đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và chữa bệnh héo xanh trên cây cà chua

TÓM TẮT LUẬN VĂN Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể đơn lẻ BHDTSo9 lên khả năng phòng và trị bệnh héo xanh trên cây cà chua trong vườn ư

-PHẠM HƯƠNG GIANG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LIỆU PHÁP THỰC KHUẨN THỂ LÊN KHẢ NĂNG PHÒNG VÀ CHỮA BỆNH HÉO XANH TRÊN CÂY CÀ CHUA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Thụy Vy

Cán bộ chấm nhận xét 3: PGS.TS Lê Phi Nga

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM

Ngày 23 tháng 01 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang

3 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thụy Vy 4 Phản biện 2: PGS.TS Lê Phi Nga

Xác nhận của Chủ tích Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI:

Đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và chữa bệnh héo xanh trên cây cà chua (Biocontrol potential of a lytic bacteriophage against bacterial wilt of tomato)

II.NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Khảo sát hoạt tính ly giải của thực khuẩn thể trong môi trường dinh dưỡng

in vitro.

2 Phân tích genome thực khuẩn thể và đánh giá tính an toàn.

3 Khảo sát hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh héo

xanh trên cây cà chua do vi khuẩn R solanacearum gây ra ở quy mô vườn

III.NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

IV.NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 11/06/2023

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN

PGS.TS HOÀNG ANH HOÀNG

TP.HCM, ngày 10 tháng 01 năm 2024

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ, tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể thầy cô trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh; đặc biệt là các thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào Thực vật, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kĩ thuật Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới hai cán bộ hướng dẫn của em, PGS TS Lê Thị Thủy Tiên và PGS.TS Hoàng Anh Hoàng, thầy cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dẫn dắt và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn Thầy cô đã truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm và kiến thức bổ ích, luôn quan tâm đến trạng thái, tiến trình thực hiện và đưa ra nhiều góp ý kịp thời hỗ trợ tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình thí nghiệm để luận văn được hoàn thành đúng với định hướng ban đầu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình, bạn bè, những người đã luôn đồng hành, động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và xuyên suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin được gửi lời chúc sức khỏe lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy cô, anh chị, các bạn đã cùng đồng hành trong suốt khoảng thời gian này

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 01 năm 2024

Học viên thực hiện

Phạm Hương Giang

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể đơn lẻ BHDTSo9 lên khả năng phòng và trị bệnh héo xanh trên cây cà

chua trong vườn ươm Trong điều kiện in vitro, BHDTSo9 xâm nhiễm, ly giải tế

bào vi khuẩn PS003 nhanh chóng chỉ trong vài giờ đầu và duy trì mật độ vi khuẩn ở mức thấp trong 47 – 48 giờ tiếp theo Vi khuẩn kháng thực khuẩn thể xuất hiện sau 52 giờ Bộ gene BHDTSo9 có kích thước 41.296 bp, gồm 46 ORF (trong đó có 28 ORF mã hóa cho protein chức năng) Kết quả dự đoán mối quan hệ phát sinh loài cho thấy BHDTSo9 tương đồng nhất với thực khuẩn thể RsoP1IDN Đồng thời bộ gene của BHDTSo9 không mang gene kháng kháng sinh và yếu tố độc lực Kết quả thử nghiệm ngoài vườn cho thấy khả năng phòng và trị bệnh của liệu pháp thực khuẩn thể không hiệu quả với cây 20 ngày tuổi Ở giai đoạn 40 ngày tuổi, BHDTSo9 cho hiệu quả phòng bệnh tốt hơn trị bệnh Cây cà chua 60 ngày tuổi có/không xử lý với thực khuẩn thể sau 14 ngày quan sát đều ghi nhận tỷ lệ bệnh thấp hơn 50%

ABTRACT

The purpose of the study was to assess the efficacy of BHDTSo9 single phage therapy in treating and preventing green wilt disease in tomato plants grown in greenhouses BHDTSo9 rapidly infects and lyses PS003 bacterial cells under in vitro conditions, and it then sustains a low bacterial density for the next 47–48 hours It takes 52 hours for phage-resistant bacteria to emerge The 41,296 bp BHDTSo9 genome contains 46 ORFs, 28 of which encode functional proteins BHDTSo9 is most related to phage RsoP1IDN, according to the results of phylogenetic relationship prediction In addition, virulence factors and genes resistant to antibiotics are absent from the BHDTSo9 genome Phage therapy is ineffective in treating or preventing diseases in plants that are 20 days old, according to test results conducted in a garden BHDTSo9 is more effective at avoiding disease than treating it in 40-day-old plants After 14 days of monitoring, 60-day-old tomato plants that were either treated or not with bacteriophages showed a 50% decreased disease rate

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Tôi xin cam đoan đề tài “Đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và chữa bệnh héo xanh trên cây cà chua” là công trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi chính bản thân tôi Số liệu và tài liệu dẫn chứng trong luận văn có nguồn gốc rõ rang và được công bố đúng quy định Các kết quả của luận văn phản ánh khách quan, trung thực, hoàn toàn không sao chép và chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác Nếu phát hiện có gian dối, tôi xin chịu mọi trách nhiệm

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 01 năm 2024

Tác giả đề tài

Phạm Hương Giang

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bệnh héo xanh trên cây trồng: 31.1.1 Bệnh héo xanh trên cây trồng: 3

1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum: 4

1.1.3 Một số biện pháp phòng và trị bệnh héo xanh trên cây cà chua: 7

1.2 Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể: 8

1.2.1 Thực khuẩn thể: 8

1.2.2 Liệu pháp thực khuẩn thể: 9

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến liệu pháp thực khuẩn thể: 10

1.3 Tình hình nghiên cứu liệu pháp thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua trong và ngoài nước: 11

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước: 11

1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước: 12

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………14

2.1 Vật liệu & Thiết bị: 14

2.2.1 Đánh giá hoạt tính thực khuẩn thể trong môi trường dinh

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ & BÀN LUẬN……… 32

3.1 Hoạt tính ly giải của thực khuẩn thể BHDTSo9 32

3.2 Phân tích genome thực khuẩn thể BHDTSo9 và đánh giá tính an toàn:………… 36

3.2.1 Lắp ráp genome: 36

3.2.2 Chú giải chức năng 48

3.2.3 Bản đồ genome và xây dựng cây phát sinh loài: 56

ANOVA ARDB BLAST BP CARD CDS CFU DNA GMO HMM IS MAPK MEGA MOI NCBI NMPDR OD ORF PAMP PATRIC PDB PE PFU PHY PTI RAST

RGI rRNA RSSC SPSS TKT

Analysis of Variance

Antibiotic Resistance Genes Database Basic Local Alignment Search Tool Basepair

Comprehensive Antibiotic Resistance Database Coding Sequence

Colony forming unit Deoxyribonucleic Acid

Genetically modified organisms Hidden Markov Model

Insertion Sequence

Mitogen-activated protein kinase

Molecular Evolutionary Genetics Analysis Multiplicity of Infection

National Center For Biotechnology Information National Microbial Pathogen Database Resource Optical Density

Open Reading Frame

Perception of pathogen-associated molecular patterns Pathosystems Resource Integration Center

Protein Data Bank Polyethylene Plaque forming unit Phylotype

Ralstonia solanacearum species complex

Statistical Package for the Social Sciences Thực khuẩn thể

Virulence Factors of Pathogenic Bacteria Database

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất và môi trường sử dụng trong thí nghiệm 15

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất sử dụng trong thí nghiệm PCR và điện di 15

Bảng 2.3 Thành phần môi trường khảo sát 27

Bảng 3.1 Các thông số cơ bản của trình tự thô R1 và R2 36

Bảng 3.2 Chú giải chức năng thực khuẩn thể BHDTSo9 51

Bảng 3.3 Tóm tắt những đoạn gene có mức độ tương đồng cao với ORF8 57

Bảng 3.4 Tóm tắt những đoạn gene có mức độ tương đồng cao với ORF22 58

Bảng 3.5 Tỷ lệ bệnh của cây cà chua ở nghiệm thức phòng bệnh trong độ tuổi 20, 40 và 60 ngày 68

Bảng 3.6 Tỷ lệ bệnh của cây cà chua ở nghiệm thức trị bệnh trong độ tuổi 20 và 40 ngày 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển của bệnh héo xanh trên cây cà chua 3

Hình 1.2 Biểu hiện bệnh héo xanh trên cà chua và khoai tây 4

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 16

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát thí nghiệm khảo sát hoạt tính ly giải vi khuẩn PS003 của thực khuẩn thể BHDTSo9 trong môi trường dinh dưỡng 17

Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát quy trình phân tích genome và đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể 19

Hình 2.4 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm thử nghiệm liệu pháp thực khuẩn thể trên cây cà chua 26

Hình 2.5 Một số thiết bị và dụng cụ trong nhà màng phục vụ cho quá trình thí nghiệm 28

Hình 2.6 Sơ đồ tổng quát tiến trình thực hiện thí nghiệm ngoài vườn ươm 29

Hình 3.1 Quá trình phát triển của vi khuẩn PS003 sau khi xâm nhiễm với thực khuẩn thể BHDTSo9 33

Hình 3.2 Kết quả drop plaque assays của 10 chủng vi khuẩn phân lập được và chủng PS003 ban đầu (đối chứng) 34

Hình 3.3 Kết quả PCR – điện di đoạn lpxC của 11 chủng vi khuẩn 35

Hình 3.4 Chất lượng mỗi base của 2 trình tự thô 37

Hình 3.5 Điểm chất lượng của 2 trình tự thô 38

Hình 3.6 Hàm lượng mỗi loại base của trình tự thô R1 và R2 40

Hình 3.7 Phần trăm GC của trình tự thô R1 và R2 41

Hình 3.8 Hàm lượng base N ở trình tự thô R1 và R2 42

Hình 3.9 Phân bố độ dài chuỗi trình tự của R1 và R2 43

Hình 3.10 Mức độ lặp lại chuỗi trình tự của R1 và R2 44

Hình 3.11 Trình tự biểu hiện quá mức của R1 và R2 45

Hình 3.12 Hàm lượng adapter có trong trình tự R1 và R2 46

Hình 3.13 Kết quả đánh giá lắp ráp genome bằng Quast 49

Hình 3.14 Bản đồ genome của thực khuẩn thể BHDTSo9 56

Hình 3.15 Kết quả sắp gióng cột 20 trình tự tương đồng với trình tự ORF8 59

Hình 3.16 Kết quả sắp gióng cột 8 trình tự tương đồng với trình tự ORF22 60

Hình 3.17 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ORF8 61

Hình 3.18 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ORF22 62

Hình 3.19 Kết quả kiểm tra gene kháng kháng sinh bằng CARD 63

Hình 3.20 Kết quả kiểm tra gene kháng kháng sinh với ResFinder 64

Hình 3.21 Kết quả tìm kiếm với VFDB BLAST 65

MỞ ĐẦU

Cà chua là một trong những cây rau ăn quả quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đóng góp sản lượng hàng năm lên tới hơn trăm triệu tấn [1] Năng suất và sản lượng của cà chua bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi bệnh hại, đặc

biệt là bệnh héo xanh Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra

được xem là một trong những bệnh truyền nhiễm từ đất tàn phá nặng nề nhất [2] với

phổ vật chủ rộng hơn 450 loài thuộc 54 họ, bao gồm những cây rau củ có giá trị kinh tế cao [3] Đây được xem là một trong những căn bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng trên thế giới, đặc biệt là ở các quốc gia khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới [2].Các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh là những chiến lược chính để kiểm soát căn bệnh, tuy nhiên những mối quan ngại về vấn đề môi trường, chất lượng sức khỏe con người, sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc đang mở ra mục tiêu tìm kiếm các giải pháp khác thay thế

Liệu pháp thực khuẩn thể ly giải vi khuẩn gây bệnh hứa hẹn là một giải pháp tiềm năng giải quyết vấn đề này Thực khuẩn thể chỉ xâm nhiễm và ly giải tế bào vi khuẩn chủ mà không gây bất lợi cho các vi sinh vật khác trong hệ sinh thái [4] Tuy nhiên không phải thực khuẩn thể nào cũng có thể sử dụng cho phương pháp này Thực khuẩn thể phải có đủ điều kiện: là phage độc (lysis), khả năng xâm nhập và ly giải tế bào chủ tốt, ít chịu ảnh hưởng từ các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH Bên cạnh đó, thực khuẩn thể mang trong mình nguy cơ tiềm ẩn làm tăng độc lực của tế bào chủ (chu trình tiềm tan)[5]

Các nghiên cứu hiện nay về hoạt tính ly giải vi khuẩn, các thí nghiệm in vitro,

trong nhà lưới và trên đồng ruộng về khả năng kiểm soát bệnh trên cây cà chua bằng liệu pháp thực khuẩn thể đã thu được nhiều kết quả khả quan, cho thấy tiềm năng của liệu pháp này trong công cuộc kiểm soát và phòng ngừa bệnh héo xanh Vì

vậy, đề tài “Đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và

trị bệnh héo xanh trong vườn ươm” được thực hiện nhằm góp phần chứng minh

hiệu quả phòng và trị bệnh héo xanh trên cây cà chua bằng liệu pháp thực khuẩn thể

Nội dung nghiên cứu gồm:

1 Khảo sát hoạt tính ly giải của thực khuẩn thể trong môi trường dinh dưỡng

ở điều kiện in vitro

2 Phân tích genome của thực khuẩn thể BHDTSo9 và đánh giá tính an toàn 3 Đánh giá hiệu quả của liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và

chữa bệnh héo xanh do vi khuẩn gây ra trên cây cà chua trong vườn ươm

1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bệnh héo xanh trên cây trồng:

1.1.1 Bệnh héo xanh trên cây trồng:

Bệnh héo xanh ở thực vật do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một

trong những bệnh hại có nguồn gốc lây nhiễm từ đất với sức tàn phá nghiêm trọng, ảnh hưởng rất lớn tới sản lượng cây trồng [2], [6] Thuật ngữ “héo xanh” dùng để chỉ lá của những cây nhiễm bệnh vẫn có màu xanh khi cây bắt đầu có các biểu hiện của triệu chứng héo rũ [7] Ngoài ra, bệnh này còn được gọi bằng một số tên khác như bệnh héo rũ do vi khuẩn, bệnh thối nâu ở khoai tây, bệnh héo rũ ở cây thuốc lá, bệnh moko ở cây chuối, bệnh Bugtok, và một số tên khác [8] Bệnh được ghi nhận xuất hiện nhiều ở các nước nhiệt đới hoặc các vùng có khí hậu ấm áp [9]

Trong đó: (a) Lá bắt đầu quăn (biểu hiện sớm), (b) Lá ở phần ngọn bắt đầu héo dần, (c) Tất cả lá trên cây đều héo, (d) Cây chết

Bệnh héo xanh xảy ra ở hơn 450 loài thực vật thuộc 54 họ khác nhau [3], trong đó bao gồm cả những cây trồng quan trọng thuộc họ Cà như cà chua, khoai tây, ớt chuông, cà tím, cây thuốc lá [9] Bệnh héo xanh ở những cây trồng thuộc họ Cà có

Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển của bệnh héo xanh trên cây cà chua [10]

thể phát hiện bằng hiện tượng héo rũ đột ngột, xuất hiện đầu tiên ở lá non trên ngọn sau đó lan dần xuống gốc hoặc héo ở một bên của cây và làm cây chết nhanh chóng chỉ trong vài ngày kể từ khi có biểu hiện héo [10] (hình 1.1) Các mô mạch rễ, thân ở cà chua chuyển sang màu nâu (hình 1.2), khi cắt ngang thân có giọt dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra [9] Các triệu chứng của bệnh héo xanh có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cây [11] Cây khoai tây nhiễm bệnh có biểu hiện héo tương tự cây cà chua, ngoài ra ở củ khoai tây có hiện tượng hình thành các khoang dọc theo vòng mạch, củ bị nứt và thối (hình 1.2) [9] Ở điều kiện nhiệt độ môi trường cao (29 – 35oC), các triệu chứng bệnh có xu hướng biểu hiện ra bên ngoài nhanh chóng [11] Tuy nhiên, kể cả trong điều kiện bệnh phát triển thuận lợi, vẫn có trường hợp cây không thể hiện biểu hiện bệnh ra bên ngoài mà tồn tại ở dạng nhiễm bệnh tiềm ẩn; từ đó trở thành nguồn phát tán mầm bệnh ra môi trường và sang các cây khác [11]

Trong đó: (C) Mạch gỗ biến đổi sang màu nâu trong thân cây, (E) Hiện tượng thối rữa và hình thành khoang dọc theo vòng mạch ở củ khoai tây nhiễm bệnh,

(F) Củ khoai tây nhiễm bệnh bị thối rữa và xuất hiện vết nứt

1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum: 1.1.2.1 Đặc điểm chung:

R solanacearum (còn gọi là Pseudomonas solanacearum hay Burkholderia solanacearum) là vi khuẩn đất [12] được phát hiện đầu tiên trên cây cà chua và khoai tây bởi nhà nghiên cứu Smith vào năm 1896 [13] có khả năng gây bệnh héo xanh trên cả thực vật một và hai lá mầm [14] Đây là vi khuẩn beta proteobacterium

Hình 1.2 Biểu hiện bệnh héo xanh trên cà chua và khoai tây [9]

Gram âm, hiếu khí và không sinh bào tử [15] R solanacearum có dạng hình que,

kích thước tế bào khoảng 0,5 - 0,7×1,5 - 2,0 µm, di động nhờ vào tiêm mao [16],

[17] Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của các chủng R solanacearum nằm trong khoảng

28 – 32oC, tuy nhiên một số chủng lại có nhiệt độ phát triển tối ưu thấp hơn 27oC [11]

R solanacearum là tác nhân gây bệnh trên cây trồng đáng chú ý nhờ vào khả

năng tồn tại thời gian dài trong đất, nước, các dụng cụ trồng trọt và cả trong các bộ phận cấy ghép (cành, thân, ) [11], phân bố rộng rãi trên toàn cầu, có phổ xâm nhiễm rộng (trên 450 loài thuộc 54 họ) [18] và bảo tồn được khả năng gây bệnh

ngay cả khi không có vật chủ [8] Vi khuẩn R solanacearum thường được phát hiện

ở các vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, gây bệnh cho nhiều cây lương thực

và cây ăn quả quan trọng [19] R solanacearum được xếp ở vị trí thứ 2 trong danh

sách các vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng có sức tàn phá nghiêm trọng chỉ sau

Pseudomonas syringae [20] Bên cạnh đó R solanacearum race 3 biovar 2 còn nằm trong danh sách sinh vật cần kiểm dịch ở Châu Âu, Canada và được xếp vào tác nhân chọn lọc có tiềm năng gây khủng bố sinh học ở Hoa Kỳ [21]

R solanacearum và hai loài khác có mối quan hệ họ hàng gần gũi với nó là R syzygii (gây bệnh trên cây đinh hương ở Indonesia) và vi khuẩn gây bệnh blood trên

cây chuối (BDB - banana blood disease) tạo thành phức hợp loài R solanacearum (R solanacearum species complex – RSSC) [22] Phức hợp loài RSSC bao gồm

hàng ngàn chủng vi khuẩn khác nhau về mặt di truyền (khác biệt có thể > 30%) và không thể thuộc về cùng một loài theo định nghĩa thông thường [11], [22] Các

chủng R solanacearum trước đây được phân thành 5 race dựa trên các loại vật chủ

xâm nhiễm và 6 biovar dựa trên khả năng chuyển hóa 3 loại đường có gốc alcohol (-OH) và 3 loại disaccharide [14], [18], [23] Tuy nhiên hai cách phân loại này được cho là thiếu chính xác khi chưa sử dụng hiệu quả mức độ di truyền khác biệt của các loài trong phức hợp Cùng với sự phát triển của công nghệ giải trình tự thế hệ mới,

genome của các chủng R solanacearum đã phân lập đều được giải trình tự, tiêu biểu là năm 2002 trình tự toàn bộ genome của chủng R solanacearum GMI1000

(phy I, sequevar 18) được giải hoàn chỉnh [8] đặt tiền đề để phát triển phương pháp phân loại dựa trên phân tích trình tự DNA Dựa trên các phân tích về vùng đệm phiên mã bên trong (internal transcribed spacer – ITS) 16S – 23S rRNA, các gene

egl và hrpB, phức hợp các chủng R solanacearum được chia thành 4 nhóm (gọi là

phylotype – phy) theo nguồn gốc phân bố: Châu Á – phy I (gồm biovar 3, 4 và 5), Châu Mỹ - phy II (gồm biovar 1, 2 và 2T), Châu Phi – phy III (gồm biovar 1 và 2T)

và Indonesia – phy IV (gồm biovar 1, 2, 2T, P.syzygii và BDB) [8], [22].

Ở những cây nhiễm bệnh, mật độ vi khuẩn trong hệ thống mạch gỗ rất cao (109 – 1010 CFU/mL dịch mạch gỗ) [22] Đồng thời, R solanacearum tiết ra

exopolysaccharide gây cản trở dòng vận chuyển trong mạch gỗ, dẫn đến phần thân trên của cây (bao gồm thân trên, ngọn, lá, hoa) bị mất nước, héo rũ dần và làm chết cây trong vài ngày [26] Trong một số trường hợp điều kiện bất lợi (nhiệt độ môi trường thấp hoặc độ kiềm trong đất cao), bệnh tiến triển chậm, rễ kém phát triển và còi cọc, khi đó thực vật sẽ rụng và chết dần do các mạch và mô tiếp giáp bị thoái hóa [27] Sau khi cây chết, vi khuẩn được giải phóng trở lại đất và sẵn sàng xâm nhiễm vật chủ mới [18] Khả năng xâm nhập vào mạch gỗ được đánh giá là bước quan trọng trong tiến trình phát triển của bệnh, bởi vì khi gây đột biến làm thay đổi

khả năng xâm nhập vào mạch gỗ thì chủng vi khuẩn này không gây héo ở thực vật [28], [29]

1.1.3 Một số biện pháp phòng và trị bệnh héo xanh trên cây cà chua:

Bệnh hại trên cà chua, cụ thể là bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum

có nguồn gốc từ đất gây ra hiện nay vẫn được xét vào nhóm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng khó kiểm soát hoàn toàn [18] Nguyên nhân là do loài vi khuẩn này có phổ vật chủ rộng, phân bố nhiều nơi, tồn tại và giữ được khả năng gây bệnh trong thời gian dài, kể cả khi không có vật chủ [27] Ngoài ra, tốc độ tiến hóa và biến đổi

của gene liên quan đến độc lực (khả năng xâm nhiễm vào vật chủ) của R

solanacearum đang nhanh hơn so với toàn thể bộ gene cũng là nguyên do làm cho

phức hợp RSSC ngày càng đa dạng, phức tạp và khó kiểm soát hơn [22] Một số

chiến lược ứng dụng để hạn chế tác hại do R solanacearum gây ra như vệ sinh

đồng ruộng/nhà kính, sử dụng các giống cây trồng kháng bệnh, luân canh cây trồng, sử dụng hạt giống sạch bệnh, loại bỏ tàn dư cây bị nhiễm bệnh, sử dụng một số hóa

chất diệt tảo hoặc một số chủng vi khuẩn có tác dụng ức chế sự phát triển của R

solanacearum [18], [27], [30]

Trước đây, các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh (ví dụ như oxytetracycline, ampicillin, streptomycin, tetracycline, penicillin) được sử dụng phổ biến để kiểm soát các bệnh hại trên cây trồng ở quy mô nhà kính và đồng ruộng [11] Tuy nhiên việc quá phụ thuộc vào các chất này để kiểm soát mầm bệnh không chỉ ảnh hưởng tới đất trồng, môi trường, sức khỏe con người mà còn dẫn đến sự xuất hiện vi khuẩn kháng thuốc, kháng kháng sinh Hiện nay một số phương pháp thân thiện với môi trường hơn đã được nghiên cứu như sử dụng các vi sinh vật đối kháng (ví dụ

Streptomyces sp [31], các loài vi khuẩn rhizobacteria, endophytic và epiphytic

[27]), hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc có nguồn gốc từ vi sinh vật đối kháng (ví dụ L-histidine từ dịch chiết nấm men [32], hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có nguồn

gốc từ Bacillus amyloliquefaciens [33]) và các tác nhân tăng cường hệ miễn dịch ở thực vật (ví dụ Pseudomonas fluorescens VSMKU3054 [34], Bacillus thuringiensis

[35], salicylic acid và chitosan [36]) Ngoài ra, sử dụng các hạt nano (ví dụ

nanosilica [37]), bổ sung than sinh học nguồn gốc từ rơm lúa mì [38], sử dụng các giống kháng bệnh hoặc gốc ghép có nguồn gốc từ các giống kháng bệnh [39] cũng làm giảm tỷ lệ nhiệm bệnh và cải thiện sinh trưởng của cây cà chua

1.2 Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể: 1.2.1 Thực khuẩn thể:

Thực khuẩn thể (bacteriophage hay còn gọi là phage – TKT) là virus có khả năng xâm nhiễm và nhân lên bên trong tế bào vi khuẩn, ly giải tế bào và tiếp tục xâm nhiễm sang các tế bào xung quanh [40] Được phát hiện đầu tiên vào năm 1915, nhưng chỉ đến năm 1917, nhà vi sinh vật học Felix d'Herelle mới đưa ra thuật ngữ ‘thực khuẩn thể’ (có nghĩa là thể ăn vi khuẩn) để đặt cho loại virus ông phân lập được từ mẫu phân người [40], [41] Thực khuẩn thể có cấu trúc đơn giản gồm phần lõi mang vật chất di truyền (DNA hoặc RNA chuỗi kép hoặc chuỗi đơn) được bảo vệ bởi lớp vỏ ngoài protein capsid [42] Ba dạng cấu trúc cơ bản thường gặp của TKT: đầu hình tứ diện có đuôi, đầu hình tứ diện không đuôi và dạng sợi [43] Mặc dù có hàng tỷ TKT xâm nhiễm các loài vi khuẩn khác nhau, nhưng hầu hết các

TKT đều thuộc Caudovirales, chia thành: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae

[44]

Thực khuẩn thể được xem là một trong những thực thể ký sinh nội bào bắt buộc phân bố rộng rãi nhất, thường được tìm thấy nhiều ở những nơi vật chủ vi khuẩn tương ứng tập trung đông đúc [44] Thực khuẩn thể không thể tự gia tăng số lượng mà cần ‘mượn’ các nguyên liệu có trong nội bào vật chủ để tổng hợp lên các thành phần cấu trúc Thực khuẩn thể là dạng có độc lực (TKT độc) hay dạng ôn hòa phụ thuộc vào chu trình sinh sản: lytic (chu trình tan) và lysogenic (chu trình tiềm tan) [44], [45] Trong chu trình tan, sau khi hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn và bơm bộ gene (gDNA) vào, TKT sử dụng vật chất và bộ máy di truyền của tế bào chủ để tái tạo vật chất di truyền TKT và protein capsid Sau đó vật chất di truyền mới được tổng hợp sẽ được đóng gói vào trong vỏ capsid và giải phóng ra ngoài môi trường sau khi ly giải màng tế bào chủ bằng holin hoặc endolysin [44] Chu

trình này tiếp tục lặp lại ở điều kiện số lượng vật chủ hiện diện thích hợp và các điều kiện sinh lý thích hợp cho quá trình nhân lên [45]

Khi điều kiện bên ngoài không thích hợp (mật độ tế bào chủ thấp, chất dinh dưỡng có sẵn thấp, ), TKT độc chuyển sang trạng thái ôn hòa (chu trình tiềm tan) Chu trình tiềm tan được đặc trưng bởi quá trình tích hợp bộ gene của TKT vào bộ gene của tế bào chủ (gọi là prophage) và được sao chép sang các thế hệ tế bào con [44] Chu trình tiềm tan có thể dừng lại và chuyển sang chu trình tan bất cứ lúc nào tùy thuộc vào điều kiện môi trường (stress), điều kiện trao đổi chất trong tế bào vi khuẩn chủ [46] Dựa vào hai cơ chế này, TKT độc được ứng dụng để kiểm soát bệnh trên cây trồng do chúng có thể tiêu diệt trực tiếp vi khuẩn gây bệnh; TKT ôn hòa được sử dụng để chẩn đoán bệnh do khả năng tích hợp gene vào tế bào chủ, nếu chèn gene mã hóa cho protein phát huỳnh quang vào TKT thì có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh dễ dàng [44]

1.2.2 Liệu pháp thực khuẩn thể:

Liệu pháp TKT là phương pháp sử dụng TKT để điều trị các bệnh gây ra bởi vi khuẩn được công nhận và phát triển vào những năm 1920 [44] Cho tới khi kháng sinh phổ rộng đầu tiên (penicillin) xuất hiện vào năm 1940, các nhà khoa học phát hiện ứng dụng liệu pháp TKT trên quy mô đồng ruộng để kiểm soát bệnh kém hiệu quả hơn so với kháng sinh [47] Thuốc kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn sau đó trở thành chiến lược chính để kiểm soát bệnh trong nhiều thập kỷ [9] cho đến khi những tác động tiêu cực của chúng lên môi trường cũng như sức khỏe con người xuất hiện Đặc biệt là sự xuất hiện của hàng loạt vi khuẩn kháng thuốc, kháng kháng sinh khiến cho các nhà nghiên cứu chú ý đến tác nhân kiểm soát tiềm năng khác để kiểm soát bệnh trên cây trồng [44]

Liệu pháp TKT có hai ưu điểm chính: phạm vi ký chủ của TKT hẹp hơn so với kháng sinh, có ý nghĩa rằng liệu pháp này chỉ loại bỏ vi khuẩn mục tiêu mà không gây hại cho những vi khuẩn khác trong môi trường [48] TKT có thể gia tăng số lượng nhanh chóng khi có vật chủ, nhưng lại tự giới hạn số lượng khi không có vật chủ hiện diện; điều này giúp hạn chế tối đa tác động đến hệ vi sinh vật tự nhiên

trong đất [30] Đồng thời chỉ những TKT ly giải (TKT độc) mới được sử dụng cho phương pháp này nhằm ly giải vi khuẩn nhanh chóng và tránh những tác động tiêu cực khi sử dụng TKT ôn hòa như tăng cường độc lực cho vật chủ [49], [50] hoặc bảo vệ vật chủ khỏi sự xâm nhiễm của các TKT độc khác [46] Ưu điểm thứ hai là hiện nay chưa có bằng chứng về tác động bất lợi của liệu pháp TKT đối với cả thực vật và động vật [51] Tuy nhiên, nhược điểm của liệu pháp này là tính đặc hiệu vật chủ, yêu cầu số lượng vật chủ tối thiểu hiện diện, các rào cản thị trường về sản phẩm nông nghiệp có sử dụng liệu pháp này (tâm lý người mua, rào cản pháp lý, ) và đáng lo ngại nhất là sự xuất hiện các chủng vi khuẩn đột biến có khả năng kháng TKT [40] Tuy rằng các nghiên cứu sau này đã chỉ ra một số cơ chế của TKT giúp chúng có thể xâm nhập được vào các vi khuẩn kháng TKT [40], [52], hoặc sử dụng hỗn hợp TKT cocktail hoặc endolysin để khắc phục [44]nhưng đây vẫn là một vấn đề đáng xem xét trước khi quyết định sử dụng liệu pháp TKT trên đồng ruộng

Liệu pháp TKT ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng được xử lý bằng các phương pháp như tưới xuống đất, phun lên lá, ngâm hạt giống [44] Đồng thời cần căn cứ vào vị trí xâm nhập và gây bệnh lên thực vật của vi khuẩn để chọn phương pháp xử

lý thích hợp Trong trường hợp vi khuẩn R solanacearum có nguồn gốc từ đất,

phương pháp tưới trực tiếp TKT vào vùng rễ cây cho thấy hiệu quả trong việc làm giảm tỷ lệ héo xanh ở cà chua [53], [54], [55]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến liệu pháp thực khuẩn thể:

Sự thành công của liệu pháp TKT trong kiểm soát bệnh không chỉ dựa vào độc lực của TKT mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như nhiệt độ, pH, nồng độ ion [4], cơ chế kháng TKT của vi khuẩn chủ [40] Nhiệt độ và pH là những yếu tố quan trọng trong môi trường quyết định vi khuẩn có thể tồn tại hay không, điều này cũng áp dụng được với TKT, tuy nhiên khoảng tối ưu của TKT không hoàn toàn tương ứng với vật chủ của chúng [4] Mỗi TKT có một khoảng giới hạn chịu đựng và một giá trị tối ưu; vượt ra ngoài khoảng giới hạn này độc lực và khả năng tồn tại của TKT suy giảm [56], [57], [58] Ngoài ra, ảnh hưởng của một số loại đất sét khoáng trong đất lên khả năng tồn tại của TKT cũng được công bố [4] Các hạt sét

khoáng có thể bảo toàn độc lực cho TKT, kéo dài thời gian tồn tại ngay cả khi TKT ở trạng thái tự do/không có tế bào chủ Đồng thời các yếu tố như loại hạt, kích thước hạt, độ hấp phụ của TKT lên bề mặt hạt cũng ảnh hưởng đến sự tồn tại của TKT trong môi trường [59], [60]

Một yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả liệu pháp TKT là vật chủ xâm nhiễm Mặc dù phổ xâm nhiễm của TKT có thể bao gồm một hoặc nhiều chi vi khuẩn, đa phần TKT chỉ xâm nhiễm một số chủng nhất định trong một loài vi khuẩn vì tính đặc hiệu cao giữa các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và TKT [44] Tuy nhiên, vi khuẩn luôn có những cơ chế đáp trả sự xâm nhiễm này, điển hình như vi khuẩn mang đột biến trên đoạn gene mã hóa cho thụ thể liên kết được với TKT, từ đó cản trợ quá trình hấp phụ của TKT lên bề mặt tế bào Trong tế bào chủ, các hệ thống phòng thủ liên quan đến hệ thống sửa đổi hạn chế (DISARM - defense island systems associated with restriction-modification) hay hệ thống loại bỏ siêu lây nhiễm (Sie - super infection exclusion) sẽ ngăn cản DNA ngoại lai xâm nhiễm; hệ thống CRISPR sẽ cắt bỏ các DNA này Ngay cả khi DNA của TKT vượt qua các hàng rào trên, quá trình tái bản DNA vẫn sẽ bị ngăn chặn bởi các hệ thống phòng thủ BREX (Bacteriophage exclusion), hệ thống Abi (Abortive infection) hoặc PICI (Phage-inducible chromosomal islands) [40], [52]

1.3 Tình hình nghiên cứu liệu pháp thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua trong và ngoài nước:

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước:

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu sử dụng liệu pháp TKT để kiểm soát bệnh héo xanh đã được thực hiện Vào năm 2017, Nguyễn Thúy An và cộng sự đã phân lập được 10 dòng TKT có phổ xâm nhiễm rộng (15 – 16 chủng vi khuẩn) từ mẫu đất và thân cây hoa vạn thọ có triệu chứng bệnh héo xanh [61] Trong đó có 3 dòng TKT ΦCT18, ΦĐT3 và ΦĐT4 là 3 dòng có khả năng ly giải tế bào chủ mạnh nhất (dựa theo kích thước vòng sinh tan) Sử dụng các dòng TKT ΦCT18, ΦĐT3, ΦĐT4 đơn lẻ và hỗn hợp 3 dòng tưới vào đất trong nhà lưới, kết quả cho thấy dòng ΦĐT4 có hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh cao nhất Ngoài ra, cùng năm đó, Huỳnh Ngọc

Tâm và cộng sự cũng phân lập được 124 dòng TKT từ mẫu đất và cây hoa cúc bị bệnh héo xanh, trong đó có 10 dòng TKT có phổ ký chủ rộng (trên 50 trong tổng số 55 dòng vi khuẩn phân lập được) [62] Dựa trên đường kính vòng sinh tan, có 5

dòng TKT có khả năng ly giải vi khuẩn R solanacearum tốt hơn các dòng còn lại

Sau đó vào năm 2019, Trương Thị Bích Vân và cộng sự đã phân lập được 25 dòng

TKT có khả năng ức chế vi khuẩn R solanacearum từ đất trồng các cây dược liệu: cây gừng (Zingiber officinale), nghệ (Curcuma longa L.), húng chanh (Coleus

aromaticus Benth) và đinh lăng (Polyscias fruticosa L.) [63] Kết quả thí nghiệm

kiểm tra phổ ký chủ cho thấy có 29 dòng TKT tạo vết tan rõ ràng (với 9 chủng vi

khuẩn R.solanacearum) và 7 dòng TKT ɸG7, ɸG8, ɸDL3, ɸDL6, ɸH6, ɸH23 và

ɸH24 có khả năng kiểm soát vi khuẩn (ly giải vi khuẩn) hơn 72 giờ trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước:

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu sử dụng liệu pháp TKT rất được giới khoa học quan tâm, đặc biệt là sử dụng liệu pháp TKT phòng ngừa các bệnh hại nghiêm trọng chưa được kiểm soát hoàn toàn, điển hình như bệnh héo xanh do

vi khuẩn R solanacearum gây ra Năm 2011, Fujiwara và các cộng sự thử nghiệm

liệu pháp TKT đơn lẻ và hỗn hợp TKT cocktail đều làm giảm đáng kể mật độ tế bào vi khuẩn [64] Đặc biệt là các cây cà chua được xử lý với TKT φRSL1 không xuất hiện triệu chứng héo trong khi các cây đối chứng xuất hiện biểu hiện bệnh sau 18 ngày Trong nghiên cứu về một loại TKT khác là PE204, kết quả cho thấy đây là loại TKT bền với khoảng nhiệt độ (15 – 60oC) và khoảng pH (4 – 11) rộng, kể cả có sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt Silwet L-77 [65] Đồng thời, dòng TKT này cũng cho hiệu quả khả quan khi ức chế hoàn toàn các triệu chứng bệnh trên cây cà chua

Vào năm 2017, nhóm nghiên cứu của Wei và cộng sự đã phân lập và xác định đặc điểm của 12 chủng TKT từ nguồn nước ở Trung Quốc và Kenya [66] Nhóm đã sử dụng 6 chủng trên tổng số 12 chủng để tạo thành hỗn hợp TKT P1, cho hiệu quả diệt được khoảng 98% vi khuẩn gây bệnh trong đất, đồng thời bảo vệ được hơn

80% số lượng cây khoai tây khỏi bệnh héo xanh Một hỗn hợp TKT ly giải khác gồm 4 chủng TKT phân lập được từ ruộng cà chua ở Trung Quốc thử nghiệm trên quy mô nhà kính và đồng ruộng cũng làm giảm số lượng mầm bệnh trong đất [67] Đến năm 2020, Ramírez và cộng sự phân lập thành công 8 dòng TKT từ các ruộng trồng chuối ở Colombia, đồng thời khảo sát phổ kí chủ của 8 chủng này trên 65

chủng vi khuẩn R solanacearum [55] Hai chủng có hiệu quả tốt nhất được phối

trộn thành hỗn hợp TKT và cho khả năng ức chế chủng vi khuẩn UA5191 100% trong nhà kính

Tháng 5 năm 2022, nhóm nghiên cứu của Magar công bố kết quả nghiên cứu

về các đặc điểm của bộ gene, độ bền in vitro với tác nhân nhiệt độ, pH; và khả năng

kiểm soát bệnh héo xanh trên cây cà chua của 2 TKT RpT1, RpT2 và hỗn hợp TKT của chúng [53] TKT RpT1 và RpT2 có chu kỳ xâm nhiễm (ly giải) rất ngắn, chỉ trong vòng 5 phút, từ đó thể hiện được hiệu quả lây nhiễm vật chủ cao RpT1 và RpT2 có đặc điểm hình thái tương tự nhau khi quan sát bằng kính hiển vi TEM; bộ gene của 2 TKT này đều có trên 40.000 bp và cho thấy mức độ tương đồng cao (84,78% identity) Mặc dù độ bền nhiệt của 2 TKT này giảm khi nhiệt độ > 37oC, nhưng kết quả thực nghiệm lại cho thấy RpT1 và RpT2 ổn định ở nhiệt độ lên đến 45oC kéo dài trong 15 ngày và cả hai chủng đều giảm mật độ ở 55oC Cả hai TKT đều ổn định ở khoảng pH khá rộng (5 – 10) và bất hoạt ở pH acid (3 – 4) Trong thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh héo xanh trên cà chua, liệu pháp TKT đơn lẻ và hỗn hợp đều cho hiệu quả tốt nhất vào ngày thứ 3 kể từ khi xâm nhiễm Tuy nhiên khi xử lý với TKT đơn lẻ, ở nghiệm thức xử lý TKT trước 1 ngày, cùng ngày xâm nhiễm vi khuẩn và sau 1 ngày đều không thể ức chế triệu chứng bệnh Trong khi đó ở các nghiệm thức xử lý bằng hỗn hợp TKT, tất cả các nghiệm thức xử lý TKT đều ghi nhận tác động làm giảm triệu chứng bệnh Như vậy, liệu pháp TKT đơn lẻ hoặc hỗn hợp TKT đều có khả năng làm giảm triệu chứng của bệnh héo xanh trên cây cà chua, đồng thời cũng ghi nhận xử lý cây trồng với TKT sau một thời gian xác định kể từ khi xâm nhiễm vi khuẩn cho hiệu quả ức chế bệnh tốt

2 CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu & Thiết bị:

2.1.1 Chủng vi khuẩn:

Chủng vi khuẩn R solanacearum PS003 có độc lực cao đã được phân lập và

làm thuần từ mẫu thu tại các ruộng cà chua bị bệnh ở tỉnh Lâm Đồng bởi nhóm nghiên cứu bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP.HCM Dung dịch vi khuẩn sử dụng ngoài vườm ươm được chuẩn bị bằng cách cấy chuyền khuẩn lạc PS003 vào môi trường được lựa chọn từ mục 2.2.3.1, nuôi lắc 150 (vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Sau khi ly tâm loại bỏ môi trường, huyền phù lại với nước cất tiệt trùng

2.1.2 Thực khuẩn thể:

Thực khuẩn thể BHDTSo9 đã được phân lập và làm thuần từ mẫu đất lấy từ huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng bởi nhóm nghiên cứu bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP.HCM BHDTSo9 thuộc họ Podoviridae, có đường kính vòng sinh tan khoảng 8 mm, thời gian tiềm ẩn là 140 phút và 11,5 ± 2,8 virion/tế bào vi khuẩn [68] Dữ liệu thô bộ gene của thực khuẩn thể BHDTSo9 do nhóm nghiên cứu bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học trực thuộc Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM gửi mẫu giải trình tự bằng hệ thống Illumina

Chế phẩm TKT được chuẩn bị bằng cách sau khi nuôi lắc vi khuẩn PS003 trong CPG đến OD600nm = 0,1; bổ sung thực khuẩn thể (MOI = 0,1) và tiếp tục nuôi lắc 150 (vòng/phút) trong 6 giờ Dung dịch sau đó được lọc bằng màng lọc 0,22 m và bảo quản ở nhiệt độ 4oC

2.1.3 Hóa chất và môi trường:

❖ Hóa chất và thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm được mô tả chi tiết trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất và môi trường sử dụng trong thí nghiệm

STT Tên môi trường Hóa chất - Hãng

Khối lượng/ 1000 mL

Nồng độ cuối (%)

1 Luria – Bertani (LB) 1,5% agar

❖ Hóa chất và vật liệu sử dụng cho thí nghiệm PCR và điện di đoạn gene lpxC:

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất sử dụng trong thí nghiệm PCR và điện di

Thể tích (L/Eppendorf)

GeneRulerTM DNA Ladder – SM0331

3,0

kháng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh trên cây cà chua và đánh giá tính an toàn

của thực khuẩn thể; (3) Đánh giá hiệu quả của liệu pháp thực khuẩn thể lên khả

năng phòng và trị bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây ra trên cây cà

chua trong vườn ươm (hình 2.1)

2.2.1 Đánh giá hoạt tính thực khuẩn thể trong môi trường dinh dưỡng: a) Mục tiêu:

Khảo sát hoạt tính thực khuẩn thể BHDTSo9 trong môi trường môi trường dinh dưỡng CPG với các thông số MOI khác nhau nhằm xác định mật độ TKT/vi

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu

khuẩn tối ưu, thời điểm TKT kiểm soát vi khuẩn cũng như thời điểm vi khuẩn tăng

sinh trở lại (xuất hiện vi khuẩn kháng TKT)

b) Phương pháp tiến hành:

Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính thực khuẩn thể được mô tả trong hình 2.2

• Phương pháp:

Chủng vi khuẩn R solanacearum PS003 được nuôi lắc 150 (vòng/phút) trong

môi trường CPG trong 24 giờ (mật độ khoảng 1,1 x 109 CFU/mL) Sau đó vi khuẩn được cấy chuyền sang erlen (thể tích 250 mL) chứa 50 mL môi trường CPG, nuôi lắc 150 (vòng/phút) đến khi đạt giá trị OD600nm = 0,1

Bổ sung dịch thực khuẩn thể vào các bình erlen sao cho thỏa các giá trị MOI = (0,01; 0,1; 1,0) và tiếp tục nuôi lắc ổn nhiệt ở 30oC, 150 (vòng/phút) MOI là tỷ lệ giữa số lượng thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn [69] Tính từ thời điểm bổ sung dịch thực khuẩn thể (t = 0), tiến hành đo mật độ quang của mẫu (OD600nm) 60 phút/lần cho đến khi giá trị OD bắt đầu giảm (OD600nm < 0,1) Tiếp tục ghi nhận giá

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát thí nghiệm khảo sát hoạt tính ly giải vi khuẩn PS003 của thực khuẩn thể BHDTSo9 trong môi trường dinh dưỡng

trị OD600nm cho tới khi mật độ quang có dấu hiệu tăng trở lại (OD600nm > 0,1) Mỗi giá trị MOI lặp lại 3 lần

Tại thời điểm OD600nm > 1,0, hút 100 L dịch vi khuẩn từ bình erlen chuyển sang đĩa petri chứa môi trường CPG 1,5% agar, trải đều và ủ ở 30oC Sau khi khuẩn lạc xuất hiện, chọn 10 khuẩn lạc/đĩa chuyển vào 10 eppendorf chứa 500 L môi trường CPG và ủ qua đêm ở 30oC Tiếp tục thực hiện drop plaque assay với dịch vi khuẩn này và thực khuẩn thể BHDTSo9 nhằm xác định tính kháng của vi khuẩn sau quá trình nuôi cấy trên với thực khuẩn thể ban đầu

• Phương pháp drop plaque assay:

Bước 1: Hút 400 L dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 6 mL CPG 0,4% agar (đã đun chảy và giữ ở 45oC), lắc đều nhẹ nhàng và đổ lên đĩa thạch LB 1,5% agar Bước 2: Khi đĩa thạch đông lại, hút 1 – 2 L dịch thực khuẩn thể nhỏ lên bề mặt đĩa theo từng ô riêng biệt Ủ qua đêm ở 30oC

Bước 3: Kiểm tra sự hiện diện của vòng sinh tan trên đĩa thạch theo phương pháp của Mazzocco [70]

• Phương pháp PCR:

Nguyên tắc: Phản ứng nhân gene, khuếch đại gene ở bên ngoài vi sinh vật

sống do có thể thu hàng triệu bản copy của 1 đoạn gene ban đầu

Thực hiện: Sử dụng 2 đoạn mồi RS-F-759 và RS-R-760 và phương pháp thực

hiện của Opina [71] (phụ lục 1) để thực hiện phản ứng PCR Hai đoạn mồi này

khuếch đại đoạn gene 281 bp có độ bảo tồn cao lpxC (cần thiết cho chức năng) của

đa số các chủng R solanacearum Thang DNA sử dụng trong thí nghiệm

2.2.2 Phân tích genome thực khuẩn thể kháng vi khuẩn R.solanacearum:

Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu được mô tả trong hình 2.3

2.2.2.1 Kiểm tra và xử lý dữ liệu thô:

Dữ liệu thô thu được từ bước giải trình tự cần được kiểm tra có phù hợp tiêu chuẩn trước khi tiến hành phân tích các bước tiếp theo Ở bước này, điểm chất lượng Q (giá trị đo lường khả năng 1 base bị lắp ráp sai) của hệ thống Illumina được quan tâm hơn cả Mối quan hệ giữa điểm chất lượng Q và xác suất xảy ra lỗi trong quá trình lắp ráp nucleotide được xác định [72]:

Q = 10 có nghĩa là có 1 base sai trong 10 base (10%)

Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát quy trình phân tích genome và đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể

Q = 20 có nghĩa là có 1 base sai trong 100 base (1%) Q = 30 có nghĩa là có 1 base sai trong 1000 base (0,1%)

Phần mềm FastQC v0.11.9 được sử dụng để kiểm tra và đánh giá chất lượng dữ liệu thô thu được sau khi giải trình tự [73] Phần mềm này sẽ phân tích dữ liệu và cung cấp các thông số cơ bản về dữ liệu như: số lượng trình tự (read), số trình tự lỗi, số trình tự lặp lại nhiều lần, kích thước của các trình tự, %GC và biểu đồ phân bố chất lượng của dữ liệu.

2.2.2.2 Lắp ráp genome: Nguyên tắc:

Khi sử dụng hệ thống Illumina hoặc bất kỳ công nghệ nào khác để giải trình tự gene của sinh vật, genome không được giải hoàn chỉnh chỉ bằng một trình tự duy nhất mà cần phân cắt thành nhiều đoạn nhỏ và tiến hành giải trình tự các đoạn gene đó Như vậy, sau khi đã hoàn tất giải trình tự các đoạn gene nhỏ, cần dùng một thuật

toán để lắp ráp de novo các đoạn trình tự ngắn thành đoạn trình tự liên tục (gọi là

contig)

Phần mềm sử dụng để lắp ráp genome ở bước này là Unicycler v0.4.8 được tạo lập vào năm 2016 bởi nhóm nghiên cứu của Ryan R Wick Unicycler sử dụng các đoạn trình tự ngắn để xây dựng biểu đồ lắp ráp genome ban đầu và sau đó căn chỉnh bằng cách sắp gióng các đoạn trình tự dài với biểu đồ lắp ráp để tạo ra bộ gene hoàn chỉnh với tỷ lệ sai sót nhỏ và ngay cả khi độ chính xác của các đoạn trình tự ban đầu thấp [74] Ngoài ra, Unicycler cho thấy tính tiện lợi khi chỉ cần sử dụng một lệnh duy nhất mà không cần người dùng cung cấp các tham số đính kèm khác, điều này khiến cho người mới sử dụng dễ dàng tiếp cận hơn

Cách tiến hành:

Dữ liệu thô thỏa điều kiện khi kiểm tra chất lượng được đưa vào phần mềm Unicycler để tiến hành lắp ráp bằng cách sử dụng câu lệnh “unicycler [-h] [-1 SHORT1] [-2 SHORT2] -o OUT” Tiếp tục tiến hành ánh xạ và tính độ bao phủ của các trình tự với genome đã được lắp ráp bằng phần mềm bwa v0.7.17-r1188 [75] và

samtools v1.13 [76] Cuối cùng kiểm tra chất lượng genome lắp ráp bằng phần mềm Pilon (v11.0.13)

Các thông số chi tiết:

Sau khi lắp ráp, kết quả được đánh giá theo các thông số bằng phần mềm Quast:

- Chiều dài genome lắp ráp

- Chỉ số N50: giá trị mà một nửa contig của hệ gene lớn hơn hoặc bằng giá trị đó Chỉ số N50 dùng để đánh giá độ liên tục, tính toàn vẹn của các contig nhưng không đánh giá được độ chính xác của trình tự

- Độ bao phủ của genome: giá trị trung bình của số lần một vị trí nucleotide được giải trình tự Độ bao phủ xác định các biến thể cũng như đánh giá độ chính xác của vị trí nucleotide

- Tỷ lệ phần trăm trống (percent gap): được biểu diễn thông qua số nucleotide ‘N’, dùng để đánh giá độ hoàn thiện của genome

2.2.2.3 Chú giải cấu trúc: Nguyên tắc:

Chú giải cấu trúc gene hay còn gọi là tiên đoán gene, là quá trình xác định các trình tự mã hóa cho protein (gọi là các ORF – Open reading frame) cũng như vị trí của chúng trên genome; ngoài ra còn nhận diện các trình tự không mã hóa cho protein và những yếu tố cần thiết khác của bộ gene như trình tự rRNA (ribosome RNA), tRNA (RNA vận chuyển) và nhân tố chuyển vị IS (insertion sequence) [77] [78] Nhằm xác định vị trí của gene trên genome, có hai loại phương pháp thường được sử dụng: (1) Phân loại các vùng DNA theo thông tin di truyền (ví dụ vùng mã hóa và vùng không mã hóa) bằng phương pháp cảm ứng nội dung bên trong/bên

ngoài (intrinsic/extrinsic) và (2) Tìm kiếm tín hiệu biểu thị cho sự hiện diện của các

vị trí chức năng đặc trưng cho một gene (các mối nối, vị trí poly(A), promoter, )

[79]

Trong bài nghiên cứu này, máy chủ trực tuyến RAST v2.0 (Rapid Annotation using Subsystem Technology – Chú thích nhanh sử dụng công nghệ hệ thống phụ -

https://rast.nmpdr.org/) được sử dụng để chú giải bộ gene của thực khuẩn thể và tạo ra các tệp đầu ra tuân theo tiêu chuẩn RAST là một dịch vụ trực tuyến miễn phí cho phép người dùng chú thích bộ gene sinh vật nhân sơ, TKT hoặc plasmid (được lắp ráp hoàn chỉnh hoặc gần như hoàn chỉnh > 97%) dựa trên nền SEED, NMPDR [80][81][82] Quá trình giải trình tự thường mất vài phút đến một ngày phụ thuộc vào số lượng dữ liệu trình tự trong hàng đợi và kích thước dữ liệu trình tự cần chú thích

Các thông số chi tiết:

Kết quả mong muốn là dữ liệu cấu trúc và vị trí các thành phần trong genome thực khuẩn thể dưới dạng các file:

- gff: file dữ liệu về các CDS

- fna: file chứa dữ liệu về các thành phần genome ở dạng trình tự nucleotide - faa: file chứa dữ liệu các thành phần genome ở dạng trình tự protein

2.2.2.4 Chú giải chức năng: Nguyên tắc:

Chú giải chức năng cho các protein được mã hóa bởi các CDS đã xác định là một công đoạn quan trọng làm tiền đề cho các bước xử lý tiếp theo nhằm nghiên cứu sâu hơn về các cơ chế, vai trò của gene trong các quá trình trao đổi chất và sự sống của sinh vật Cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ NGS, hàng trăm nghìn bộ gene đã và đang được giải trình tự Điều này mang đến sự tăng trưởng theo cấp số nhân về kích thước của cơ sở dữ liệu protein và đem đến khó khăn khi chú thích và mô tả đặc tính mới của protein nếu chỉ dựa vào các kỹ thuật xét nghiệm

Chính vì vậy, nhiều công cụ và phần mềm hiện nay đã được phát triển để giải quyết khó khăn này của cộng đồng nghiên cứu khoa học; bằng cách sử dụng các thuật toán so sánh tương đồng (homology và similarity) để truy vấn và dự đoán

chức năng của protein dựa trên sự tương đồng của nó với các protein đã xác định cấu trúc và chức năng trước đó trong các cơ sở dữ liệu NCBI, TIGRFAM, Pfam, PRK HMM [83] Ngoài ra, dữ liệu về họ protein và vùng bảo tồn (domain) của protein cũng được xác định bằng NCBI Conserved Domains Database [84]

Cách tiến hành:

Sử dụng công cụ BLASTP trên web server của NCBI với giá trị e-value cut off là 0,001 để tìm kiếm tương đồng với cơ sở dữ liệu NCBI non-rebudant nucleotide database và web server của NCBI để tìm kiếm các motif trên NCBI Conserved Domains Database

Các thông số quan tâm: Xác định các protein chức năng, protein cấu trúc,

domain của hệ protein trong genome thực khuẩn thể

2.2.2.5 Lập bản đồ genome và phân tích cây phát sinh loài: Cách tiến hành:

Tiến hành lập bản đồ genome và xây dựng cây phát sinh loài thông qua 3 bước: (1) lập bản đồ gene bằng công cụ trực tuyến Proksee (đường liên kết

https://proksee.ca/) [85], (2) sắp gióng cột các trình tự tương đồng bằng công cụ trực tuyến MAFFT (đường liên kết https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)[86] và (3) xây dựng cây phát sinh loài dùng phần mềm MEGA v10 [87]

Ở nghiên cứu này sử dụng protein bảo tồn trong genome thực khuẩn thể là

terminase large subunit (terL) để xây dựng cây phát sinh loài với các thực khuẩn thể

tương đồng khác (sử dụng BLASTP để tổng hợp các trình tự tương đồng khác) Trong đó, lịch sử tiến hóa được suy ra bằng phương pháp Maximum likelihood và mô hình thay thế Jones-Taylor-Thornton (JTT) bởi phần mềm MEGA X (bootstrap 1000) Chiều dài nhánh cây có cùng đơn vi với khoảng cách tiến hóa

Thông số cần quan tâm: Cây phát sinh loài dựa trên terL của thực khuẩn thể

và mối liên hệ với các thực khuẩn thể khác

2.2.2.6 Tính an toàn của thực khuẩn thể:

Nguyên tắc: Đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể thông qua việc kiểm

tra:

- Gene kháng kháng sinh - Gene tạo độc tố

- Các gene độc lực của vi khuẩn và TKT

- ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)

Công cụ ResFinder được phát triển bởi nhóm nghiên cứu Đan Mạch nhằm cung cấp một nền tảng dữ liệu kháng kháng sinh mở và miễn phí dành cho các nhà nghiên cứu [89] Phiên bản mới nhất của ResFinder sử dụng BLAST kết hợp với công cụ sắp gióng KMA để tìm kiếm tương đồng với các trình tự tham chiếu trong cơ sở dữ liệu [89]

- Virulence Factors of Pathogenic Bateria database (VFDB –

http://www.mgc.ac.cn/VFs/)

Các yếu tố độc lực ở mầm bệnh vi khuẩn thường là toxin, enzyme, một số cấu trúc bề mặt tế bào (polysaccharide dạng nang, lipopolysaccharide và protein màng) [90] Cơ sở dữ liệu VFDB cung cấp các thông tin về các yếu tố gây độc ở 16 vi khuẩn quan trọng, các gene liên quan đến độc lực cũng như các đặc điểm cấu trúc và chức năng quan trọng của protein [90] Công cụ VFDB cho phép người dùng tìm kiếm dự liệu bằng văn bản, tìm kiếm bằng BLAST và theo danh mục chức năng của yếu tố độc lực

Thông số cần quan tâm: Tính an toàn của thực khuẩn thể khi áp dụng trong

thực tế

2.2.3 Đánh giá hiệu quả của liệu pháp thực khuẩn thể trên cây cà chua trong vườn ươm:

2.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên độc lực của vi khuẩn PS003 trên cây cà chua ở quy mô phòng thí nghiệm:

Thí nghiệm được thực hiện ở khu vực phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa TP HCM Quy trình thực hiện được mô tả chi tiết trong hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm thử nghiệm liệu pháp thực khuẩn thể trên

cây cà chua

• Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên độc lực của vi

khuẩn R solanacearum PS003 trên cây cà chua cherry ở quy mô phòng thí

nghiệm

• Phương pháp: Tăng sinh khuẩn lạc vi khuẩn PS003 lần lượt trong các môi

trường (bảng 2.3) và nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Sau khi ly tâm loại bỏ môi trường, huyền phù lại với nước cất tiệt trùng Cây con 20

ngày tuổi được gây nhiễm nhân tạo với chủng vi khuẩn R solanacearum PS003

theo các nghiệm thức trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần môi trường khảo sát

Trong đó, dịch chiết thân cây cà chua thu được bằng cách rửa sạch phần thân cây cà chua, xay nhỏ thân với nước cất theo tỷ lệ 200 g thân cây/1 L nước Sau khi lọc thô bằng vải và ly tâm thu dịch nổi sẽ được phối trộn với CPG theo tỷ lệ và hấp tiệt trùng Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ bệnh trên các cây cà chua

2.2.3.2 Đánh giá hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể lên khả năng phòng và chữa bệnh trên cây cà chua ngoài vườn ươm:

Thí nghiệm này được thực hiện ở khu vực trồng rau ăn quả thuộc Khu Nông nghiệp Công nghệ cao Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Quy trình thực hiện được mô tả chi tiết trong hình 2.4

a) Gieo hạt:

Hạt giống cà chua cherry hữu hạn F1 được cho vào các lỗ trên khay gieo hạt đã chứa sẵn giá thể xơ dừa (với độ dày lớp giá thể bằng 1/2 chiều cao lỗ) Lấp kín các lỗ đã gieo hạt và chuyển sang bàn ươm Tưới nước sạch làm ẩm giá thể Khi hạt