrf2 (0)
    • 4.3. Kết quả khảo sát tác dụng của cao chiết phân đoạn tiềm năng đến biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 (60)
    • 4.4. Kết quả xác định nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 và nồng độ gây độc 50% tế bào Huh7 (63)
    • 4.5. Kết quả định tính các hợp chất chính có trong các cao chiết phân đoạn (65)
  • CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ (70)
    • 5.1. Kết luận (70)
    • 5.2. Kiến nghị (71)
  • TÀI LIỆU THAM KHẢO (74)
  • PHỤ LỤC (94)

Nội dung

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của Nrf2 đã được chứng minh là góp phần làm tăng khả năng kháng thuốc trên tế bào ung thư.. Kết hợp với kết quả sắc ký lớp mỏng cho th

TỔNG QUAN

Sự phát quang

Phát quang là quá trình phát xạ ánh sáng tự phát của một chất (có thể là hữu cơ hoặc vô cơ, hoặc thậm chí là một sinh vật sống), bởi tác động của các nguồn năng lượng khác, có thể diễn ra ở nhiệt độ bình thường và nhiệt độ thấp và không sinh ra do nhiệt [26] Sự phát quang là sự phát xạ “lạnh” gây ra bởi sự chuyển động của các electron bên trong một chất từ trạng thái năng lượng cao hơn sang trạng thái năng lượng thấp hơn hoặc trạng thái bền [27] Bước sóng của ánh sáng phát ra là đặc trưng của chất phát quang [28] Điều này có thể được gây ra bởi sự hấp thụ các photon, phản ứng hóa học hoặc sinh hóa, hoạt động của các hạt hạ nguyên tử, bức xạ hoặc ứng suất lên tinh thể Hiện tượng này có thể được quan sát trong tự nhiên như ở giun phát sáng, đom đóm và ở một số loài nhất định như một số vi khuẩn biển và động vật ở vùng biển sâu [29] Hiện tượng này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bởi các nhà khoa học khác nhau trên khắp thế giới, ví dụ như Khảo cổ học, Địa chất, Kỹ thuật y sinh, Hóa học, Vật lý và các ứng dụng công nghiệp khác nhau để kiểm soát chất lượng, nghiên cứu và phát triển [30]

2.1.2 Cơ chế phát quang Ánh sáng là một dạng bức xạ điện từ, gồm một điện trường dao động có từ trường dao động vuông góc với nó Ánh sáng được đặc trưng bởi bước sóng λ và tần số ν, và liên hệ với nhau bởi phương trình ν = c / λ, trong đó c = 3 x 10⁸ m/s là vận tốc ánh sáng Khi ánh sáng chiếu vào vật chất, nó có thể đi qua vật chất mà không xảy ra sự hấp thụ, bị hấp thụ hoàn toàn hoặc bị hấp thụ một phần Trong trường hợp bị hấp thụ bởi vật chất, năng lượng ánh sáng được truyền cho các phân tử trong quá trình hấp thụ Sự hấp thụ năng lượng phải xảy ra theo đơn vị tích phân gọi là lượng tử Mối quan hệ lượng tử-năng lượng có thể được biểu thị bằng phương trình E = hν = hc / λ trong đó E là năng lượng, h là hằng số Planck (6,626 x 10⁻³⁴ J/s)

Theo cơ học lượng tử, các phân tử chỉ có thể tồn tại ở một số trạng thái xác định nhất định với các giá trị nội năng xác định Phân tử có thể thay đổi trạng thái của nó từ trạng thái này sang trạng thái khác chỉ khi được cung cấp một phần năng lượng bằng sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái từ bên ngoài hoặc nếu nó được giải phóng hoặc mất đi ra bên ngoài Đối với quá trình quang phát quang, sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng có thể được giải thích bằng sự chuyển tiếp của các electron giữa các trạng thái xác định nhất định Sự chuyển đổi giữa hai trạng thái của phân tử có thể được coi là sự chuyển đổi của một electron từ một quỹ đạo phân tử này đến quỹ đạo phân tử khác

Hình 2.1 Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31]

Quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử được minh họa bằng giản đổ Jablonski (Hình 2.1) Trên sơ đồ, các đường in đậm biểu thị năng lượng cơ bản của từng trạng thái υ₀ Các trạng thái năng lượng rung động bổ sung (υ₁, υ₂, υ₃, v.v.) được thể hiện bằng các đường mỏng hơn Sự chuyển đổi đầu tiên trong hầu hết các sơ đồ Jablonski là sự hấp thụ một photon có năng lượng cụ thể của phân tử quan tâm, được biểu thị bằng một mũi tên thẳng hướng lên, màu xanh lam Hấp thụ là phương pháp mà một electron bị kích thích từ mức năng lượng thấp hơn đến mức năng lượng cao hơn Chỉ có những

6 bước sóng ánh sáng có năng lượng tương ứng với sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái riêng khác nhau của phân tử mới có thể được hấp thụ Năng lượng của photon được truyền cho electron Electron đó sau đó chuyển sang trạng thái kích thích ở mức tương ứng với mức lượng năng lượng đã nhận Khi một electron đi vào trạng thái kích thích, nó có thể có bội số spin khác nhau, tùy thuộc vào việc tổng xung lượng góc spin có được bảo toàn hay không Nếu spin được bảo toàn thì electron được gọi là ở trạng thái kích thích đơn (S₁) Nếu xung lượng góc không được bảo toàn thì electron chuyển sang trạng thái năng lượng bậc ba (T₁)

Phân tử ở trạng thái kích thích không bền và có xu hướng trở về trạng thái có năng lượng thấp hơn qua nhiều con đường khác nhau Đầu tiên là thông qua phục hồi dao động (vibrational relaxation - vr), một quá trình không bức xạ [31] Điều này được biểu thị trên sơ đồ Jablonski dưới dạng mũi tên cong giữa các mức rung động Sự phục hồi dao động là quá trình năng lượng từ photo mà được electron hấp thụ chuyển sang các dạng dao động khác dưới dạng động năng Động năng này có thể tồn tại trong cùng một phân tử hoặc có thể được truyền sang các phân tử khác xung quanh phân tử bị kích thích Vì đây là quá trình chuyển đổi rất nhanh nên rất có khả năng xảy ra ngay sau quá trình hấp thụ Sự phục hồi dao động này xảy ra giữa các mức rung động, vì vậy nhìn chung các electron sẽ không thay đổi từ mức điện tử này sang mức điện tử khác thông qua phương pháp này

Tuy nhiên, nếu các mức năng lượng rung động trùng lặp mạnh với các mức năng lượng điện tử, thì có khả năng là electron bị kích thích có thể chuyển từ mức rung động ở trạng thái điện tử này sang mức rung động khác ở trạng thái điện tử thấp hơn Quá trình này được gọi là chuyển đổi bên trong (internal conversion – ic) và về mặt cơ học giống hệt với sự phục hồi dao động Chuyển đổi bên trong xảy ra do sự chồng chéo của trạng thái năng lượng rung động và năng lượng điện tử Khi năng lượng tăng lên, sự đa dạng của các trạng thái riêng rung động và điện tử trở nên phân bố chặt chẽ hơn bao giờ hết Ở các mức năng lượng lớn hơn trạng thái kích thích đầu tiên, có nhiều mức năng lượng rung động trùng lặp với các mức điện tử Sự chồng chéo này làm tăng xác suất chuyển đổi giữa các mức dao động của electron để trở về

7 trạng thái kích thích với mức năng lượng thấp hơn Do đó, sự chuyển đổi bên trong xảy ra trong cùng khung thời gian với sự hồi phục rung động, do đó, rất có thể là một cách để các phân tử tiêu tán năng lượng Tuy nhiên, do thiếu sự chồng chéo trạng thái năng lượng điện tử và dao động cũng như sự chênh lệch năng lượng lớn giữa trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích đầu tiên, quá trình chuyển đổi bên trong rất chậm để một electron trở về trạng thái cơ bản Việc quay trở lại trạng thái cơ bản chậm này cho phép các quá trình chuyển tiếp khác cạnh tranh với quá trình chuyển đổi bên trong ở trạng thái kích thích điện tử đầu tiên Cả sự phục hồi rung động và sự chuyển đổi bên trong đều xảy ra ở hầu hết các nhiễu loạn, tuy nhiên hiếm khi xảy ra sự chuyển tiếp cuối cùng

Một con đường khác để phân tử trở về trạng thái cơ bản hoặc trạng thái kích thích với mức năng lượng thấp hơn là phát ra một photon Quá trình này được gọi là huỳnh quang Nó được biểu thị trên sơ đồ Jablonski dưới dạng một đường thẳng đi xuống màu xanh lá trên trục năng lượng giữa các trạng thái điện tử (Hình 2.1) Huỳnh quang là một quá trình diễn ra chậm trong khoảng từ 10 -9 đến 10 -7 giây; do đó, đó không phải là con đường có nhiều khả năng xảy ra để một electron tiêu tán năng lượng, đặc biệt là ở các trạng thái năng lượng điện tử cao hơn trạng thái kích thích đầu tiên Mặc dù quá trình chuyển đổi này diễn ra chậm nhưng nó là một quá trình chuyển đổi được phép với electron vẫn ở trong cùng một đa tạp Huỳnh quang thường được quan sát thấy nhiều nhất giữa trạng thái electron kích thích đầu tiên và trạng thái cơ bản đối với bất kỳ phân tử cụ thể nào vì ở mức năng lượng cao hơn, nhiều khả năng năng lượng sẽ bị tiêu tán thông qua chuyển đổi bên trong và phục hồi rung động Ở trạng thái kích thích đầu tiên, huỳnh quang có thể cạnh tranh về mặt thời gian với các quá trình không bức xạ khác Năng lượng của photon phát ra trong huỳnh quang bằng năng lượng chênh lệch giữa các trạng thái riêng của quá trình chuyển đổi; tuy nhiên, năng lượng của photon huỳnh quang luôn nhỏ hơn năng lượng của photon kích thích

Sự khác biệt này là do năng lượng bị mất đi trong quá trình chuyển đổi bên trong và sự hồi phục dao động, nơi nó được truyền ra khỏi electron Do có số lượng lớn các mức rung động có thể kết hợp với sự chuyển đổi giữa các trạng thái điện tử, nên phát

8 xạ đo được thường được phân bố trên một phạm vi bước sóng Nó được biểu thị trên sơ đồ Jablonski như một đường thẳng đi xuống trên trục năng lượng giữa các trạng thái điện tử Huỳnh quang thường được quan sát thấy nhiều nhất giữa trạng thái electron kích thích đầu tiên và trạng thái cơ bản đối với bất kỳ phân tử cụ thể nào vì ở mức năng lượng cao hơn, nhiều khả năng năng lượng sẽ bị tiêu tán thông qua chuyển đổi bên trong và phục hồi rung động Ở trạng thái kích thích đầu tiên, huỳnh quang có thể cạnh tranh về mặt thời gian với các quá trình không bức xạ khác Năng lượng của photon phát ra trong huỳnh quang bằng năng lượng chênh lệch giữa các trạng thái riêng của quá trình chuyển đổi; tuy nhiên, năng lượng của photon huỳnh quang luôn nhỏ hơn năng lượng của photon kích thích Sự khác biệt này là do năng lượng bị mất đi trong quá trình chuyển đổi bên trong và sự hồi phục dao động, nơi nó được truyền ra khỏi electron Do có số lượng lớn các mức rung động có thể kết hợp với sự chuyển đổi giữa các trạng thái điện tử, nên phát xạ đo được thường được phân bố trên một phạm vi bước sóng Trên thực tế, số phân tử có thể phát huỳnh quang tương đối ít vì có nhiều quá trình cạnh tranh với huỳnh quang

Một con đường khác mà một phân tử có thể thực hiện để tiêu tán năng lượng được gọi là sự giao thoa giữa các hệ thống (intersystem crossing – isc), trong đó electron chuyển đổi từ singlet sang triplet khi trạng thái T₁,𝑣₁ có cùng mức năng lượng với S₁,𝑣0, chuyển từ trạng thái thái S₁ sang trạng thái kích thích bậc ba, T₁ Đây là nơi electron thay đổi bội số spin từ trạng thái bộ ba bị kích thích sang trạng thái bộ ba bị kích thích Nó được biểu thị bằng một mũi tên ngang, cong từ cột này sang cột khác Ứng với trạng thái này, phân tử có thể thực hiện quá trình isc hoặc phát xạ lân quang để hồi phục về trạng thái cơ bản Đối với phát quang hóa học và phát quang sinh học, cơ chế phát quang phức tạp hơn so với quang phát quang Phát quang hóa học là một quá trình phát sáng dựa trên phản ứng hóa học trong đó sản phẩm có chất trung gian bị kích thích Chất trung gian này phát ra ánh sáng khi rơi vào trạng thái cơ bản Không giống như huỳnh quang, các electron trong vật liệu phát quang hóa học bị kích thích bởi một phản ứng hóa học chứ không phải do sự hấp thụ các photon

2.1.3 Phân loại sự phát quang

2.1.3.1 Phân loại phát quang dựa trên độ trễ thời gian

Dựa trên thời gian phát xạ, có thể phân loại phát quang thành:

- Phát xạ huỳnh quang: là đặc tính của một số nguyên tử và phân tử để hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng cụ thể và sau đó phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn sau một khoảng thời gian ngắn [32]

+ Khi các nguyên tử ở trạng thái cơ bản tiếp xúc với tia cực kím hoặc bức xạ khả kiến, chúng sẽ hấp thụ các photon và chuyển sang trạng thái năng lượng cao hơn được gọi là trạng thái singlet bị kích thích Trạng thái này có thời gian tồn tại khoảng 10 −8 giây

+ Các electron bị kích thích sau một thời gian sẽ giải phóng năng lượng dư thừa này dưới dạng photon, từ đó chuyển ngược lại về trạng thái cơ bản (trạng thái bền), phát ra năng lượng kích thích dưới dạng huỳnh quang

Tổng quan về Nrf2 và vai trò của Nrf2 trong tế bào

Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) là một yếu tố phiên mã có chức năng điều chỉnh khả năng bảo vệ tế bào chống lại sự độc hại và căng thẳng oxy hóa thông qua sự biểu hiện của các gen liên quan đến phản ứng căng thẳng oxy hóa và giải độc [51] Nrf2 là yếu tố phiên mã dạng dây kéo leucin (bZIP) thuộc họ Cap n' Collar với cấu trúc gồm khoảng 600 acid amin và bảy miền chức năng Neh1 đến Neh7 (Hình 2.7) [52] Neh1 là miền liên kết DNA chứa vùng CNC-bZIP để liên kết của Nrf2 với sMaf và yếu tố phản ứng chống oxi hóa (Antioxidant Response Element

- ARE) quyết định hoạt động của yếu tố phiên mã [52, 53] Miền Neh2 chứa hai mô- đun 29 DLG 31 và 79 ETGE 82 để liên kết với Keap1, bảy lysin để liên kết với Cullin3/ligase E3 và ubiquitin hóa [54, 55] Miền Neh3 là miền phụ trách kích hoạt phiên mã của Nrf2 và tương tác với protein liên kết DNA helicase chromodomain 6 (CHD6) có vai trò trong việc tái cấu trúc chất nhiễm sắc [56] Neh4 và Neh5 có vai trò làm tăng tốc độ hoạt động phiên mã Nrf2 [57] Miền Neh6 là miền điều hòa hoạt động Nrf2 độc lập với Keap1 Miền Neh6 chứa hai mô-đun 334 DSGIS 338 và

373DSAPGS 378 giúp tăng cường hoạt động βTrCP dựa trên quá trình phosphoryl hóa qua trung gian GSK3 (Glycogen synthase kinase 3) [58] Neh7 là miền liên kết cho thụ thể retinoid Xα (RXRα) Khi liên kết với miền này sẽ giảm thu hút các yếu tố đồng hoạt hóa đến Neh4 và Neh5 và ngăn chặn sự kích hoạt phiên mã [59]

Hình 2.7 Cấu trúc miền Nrf2

2.2.2 Hoạt động của Nrf2 trong tế bào

Tất cả các tế bào sống đòi hỏi cân bằng nội môi tế bào cho quá trình trao đổi chất và khả năng phản ứng nhanh chóng với các căng thẳng khác nhau do tiếp xúc với chất độc hại Phản ứng chống oxy hóa qua trung gian Nrf2 là một trong những cơ chế bảo vệ tế bào chính giúp bảo vệ chống lại stress oxy hóa [60] Hoạt động của Nrf2 được điều hòa trực tiếp bởi protein Keap1 (Hình 2.8), là một protein có khả năng cảm ứng với các chất gây stress oxy hóa [61] Nrf2 khi gắn với Keap1 sẽ bị ubiquitin hóa bởi ligase E3 hình thành từ protein Cullin3 và RBX1 (Cul3/RBX1), sau đó Nrf2 bị thoái hóa bởi proteasome 26S Ở điều kiện bình thường khi tế bào ở trạng thái cân bằng nội môi, Nrf2 liên tục bị Keap1 bắt giữ, ức chế và bị phân hủy [62] Trong điều kiện stress oxy hóa, các chất cảm ứng làm biến đổi nhóm thiol cystein của Keap1, dẫn đến phá vỡ liên kết giữa các phức hợp Keap1–Nrf2–Cul3 Kết quả là Nrf2 không bị ubiquitin hóa và được giải phóng tự do [62] Nrf2 tự do di chuyển vào nhân, tạo phức hợp phiên mã với sMaf và kích hoạt sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa thông qua ARE [63]

Hình 2.8 Con đường điều hòa Nrf2 và yếu tố phản ứng oxi hóa trong điều kiện môi trường bình thường và stress oxy hóa

Biểu hiện của Nrf2 có thể được xem là “con dao hai lưỡi” đối với bệnh nhân mắc ung thư Một số bằng chứng cho thấy việc kích hoạt Nrf2 có thể ngăn chặn quá trình gây ung thư, đặc biệt là ở giai đoạn đầu [60] Nrf2 duy trì cân bằng nội môi oxy hóa khử của tế bào và thực hiện các chức năng chống viêm cũng như các hoạt động chống ung thư khác, do đó hỗ trợ sự sống của tế bào Tuy nhiên, đối với việc điều trị ung thư, biểu hiện quá mức của Nrf2 trên tế bào ung thư được chứng minh rằng có sự liên quan mật thiết đến việc hình thành tình trạng kháng thuốc của tế bào [64] do cơ chế bào vệ tế bào chống lại tác nhân độc hại từ thuốc hóa trị làm tăng cường sức đề kháng của chúng đối với các tác nhân hóa trị liệu [13, 14, 65] Trên lâm sàng, sự biểu hiện quá mức của Nrf2 luôn được quan sát thấy với tiên lượng xấu đối với bệnh nhân ung thư [66]

2.2.3 Một số hợp chất làm giảm biểu hiện của Nrf2 có nguồn gốc thiên nhiên

Luteolin là một flavone đã được báo cáo có khả năng hoạt động như một chất ức chế mạnh với Nrf2 Luteolin làm giảm nồng độ ức chế hiệu quả Nrf2 mRNA xuống 34% khi điều trị đồng thời với Actinomycin D trong 30 phút và 43% sau 1,5 giờ trong tế bào ung thư biểu mô phổi ở người A549 [20] Nghiên cứu của Tssai và cộng sự đã báo cáo kết quả luteolin làm giảm đáng kể các dấu ấn sinh học của ung thư vú bằng các điều chỉnh giảm các biểu hiện qua trung gian Nrf2, cho thầy tiềm năng của nó như tác nhân điều trị nhắm đích hiệu đối với ung thư vú [67] Luteolin cũng làm tăng quá trình quá trình chết tế bào theo chương trình, kích hoạt các con đường truyền tín hiệu ATR/Chk2/p53 và ức chế con đường truyền tín hiệu NF-κB trong các tế bào kháng mitoxantrone ung thư vú, theo báo cáo của Rao và cộng sự [68] Ngoài ra, luteolin còn cho thấy khả năng thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình và điều hòa giảm EGFR, đường truyền tín hiệu PI3K/AKT/mTOR; do đó, các tế bào khối u kháng erlotinib nhạy cảm hơn với erlotinib [69] Nghiên cứu in vivo trên chuột cho thấy điều trị đơn lẻ với liều luteolin tăng dần và điều trị bằng luteolin và cisplatin cho thấy khối lượng khối u giảm đi đáng kể so với chỉ dùng cisplatin [70]

Hình 2.9 Cấu trúc của một số hợp chất được ghi nhận có khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2

Brusatol, một hợp chất chiết xuất từ Brucea javanica, cho thấy khả năng khắc phục tình trạng kháng thuốc là khả năng ức chế hoạt hóa Nrf2 trong tế bào ung thư [71] Nghiên cứu được công bố bởi Ren và cộng sự chỉ ra rằng brusasol ức chế cơ chế bảo vệ qua trung gian Nrf2 trong tế bào ung thư phổi [72] Nhiều nghiên cứu cũng báo cáo khả năng phục hồi hoạt động Nrf2 trong tế bào của nó, gây ra các đường truyền tín hiệu khác và gây ra tác dụng ức chế tăng trưởng hoặc gây chết tế bào [73, 74] Ngoài ra, brustatol còn thể hiện tác dụng hiệp đồng khi sử dụng cùng với thuốc chống ung thư Brusatol đã được phát hiện là có tác dụng nâng cao hiệu quả của gemcitabine bằng cách ức chế sự phát triển của tế bào và gây ra apoptosis trong tế bào ung thư tuyến tụy ở người so với các loại khác thông qua việc ức chế con đường Nrf2 khi kết hợp 1 μM brusatol và 20 μM gemcitabine trong 48 giờ điều trị [73] Tuy nhiên, khả năng ức chế Nrf2 của brustatol được báo cáo là không đặc hiệu, đồng thời nó còn làm làm giảm khả năng sống sót của tế bào đại tràng khỏe mạnh của con người [75, 76]

Các hợp chất tự nhiên khác như ochratoxin A [77] và trigonelline trong cà phê [78] cũng được báo cáo ngăn chặn sự tích lũy Nrf2 trong hạt nhân của tế bào Trong các tế bào bạch cầu, malabaricone-A, một chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật, ức chế hiệu quả hoạt động phiên mã Nrf2 được phản ánh bằng việc giảm mức protein

HO-1 và dẫn đến tích lũy ROS và tiếp theo là quá trình chết theo chương trình của tế bào [79] Ascorbic acid, một chất ức chế Nrf2, đã được báo cáo với khả năng khôi phục một phần độ nhạy cảm của tế bào với imatinib bằng cách điều chỉnh giảm Nrf2 [17], đồng thời tăng độ nhạy cảm của tế bào HeLa với cisplatin và adriamycin [18] Nhìn chung, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm chứng minh khả năng của hợp chất thiên nhiên trong việc hỗ trợ tình trạng kháng thuốc điều trị ung thư thông qua ức chế biểu hiện của Nrf2 Tuy nhiên tính chọn lọc của các hợp chất này đối với việc ức chế Nrf2 vẫn là một hạn chế để có thể ứng dụng trên lâm sàng hay thử nghiệm điều trị cho bệnh nhân ung thư vì một số hợp chất có khả năng gây ức chế Nrf2 cũng như gây độc trên cả tế bào khỏe mạnh

2.3 Mô hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.3.1 Một số mô hình sàng lọc trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu sàng lọc in vitro và in vivo đã được tiến hành nhằm tìm ra dược liệu hoặc hoạt chất có khả năng chống lại hiện tượng kháng thuốc trên tế bào ung thư thông qua ức chế một hoặc các tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình kháng thuốc

Gale và cộng sự (2016) đã tiến hành sàng lọc các hợp chất ức chế lysine demethylase 5A (KDM5A) – một histone lysine demethylase được báo cáo có biểu hiện quá mức đối với một số bệnh ung thư ở người bao gồm ung thư phổi, dạ dày, vú và gan KDM5A vai trò quan trọng trong các quá trình ung thư quan trọng bao gồm tạo khối u, di căn và dung nạp thuốc, khiến nó trở thành mục tiêu điều trị ung thư tiềm năng Nghiên cứu áp dụng phát quang đồng nhất (homogeneous luminescence-based assay) để tiến hành sàng lọc trên khoảng 9.000 phân tử, nhằm tìm ra ức chế KDM5A Kết quả đã xác định được có 34 hợp chất ức chế KDM5A in vitro với nồng độ ức chế

Li và cộng sự (2020) đã thực hiện nghiên cứu nhằm sàng lọc hoạt chất có khả năng ức chế enzyme uracil-DNA glycosylase (UDG), một loại enzyme gây ra tình trạng kháng thuốc điều trị ung thư 5-fluorouracil (5-FU) Nghiên cứu này đã sử quang phổ phát xạ theo thời gian (Time-resolved emission spectroscopy - một kỹ thuật đo sự

23 phát xạ ở những thời điểm riêng biệt trong quá trình phân rã huỳnh quang) để tiến hành sàng lọc trên 400 hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Kết quả tìm thấy 2 hợp chất là dẫn xuất indole giống như sản phẩm tự nhiên và thuốc kháng sinh nifuroxazide được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê chuẩn có khả năng ức chế đáng kể UDG trên mô hình sàng lọc Thử nghiệm phản ứng theo liều lượng cho thấy hai hợp chất này có khả năng ức chế đến 80% biểu hiện của UDG, đồng thời cũng cho thấy tác dụng hiệp đồng đầy hứa hẹn với 5-FU trong việc gây tổn thương DNA và làm suy yếu sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [81]

Song và cộng sự (2023) đã dựa trên quang phát quang theo thời gian (robust time- resolved photoluminescence) để xây dựng mô hình sàng lọc các chất có khả năng ức chế alkyladenine DNA glycosylase (AAG) AAG là một enzyme kích hoạt quá trình sửa chữa cắt bỏ base bằng cách cắt bỏ các tổn thương N3-methyladenine và N7- methylguanine do temozolomide (TMZ), một chất chống ung thư được sử dụng để điều trị u nguyên bào thần kinh đệm, thường là sau xạ trị và/hoặc phẫu thuật cắt bỏ, gây ra Tuy nhiên, ít nhất 50% bệnh nhân không đáp ứng với TMZ liên quan đến việc sửa chữa và/hoặc dung nạp các tổn thương DNA do TMZ gây ra AAG được báo cáo có biểu hiện quá mức trong các mô u nguyên bào thần kinh đệm so với các mô bình thường Kết quả nghiên cứu đã xác định được sunitinib là chất chất ức chế AAG tiềm năng và hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị u nguyên bào thần kinh đệm trong số 1440 loại thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt [82]

2.3.2 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu trong nước

Việt Nam là một đất nước có nguồn tài nguyên phong phú, nhiều loài đặc hữu quý hiếm nhờ vào vị trí địa lý thuận lợi và khí hậu được thiên nhiên ưu đãi Nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời và ghi nhận 5.117 loài thuộc 1.823 chi của 360 họ thực vật có giá trị làm thuốc, chữa bệnh, chăm sóc và bảo vệ sức khỏe [83] Nhiều loài dược liệu quý, hiếm, có công dụng chữa bệnh và giá trị kinh tế cao được ghi nhận như: sâm Ngọc linh, sâm Lai Châu, sâm vũ diệp, bảy lá một hoa, lan kim tuyến, tam thất hoang, bách hợp, thông đỏ, vàng đắng, hoàng liên ô rô, hoàng liên gai, thanh thiên quỳ, bình vôi, … [21] Một số loại dược liệu được ghi nhận với công dụng hỗ

ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Đối tượng

Danh mục dược liệu sử dụng trong nhiên cứu được thiết lập dựa trên cơ sở tìm kiếm và chọn lọc từ các bài thuốc dân gian có tác dụng điều trị ung thư gan hoặc các bệnh về gan, những ghi chép trong tài liệu thuốc sử dụng trong Đông Y và y học cổ truyền Kết quả thiết lập được danh mục 23 loài dược liệu để thực hiện sàng lọc hoạt tính ức chế gen Nrf2

Các dược liệu được thu hái vào tháng 12/2022, tại tỉnh An Giang và được định danh bởi TS Hoàng Việt và TS Võ Thanh Hóa Sau khi thu hái, dược liệu được sửa sạch, để ráo, sau đó cắt nhỏ và sấy ở 50 °C cho đến khi khô hoàn toàn (độ ẩm dưới 10%) Dược liệu sau khi khô được xay nhỏ và sàng qua rây 5 mm để thu được bột dược liệu Cao dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt, với tỷ lệ dược liệu : dung môi chiết là 1:16 (w/v, g/mL) Cụ thể, 25 g bột dược liệu được chiết ngấm kiệt với 400 mL MeOH trong 3 ngày, sau đó thu dịch lọc và tiến hành bay hơi dung môi áp suất giảm để thu cao chiết MeOH toàn phần tương ứng Cao chiết MeOH toàn phần được tiến hành thử nghiệm sàng lọc hoạt tính ức chế biểu hiện gen Nrf2 trên mô hình tế bào Huh7 đã xây dựng để chọn ra cao chiết MeOH tiềm năng và tiến hành chiết phân đoạn theo mô tả tại Hình 3.2 Các cao chiết MeOH toàn phần được tiến hành phân tán trong nước cất, sau đó chiết xuất phân đoạn lần lượt với n-hexane

(Hex), cloroform (CHCl3), ethyl acetat (EA), n-butanol (BuOH) Phần dung dịch sau khi chiết với BuOH được gọi là phần chiết xuất nước còn lại (rDW)

Hình 3.2 Sơ đồ chiết suất phân đoạn

Tế bào HEK293T, tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Huh7 và HaCaT được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc (Drug Development and Value Creation Research Center, Đại học Y Cao Hùng, Đài Loan).

Thiết bị

3.3.1 Synergy HT Multi-Mode Reader

Synergy HT Multi-Mode Reader là thiết bị đo quang được thiết kế với khả năng đo độ hấp thụ, huỳnh quang và phát quang Thiết kế nhỏ gọn và giá đỡ đĩa thân thiện với robot khiến nó trở thành nền tảng lý tưởng cho các thí nghiệm yêu cầu thông lượng lớn

Hình 3.3 Thiết bị Synergy HT Multi-Mode Reader Nguồn: Agient

Synergy HT sử dụng thiết kế quang học kép, gồm hệ thống đèn nháy đơn sắc/xenon với đầu dò diode silicon để hấp thụ và đèn halogen vonfram với bộ lọc chặn nhiễu và đầu dò ống nhân quang để phát huỳnh quang Synergy HT Multi-Mode Reader có thể được tùy chỉnh bằng cách sử dụng các bộ lọc và băng thông khác nhau, với các bộ lọc được thiết kế đặc biệt để ngăn chặn thất thoát ánh sáng từ sự kích thích đến các bước sóng phát xạ Phạm vi bước sóng hấp thụ có thể đo nằm trong khoảng 200-999 nm, có thể điều chỉnh theo bước tăng 1 nm Đầu đọc của thiết bị được trang bị ống nhân quang có độ nhiễu thấp với chế độ photon kỹ thuật số để phát hiện tối ưu ở chế độ phát quang 300-650 nm khi kích thích và 300-700 nm khi phát xạ Khi thực hiện xác định tín hiệu huỳnh quang, thiết bị sử dụng đèn halogen thạch anh vonfram với các bộ lọc quang học để xác định bước sóng cụ thể kết hợp với máy dò ống nhân quang Ở chế độ hấp thụ, đèn flash xenon với bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc được sử dụng để người dung có thể cài đặt bước song phù hợp Thiết bị cũng được tích hợp hệ thống kiểm soát nhiệt độ để phân tích động học Đầu đọc vi bản này được điều khiển bằng máy tính với phần mềm Gen5, giúp kiểm soát và phân tích dữ liệu được thu thập một cách nhanh chóng và hiệu quả

Vị trí của cụm đèn huỳnh quang và bộ lọc ánh sáng kích thích, ánh sáng bức xạ của thiết bị được mô tả tại hình 3.4 Bộ lọc kích thích chọn dải ánh sáng hẹp để chiếu qua mẫu, trong khi bộ lọc phát xạ chọn dải ảnh sáng có tín hiệu huỳnh quang tối đa để đo bằng ống nhân quang

Hình 3.4 Vị trí cụm đèn huỳnh quang và bộ lọc ánh sáng [88]

Hình 3.5 Bộ lọc ánh sáng phát xạ

Ngoài ra, thiết bị còn được trang bị mô đun phun thuốc thử, nhằm hỗ trợ các thí nghiệm yêu cầu bổ sung thuốc thử và đọc kết quả cùng lúc như phản ứng luciferase Bên trong thiếu bị Synergy™ HT, hai ống Teflon vận chuyển thuốc thử từ các cổng ống ở phía sau thiết bị đến hai kim phun Cả hai kim phun đều được đặt ngay phía trên đầu dò quang huỳnh quang phía dưới nhằm mục đích xác định tức thì tín hiệu quang học của phản ứng khi có mặt thuốc thử

Hình 3.6 Mô-đun phun thuốc thử Gồm: 1) Bơm hút thuốc thử 2) Ống vận chuyển thuốc thử đến đầu kim phun 3) Van 3 chiều vận chuyển dòng thuốc thử từ ống đầu vào sang đầu ra 4) Các ống đầu ra vận chuyển thuốc thử từ ống tiêm vào thiết bị

3.3.2 Đèn soi sắc ký bản mỏng

Nghiên cứu sử dụng đèn soi WFH-203B, xuất sứ Trung Quốc Thiết bị được thiết kế bao gồm một đèn có 2 bước sóng (254 và 365 nm) nằm bên trong buồng tối, được sử dụng để kiểm tra và nhận biết một số nhóm chức có khả năng phát quang hoặc sản phẩm từ phản ứng hóa học của một số nhóm hợp chất với thuốc thử để nhận biết chúng

Hình 3.7 Đèn soi sắc ký bản mỏng WFH-203B

3.3.3 Một số thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu

Tủ an toàn sinh học (Sanxiong Technology, Đài Loan), Máy cô quay chân không RE300 (Stuart, Anh), Cân phân tích (Ohaus, Mỹ), Tủ ủ NuAire CO₂ (NuAire, Mỹ).

Hóa chất

Môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM), Huyết thanh nhau thai bò (FBS), Streptomycin, Acid amin không thiết yếu, L-glutamin, Thuốc thử TRIzol Puromycin, Hygromycin, Tris, Sodium Chloride, EDTA, NP-40, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), chất ức chế protease và phosphatase, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Alamarblue được cung cấp bởi Thermo Fisher Scientific, Mỹ; anti-NRF2 (GTX103322, GeneTex, Mỹ), anti-GAPDH (60004-1g, Proteintech, Mỹ), anti- KEAP1 (10503-2-AP, Proteintech, Mỹ), anti-lamin B1 (66095-1-Ig, Proteintech, Mỹ); KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit (KAPA Biosystems, Mỹ); Luciferase Assay Substrate, Luciferase Assay Buffer, Cell Culture Lysis 5X Thuốc thử (Promega, Mỹ); Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); Thuốc thử TurboFect (Fermentas, Mỹ); Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Mỹ); TOOLs Easy Fast RT Kit (TOOLs Biotechnology, Đài Loan); Methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-Butanol được cung cấp bởi Xi Long Scientific, Trung Quốc

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Nuôi cấy tế bào và cấy truyền DNA

Tế bào HEK293T và Huh7 được nuôi cấy trong môi trường môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM) với 10% huyết thanh nhau thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt (FBS), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), L-glutamine (2 mM), và acid amin không thiết yếu (0,1 mM) theo mô tả của Li và cộng sự [89] Tế bào HaCaT được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) Tế bào Lentivirus để chuyển nạp được nuôi cấy trong DMEM và được bổ sung hygromycin (100 μg/mL) hoặc hỗn hợp gồm puromycin (1 μg/mL) và hygromycin (100 μg/mL) Thuốc thử TurboFect (Fermentas, Mỹ) đã được sử dụng để truyền DNA plasmid theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.5.2 Mô hình xác định hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7

3.5.2.1 Xác đinh mức độ biểu hiện mRNA của các gen mục tiêu Nrf2 bằng Real- time PCR

RNA được phân lập bằng cách sử dụng thuốc thử TRIzol và được phiên mã ngược thành cDNA bằng TOOLs Easy Fast RT Kit qPCR được thực hiện trên ABI StepOne Plus System (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) bằng KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit Mức mRNA được chuẩn hóa với mức mRNA glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Các đoạn mồi được sử dụng được trình bày trong Bảng 3.1, bao gồm các yếu tố liên quan đến hoạt động chống oxy hóa và phản ứng viêm ở tế bào

Bảng 3.1 Các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu Đoạn mồi Dạng mồi Trình tự đoạn mồi

Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit

ATP binding cassette subfamily C member 2

3.5.2.2 Immunoblot để xác định protein Nrf2

Tế bào trước khi tiến hành thí nghiệm được rửa với dung dịch đệm PBS, sau đó sử dụng dung dịch đệm ly giải RIPA (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS) để thu hoạch tế bào và bổ sung chất ức chế protease và phosphatase (chứa 1 mM PMSF, 10 μg/mL Leupeptin, 50 μg/mL TLCK, 50 μg/mL TPCK, 1 μg/mL Aprotinin, 1 mM NaF, 5 mM NaPPi và 10 mM Na₃VO₄) Tế bào sau khi ly giải được ly tâm lạnh ở 4 °C với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút Nồng độ protein được xác định bằng Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, Mỹ) Các kháng thể được sử dụng bao gồm: anti-NRF2 (GTX103322), anti-GAPDH (60004-1g), anti-KEAP1 (10503-2-AP), và anti-lamin B1 (66095-1-Ig)

3.5.2.3 Thiết kế plasmid pGL4.37 [luc2P/ARE/Hygro] (Promega Corporation, Mỹ) được cắt giới hạn bằng enzym SspI và SalI để thu được đoạn Nrf2 reporter 4kB pLKO.1-shLuc plasmid (clone#TRCN0000072249) cung cấp bởi National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Đài Loan) được cắt giới hạn bằng enzyme ClaI và KpnI để tạo đoạn khung chính chứa các yếu tố cần thiết cho quá trình chuyển nạp vào lentivirus Quick Blunting Kit (New England Biolabs, Beverly MA, Mỹ) được sử dụng để “cắt” phần thừa ra không tương thích ở đầu 5′ hoặc 3′ trong hai đoạn này thành DNA đầu cùn theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi ghép 2 đoạn DNA với nhau, thiết lập bản đồ gen và xác định hướng chèn của plasmid bằng enzyme cắt giới hạn SspI và EcoRV Cấu trúc của plasmid thu được là pLV-ARE-Luc_R Hai plasmid mã hóa các shRNA khác nhau của Nrf2 bao gồm: shNRF2-1 (5'AGTTTGGGAGGAGCTATTATC, clone #: TRCN0000007555) và shNRF2-2 (5'GCTCCTACTGTGATGTGAAAT, clone #: TRCN0000273494); plasmid kiểm soát RNAi (pLKO.1-shSCR); plasmid đóng gói (pCMV-DR8.91); và plasmid vỏ (pMD.G) từ National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Đài Loan)

3.5.2.4 Tạo dòng virus chứa plasmid Để tạo lentivirus, tế bào HEK293T được đồng chuyển nạp với các plasmid đã thiết kế trước đó sử dụng thuốc thử TurboFect theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các hạt nổi có chứa lentivirus được thu hoạch theo quy trình đã được công bố (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/) [90] Để tạo ra các dòng tế bào ổn định, tế bào Huh7 được nuôi cấy trong môi trường chứa lentivirus và polybrene (8 μg/mL) trong

24 giờ Các tế bào ổn định sau khi chuyển nạp plasmid được chọn bằng cách nuôi cấy trong môi trường chứa kháng sinh trong 48 giờ

3.5.3 Xác định khả năng sống của tế bào và hoạt động tương đối của Nrf2

Khả năng sống sót của tế bào Huh7 được xác định bằng xét nghiệm alamarblue theo hướng dẫn của nhà sản xuất [91] Tế bào Huh7 được gieo trong đĩa 96 giếng (10⁴ tế bào/giếng), sau đú được xử lý với cao chiết nồng độ 100 àg/mL và ủ 18 giờ ở nhiệt độ 37 °C và 5% CO₂ Sau 18 giờ, cao chiết và môi trường được loại bỏ, sau đó thêm vào mỗi giếng 100 àL mụi trường nuụi cấy mới và 10 àL Alamarblue (1 mg/mL) sau đó tiếp tục ủ trong 4 giờ Độ huỳnh quang của resazurin trong alamarblue bị khử được đo ở lớp dung dịch trên của bề mặt nuôi cấy với bước sóng của ánh sáng kích thích/phát xạ là 560/590 nm, sử dụng Synergy HT Multi-Mode Reader (BioTek, Winooski, VT, Mỹ) Khả năng sống của tế bào được xác định theo công thức:

% tế bào sống sót = F giếng thí nghiệm

Trong đó: F là độ phát huỳnh quang resazurin trong Alamarblue

Hoạt động tương đối của Nrf2 được xác định theo công bố của Wu và cộng sự có hiệu chỉnh [92] Tế bào Huh7 được ly giải bằng dung dịch đệm ly giải nhằm thu được protein luciferase và đo hoạt động luciferase theo giao thức của nhà sản xuất (Promega Corporation, Madison, WI, Mỹ) Hoạt động tương đối của Nrf2 trên tế bào Huh7 được xác định bằng cách xác định độ phát huỳnh quang của phản ứng của protein luciferase với luciferin Giếng đối chứng âm DMSO 1% được quy ước là Nrf2 cú hoạt tớnh 100% Luteolin nồng độ 50 àM được sử dụng làm đối chứng dương cho

37 thí nghiệm sàng lọc hoạt tính của Nrf2 trên dòng tế bào Huh7 Hoạt động của Nrf2 của giếng thí nghiệm được xác định như sau:

% hoạt động tương đối của Nrf2 = F giếng thí nghiệm /TB giếng thí nghiệm

F DMSO /TB DMSO x 100% Trong đó: F: độ phát huỳnh quang của phản ứng của protein luciferase với luciferin (lumen)

TB: số tế bào sống sót, được xác định thông qua độ phát huỳnh quang của resazurin trong alamarblue (tế bào)

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD

3.5.4 Sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên dòng tế bào Huh7

44 cao chiết MeOH toàn phần từ các bộ phận khác nhau của 24 loài dược liệu được tiến hành sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 dựa trên mô hình sàng lọc đã xây dựng Phương pháp thực hiện tương tự quy trình kiểm tra khả năng sống của tế bào và hoạt động tương đối của Nrf2 đã đề cập Nồng độ các cao chiết MeOH được khảo sát là 100 μg/mL Các cao chiết MeOH có khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 được tiến hành chiết suất phân đoạn, sau đó tiếp tục được tiến hành sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 và kiểm tra khả năng gây độc trên dòng tế bào HaCaT

3.5.5 Xác định nồng độ gây độc 50% tế bào và nồng độ ức chế 50% hoạt động của

Nrf2 trên tế bào Huh7

Các cao chiết phân đoạn tiềm năng được tiến hành xác định nồng độ gây ức chế 50% hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 và khả năng gây độc 50% tế bào Huh7 Để xác định nồng độ gây độc 50% tế bào Huh7 (CC 50 ) , tế bào Huh7 được gieo vào các giếng trong đĩa 96 giếng (3.000 tế bào/giếng) qua đêm Sau đó, tế bào được xử lý với một dãy nồng độ tương ứng cao chiết pha loãng trong DMSO trong 72 giờ, với nhiệt độ nuôi cấy là 37 °C và 5% CO2 Sau đó, môi trường nuôi cấy và dịch chiết dược liệu được loại bỏ, mỗi giếng được thờm vào 100 àL mụi trường nuụi cấy mới và 10 àL

Alamarblue (1 mg/mL) sau đó tiếp tục ủ trong 4 giờ Độ huỳnh quang của resazurin trong alamarblue bị khử được đo ở lớp dung dịch trên của bề mặt nuôi cấy bằng cách sử dụng Synergy HT Multi-Mode Reader (BioTek, Winooski, VT, Mỹ) với bước sóng của ánh sáng kích thích/phát xạ là 560/590 nm Phần trăm tế bào sống sót của tế bào theo công thức:

Trong đó: F: độ phát huỳnh quang resazurin trong Alamarblue

Giá trị CC50 được xác định dựa trên đường cong hồi quy phi tuyến tính (non-linear regression) giữa log(nồng độ) và phần trăm tế bào sống sót [93] Để xác định nồng độ ức chế 50% (IC 50 ) biểu hiện Nrf2 trên tế bào Huh7 , quy trình được thực hiện tương tự với quy trình sàng lọc khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên dòng tế bào Huh7 Trong đó, tế bào sẽ được xử lý với một dãy nồng độ cao chiết pha loãng trong DMSO (từ 6,25 – 500,0 μg/mL) để xác định quan hệ giữa liều và biểu hiện của Nrf2 Giá trị IC50 được xác định dựa trên đường cong hồi quy phi tuyến giữa log(nồng độ) và hoạt động tương đối của Nrf2 [93]

3.5.6 Định tính thành phần hóa học chính trong cao chiết dược liệu

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) được thực hiện để tiến hành định tính các nhóm hợp chất chỉnh có trong các cao chiết phân đoạn Quy cách thực hiện SKLM được quy định tại Phụ lục 5.4, dược điển Việt Nam V (2018) [94] Các cao chiết phân đoạn tùy theo nhóm chất khảo sát mà được pha loãng tương ứng trong MeOH hoặc CHCl3 Khoảng 5 μL dịch chiết pha loãng được chấm lên bề mặt bản mỏng silica gel

60 (Merck, Đức) Bản mỏng sau khi được phun mẫu được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó được đặt trong bình hai đáy kích thước 10 × 10 cm chứa dung môi khai triển cho phép các hoạt chất trong mẫu di chuyển và phân tách trên bản mỏng tuỳ theo độ phân cực Hệ dung môi và thuốc thử sử dụng được trình bày ở Bảng 3.2 Các bản sắc ký đều được đo ở 4 điều kiện bao gồm: ở ánh sáng thường, ở các bước sóng lần lượt là 254 nm và 365 nm, cũng như đo sau khi được nhúng thuốc thử và sấy khô

39 bản mỏng tùy vào loại hợp chất khảo sát Các thông số về hình dạng, màu sắc, số lượng vết và hệ số di chuyển Rf được ghi nhận

Rf được xác định dựa trên các vệt có xuất hiện phản ứng màu với thuốc thử đặc hiệu tương ứng với nhóm chất khảo sát và được tính bằng công thức:

Rf = a/b Trong đó a là quãng đường vết chạy trên bản mỏng (cm); b là quãng đường dung môi chạy trên bản mỏng (cm)

Bảng 3.2 Các hệ dung môi và thuốc thử

Dung môi pha dịch chiết

Hệ dung môi khai triển

(tỉ lệ) Thuốc thử Phản ứng màu

Alkaloid CHCl3 Toluene : EA : Amonia solution (75 : 24 : 1)

NH4OH Hồng → nâu đỏ

Phenolic MeOH CHCl3 : EA : MeOH

Kết quả xác định tế bào sống sót và độ biểu hiện của Nrf2 được thu thập bằng phần mềm Gen5 version 2.04 Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và GraphPad Prism 9.5.0 Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

loài dược liệu đến biểu hiện của Nrf2

Kết quả khảo sát tác dụng của cao chiết phân đoạn tiềm năng đến biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7

hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7

Trên cơ sở kết quả khảo sát 44 cao chiết MeOH từ 23 loại dược liệu khác nhau, nghiên cứu chọn ra một số cao chiết MeOH tiềm năng để chiết xuất phân đoạn, bao gồm: Lá

An xoa (LHH), Rễ Lá lốt (RPS), thân rễ Gừng gió (RZZ), thân Núc nác (SOI) và thân Chó đẻ thân xanh (SPA) Dung môi được sử dụng cho quá trình phân đoạn bao gồm: Hex, CHCl3, EA, BuOH và rDW Các cao chiết phân đoạn được tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng ức chế biểu hiện Nrf2 trên tế bào Huh7 cũng như khả năng gây độc trên tế bào sừng HaCaT Kết quả khảo sát được thể hiện tại Bảng 4.2

Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc tác dụng của cao chiết các phân đoạn đối với biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 và khả năng gây độc tế bào HaCaT

% ức chế hoạt động tương đối của Nrf2

% ức chế hoạt động tương đối của Nrf2

% ức chế hoạt động tương đối của Nrf2

27 LuT (50 àM) c 73,4 ± 0,8 89,4 ± 0,7 - a Huh7, tế bào ung thư biểu mô tế bào gan b HaCaT, tế bào sừng ở người c Luteolin, được sử dụng làm đối chứng dương cho thí nghiệm xác định hoạt động của Nrf2, nồng độ cuối 50àM

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SD

Chú thích: LHH: Lá An xoa; RPS: Rễ Lá lốt; RZZ: thân rễ Gừng gió; SOI: thân

Núc nác; SPA: thân Chó đẻ thân xanh; Hex: n-Hexane; CHCl3: Cloroform; EA: Ethyl acetat; BuOH: n-Butanol; rDW: phần cao chiết nước còn lại sau khi phân đoạn

Kết quả sàng lọc cho thấy 9/25 cao chiết phân đoạn khảo sát thể hiện khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 Đáng chú ý, cao chiết phân đoạn Hex từ rễ Gừng gió cho thấy khả năng ức chế hơn 97% hoạt động của Nrf2 trên tế bào Huh7 và gây độc hơn 57% tế bào Huh7 Bên cạnh đó, cao chiết phân đoạn Hex từ rễ Gừng gió không thể hiện độc tính trên tế bào sừng HaCaT, cho thấy tác dụng chọn lọc của các hợp chất trong phân đoạn Hex rễ Gừng gió tác động trên tế bào ung thư Huh7 Cao chiết phân đoạn CHCl3 từ rễ Gừng gió và thân Núc nác cũng cho kết quả tương đồng, với khả năng ức chế hơn 80% biểu hiện của Nrf2 và gây độc trên 45% tế bào ung thư Huh7, trong khi phần trăm tế bào HaCaT sống sót là hơn 80% Các cao chiết phân đoạn Hex và CHCl3 từ An xoa, phân đoạn Hex và EA từ rễ Lá lốt, phân đoạn Hex và

EA từ thân Chó đẻ thân xanh cũng thể hiện khả năng ức chế trung bình, với phần trăm hoạt động của Nrf2 trong khoảng 38,6 ± 8,1 đến 69,7 ± 2,3 Tất cả các cao chiết phân

49 đoạn được thử nghiệm không thể hiện khả năng gây độc trên tế bào HaCaT với tỷ lệ tế bào sống sót lên đến hơn 80%, cho thấy khả năng tác dụng chọn lọc của các cao chiết trên tế bào ung thư Huh7 Kết quả này cho thấy tiềm năng của 8/25 cao chiết phân đoạn trong hỗ trợ điều trị kháng thuốc ung thư thông qua ức chế biểu hiện của Nrf2 mà không gây độc trên tế bào bình thường.

Kết quả xác định nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 và nồng độ gây độc 50% tế bào Huh7

Dựa trên kết quả khảo sát biểu hiện của Nrf2 từ cao chiết phân đoạn, 9 cao chiết tiềm năng được tiếp tục thí nghiệm để xác định nồng độ ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 (IC50) và nồng độ gây độc 50% tế bào (CC50) Huh7 Giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ khả năng ức chế biểu hiện hoạt động Nrf2 của cao chiết càng mạnh, CC50 càng thấp chứng tỏ khả năng gây độc càng mạnh của cao chiết đối với tế bào Huh7 Kết quả được trình bày ở Hình 4.2 và Bảng 4.3

Hình 4.2 Kết quả xác định IC50 và CC50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng

Cao chiết phân đoạn Hex từ lá An xoa và EA của rễ Lá lốt có giá trị IC50 lần lượt là 42,22 ± 2,10 và 58,29 ± 3,79 àg/mL Trong khi CC50 lớn hơn gấp nhiều lần so với

IC50, điều này cho thấy tiềm năng của hai mẫu cao chiết này trong nghiên cứu hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của Nrf2 mà không gây độc tế bào Cao chiết Hex từ thân rễ Gừng gió cũng thể hiện khả năng ức chế vượt trội, với giá trị IC50 là 49,16 ± 0,56 àg/mL Tuy nhiờn khả năng gõy độc tế bào Huh7 của cao chiết này lại vượt trội hơn, thể hiện qua giỏ trị CC50 là 15,37 ± 0,56 àg/mL, nhỏ hơn 3 lần so với giỏ trị

IC50 Kết quả này cho thấy tiềm năng của cao chiết phân đoạn Hex từ thân rễ Gừng gió cho nghiên cứu hợp chất hỗ trợ điều trị ung thư từ thiên nhiên đồng thời hỗ trợ tình trạng kháng thuốc thông qua việc làm giảm hoạt động của Nrf2 Cao chiết phân đoạn CHCl3 từ thân rễ Gừng gió, phân đoạn CHCl3 từ thân Núc nác, và phân đoạn

EA từ thân Chó đẻ thân xanh cũng cho kết quả tương tự, với khả năng gây độc tế bào ung thư Huh7 nổi trội hơn so với khả năng là ức chế hoạt động của Nrf2 Kết quả này có thể gợi ý khả năng phát triển thuốc điều trị ung thư nhắm đích từ cao chiết phân đoạn hoặc hợp chất được phân lập từ chúng, với khả năng tác động trực tiếp gây độc lên tế bào ung thư Huh7

Bảng 4.3 Kết quả xác định IC50 và CC50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng

STT Mẫu IC 50 a (àg/mL) CC 50 b (àg/mL)

STT Mẫu IC 50 a (àg/mL) CC 50 b (àg/mL)

9 SPA-EA 170,90 ± 11,32 62,10 ± 1,71 a: Nồng độ tối thiểu ức chế 50% biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 Giá trị này được xác định dược trên đường cong phi tuyến giữa log(nồng độ) và phần trăm biểu hiện của Nrf2 tương ứng b: Nồng độ tối gây độc 50% tế bào Huh7 Giá trị này được xác định dược trên đường cong phi tuyến giữa log(nồng độ) và phần trăm tế bào sống sót tương ứng Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ±

Kết quả định tính các hợp chất chính có trong các cao chiết phân đoạn

Kết quả định tính 5 cao chiết toàn phần và 25 cao chiết phân đoạn tương ứng từ Lá

An xoa (LHH), Rễ Lá lốt (RPS), thân rễ gừng gió (RZZ), thân Núc nác (SOI) và thân Chó đẻ thân xanh (SPA) được thể hiện tại Bảng 4.4 và Phụ lục PL-03

Bảng 4.4 Tổng hợp kết quả khảo sát thành phần chính có trong các cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn tiềm năng

Alkaloid Anthranoid Flavonoid Phenolic Sterol

Alkaloid Anthranoid Flavonoid Phenolic Sterol

Alkaloid Anthranoid Flavonoid Phenolic Sterol

Alkaloid Anthranoid Flavonoid Phenolic Sterol

- : Không ghi nhận vết trên bản mỏng

+ : ghi nhận vết trên bản mỏng nhưng không xác định được Rf

(+): ghi nhận vết trên bản mỏng, số lượng dấu + quy định số vết trên bản mỏng. Kết quả từ SKLM kết hợp với kết quả sàng lọc cao chiết phân đoạn có khả năng ức chế biểu hiện Nrf2 trên tế bào Huh7 cho thấy đa số cao chiết phân đoạn thể hiện khả năng ức chế mạnh hoạt động của Nrf2 đều có điểm chung là có chứa hợp chất nhóm sterol, alkaloid và phenolics Trong đó, nhóm sterol là là thành phần chính trong các mẫu cao chiết phân đoạn Hex và CHCl3 từ lá An xoa và phân đoạn EA ở rễ Lá lốt Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận sterol thực vật có thể tác động lên tế bào ung thư theo nhiều con đường khác nhau [108] bao gồm cả điều hòa PI3K, MAPK và điều hòa Nrf2 gây tăng nhạy cảm tế bào ung thư với cisplatin [109] Với khả năng ức chế mạnh biểu hiện của Nrf2 mà không gây độc tế bào thường, kết quả này gợi ý tiềm năng nhóm sterol thực vật trong hỗ trợ điều trị ung thư kháng thuốc thông qua con đường ức chế biểu hiện của Nrf2, đồng thời hạn chế tác dụng không mong muốn lên tế bào thường Ở các phân đoạn khác như Hex ở rễ Lá lốt, Hex từ thân rễ Gừng gió, và CHCl3 từ thân rễ Gừng gió, ngoài nhóm sterol còn có sự hiện diện của các alkaloid và phenolic Phenolic và alkaloid là một trong những nhóm hợp chất đầy tiềm năng với khả năng

55 làm tái nhạy cảm tế bào ung thư với thuốc hóa trị hoặc đảo ngược tình kháng kháng thuốc ung thư thông qua con đường vận chuyển ABC (ATP-Binding Cassette) trong tế bào ung thư [110] Trong những năm gần đây, alkaloid được biết đến như một nhân tố đầy hứa hẹn trong việc ngăn ngừa tình trạng kháng thuốc hóa trị thông qua ức chế biểu hiện của P-glycoprotein [111, 112] – một protein tạo ra tham gia vào quá trình ngăn chặn sự tích lũy thuốc trong tế bào, qua đó tránh được tác dụng gây độc tế bào hoặc gây chết tế bào của thuốc hóa trị Sự hiện diện đồng thời của nhóm sterol, alkaloid và phenolic trong cao chiết phân đoạn Hex và CHCl3 từ thân rễ Gừng gió và phân đoạn CHCl3 từ thân Núc nác thể hiện khả năng ức chế hơn 80% biểu hiện của Nrf2 Kết quả này có thể gợi ý khả năng tác dụng hiệp đồng của sterol, alkaloid và phenolic có trong thần rễ Gừng gió và thân Núc nác Ngoài ra, phân đoạn Hex và CHCl3 được xem là khá phù hợp để tiến hành chiết xuất các hợp chất có khả năng gây độc trên tế bào ung thư Huh7

Ngày đăng: 22/05/2024, 11:31

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hình 2.1. Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31]. - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.1. Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31] (Trang 19)
Hình 2.2. Phản ứng của luciferase và luciferin - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.2. Phản ứng của luciferase và luciferin (Trang 26)
Hình 2.3. Xét nghiệm định lượng bằng gen chỉ thị luciferase dựa trên tương tác của  enzyme luciferase với cơ chất phát quang luciferin, giải phóng ánh sáng thông qua - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.3. Xét nghiệm định lượng bằng gen chỉ thị luciferase dựa trên tương tác của enzyme luciferase với cơ chất phát quang luciferin, giải phóng ánh sáng thông qua (Trang 27)
Hình 2.4. Cấu trúc hóa học của resazurin và resorufin - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.4. Cấu trúc hóa học của resazurin và resorufin (Trang 28)
Hình 2.5. Phổ phát xạ huỳnh quang của resazurin (màu xanh) và resorufin (màu đỏ)  [44] - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.5. Phổ phát xạ huỳnh quang của resazurin (màu xanh) và resorufin (màu đỏ) [44] (Trang 29)
Hình 2.6. Minh họa hiện tượng truyền cộng hưởng huỳnh quang - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.6. Minh họa hiện tượng truyền cộng hưởng huỳnh quang (Trang 30)
Hình 2.7. Cấu trúc miền Nrf2 - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.7. Cấu trúc miền Nrf2 (Trang 32)
Hình 2.8. Con đường điều hòa Nrf2 và yếu tố phản ứng oxi hóa trong điều kiện môi  trường bình thường và stress oxy hóa - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.8. Con đường điều hòa Nrf2 và yếu tố phản ứng oxi hóa trong điều kiện môi trường bình thường và stress oxy hóa (Trang 33)
Hình 2.9. Cấu trúc của một số hợp chất được ghi nhận có khả năng  ức chế biểu hiện của Nrf2 - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 2.9. Cấu trúc của một số hợp chất được ghi nhận có khả năng ức chế biểu hiện của Nrf2 (Trang 35)
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu (Trang 40)
Hình 3.2. Sơ đồ chiết suất phân đoạn - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.2. Sơ đồ chiết suất phân đoạn (Trang 42)
Hình 3.3. Thiết bị Synergy HT Multi-Mode Reader. Nguồn: Agient. - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.3. Thiết bị Synergy HT Multi-Mode Reader. Nguồn: Agient (Trang 43)
Hình 3.5. Bộ lọc ánh sáng phát xạ - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.5. Bộ lọc ánh sáng phát xạ (Trang 44)
Hình 3.4. Vị trí cụm đèn huỳnh quang và bộ lọc ánh sáng [88] - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.4. Vị trí cụm đèn huỳnh quang và bộ lọc ánh sáng [88] (Trang 44)
Hình 3.6. Mô-đun phun thuốc thử. Gồm: 1) Bơm hút thuốc thử. 2) Ống vận chuyển  thuốc thử đến đầu kim phun - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.6. Mô-đun phun thuốc thử. Gồm: 1) Bơm hút thuốc thử. 2) Ống vận chuyển thuốc thử đến đầu kim phun (Trang 45)
Hình 3.7. Đèn soi sắc ký bản mỏng WFH-203B - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 3.7. Đèn soi sắc ký bản mỏng WFH-203B (Trang 46)
Bảng 3.2. Các hệ dung môi và thuốc thử - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Bảng 3.2. Các hệ dung môi và thuốc thử (Trang 53)
Bảng 4.1. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 của  44 cao chiết MeOH toàn phần - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Bảng 4.1. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 của 44 cao chiết MeOH toàn phần (Trang 55)
Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc tác dụng của cao chiết các phân đoạn đối với biểu hiện  của Nrf2 trên tế bào Huh7 và khả năng gây độc tế bào HaCaT - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc tác dụng của cao chiết các phân đoạn đối với biểu hiện của Nrf2 trên tế bào Huh7 và khả năng gây độc tế bào HaCaT (Trang 60)
Hình 4.2. Kết quả xác định IC 50  và CC 50  của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Hình 4.2. Kết quả xác định IC 50 và CC 50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng (Trang 63)
Bảng 4.3. Kết quả xác định IC 50  và CC 50  của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Bảng 4.3. Kết quả xác định IC 50 và CC 50 của một số cao chiết phân đoạn tiềm năng (Trang 64)
Bảng 4.4. Tổng hợp kết quả khảo sát thành phần chính có trong các cao chiết toàn  phần và cao chiết phân đoạn tiềm năng - ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế nri2 ở tế bào ung thư gan huh7
Bảng 4.4. Tổng hợp kết quả khảo sát thành phần chính có trong các cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn tiềm năng (Trang 65)

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w