Luận án tiến sĩ sinh học: Xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội (2013 – 2015)

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NOI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DANG THỊ THUY DUONG

XAC DINH Ti LE NHIEM VA MOT SO DAC DIEM DICH TE HOC

KHÁNG SINH TAI BON BỆNH VIEN Ở HÀ NỘI (2013 - 2015)

LUẬN AN TIEN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH Ti LE NHIEM VÀ MOT SO ĐẶC DIEM DỊCH TE HỌC

PHAN TU CUA CAC CHUNG Clostridium difficile MANG GEN DOC TOPHAN LAP ĐƯỢC TỪ BỆNH NHÂN TIÊU CHAY SAU DUNG

CHUYEN NGANH : VISINH VAT HỌC

MA SO : 62420107

LUAN AN TIEN SI SINH HOC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ2 TS VŨ THỊ THU HƯỜNG

HÀ NỘI - 2018

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới

sự hướng dẫn của tập thể cán bộ hướng dẫn Các số liệu trong luận án là một phầnkết quả của đề tài: “Nghiên cứu vai trò gây bệnh và đặc điểm dịch tế học phân tử

của các vi khuẩn ky khí và hiểu khí gây hội chứng tiêu chảy liên quan đến kháng^+99

sinh ở một số bệnh viện ở Hà Nội” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốcgia — NAFOSTED tài trợ, mã số dé tài là 106.03-2012.65, do TS Vũ Thị ThuHường là chủ nhiệm đề tài mà tôi là một thành viên Các kết quả trong luận án làtrung thực và chưa từng được ai khác công bố.

Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Thùy Dương

LOI CAM ON

Luận án này không thé hoàn thành nếu thiếu sự hướng dan, hỗ tro, động viên của

nhiều cá nhân và cơ quan:

Loi dau tiên tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tập thé Cánbộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh

học, Trường Đại học khoa học Tự nhiên, đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyênngành Vi sinh vật học, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tap, đã tận

tình sửa chữa luận án, đặc biệt cô luôn động viên và cho tôi những bài học rất quý giá

khi giải quyết những khó khăn và trở ngại trong học tập cũng như trong cuộc sống; TS.

Vũ Thị Thu Hường, Trưởng phòng Vi khuẩn Ky khí, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinhDịch té Trung ương, chủ nhiệm dé tài “Nghiên cứu vai trò gây bệnh và đặc điểm dich

té học phân tử của các vi khuẩn ky khí và hiểu khí gây hội chứng tiêu chảy sau dùng

kháng sinh ở một số bệnh viện ở Hà Nội” với mã số dé tài là 106.03-2012.65 do Quỹ

Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia tài trợ, đã cho phép tôi tham gia đề tài,được sử dụng một phan số liệu trong dé tài vào luận án, đã tận tình hướng dẫn chỉ bảođể tôi nắm vững các thao tác kỹ thuật cũng như các kiến thức chuyên sâu về doi tượngnghiên cứu, tận tình giúp tôi sửa chữa hoàn thiện luận án, cô dẫn dat chi bảo tôi trở

thành một nhà nghiên cứu khoa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phong Đào tạo Sau Dai học và Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi diéu kiện tốt nhất cho tôitrong suốt quá trình học tập

Toi xin tran trọng cam ơn Dang ủy, Hội dong Trường, Ban Giám hiệu, Labo

XNATVSTP, đặc biệt TTND PGS TS Vũ Đình Chính, TS Dinh Thị Diệu Hang

Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi di học

và hoàn thành luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Viện Vệ sinh Dịch té Trung ương đã taomọi điều kiện cho tôi trong quá trình tôi làm nghiên cứu dé tài ở Viện.

Tôi xin chân thành cảm on ThS Tăng Thi Nga, CN Lê Thị Trang, CN Pham Thi

Hồng Thủy, BS Phùng Thu Hang đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập mẫu, thực hiện kỹ

thuật trong thời gian tôi làm việc tại phòng Vi khuẩn Ky khí.

Tôi xin chân thành cảm on các thay cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Trường DHKhoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và các bạn đồng nghiệp tại trườngĐH Kỹ thuật Y tế Hải Dương đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ, động viên tôi trong suốt

quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bé, Me, Chong, các con, những người thânyêu đã động viên và hỗ trợ rất nhiều về thời gian, vật chất và tinh than dé tôi vượt qua

mọi khó khăn trong quả trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

ĐĂNG THỊ THÙY DƯƠNG

1.1 TIEU CHAY SAU DUNG KHANG SINH -222ccc+++ttteccevrxe 14

1.1.1 Định ng hĩa - 5< 2< 5S 9 9 TH 0 0 00006000806 14

1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng khang sỉnh ‹ 14

1.2 VI KHUAN Clostridium difficile -522222222222c¿+ettttEEEEEEEEvveeeerrrrrrrrrre 161.2.1 Đặc điểm sinh hOC cccsccssssssssssscescecsescessessssssecsessesseeeesecsscsucsecseeseseesseenees 16

a 16

L212 Hinh thé Nuu 161.2.1.3 NUGi CAY maaa Ả 161.2.1.4 Tinh chất sinh NO cessesscsssessesssessessesssssssssessessesssessessessusssessessessusssesseesess 181.2.1.5 Sức để KNGNG cesceccesesscsscssssesessessessessessesssssessssessessssssssessssestsasssessesseeseeees 181.2.2 Độc tố của C difficile e«ccssceceereertesresreertertssrssrkerrsrrssrssrssre 181.2.2.1 Độc tổ TcdA và TCAB veceecessessssssessessesssssessessesssessecsessesssessessesssesseeseesees 181.2.2.2 DOC 6 KEP CDTynNốhn AẦ ÔỎ 231.2.3 Cơ chế gây bệnh: cccccsssssssssessesssessessesssssssssessessnssssssessessssssssscssessnssseeseessees 23

1.2.4 Các bệnh do C difficile gây ra c G55 s0 090 196 856.0 24

1.2.5 Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C difficile -« s « 261.3 TINH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC - 271.3.1 Trên thé giới -¿ ©2©VVV22++22EEE11112122222111111222211111112.22.111112 101111 c E.e 271.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng do C diffieile -©ce©cccceceererssrsee 271.3.1.2 Dịch té học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh 29

1.4.3.1 Trung hòa độc tô tế bào (CCCNA — cell culture cytotoxicity

NECULVALIZATION ASSAY) SE 00n0n0n80808Ẻ8 Ầ e 40

1.4.3.2 Phương pháp miễn dịch hấp phụ enzym (EIAs hoặc ELISA) 411.5 CAC PHUONG PHAP PHAN LOAI PHAN TU CAC CHUNG Clostridium

difficile MANG GEN DOC TO sssssssssssssssssssessssssssseeessssssssesesessssssssssesssssssesssssssssesesssssssees 42

1.5.1 Phương pháp PCR ribotyping .o- <5 55s n1 ngu” 421.5.2 Phương pháp giải trình tự gen SÏJ0Á 0-5 << 5s s5 5 5996.” 43

1.5.3 Các phương pháp khác << s9 9 9 Hi 00096 0 44

CHUONG 2 DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 472.1 DOL TƯỢNG NGHIÊN CỨU :cccc522rcreccvvvEttrrrtrerrtrrrrrrrrrrrrrtrrd 472.2 C6 MẪU, THỜI GIAN VÀ DIA DIEM NGHIÊN CỨU - 41

2

2.3 THIẾT KE NGHIÊN CỨU -2 2-©t2EEESEEE+2EEEtEEEEtEEEEtEEEEtEEEetEEEesEEseerres 482.4 CAC BIEN SO NGHIÊN CỨU -2¿¿2¿+++++++++222222222222222222222221121121222Xe 482.4.1 Mẫu bệnh phẫẩm . << 5£ s£ s£ 8£ s£Ss£S£Es£ s9 EsEs£Es£Ssesessessrsersee 48

2.4.2 Thông tin bệnh nhânn d ó5 6 9 99 589 999.989 999 5905909985899988999 49

2.5 VAT LIEU NGHIÊN CỨU -2222222222222222++++++++ttttttttttEErrrrrrrrre 502.5.1 Chủng Vi khuẩn - se s< se sESsESsESsEseEseEseEseEsessessessrserserserse 502.5.2 Simh PHAM 08h 512.5.3 Môi trường nuôi CẤy s- se ©ss©ss+sseEsEssesserserserssesserserserssssee 522.5.4 Thiết bị, dụng Cụ . s- << se cssvssexserseEsstsstrserserssrsssrserserssssse 532.6 NỘI DUNG VA CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 54

2.6.1 Đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trường

e0 54

2.6.2 Nuôi cấy phân lập C difficile mang gen độc tố - . -5-s°-<¿ 562.6.2.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ mẫu phâh +52 562.6.2 2 Xác định chủng vi khuan C difficile và phân loại độc tố 57

2.6.3 Phương pháp nested PCR - << 5s se n0 890.50 592.6.4 Phương pháp PCR ribotyping -.os- 5= < 5s sen 190 896 36 602.6.5 Phương pháp giải trình tự gen SÏJ2 co s55 s2 5s 59365955995 62

2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU -¿¿2¿++++++++++2222222222EEEEEEErrrrr 642.8 PHƯƠNG PHAP XỬ LÝ VÀ PHAN TÍCH SỐ LIỆU - 65CHUONG 3 KET QUA VÀ BAN LUẬN -c 5s cscsscssesseeserssessee 663.1 TI LỆ NHIEM C difficile MANG GEN DOC TO Ở BỆNH NHÂN TIÊU CHAY

SAU DUNG KHÁNG SINH hieeccecessssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssisnsinisssusssssusscsssessesseseececceeeees 663.1.1 Kết quả đánh giá hiệu năng và xác định giới han phát hiện của

môi trường C(CÌMA 5 sọ TH 0000 000000000050 66

3.1.1.1 Tính năng suất - - 2= + SE+S£+EE+EE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkerkerkres 66

KIEN XS (|,)1‹/.0n-Ä(fc0cẮc 663.1.1.3 Giới hạn phát hiện của môi trường CCMA - -«<<s<<s<++ 67

3.1.2 So sánh phương pháp nested PCR với phương pháp nuôi cấy

C difficile mang gen độc tỐ -s-s-s< se ©ssssecsetssSssersersersstsserserserssssse 70

3.1.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy

sau dùng kháng SỈInHh o5 G2 S9 9 9 9.0.9 9 0 0009008096 75

3.1.3.1 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố (C difficile MGĐT) 75

3.1.3.2 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo kiểu độc tỐ . -:-cs-52 793.1.3.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo đặc điểm nhân khẩu học 83

3.1.3.4 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tién sử sử dụng kháng sinh 89

3.1.3.5 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo 95

3.1.3.6 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGDT theo khoa và bệnh viện 97

3.2 BAC DIEM DICH TE HOC PHAN TU CUA CAC CHUNG Clostridium difficileMANG GEN BOC TO essssssssssssessssssssssssssssssessssseseesssssssssssssssseeeessssssssuesesssseesesssssssnvesseseeeeee 993.2.1 Đặc điểm dich té học phân tử C difficile MGDT theo phương phápphân loại PCR rÏb0fyDỈIIE 0 G5 <5 9 9 9 9 9 00.09 0040600866 993.2.1.1 Kết quả phân ÌOqi - 5+ 5+S++S£+E£+EE+E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkerkerres 993.2.1.2 Sự phân bố của các riOfJĐE - 5e eSt+E+k‡ceEeEEEEErrrrrrkeree 1023.2.1.3 Sự phân bo các ribotype C difficile lưu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nộiso với một số nước trên thé giới + S5 +t‡EkÉEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrreei 1073.2.2 Đặc điểm dịch té học phân tử các chủng C difficile MGĐT theophương pháp giải trình tự gen SÏƑ <5 5G 5< S59 9 551996995 1093.2.2.1 Kết quả phân ÏOại -2-©5¿©c<+EE‡Ek£EESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrrrrkervee 1093.2.2.2 Mối quan hệ di truyền gen slIpA giữa các chủng trong nghiên cứu vàCC g/71/1.8112/87/15-12Đ8 RE tta 113

0n — 119

KKTEN (60 — 120DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIÁ ĐÃ CÔNG BÓ

CÓ LIÊN QUAN DEN LUẬN ÁN <5 scsecsstssesserserssrssersrrsrre 121TÀI LIEU THAM KHAO ° 2-2 s2 S2Ss£EseEssESsESseEserssessersersers 122

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

ADN Axit DeoxyRibonucleicARN Axit Ribonucleic

bp Base pair

BHI Brain heart Infusion (Canh thang não tim)

CCMA Cyclocerine — Cefoxitin — Manitol — AgarCCFA Cyclocerine — Cefoxitin — Fructose — Agar

CCMB Cyclocerine — Cefoxitin — Manitol — Broth

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm phòng ngừa va kiểm soát bệnh, Mỹ)

CEU Colony form unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CI Confidence Interval (khoang tin cay)

C difficile MGĐT_ C difficile mang gen độc tố

Elisa Enzym linked — immusorbent assay

(Thử nghiệm hap phụ miễn dich gắn enzym)

GAM-HT GAM - Horse Taurocholate

kb KilobasekDa Kilodalton

MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiêu)

MLVA Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis

(Phân tích trình tự lặp lại ngẫu nhiên)

MLST Multilocus sequence typing (Phân tích trình tự đa locus)MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus

Odd Ratio (tỉ suất chênh)

Polymerase Chain Reaction

Pulsed Field Gel Electrophoresis (Điện di xung trường)

Endonuclease Restriction Analysis

(Phân tích đoạn nhờ enzym giới han)

Society for Healthcare Epidemiology of Americaand the Infectious Diseases Society of America

(Hiệp hội nghiên cứu dich té học của Mỹ/ các bệnh truyền

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cac dạng hình thai của C đjƒfi€iÏe -s- S25 +S+cseksserserseersserrres 17

Hình 1.2 Đặc điểm khuẩn lạc C đjƒficile ¿ ¿- c+©5z+c++c+crxerksresrxerecres 17Hình 1.3 Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C đjƒficile -:-5¿ 19Hình 1.4 Cấu trúc của TcdA và TcdB, vị trí và chức năng hoạt động của mỗi

B00 111 20

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của các độc tố TcdA và TcdB -s-s+cscssxseee 22Hình 1.6 Các thể nhiễm trùng do C difficile 2-©5¿©52+c+cccccxcczssrxerxeces 25Hình 1.7 Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013 2: s2 s2 30Hình 1.8 Hệ thống hộp ủ GasPak 2-2 S£+E2EE2EE£EEEEEE2EESEEEEEEEEErEkrrkrrkrrer 36Hình 1.9 Cau trúc gen slpA của C đjƒficile -¿ +©x+ccz+e+rerxerkerresrkerrcres 44

Hình 2.1 Quy trình thu thập mẫu và thông tỉn - -c<- 2< 55: 49

Hình 2.2 Nội dung và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 54

Hình 2.3 Kết quả PCR đa mồi trên các chủng C difficile sinh độc tô và không sinhhon 58Hình 2.4 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng nested PCR -5:5¿ 55+ 60

Hình 3.1 Khả nang moc của C difficile trên môi trường CCMA và GAM -HT 66

Hình 3.2 Kha năng ức chế các vi khuẩn khác của môi trường CCMA 67

Hình 3.3 Ti lệ nhiễm C difficile MGDT tai 4 bệnh viện ở Hà Nội va

MOt SỐ THƯỚC - E233 SE EEEEEEEEEE E111 1191111151 111111111151 11111 111711117 xeE 77Hình 3.4 Ti lệ dong vi khuẩn C difficile AB* tai bốn bệnh viện ở Hà Nội va

MOt SỐ THƯỚC - St S9 SE EEEESEEEEEESEEEEEEEEEE E1 1111111111111 1151111111111 11171 cxeE 82Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR riboftyping - 2-5 525522 sẻ 100Hình 3.6 Tỉ lệ các ribotype trong quan thể nghiên cứu . ¿-s+ 5+: 102

Hình 3.7 Sự lưu hành của các ribotype tại 4 bệnh viện Hà Nội 103Hình 3.8 Sự lưu hành của các ribotype C difficile qua các năm 103

Hình 3.9 Sự phân bố các phân nhóm sIpAST ở 4 bệnh viện - : 111Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền gen sipA giữa các chủng trong nghiên cứu va

các chủng trên thé giới ¿- 2: +: ©5+©+£+EE+2EE£EEEE2EE2E12212112711271211 21121 re 115

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh đo 15

Bảng 1.2 Các ribotype phô biến ở một số nước trên thé giới - - 3lBang 1.3 Các phương pháp phân loại phân tử C difficile -« <<<++ 45Bang 2.1 Danh sách chủng vi khuan sử dụng trong nghiên cứu - 50

Bảng 2.2 Trình tự các cặp môi trong phản ứng PCR đa môii - 5-52 51Bảng 2.3 Trinh tự các cặp mỗi cho phản ứng nested PCR -. -5- 51Bang 2.4 Cặp mỗi dùng cho phương pháp PCR ribotyping - 52

Bang 2.5 Trình tự các cặp môi sử dụng cho PCR giải trình tự . 52

Bang 2.6 Thành phần môi trường CCMA - ¿2 2 5E+2E22EE+EE+EEtEEEzEzrxerxezex 53Bang 2.7 Thành phan phan ứng PCR đa mỖìi - 2-2 2 2 2+S£+E££E+£E+£xezszsez 57Bang 2.8 Kết quả phân loại độc tố bằng PCR đa môii 2-5555 s22 5+2 58Bảng 2.9 Thanh phan phản ứng nested PCR.u cssccssesssesssesssecsssseessecssecsessesssecsseess 60Bang 2.10 Thanh phan phan ứng PCR ribotyping - 2-2 s2sz+zs+zx+zxzsz 61Bang 2.11 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ribotyp1ng - s- 5 «<< <+s<+s+2 62Bang 2.12 Các thành phan phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen sÏpA - 63

Bảng 2.13 Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen 5-5 5552552 64Bảng 3.1 Tỉ lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 10° bào tử/1g phân 68

Bảng 3.2 Tỉ lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 10” bao tử/ 1g phân 68

Bang 3.3 Ti lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 10-50 bao tử/1g phân 69

Bang 3.4 Kết quả xét nghiệm mẫu phân bằng 2 phương pháp - 71

Bang 3.5 Các trường hợp đồng nhiễm ¿2-2 E5 EEE£2E£2E£EeEEeEEerkrrexee 73Bảng 3.6 Kết quả xét nghiệm kết hợp song song hai phương pháp 75

Bang 3.7 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGDT theo năm -2- 52552 555xccxszvss+2 76Bang 3.8 Tỉ lệ nhiễm C difficile theo kiểu độc tố 2-2 ++2sz+zs+cxsrxzsz 79Bảng 3 9 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo các đặc điểm về nhân khâu học 84

Bang 3.10 Mối liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu học và nhiễm - 84

Bang 3.11 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGDT theo giới tính qua các năm 85

Bảng 3.12 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGDT theo giới tính ở mỗi bệnh viện 86

Bảng 3.13 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh 91

Bang 3.14 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGDT theo tiền sử bệnh lý kèm theo 96

Bang 3.15 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện - 98

Bảng 3.16 Kết quả phân loại 65 chủng theo phương pháp PCR ribotyping 100

Bảng 3.17 Phân bố của hai ribotype trf và 017 theo một số đặc điểm 106

Bảng 3.18 Các ribotype C difficile lưu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một sốnước trên thé giới - 2 ¿5® ©E£+E£+EE+EE£EE£EEE2EEEEEEEEEEEE2E127171711211771 71.21 1.rxeE 108Bang 3.19 Kết quả phân loại 65 chủng C difficile theo phương pháp sIpAST 110

Bảng 3.20 So sánh trình tự gen s/pA giữa các chủng trong nghiên cứu với các

chủng trên thế giớii ¿2-2-5 £©S£+SE+EE£EE£EEEEEE2EEEEEEEE121122117171121121171 1.1.1 crxeE 113

MỞ DAU

1 TINH CAP THIET CUA DE TÀI

Tiêu chảy sau dùng kháng sinh được định nghĩa là tinh trạng tiêu chảy xảy ra

có liên quan đến việc sử dung kháng sinh gây pha vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩnđường ruột hoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hai sinh độc tố [22] Trongsố các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, Clostridium difficile (C.difficile) là nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất, chiếm từ 10-25% các ca tiêu

chảy sau dùng kháng sinh, 90-100% các ca viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng

sinh [23, 127].

C difficile là vi khuan ky khí tuyệt đối, có khả năng sinh bao tử Vi khuẩnnày đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phô biến ở các nước châu Âu va châuMỹ trong gan hai thập ki qua Ở Mỹ, C difficile là nguyên nhân hàng dau gây ra các

ca tử vong do viêm da dày ruột [41, 61, 105] Các nghiên cứu dich té học phân tử

trên thế giới đã chỉ ra răng có mối liên quan giữa mức độ nặng của bệnh với kiểugen của vi khuẩn, điển hình như tip C difficile BI/NAP1/027 được xác định là cănnguyên gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu và Bắc Mỹ vào đầu thé ki XXI Do vậy,việc nghiên cứu các đặc điểm dịch té học phân tử của C difficile gây bệnh là cần

thiết cho điều tra vụ dịch tiêu chảy trong bệnh viện và phát hiện một típ chủng vikhuẩn có kha năng gây ra các vụ dich mới.

Trong khi, nhiều nước như Anh, Mỹ, Ai-xơ-len có hệ thống giám sát tiêu

chảy bệnh viện nói chung và tiêu chảy sau dùng kháng sinh do C difficile nói riêng

ngày càng được mở rộng và trở thành bắt buộc, nhận thức về tác nhân gây bệnh nàyở châu Á còn rất hạn chế [37] Một số ít nghiên cứu trong thời gian gần đây đã bướcđầu xác định C difficile là tác nhân truyền nhiễm mới nỗi ở các nước Nhật Ban,Trung quốc, Singapore, Hàn Quốc và Thái Lan [71, 86, 92, 109].

Tại Việt Nam, vai trò gây bệnh của vi khuẩn ky khí nói chung va C.

difficile nói riêng chưa được quan tâm đúng mức Một trong những nguyên nhân

của thực trạng này là do thiếu các bằng chứng, cơ sở khoa học chứng minh vai trò

10

gây bệnh của các vi khuân này Trong khi đó, với thực trạng lạm dụng kháng sinh,

môi trường bệnh viện luôn trong tình trạng quá tải và các biện pháp kiểm soát

nhiễm khuan bệnh viện kém hiệu quả ở nước ta đều là các yêu tố làm tăng nguy cơnhiễm trùng do C difficile Từ năm 2012, nhóm nghiên cứu phòng Vi khuẩn Kykhí, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã xây dựng qui trình nuôi cấy và PCRchân đoán nhiễm trùng do C difficile và đã báo cáo các ca bệnh điển hình do C.difficile [2, 4], bước đầu xác định được tỉ lệ nhiễm C difficile nhưng trên lượngmẫu còn nhỏ [5] Tuy nhiên, một vài kết quả này chưa phản ánh đầy đủ tình hình

nhiễm C difficile trong một khu vực Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào phân tích

đặc điểm dịch té học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh ở nước ta Xuấtphát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định tỉ lệ nhiễm và một số

đặc điểm dịch té học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang genđộc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn

bệnh viện ở Hà Nội (2013 — 2015)”.

2 MỤC TIÊU CỦA ĐÈ TÀI

1) Xác định được tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhântiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội

2) Phân tích được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủngClostridium difficile mang gen độc tô

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIEN CUA DE TÀI3.1 Ý nghĩa khoa học

e Đây là một trong số Ít các nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định tỉ lệ

nhiễm C difficile ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh trên cỡ mẫu

lớn Kết quả này không những góp phan bé sung thông tin bị thiếu hụt vềtiêu chảy sau dùng kháng sinh mà còn cung cấp bằng chứng chứng minh vaitrò gây bệnh quan trọng của vi khuan C difficile cũng như nhóm vi khuan kykhí gây bệnh nói chung, vốn ít được quan tâm ở Việt Nam.

e Kết quả về phân loại đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C difficile

mang gen độc tô sẽ là cơ sở khoa học đê xác định môi tương quan vê kiêu

11

gen giữa các chủng vi khuẩn gây bệnh trong một bệnh viện, giữa các bệnh

viện trong khu vực.

3.2.Ý nghĩa thực tiễn

e Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố trên những bệnh nhân tiêu chảy saudùng kháng sinh tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội là 24,9% Đây là bang chứngthuyết phục cho thấy sự cần thiết phải tiến hành xét nghiệm phân tìm C.difficile gây bệnh trong các ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh Kết qua

của các xét nghiệm này sẽ giúp cho các bác sỹ lâm sàng trong việc xử trí, lựa

chọn liệu pháp điều trị thích hợp cho các bệnh nhân bị tiêu chảy sau dùngkháng sinh, đồng thời giúp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện tốt hơn và giảm

gánh nặng cho ngành y tế.

e Kết quả phân loại đặc điểm dịch té học phân tử các chủng C difficile manggen độc tô đã phát hiện được các tip vi khuân gây bệnh phổ biến tại bốn bệnhviện ở Hà Nội là trf, 017, cc835, og39 và dự đoán tip có thé gay ra cac vu dich

là trf Day là thông tin quan trong giúp cho các nhà dich té hoc, các nha quan

ly y tế có biện pháp phòng chống hiệu qua khi dịch bệnh xảy ra.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

Luận án nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi khuẩn kykhí, Viện vệ sinh Dịch té Trung ương Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân bị tiêu

chảy sau khi dùng kháng sinh; có độ tuổi > 15 tuổi; thu thập từ 4 bệnh viện lớn ở HàNội bao gồm bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, bệnhviện Lão Khoa và bệnh viện Đống Đa Một trong những mục đích của nghiên cứu làxác định tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố 6 người lớn, tuy nhiên bệnh việnNhi Trung ương chỉ nhận bệnh nhân dưới 15 tuổi Do vậy, nghiên cứu này đã lựachọn bệnh nhân > 15 tuổi ở 4 bệnh viện trên vào đối tượng nghiên cứu Các số liệunghiên cứu được thu thập trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa Viện vệ sinhDịch té Trung ương và các bệnh viện trên Các khía cạnh về đạo đức của nghiêncứu được thông qua và chấp thuận bởi Hội đồng y đức của Viện Vệ sinh Dịch té

Trung ương.

12

Luận an này thực hiện 4 nội dung nghiên cứu chính Mot /a đánh giá hiệunăng và xác định giới hạn phát hiện của môi trường Cycloserine — Cefoxitine —

Manitol — Agar (CCMA) trong nuôi cấy phân lập C difficile Hai là so sánh phươngpháp nested PCR phát hiện gen sinh độc tố A với phương pháp nuôi cấy phân lập C.difficile mang gen độc tô (C difficile MGĐT) Ba là xác định tỉ lệ nhiễm C difficile

mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh bằng haiphương pháp nested PCR và nuôi cấy Bon là phân tích đặc điểm dịch té học phântử của các chủng C difficile mang gen độc tô bang hai phương pháp phân loại phân

tử PCR ribotyping và giải trình tự gen sl/pA (slpAST).

5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam chứng minh sự lưu

hành của các chủng C difficile thuộc 8 ribotype và 10 phân nhóm slpAST

trên quan thé bệnh nhân bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh, có độ tuổi > 15

tuổi, tại bốn bệnh viện ở Hà Nội Trong đó, các ribotype phô biến nhất là trf,

017, cc835 và og39, các phân nhóm sIpAST phổ biến nhất lần lượt là fr-01,kr-03.1, og39-01 Luận án có vai trò như là bước đi đầu tiên thúc đây hướngnghiên cứu tiếp theo về dịch té học phân tử của các chủng C difficile gâybệnh trên các quần thể bệnh nhân khác nhau và các vùng miền khác nhau ở

nước ta.

Kết quả luận án còn cho thấy, ở nước ta xuất hiện hai phân nhóm slpASTmới so với các phân nhóm đã công bố trên thế giới là fr-23 và fr-24 Trình tựgen sIpA của các chủng nay đã được đăng ký trên ngân hàng Genbank với sốtruy cập tương ứng là LC176667 và LC189481 Kết quả này có ý nghĩa hếtsức quan trọng trong việc điều tra nguồn gốc của các chủng gây bệnh lưuhành giữa các vùng miễn trong một nước, giữa các nước trong một khu vực

và trên toàn thê giới.

13

CHƯƠNG 1

TONG QUAN CAC VAN DE NGHIÊN CỨU

1.1 TIEU CHAY SAU DUNG KHÁNG SINH

1.1.1 Dinh nghia

Tiéu chay sau dung khang sinh dugc dinh nghia 1a tinh trang tiéu chay xay ra

sau khi sử dung khang sinh gây phá vỡ sự cân bang của hệ vi khuân đường ruộthoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hại sinh độc tố [21, 23] Tiêu chảy làbiến chứng phô biến nhất của liệu pháp điều trị kháng sinh Tiêu chảy xảy ra ở 5-

10% bệnh nhân được điều trị với ampicillin, 10-25% bệnh nhân được điều trị vớicefixime, amoxicillin và 2-5% bệnh nhân được điều trị với các kháng sinh khác như

cephalosporins, fluoroquinolones, azithromycin, clarithromycin, erythromycin, và

tetracylin [16] Các biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm đại tràng sau dùng kháng

sinh bao gồm đau bụng, sốt, tăng bạch cầu, có bạch cầu trong phân, giảm albumine,

thành ruột dày được quan sát khi chụp cắt lớp, và những thay đổi đặc trưng khác khikiểm tra nội soi hoặc sinh thiết [21] Các thé lâm sàng của tiêu chảy sau dùng khángsinh dao động từ nhẹ đến nặng, có thể gây viêm đại tràng giả mạc, dẫn đến tắc ruột,hoại tử đại tràng, nhiễm khuẩn huyết và tử vong [21, 23].

1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh

Trong số các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, C difficile lànguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất chiếm từ 10-25% các ca tiêu chảy sau

dùng kháng sinh, 90-100% viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng sinh [23, 127].

Ngoài ra, các vi khuẩn khác bao gồm Clostridium perfringens tip A, Staphylococcusaureus, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp và Candida albicans có thê là nguyênnhân, nhưng ít phổ biến hơn; còn lại phần lớn các ca tiêu chảy nhẹ tự khỏi và không

xác định rõ nguyên nhân [21, 23, 146] Tiêu chảy sau dùng khang sinh do Klebsiella

oxyfoca và E coli O157: H7 luôn tạo ra viêm ngay trên bề mặt và dưới hình ảnh nộisoi giống như viêm đại tràng thiếu máu cục bộ Tiêu chảy do K oxytoca thường

14

được điêu tri với penicillin, không cân điêu tri với metronidazole va vancomycin,

viêm do E.coli O157: H7 việc sử dụng kháng sinh làm cho bệnh nặng hơn [54] Dac

điểm lâm sàng chính dé phân biệt giữa tiêu chảy sau dùng kháng sinh do C difficile

và tiêu chảy sau dùng kháng sinh do các tac nhân khác được chỉ ra ở Bảng 1.1.

Bảng 1 1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh do

C difficile so với các tác nhân khác [21]

Đặc điềmTiêu chảy do C difficileTiêu chảy do các tác

Thường dir đội, cấp tính, nhiềulần/ ngày (5-10 lần), mất nước,rối loạn điện giải, sốt, bạch cầu

trung tính tăng cao trong máu

Thường ở mức độ trungbình

Bằng chứng khichụp cắt lớp hoặc

nỘI SOI

Thường viêm dai trangKhông viêm

Biến chứng Giảm albumine, sưng ruột, thủng

ruột, tái phát khi điều trị với

metronidazole hay vancomycin

Thường không có biến

chứng, ngoại trừ trường

hợp mắt nước nặngKết quả phân tích

Dich té Có thé là 6 dich hoặc không | Không thành dich, rải

1.2 VI KHUẨN Clostridium difficile1.2.1 Đặc điểm sinh học

1.2.1.1 Lich sử

Clostridium difficile được phan lập đầu tiên bởi Hall và O’Toole [54, 62],ban dau vi khuẩn nay có tên là Bacillus difficile Tên “difficile” được sử dụng vớihàm ý vi khuẩn này khó phân lập do đòi hỏi điều kiện nuôi cây ky khí tuyệt đối,môi trường nuôi cấy đặc biệt và khó xác định đặc điểm sinh hóa Về sau, vi khuẩnnày được xếp vào giống Clostridium và đến giữa những năm 1930 được mô tả lầnđầu tiên với tên Clostridium difficile [54, 118] Năm 2016, Lawson và cộng sự đã

phân loại lai Clostridium difficile thành Clostridioides difficile thuộc họ

Peptostreptococcaceae và tên mới này chính thức được sử dụng làm danh pháp quốctế [102] Tuy nhiên, tên thường gọi Clostridium difficile vẫn được phần lớn các nhà

nghiên cứu sử dụng cũng như trong luận án nay sé dùng tên Clostridium difficile.

1.2.1.2 Hình thể

C difficile là trực khuân Gram dương, kích thước 1x3um, ky khí bắt buộc,có khả năng sinh bào tử C difficile có thé tồn tại ở hai dang, dạng tế bào sinh

dưỡng có hoặc không có nội bào tử và dạng bào tử tự do Trên hình ảnh tiêu bản

nhuộm Gram từ canh thang nuôi cấy, ở dang tế bào sinh dưỡng C difficile có dạnghình que, bắt màu tím, kích thước ngắn hơn và nhỏ hon so với loài C perfringens,nội bào tử ở gần đầu cực; ở dang bào tử tự do C difficile có hình dạng giống như

“đầu cái kim” (Hình 1.1) [54].1.2.1.3 Nuôi cấy

C difficile là vi khuẩn ky khí tuyệt đối Do vậy, điều kiện ủ các môi trườngnuôi cây phải đảm bảo không có oxi, thay vào đó là khí trường gồm hỗn hợp các khíN> (80%), CO; (10%), H; (10%) Thời gian tiến hành các thao tác nuôi cấy phải rấtnhanh (thường không quá 20 phút) C difficile là vi khuẩn khó sinh trưởng, đòi hỏimôi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng có bé sung các chất như: vitamin K, hemin,máu ngựa hoặc cừu, nhũ tương lòng đỏ trứng Ngoài ra, dé phân lập được bao tử C.difficile từ các mẫu phân hay mẫu môi trường thì cần phải bổ sung thêm các chat

16

kích thích quá trình nay mầm như cholate, taurocholate, glycocholate hay glycine

[27 147, 159].

Hình 1 1 Các dạng hình thái của C difficile [54]

1: tế bào sinh đưỡng; 2: tế bào sinh đưỡng có nội bảo tử; 3: bảo tử tự do

Đặc điểm khuẩn lac C difficile có thé thay đổi tùy thuộc loại môi trường nuôicấy, từ dạng nhăn đến ghồ ghé, từ màu vàng nhạt đến trắng đục, từ lồi đến det,thường có rễ giả hoặc bờ không đều Trên môi trường phân lập chọn lọc CCMA,khuẩn lạc C difficile có đặc điểm det hoặc hơi lồi, bờ không đều, bề mặt thô ráp,kích thước dao động từ 2-5mm, màu vàng do chuyên hóa mannitol (Hình 1 2).Ngoài ra, có thé nhận biết khuẩn lạc C difficile bằng các đặc tính sau [36, 162]: cómùi rất đặc trưng như mùi phân ngựa hay phân voi (dễ nhận ra mùi này từ đĩa cấychủng thuần); có khả năng phát huỳnh quang màu vàng xanh hoặc lục nhạt khi chiếu

tia UV với bước sóng 360 nm [4] (Hình 1 2).

17

1.2.1.4 Tính chất sinh hóa

C difficile lên men một số loại đường như: fructose, manitol, glucose; không

lên men đường arabinose, lactose, maltose, sucrose; thủy phân được gelatin, không

có lecithinase va lipase, phản ứng indol âm tính, thủy phân được esculin, phản ứng

khử nitrate âm tính [154].

1.2.1.5 Sức đê kháng

C difficile có thé tồn tại ở dạng sinh dưỡng hoặc dang bào tử Dạng sinh

dưỡng thường có mặt trong đường ruột của người và động vật, nhưng nhanh chóng

bị chết khi tiếp xúc với oxi không khí Ở dang bao tử, C difficile có thé sống sót rấtlâu bên ngoài vật chủ, có sức đề kháng cao với các điều kiện khắc nghiệt, hơn 12tháng trong môi trường khô hoặc không có khí [136], sống được trong môi trườngaxit [63]; đề kháng với nhiều chất tay trùng như: ethanol 95%, isopropyl alcohol

70%, chlorhexidine gluconate, hydrogen peroxide 3%, các dung dịch dạng xit chứa

65% ethanol và 0.6% hợp chất chứa ammonium, povidone iodine 10% [63]; có sứcdé kháng trung bình với benzisothiazolinone và isothiazolin-benzalkonium chloride[101] Các chất tây trùng peroxide 10%, potassium peroxymonosulphate, sodiumhypochlorite 1% và sodium dichloroisocyanurate có tác dụng tốt với bao tử C.

e Phân loại các chủng C difficile theo độc tố

Gần như tất cả các chủng C difficile gây bệnh trong tự nhiên đều sản xuấtđộc tố TcdB, và hầu hết các chủng cũng sản xuất độc tố TedA [153] Dựa vao sự cómặt của các độc tô này, các chủng C difficile được phân thành các tip: A*B*, A’B*,ATB và A'B Các chủng mang một trong hai độc tố TedA hoặc TcdB hoặc cả hai

18

độc tố có khả năng gây bệnh, các chủng không sản xuất độc tố nào (AB) không cókhả năng gây bệnh Các độc tô A và B có thé được phát hiện trong phân bệnh nhânbị nhiễm trùng do C difficile và là hai dau ấn đầu tiên cho chân đoán nhiễm trùngdo C difficile [155] TedA là độc tố ruột, TedB có khả năng gây độc tế bào cao hơnTcdA, gấp 10 lần trên tế bào biểu mô ruột của người và thậm chí 500-1000 lần trênmột số dòng tế bào khác [32].Trong những năm 1990, chủng A'BỶ đã được xác địnhgây ra các ca nhiễm trùng nghiêm trong do C difficile, tuy nhiên chiếm tỉ lệ ít hơn

(0,14 -11%) so với chủng A*B* [155].

e Cấu trúc của độc tố TedA, TedB

Các độc tố TedA và TedB được mã hóa bởi các gen tương ứng tcdA, tcdBnam trong locus gây bệnh cua C difficile (được gọi là đảo PaLoc) dai 19,6 kb (kilobase) (Hinh 1.3) [138] O những chung không sản xuất độc tố (AB) vị trí PaLoc

được thay thế bởi một trình tự ngắn gồm 115 bp [138].

tcdR tcdB tcdE tcdA

-#? Sch

không sinh độc tô

Hình 1 3 Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C difficile [138]

Đảo PaLoc dài 19,6 kb ở các chủng sinh độc té (điển hình là chủng thuộc toxinotype 0) Trong daoPaLoc, ngoài hai gen tcdA và tcdB còn có các gen khác bao gồm tcdR, tcdC và tcdE Doan gen dai

115 bp thay thé đảo PaLoc ở những chủng không sinh độc tố

TcdA và TedB có bản chat là chuỗi polypeptid, TedA có 2710 gốc axit aminvới khối lượng phân tử 308 kDa (kilodalton) và TcdB có 2366 gốc axit amin với khốilượng phân tử 270 kDa [32] Cả hai độc tổ A và B đều là các glucosyltransferase, cócấu trúc gồm 4 domain: domain GT (N-terminal glucosyltransferase domain) có chức

19

năng glycosyl hóa các GTPase, nằm ở đầu amino; domain CPD (autocatalytic

cysteine protease domain) thủy phan protein tại vi tri cystein; domain TMD (central

translocation domain) chuyén vị tri va domain RBD (receptor binding domain) bámvào thu thé tế bào chủ, nằm ở dau carboxyl (Hình 1.4) Cả 4 domain này đều có vaitrò tham gia vào quá trình xâm nhập của độc tố vào trong tế bào va glycosyl hóa các

GTPase trong bào tương của các tế bào ruột.

TcdA 543 769 1848 2710

N CPD | TMD RBD Cc

ViAEhoa đông: keto — fide Endesomne ENeasibamarchat chat

Hình 1 4 Cấu trúc của TcdA và TcdB, vi tri va chức năng hoạt động của mỗi

domain [136]

TcdA và TcdB đều có cau trúc gồm 4 domain: GT (N-terminal glucosyltransferase domain); CPD

(autocatalytic cysteine protease domain); TMD (central translocation domain) va RBD (C-terminalreceptor binding domain)

¢ Cơ chế hoạt động của độc tố TedA va TedB

Cơ chế hoạt động của các độc tố A và B được thể hiện ở Hình 1.5 Bước cóvai trò quyết định trong cơ chế này là chuyền vị trí của các domain, xảy ra khidomain RBD ở dau C của độc tố tương tác với thụ thé là các phân tử carbohydratetrên bề mặt tế bao (vi dụ: œGal(I—>3)bGal(1—>4)BGleNac glycan ở chuột) Sau đócác vùng trung tâm và đầu C của độc tố dé dang đi vào trong tế bào nhờ quá trình

20

nhập bào (endocytosis) qua trung gian thụ thể Nhờ pH thấp trong endosome, cácđộc tố bị thay đổi hình dạng làm cho domain TMD bị gấp nếp và chèn vào màngendosome, dẫn đến hình thành các kênh trên màng endosome mở đường cho

domain GT di qua Lúc này, các phân tử InsP6 (inositol hexakisphosphate) bam vào

domain CPD và kích hoạt phản ứng phân cắt nội phân tử giải phóng domain GT vàotrong bảo tương Domain GT xúc tác phản ứng chuyên một phân tử glucose từ cơchat cho là UDP — glucose tới gốc threonine (Thr-37) của các protein Rho, Rac vàCdc42 trong các tế bào đích, khiến cho các protein này chuyên từ dạng hoạt độngsang trạng thái không hoạt động, do đó điều chỉnh một số quá trình sinh lý tế bàonhư làm gián đoạn quá trình hình thành khung xương tế bào va mat đi mối liên kếtchặt chẽ trong tế bào, do đó cấu trúc tế bào bị lỏng lẻo, các thành phần trong tế bàokhông liên kết với nhau như một thê thống nhất và cuối cùng làm chết tế bào [54,136, 142] Tuy nhiên, tùy thuộc vào hiệu lực của CPD hoặc các chất ức chế quátrình tự phân cắt, sự phân cắt và giải phóng GTD bị giảm hoặc bị chặn lại, lúc nàydomain GTD của các độc tố vẫn bám vào màng của endosome Khi ở trạng thái gắnvới mang của endosome, GTD chỉ có thé tương tác và làm thay đôi một lượng nhỏ

các Rho GTPases có mặt xung quanh nó Cả hai dạng GTD tự do và liên kết đềulàm bất hoạt Rho GTPases nhưng ở các bộ phận tế bào khác nhau thì mức độ hoạt

thương mô [32, 136].

21

/ Endocytosis

berm (Clee) +UDP

Hình 1 5 Cơ chế hoạt động của các độc tố TedA và TcdB [108]

Các độc tố bám vao thụ thể trên các tế bao đích và được chuyền vào trong tế bào nhờ quá

trình nhập bào Nhờ quá trình axit hóa trong endosome khiến domain TMD bị gấp nếp và chèn

vào màng endosome, mở đường cho domain GT di qua a) khi có mặt của InsP6 sẽ kích hoạt

domain CPD xúc tác phản ứng phân cắt nội phân tử làm giải phóng domain GT vào trong bào

tương Domain GT tự do xúc tác cho phản ứng glycosyl hóa, chuyền một phân tử gluco từ

UDP-Gluco sang phân tử Rho, Rac, Cd42, do đó làm bat hoạt các protein này.b) trong trường hợp cómặt chất ức chế hoặc hiệu lực domain CPD giảm domain GT không được cắt và vẫn bám vào

màng của endosome Lúc này nó chỉ có hiệu lực đôi với các phân tử Rho, Rac, Cd42 có mặt xungquanh nó.

22

1.2.2.2 Độc tổ kép CDT

Khoảng 10% các chủng C difficile (bao gồm cả các chủng dịch té thuộcNAP1/ 027) có sản xuất độc tố kép (CDT) song song với việc sản xuất độc tố TcdBvà/ hoặc TedA [136]; 6 — 30% các chủng A*B* cũng sản xuất độc tố CDT; đặc biệt2% các chủng A-B- không gây ra tiêu chảy nhưng cũng sản xuất CDT và thường cóở người lành mang C difficile [127] Gen mã hóa độc tố CDT được mã hóa trênvùng nhiễm sắc thé CdtLoc chứa hai gen cdtA và cdtB cau tạo nên độc tố, và mộtgen điều hòa cdtR [121] Gen cđ/A cau tạo nên enzym ribosyltransferase ADP, gencdtB cấu tạo nên thành phần bám của độc tố.

Độc tố kép CDT thuộc về họ các độc tố giống như độc tố iota của vi khuẩnClostridia CDT có vai trò kích thích hình thành các cấu trúc nhỏ giống như các viống có kích thước khoảng từ 5-100 um năm trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, do đólàm tăng độ bám dính của vi khuẩn với tế bào biểu mô ruột [142], tạo điều kiện chovi khuẩn nhân lên mạnh mẽ hơn và quá trình nhiễm trùng cũng diễn ra nặng nề hơn.Những bệnh nhân bị nhiễm C difficile sản xuất cả độc tố CDT song song với cácđộc tố A và B có tỉ lệ tử vong cao hơn 60% so với những bệnh nhân bị nhiễm C.difficile chỉ sản xuất các độc tố A và hoặc B [18].

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

C difficile được truyền vào cơ thê qua đường phân - miệng và gây bệnh khicó sự rối loạn hệ vi khuân đường ruột chủ yếu do liệu pháp điều trị kháng sinh Cácdạng tế bào sinh dưỡng và bào tử của C difficile đi vào cơ thể qua đường miệng.Tuy nhiên hau hết các tế bào sinh dưỡng bị chết bởi axit trong da dày, chi 1% mam

bệnh đi vào ruột non do bào tử của C difficile có khả năng kháng axit Các bào tử

nảy mầm trong ruột non khi tiếp xúc với axit mật Một số yếu tố độc lực, bao gồm

độc tố, lông, roi, SLPs (protein lớp bề mặt), protein thành tế bào Cwp66, Cwp84 vàcác enzym thủy phân được sản xuất bởi C difficile đóng vai trò trong quá trình pháttriển bệnh Trong đó, yếu tố độc lực đặc trưng nhất và quan trọng nhất là các độc tô

TcdA và TcdB.

23

Nhờ cơ chế gây độc và gây bệnh lý tế bào, các độc tô của C difficile tácđộng nhanh chóng đến tế bào biểu mô ruột làm mắt đi sự liên kết chặt chẽ giữa cáctế bào, các tế bào tách rời nhau và gây hoại tử tế bao dé tạo ra các lỗ thủng trong lớpnhay bảo vệ Khi hang rào biểu mô bi thủng, TedA, TcdB và các protein khác tiếpxúc với các đại thực bào dưới niêm mạc, bạch cầu đơn nhân và kích hoạt phản ứngviêm bằng cách kích thích giải phóng cytokine tiền viêm IL-la, IL-1, IL-6, IL-8và yếu tô hoại tử khối u a Sự phân hủy tế bao mast sẽ giải phóng histamine qua đólàm tăng tính thấm của mạch máu dẫn đến mất nước vào khoang ruột và gây tiêuchảy phân lỏng Triệu chứng lâm sàng phản ánh các phản ứng viêm nhiễm bao gồmsố lượng bach cầu tăng cao và sốt, tiêu chảy nặng có thé dẫn đến dau bung, matnước Khi các tế bảo biểu mô ruột bị tốn thương nặng sẽ hình thành giả mạc, bao

gồm các mảnh vỡ tế bào do bị hoại tử, fibrin, dịch nhay, bach cau trung tính va các

tế bào đa nhân khác Trong trường hợp bệnh nặng hơn, phức tạp hơn, bệnh nhân cóthé bị chướng phinh bụng, tắc ruột, loét đại tràng ở các lớp mô dưới có thé dẫn đếnthủng ruột, nhiễm trùng huyết và tử vong Quá trình chuyển đổi từ một phản ứngviêm ở bộ phận niêm mạc đến phản ứng toàn thân dẫn đến hội chứng bệnh lý, baogồm tăng creatinine huyết thanh, suy thận, suy hô hấp cấp tính, và rối loạn chứcnăng của nhiều nội tạng [144].

1.2.4 Các bệnh do C difficile gay ra

Vi khuẩn C difficile được miêu tả đầu tiên vào năm 1935 là một loài thuộchệ vi khuẩn chí nhưng với số lượng thấp ở trẻ khoẻ mạnh và không được coi là cănnguyên gây bệnh Đến năm 1978, lần đầu tiên C difficile được biết có khả năng gâybệnh khi nó được xác định là căn nguyên gây viêm đại tràng giả mạc [73] Các thểlâm sàng của nhiễm trùng do C difficile dao động từ tiêu chảy nhẹ đến các thé viêmnặng có thé gây tử vong, đặc điểm của các thé này như sau [118]:

e Tiêu chảy nhẹ đến vừa: là thé lâm sàng phổ biến nhất của nhiễm trùng doC difficile Bệnh nhân có thể đau bụng, tiêu chảy không có máu, ruộtkhông bị tổn thương.

24

e_ Viêm không hình thành giả mạc: bệnh nhân có các triệu chứng như sốt,khó chịu, tiêu chảy nhiều, phân có thể dính máu, đau bụng từ vừa đến dữdội Bạch cầu tăng và đây có thể là tiêu chí để chân đoán Không hình

thành giả mạc.

e Viém đại trang giả mạc: bệnh nhân có các triệu chứng đau bụng, sốt, tiêuchảy nghiêm trọng, phân có thể có máu Bạch cầu tăng cao, có hình thànhgiả mạc (Hình 1.6 a), đây có thé là dấu hiệu dé chan đoán.

e Đau bụng cấp với hội chứng nhiễm trùng huyết: Hiếm khi C difficile gây

ra hội chứng nhiễm trùng huyết với các triệu chứng: sốt, hạ huyết ap, dau

bụng cấp, chướng phình bung, tắc ruột nhưng không tiêu chảy, ruột bigiãn, có thé tran dịch màng phổi và mang bụng lớn Chan đoán phân biệtlà thủng ruột Bạch cầu có thể lên đến 20x10”/1 Viêm tối cấp có thé xảy raở 3-8% bệnh nhân nhiễm trùng do C difficile [67] Một trong những biếnchứng của viêm tối cấp là phình đại tràng nhiễm độc (toxic megacolon).Toxic megacolon được chân đoán dựa trên triệu chứng phình ruột (>7cm)

kèm theo nhiễm độc toàn thân (Hình 1.6 b).

(Nguén: http://www.umm.edu/patiented/articles/toxic_megacolon_000215.htm)

a) Viém dai trang gia mac qua hinh anh ndi soi b) Toxic megacolon với biéu hién phinh ruột,

chướng bung

25

1.2.5 Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C difficile

Yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu trong nhiễm trùng do C difficile là việctiếp xúc với các chất kháng khuẩn, điển hình là kháng sinh [36] Việc sử dụng batkỳ kháng sinh nào, phé rộng hay hẹp, thời gian dài hay ngắn, một loại hay kết hợpnhiều loại kháng sinh đều làm rối loạn hệ vi khuan chí đường ruột, có thé dẫn đến

sự nhân lên của C difficile nội sinh (có san trong đường ruột) hoặc ngoại sinh (lâynhiễm bào tử C difficile từ môi trường bên ngoài) Các kháng sinh clindamycine,

cephalosporins (đặc biệt là thế hệ 3) và peniciline phố rộng (đặc biệt là clavulanate) là những kháng sinh phổ biến nhất liên quan đến tiêu chảy do C.difficile [21, 73] Các kháng sinh ít phổ biến hon là macrolide, quinolone,tetracyline; các kháng sinh hiếm khi gây tiêu chảy do C difficile là metronidazole,vancomycin [73] Hầu hết các ca tiêu chảy liên quan đến C difficile xảy ra ở ngàythứ 4-9 sau khi ngừng điều trị kháng sinh, tuy nhiên cũng có thé xảy ra ở tuần thứ 8

amoxicillin-sau khi ngừng sử dụng thuốc kháng sinh [67].

Bên cạnh yếu tố dùng kháng sinh, tuổi cao đặc biệt trên 65 tuôi cũng đượcxếp vào nhóm nguy cơ hang đầu cho nhiễm trùng do C difficile Tại Mỹ, số ca tử

vong do C difficile không chỉ tăng theo các năm (từ 793 trong năm 1999 lên 7251

trong năm 2009), mà cũng tăng theo nhóm tuổi, từ 5% ở nhóm tuôi 61-70 lên 10% ởnhóm tuổi >80 [82] Trong năm 2010, có 91% số ca tử vong vì nhiễm trùng do C.difficile xảy ra ở những người trên 65 tuổi, điều này khiến C difficile trở thành

nguyên nhân gây tử vong thứ 18 trong nhóm tuổi này ở Mỹ [82].

Bệnh viện không chỉ là 6 chứa mà còn là một vector truyền bao tử C.

difficile Những bệnh nhân bị nhiễm trùng do C difficile là nguồn lay lan C difficilechính trong các cơ sở chăm sóc y tế Bào tử C difficile được thải ra ngoài môitrường qua phân của những bệnh nhân này, sau đó được truyền đến bệnh nhân khácqua bàn tay của nhân viên y tế hay do tiếp xúc với các bề mặt trong bệnh viện như

dụng cụ y tế, giường, ghế, tay vin cau thang, bồn vệ sinh, Các nghiên cứu cho

thấy 25-30% nhân viên y tế mang bao tử C difficile [118], 30% các bề mặt trong

bệnh viện có bào tử C difficile [149].

26

Nhóm nguy cơ thứ hai bao gồm các yếu tố như: sử dụng thuốc giảm axit dạdày, đặt ống thông mũi, thực quản, hút thuốc lá hoặc các bệnh lý kèm theo Đặt ốngsông thức ăn, ống thông mũi làm tăng nguy cơ nhiễm trùng C difficile gap 3 lần, sửdụng chất ức chế axit dạ dày bằng các chất ức chế bơm proton đều làm tăng nguy cơ

cho nhiễm trùng do C difficile [149].

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC1.3.1 Trên thế giới

1.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng do C difficile

e Châu Mỹ

C difficile đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phổ biến ở các nướcphương Tây trong gần hai thập ki qua Ở Mỹ, C difficile là nguyên nhân hàng đầugây ra các ca tử vong do viêm dạ dày ruột, gần một nửa triệu các ca nhiễm trùng,

ước tính 14000 ca tử vong trong năm 2007, 29000 ca trong năm 2011 và tăng lên

44500 ca trong năm 2014 [41, 61, 105] Năm 2008, có đến 93% số ca tử vong donhiễm trùng do C difficile ở những bệnh nhân trên 65 tuổi [119] C difficile lànguyên nhân phô biến nhất gây ra nhiễm trùng bệnh viện và chi phí chăm sóc sức

khỏe liên quan đến nhiễm trùng do C difficile lên đến 4,8 tỉ đô la Mỹ trong năm2008; 5,4 tỉ đô la trong năm 2014 [41, 46] Theo CDC (trung tâm kiểm soát vàphòng chống bệnh tật Hoa Ky), trong 20 bệnh nhân nằm viện sẽ có 1 bệnh nhânmắc phải nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế và trong khi nhiễm trùng liênquan đến chăm sóc y tế bởi MRSA (S aureus kháng methicillin) đang giảm thì tỉ lệnhiễm trùng do C difficile tiếp tục tăng lên nhanh chóng: cứ 5 bệnh nhân nhiễm

trùng bệnh viện do C difficile sẽ có 1 bệnh nhân bị tái nhiễm trùng; cứ 9 bệnh nhân

trên 65 tuổi bị nhiễm trùng bệnh viện do C difficile sẽ có 1 bệnh nhân tử vong trongvòng 30 ngày sau khi chan đoán [58].

Ở Canada, trong năm 2012 có tong số 37.932 ca nhiễm trùng do C difficile,trong đó 20.002 ca nhiễm trùng ở bệnh viện; 16.326 ca nhiễm trùng ở cộng đồng và

27

1.604 ca trong các cơ sở chăm sóc dài hạn Trong đó, 73% là các ca nhiễm mới,

27% là các ca tái nhiễm Ti lệ nhiễm trùng C difficile cao nhất ở Quebec, tiếp đếnlà Ontario, British Columbia va Alberta [107] Ở Quebec, hang năm ước tính

khoảng 3.700 ca nhiễm trùng bệnh viện do C difficile trong giai đoạn từ năm 2010

-2013 [111].

e Châu Âu

Ở Đông Âu, tỉ lệ nhiễm trùng bệnh viện do C difficile là 21/1000 (2,1%)bệnh nhân nhập viện vì tất cả nguyên nhân Tỉ lệ này cao nhất ở nhóm bệnh nhântrên 60 tuổi, chiếm 83,4%; 40-60 tuổi là 11,9% và nhỏ hơn 40 tuổi là 4.7% [99].

Ở Anh và các nước lân cận, nhiễm trùng do C difficile gia tăng liên tục suốttừ thập niên 90 đến đầu năm 2000 Từ 2007 đến 2010, tỉ lệ nhiễm trùng do C.

difficile giảm 61% [158].e Chau A

Trong khi nhiễm trùng do C difficile nổi lên như bệnh dich chính ở các nướcBắc Mỹ và Châu Âu trong hơn thập ky qua, nhận thức về nhiễm trùng do C difficileở Châu Á còn rất hạn chế [37] Trong những năm gần day, C difficile được báo cáolà tác nhân truyền nhiễm mới nổi của các nước Nhật Bản, Trung quốc, Singapore,Hàn Quốc và Thái Lan

Ở Hàn Quốc, số lượng bệnh nhân nhiễm trùng do C difficile tang từ 700

trong năm 2008 lên 1.177 ca trong năm 2009; 1.714 trong năm 2010 và 2.521 trong

năm 2011 Tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile ở nhóm bệnh nhân trên 65 tuổi là 61,7%

trong năm 2008; 59,5% năm 2009; 66,3% năm 2010 và 67% năm 2011 Số ca tử

vong liên quan đến nhiễm trùng do C difficile tăng 2,5 lần trong 3 năm, từ 69 catrong năm 2008 lên 172 ca trong năm 2011 Trong đó, số ca tử vong ở nhóm nữ giớichiếm 62% Gánh nặng kinh tế ước tính 2,4 triệu đô la trong năm 2008 tăng lên 7,6triệu đô la (tăng 3,12 lần) trong năm 2009; 10,5 triệu đô la (tăng 4,28 lần) trong năm

2010; và 15,8 triệu đô la (tăng 6,45 lần) trong năm 2011 [35].

28

Ở Trung Quốc, tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile tại một bệnh viện ở Thượng

Hai là 17,1/ 10.000 dan trong năm 2007 - 2008 Các ribotype phô biến là 017, 012

và 046 [37].

1.3.1.2 Dịch t học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh

Nghiên cứu mối liên quan giữa thể lâm sàng và đặc điểm kiểu gen của cácchủng C difficile gây bệnh cho thay một số chủng vi khuẩn có xu hướng gây bệnhcảnh nặng nề và là căn nguyên lưu hành trong các vụ dịch, đại dịch, như tip vikhuẩn C difficile BI/NAP1/027 gây đại dịch ở Mỹ và châu Âu [20, 59, 60] Trong

năm 2005, 30 bệnh viện ở Quebec báo cáo tỉ lệ tiêu chảy bệnh viện do C difficile

tăng gấp 5 lần so với các năm trước đó, chi phí ước tính lên đến 13,7 tỉ Euro [97].Nguyên nhân được xác định là do xuất hiện biến chủng độc lực cao C difficile

ribotype 027 [97] Năm 2006, típ độc lực cao này đã lan rộng ra 7 tỉnh của

Canada, tỉ lệ nhiễm và tử vong cao nhất ở Quebec lần lượt là 13/1000 bệnh nhânnhập viện và 7,9% [48] Típ độc lực cao này cũng gây ra nhiều vu dịch ở 11 bangcủa Mỹ trong giai đoạn đầu những năm 2000 [97] Ở Anh, tỉ lệ nhiễm trùng do C.difficile tăng từ 4/10.000 bệnh nhân nhập viện trong năm 2004 đến 83/10.000

trong năm 2005, tỉ lệ tử vong trong một vụ dịch năm 2005 là 22% (19/85 bệnh

nhân) [97] Ở Bồ Đào Nha, vụ dịch do C difficile ribotype 027 đầu tiên đã đượcbáo cáo bởi Oleastro, chiếm 72,7% các chủng phân lập [128] Nhìn chung, các vudịch liên quan đến típ độc lực cao ribotype 027 đều có tỉ lệ nhiễm và tử vong cao

hơn, tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh, đáp ứng kém với liệu pháp điều trị trước

đó và tỉ lệ tái phát cao [40].

Kết quả khảo sát dịch té hoc phân tử nhiễm trùng do C difficile ở Anh chothấy có sự thay đổi đáng ké sự lưu hành của các tip gây bệnh Từ năm 2007 đến2011 C difficile ribotype 027 là căn nguyên chủ yếu của các vụ dịch, tuy nhiên lạicó xu hướng giảm dần từ năm 2012- 2015 Thậm chí một số vùng đông nam và

đông bắc, tip này gần như không còn xuất hiện [28, 50] Bên cạnh đó, xuất hiện các

ribotype mới nổi như 078, 002, 005, 014, 015 [127][115], 176 và 198 [28, 50] (Hình1.7) Ribotype 078 gây ra các vụ dịch ở Bắc Ireland, lưu hành phổ biến ở

29

Netherland và Scotland Điểm đặc biệt là chủng thuộc típ ribotype 078 cũng đượcphân lập từ một số loài động vật, tuy nhiên chưa có bang chứng xác định mối liênquan giữa nguồn thực phẩm này với các ca nhiễm trùng ở người [50] Hai ribotype176 và 198 có nhiều đặc điểm giống với ribotype 027, và cả ba ribotype này đều

được phân loại trong một cụm theo phương pháp phân loại trình tự đa locus

(Multiple Locus Sequence Typing - MLST) [28] Điều này gợi ý rằng có sự đồngtiến hóa trong các ribotype này.

vể Voi v v vế oe GF vo Mk MEE Vor ếđ ý WV Pe Vo PME Vee ý Ýợ ở Ý Vor y

Hình 1 7 Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013 [115]

Mặc dù ribotype 027 và 078 gây ra các vụ dịch lớn ở Bắc Mỹ và châu Aunhưng lại hiếm gặp ở châu A [37] Trong khi đó, các biến chủng A'B” thuộcribotype 017 được xác định là nguyên nhân gây ra các vụ dịch ở Trung Quốc [37],Hàn Quốc [94], Thái Lan [135] Hay ribotype smz (mới được xác định là ribotype018 theo phương pháp phân loại ở châu Âu) là tip gây bệnh phổ biến ở Nhật Bantrong hơn thập kỷ qua và gần đây đã xuất hiện ở Hàn Quốc, Áo, Tây Ban Nha vàSlovenia [37] Sự phân bồ các ribotype ở một số quốc gia theo các năm được tổng

hợp trong Bang 1.2.

30

Bang 1 2 Các ribotype phố biến ở một số nước trên thế giới

Nước Năm Ribotype pho biến Nguồn tham khảo

017, 018.

1.3.2 Trong nước

Kết quả tìm hiểu các nghiên cứu công bố trên thế giới cho thấy chỉ có mộtvài nghiên cứu của Vu Nguyen và cộng sự tập trung vào 2 loại vi khuẩn Bacteroidesfragilis va Clostridium perfringens [125, 126] Các nghiên cứu công bồ trong nướcvề nhóm vi khuẩn ki khí chủ yếu tập trung vào loài C perfringens và trên đối tượngnghiên cứu chủ yếu là động vật và mẫu môi trường [3, 9].

Nhìn chung, nghiên cứu về vi khuẩn ky khí gây bệnh ở người ít được tiếnhành tại Việt Nam Có thê giải thích tình huống này bằng một số lí do sau:

3l

e Nuôi cấy vi khuẩn ky khí thường tốn kém, đòi hỏi môi trường nuôi cấy nhiềudinh dưỡng và điều kiện khí đặc biệt không chứa oxy Điều này làm tăng chỉphí cho các xét nghiệm vi khuân ky khí.

e Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn ky khí thường phức tap Đặc biệt đối với một sốvi khuẩn ky khí tuyệt đối như C difficile, việc phơi nhiễm lâu với môi trườngkhông khí chứa oxy sẽ gây chết vi khuân và nuôi cay không thành công Dođó, thao tác nuôi cấy phải rất nhanh chóng Nếu sử dụng hệ thống tủ nuôi cấyky khí mà không bảo dưỡng và kiểm soát chất lượng khí thường xuyên cóthê là một nguyên nhân dẫn đến thất bại khi nuôi cấy vi khuẩn ky khí.

e Thiếu các bằng chứng vi khuẩn học từ bệnh phẩm lâm sàng nên không khangđịnh được vai trò gây bệnh quan trọng của nhóm vi khuan ky khí Điều này

làm hạn chế sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng cũng như toàn xã hội.

Với thực trạng lạm dụng kháng sinh, môi trường bệnh viện luôn trong tình

trạng quá tải và các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện kém hiệu quả ởnước ta gợi ý rằng tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile có thé ở mức khá cao tại các bệnh

viện Từ năm 2012, phòng Vi khuẩn Ky khí, viện Vệ sinh Dịch té Trung ương là

đơn vị tiên phong nghiên cứu về nhiễm trùng do C difficile ở Việt Nam Nhữngbằng chứng lâm sàng và xét nghiệm vi sinh đầu tiên về các ca bệnh tiêu chảy sau

dùng kháng sinh và viêm đại trang giả mạc do C difficile đã được ghi nhận tại một

số bệnh viện ở Hà Nội [2, 4].

Năm 2014, nhóm nghiên cứu Vi khuẩn ky khí, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ương đã xây dựng thành công phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile mang genđộc tô (nuôi cây) gồm 2 bước cho chân đoán nhiễm trùng do C difficile với mãphương pháp là QT-VKKK-05 Bước 1 là quy trình nuôi cấy phân lập C difficile từmẫu bệnh phẩm phân trên môi trường CCMA và bước 2 là quy trình PCR đa mỗiphát hiện vi khuẩn C difficile, gen sinh độc tố A, B và cho phép phân loại 3 dòng vikhuan C difficile A+B+, A-B+ và A-B- Môi trường CCMA được đánh giá có khảnăng phân lập C difficile cao gap 9 lần so với môi trường CCFA [74], phương phápPCR đa mồi có độ nhạy là 50 vi khuan/ 1 phản ứng, độ đặc hiệu 100% Ứng dụng

32

phương pháp này trên 100 mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh

tại bệnh viện Bạch Mai cho thấy tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile là 14%.

Năm 2015, phương pháp nested PCR phát hiện gen sinh độc tố A với mãphương pháp là QT-VK-5.5.4.3 được phát triển để xác định C difficile mang gen

độc tổ trực tiếp từ phân, và áp dụng trên 115 mẫu phân từ những bệnh nhân tiêuchảy sau dùng kháng sinh tại bệnh viện Bạch Mai Kết quả cho thấy, phương pháp

nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu lý thuyết trên các chủng vi khuẩn là 100%;

trên mẫu lâm sàng có độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự

đoán âm tính lần lượt là 95%, 92,6%, 73,1% và 98,9% (so với phương pháp nuôicấy); tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố theo nested PCR là 22,6% [5].

Năm 2016, một luận văn cao học thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ương đã báo cáo tỉ lệ C difficile mang và không mang gen độc tố bằng phươngpháp nuôi cấy là 22,7% trên 154 mẫu phân từ các bệnh nhân > 5 tuổi có triệu chứng

tiêu chảy sau dùng kháng sinh từ 3 bệnh viện Bạch Mai, Bệnh Nhiệt Đới Trung

ương, Đống Da, trong thời gian từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2015 Trong đó, tỉ lệ

chủng C difficile A*B” là 6,5%, chủng C difficile A'B” là 10,4%.

Như vậy, trong vài năm gần đây, một số ít nghiên cứu trong nước đã đưa rađược quy trình xét nghiệm 2 bước cho chân đoán nhiễm trùng do C difficile, báocáo các ca bệnh điển hình, tỉ lệ nhiễm C difficile Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy2 bước cho chan đoán C difficile đòi hỏi nhiều thời gian, điều kiện cũng như chi phítốn kém trong nuôi cay phân lập và xác định gen sinh độc tố từ chủng phân lập Dovậy, phương pháp này chưa thích hợp là phương pháp chân đoán áp dụng thường

quy tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sang trong các bệnh viện Ngoài ra, một

trong các yếu tố quyết định nuôi cấy phân lập thành công là môi trường phân lập.Trong khi đó, môi trường phân lập CCMA được sử dụng tại phòng vi khuân ky khí

chưa được đánh giá hiệu năng và giới hạn phát hiện Phương pháp nested PCR được

cho là có độ nhạy cao hơn so với nuôi cấy, tuy nhiên cần phải đánh giá trên sốlượng mẫu lớn hơn Hơn nữa, số lượng các nghiên cứu báo cáo về tỉ lệ nhiễm C.

difficile van còn hạn chê và trên lượng mâu nhỏ, do đó chưa làm rõ tình hình nhiễm

33

C difficile ở khu vực đô thị, chưa làm rõ được vai trò gây bệnh của vi khuẩn này.

Đặc biệt, chưa có một công trình nào nghiên cứu về đặc điểm dịch té học phân tử

của các chủng C difficile gây bệnh ở nước ta Vì vây, trong khuôn khổ chương trìnhhợp tác nghiên cứu giữa Viện Vệ sinh Dich tễ Trung ương, Viện Truyền nhiễm

quôc gia Nhat bản, và một sô bệnh viện tại Hà Nội, nghiên cứu này được thực hiệnnhăm 2 mục tiêu chính:

Xác định được tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu

chảy sau dùng kháng sinh

Trong mục tiêu này, nghiên cứu thực hiện các nội dung sau: Mot là đánh gia

hiệu năng, giới hạn phát hiện của môi trường CCMA Kết quả này làm tăngđộ tin cậy cho phương pháp nuôi cấy Hai là mỗi mẫu phân được xét nghiệmđồng thời bang hai phương pháp nuôi cấy C difficile MGĐT va nested PCR.Kết quả của xét nghiệm song song này sẽ xác định được ti lệ nhiễm C.difficile mang gen độc tố, đồng thời so sánh phương pháp nested PCR vớiphương pháp nuôi cấy dé cung cấp cơ sở chứng minh phương pháp nestedPCR có thể áp dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng ở

Theo Hiệp hội dich té học va các bệnh truyền nhiễm của Mỹ (SDEA/ IDSA),

một ca bệnh được chan đoán là nhiễm trùng do C difficile dựa trên tổ hợp bằngchứng về lâm sàng và kết quả xét nghiệm bao gồm: có hiện tượng tiêu chảy 3 lầnhoặc nhiều hơn trong 24 giờ và kết quả xét nghiệm mau phân có độc tố hoặc C.difficile sinh độc tố, hoặc có băng chứng viêm đại trang giả mac qua hình ảnh nội

34

soi hoặc giải phẫu bệnh [36] Dưới đây là các phương pháp thường được sử dụng déchân đoán nhiễm trùng do C difficile.

1.4.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố

Phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố gồm hai bước: nuôi cayphân lập C difficile từ bệnh phâm sau đó xác định chủng sinh độc tó.

1.4.1.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ bệnh phẩme_ Nuôi cấy phân lập

Có nhiều phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile từ phân Nguyên lýchung của các phương pháp này là nuôi cấy mẫu phân hoặc mẫu tăm bông trựctràng trên môi trường rắn hoặc môi trường lỏng có bé sung các chất ức chế sự sinhtrưởng của các vi khuẩn đường ruột khác đồng thời tăng khả năng nảy mam của bàotử C difficile Một số nghiên cứu cho rằng việc xử lý mẫu bang sốc nhiệt hoặc sốc

cồn trước khi cây có hiệu quả phân lập C difficile tốt hơn [28] Hink và cộng sự đãchứng minh phương pháp nhạy nhất dé phát hiện C difficile từ mẫu phân và tămbông trực tràng là sốc nhiệt ở 80°C trước khi cấy vào canh thang cycloserine —cefoxitin manitol broth, sau đó cấy phân lập trên môi trường thạch không chọn lọc[66] Tuy nhiên, hai yếu tố chính quyết định thành công trong nuôi cay phân lập C.difficile là môi trường nuôi cấy phân lập và kỹ thuật ủ.

- Môi trường nuôi cấy phân lập C difficile

Môi trường nuôi cay phân lập C difficile đòi hỏi nhiều chất dinh dưỡng, bổsung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn này như Hemin,

Vitamin K, máu ngựa hoặc cừu và các kháng sinh cefoxitin, cycloserine có khả năng

ức chế sự sinh trưởng của vi khuân khác trong phân Ngoài ra dé tăng cường hoạttính nảy mầm của các bào tử C difficile, cần bố sung các chất kích thích nảy mầm

như sodium taurocholate, cholate, glycocholate, glycine [27, 147, 159] Hiện nay, có

nhiều môi trường khác nhau dùng để nuôi cấy phân lập C difficile như: CCEY

(cycloserin- cefoxitine- egg york agar), CCEYL (cycloserin- cefoxitine- egg lysozym agar), CCFA (Cefoxitin-Cycloserine Fructose Agar), CCMA (Cefoxitin-

york-Cycloserine Mannitol Agar) Hai môi trường CCEY va CCEYL không chon lọc

35

hoàn toàn cho C difficile vì một số loài Clostridia khác như C glycolicum, C.innocuum, C bifermentans và C sordellii có thé sinh trưởng trên các môi trường

này với hình thái khuẩn lạc tương tự C difficile [162] Môi trường CCFA được coi

là môi trường chuẩn dé phân lập C difficile và thường được sử dụng ở châu Âu.Tuy nhiên, một số chủng C difficile bị ức chế bởi nồng độ kháng sinh cycloserin

cao trong môi trường nảy [106].- Kỹ thuật ủ

Đối với vi khuẩn ky khí tuyệt đối như C difficile, sự phơi nhiễm với môitrường không khí chứa oxy quá lâu (> 20 phút) có thé gây chết vi khuẩn, dẫn đếnnuôi cay không thành công Thêm vào đó, chất lượng khí ủ phải 6n định trong quátrình nuôi cấy Hiện nay, có 3 phương pháp ủ tạo được điều kiện ky khí là tủ nuôi cấyky khí, hệ thống phối trộn khí và túi ủ Nếu sử dụng tủ nuôi cấy ky khí và hệ thốngphối trộn khí không bảo dưỡng và kiểm soát chất lượng hỗn hợp khí thường xuyên cóthé là một nguyên nhân dẫn đến that bại khi nuôi cấy vi khuẩn ky khí Hơn nữa, cảhai phương pháp này đều đòi hỏi chỉ phí lớn khi trang bị lần đầu và các chỉ phí bảo trìhàng năm GasPak là hệ thống túi ủ hoặc bình ủ ky khí kín sử dụng cùng túi tạo hỗnhợp khí đặt bên trong và chỉ thị oxi cho kiểm soát chất lượng khí ủ trong quá trìnhnuôi cấy (Hình 1.8) Ưu điểm của hệ thống này là đơn giản, thuận tiện mà vẫn có khảnăng phân lập vi khuân ky khí từ bệnh phẩm lâm sàng tốt như hệ thống tủ ky khí.

Theo tính toán của các nhà sản xuất, chỉ sau 30 phút đến 2 giờ hoạt động, túi tạo hỗnhợp khí đã tạo được khí trường đạt tiêu chuẩn với hàm lượng oxy bằng 0 hoặc <0,1%.

_ Hình 1.8 Hệ thống hộp ủ GasPak

(Nguồn phòng Vi khuân ky khí, viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương)

36