báo cáo thiết bị kỹ thuật shpt

Tại Châu Âu, Châu Đại Dương và Châu Mỹ, chỉ có loài F.patica đặchữu, trong khi ở nhiều khu vực tại Châu Phi và Châu Á, cả F.patica và F.giganticađều phổ biến.Sán lá gan cần vật chủ trung

BÁO CÁO MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SỬ DỤNG KĨ THUẬT PCR ĐỂ CHUẨN ĐOÁN SÁN LÁ GAN

TRÊN CỪU

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT TRẦN VĂN PHÚC

ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN NGUYỄN PHÚC THIỆN

BÀNG ĐỨC QUÂN

TP Thủ Đức, 10/2023

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc và tình cảm chân thành, cho phép em gửi lời cảm ơn tớiTrường Đại học Nông Lâm TP.HCM nói chung cũng như Khoa Khoa học Sinh họcnói riêng đã trang bị, hỗ trợ cơ sở vật chất, tạo cơ hội cho sinh viên chúng em đượctiếp cận với môn Thiết bị và Kĩ thuật CNSH

Đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Huỳnh Văn Biết đã nỗ lực, tận tìnhgiảng dạy, đưa bài seminar này vào chương trình giảng dạy Đối với em và các cánhân khác thì đây là một cơ hội vô cùng ý nghĩa để làm quen, trau dồi kĩ năng, kiếnthức, chuẩn bị nền tảng cho Khóa luận tốt nghiệp sau này

Chân thành cảm ơn anh Trương Quang Toản cũng như các anh chị phòng LAB

207 đã trang bị cơ sở vật chất, tận tình giảng dạy, giúp đỡ chúng em trong quá trìnhhọc Thực hành

Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, nhưng bài cũng thể không tránh khỏi những thiếusót Em kính mong Thầy và Anh sẽ có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để bài của em

có thể được hoàn thiện hơn

Cuối lời em xin chúc Thầy và Anh thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tụcthực hiện sứ mệnh cao đẹp là ươm mầm, truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

TP Thủ Đức, ngày 28 tháng 10 năm 2023

MỤC LỤC

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sán lá gan Fasciola hepatica 2

2.1.1 Cấu trúc của Fasciola hepatica 2

2.1.1.1 Hình dáng, kích thước, màu sắc 2

2.1.1.2 Hình thái bên ngoài 3

2.2.2 Hệ thống sinh sản của Fasciola Hepatica 3

2.2.2.1 Hệ thống sinh sản nam của Fasciola Hepatica 3

2.2.2.2 Hệ sinh sản cái của Fasciola Hepatica 4

2.2.3 Cơ chế lây truyền của Fasciola Hepatica 5

2.2.4 Biểu hiện lâm sàng của Fasciola Hepatica 6

2.2.5 Phương pháp chuẩn đoán 6

2.2.6 Tác hại của Fasciola Hepatica trên cừu 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thu thập và bảo quản mẫu 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 9

3.2.1 Xét nghiệm phân trực tiếp 9

3.2.2 Sử dụng formalin etyl axetat 9

3.2.3 Tách triết DNA 9

3.2.4 Phản ứng PCR 10

3.2.5 Điện di sản phẩm 11

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả 124.2 Thảo luận 12CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tài liệu tham khảo………14

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

F.patica: Fasciola Hepatica

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự primer R và primer F 10Bảng 3.2 Chu kì nhiệt của phản ứng 11

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng của sán lá gan (Fasciola hepatica) 2

Hình 2.2 Cấu tạo của sán lá gan 4

Hình 2.3.Cấu tạo hệ thống sinh sản của sán lá gan 5

Hình 2.4 Vòng đời của sán lá gan 6

Hình 2.5.Sán lá gan được quan sát trên tấm ảnh siêu âm 7

Hình 4.1 Ảnh minh họa kết quả đi 12

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sán lá gan Fasciola hepatica là tác nhân chính gây ra bệnh sán lá gan ở trênngười và động vật, nó cũng chính là tác nhăn chính cho việc truyền bệnh từđộng vật sang người

Fasciola hepatica có một vòng đời phức tạp, qua đó nó yêu cầu sự tồn tại của vậtchủ trung gian và vật chủ cuối cùng để phát triển và trưởng thành qua nhiều giaiđoạn ấu trùng Tại Châu Âu, Châu Đại Dương và Châu Mỹ, chỉ có loài F.patica đặchữu, trong khi ở nhiều khu vực tại Châu Phi và Châu Á, cả F.patica và F.giganticađều phổ biến

Sán lá gan cần vật chủ trung gian để hoàn thành một phần của chu kỳ sống của nó.Các ấu trùng của sán lá gan phát triển trong ốc nước ngọt, ví dụ như dê và ốc tiêu.Điều này thường xảy ra trong các vùng nước ngọt, bao gồm ao, hồ, và dòng sông.Khi đã phát triển ở vật chủ trung gian, sán lá gan cần được ăn bởi vật chủ cuốicùng, bao gồm các loài gia súc như bò, cừu, dê, trâu và thậm chí con người

Nhiễm trùng bởi sán lá gan Fasciola spp trong gia súc gặp thiệt hại kinh tế ước tínhlên tới 3 tỷ USD hàng năm Mặt một, bệnh sán lá gan ảnh hưởng đáng kể đến phúc lợi của động vật và chất lượng thực phẩm xuất phát từ động vật Mặt khác, nó cũng

có tác động quan trọng đến sức khỏe của cộng đồng

1.2 Mục tiêu đề tài

Áp dụng kĩ thuật PCR vào việc nhận biết sự tồn tại của sán lá gan có trongcừu

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Tách chiết DNA của sán lá gan

Nội dung 2: Dùng phản ứng PCR trên doạn gen mục tiêu Spacer

Nội dung 3: Điện di sản phẩm PCR

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sán lá gan Fasciola hepatica

Fasciola hepatica, hay còn được gọi là sán lá gan thường hoặc sán lá gancừu, là một loài dẹp ký sinh thuộc lớp Trematoda, thuộc ngành Platyhelminthes,

có khả năng nhiễm vào gan của nhiều loại động vật có vú, bao gồm cả con người.Bệnh do nhiễm loài sán này thường được gọi là bệnh sán lá gan lớn, hay còn đượcgọi là fasciolosis, một loại bệnh giun sán, và từng được xem như một căn bệnhnhiệt đới bị lãng quên Fasciola hepatica phân bố trên toàn thế giới và gây thiệt hạikinh tế lớn đối với cừu và gia súc Loài sán này đã lâu nay được biết đến như một

ký sinh trùng quan trọng của cừu và gia súc, và đã là chủ đề của nhiều nghiên cứukhoa học Có lẽ đây là loài sán lá nổi bật trong số tất cả các loài sán lá

2.1.1 Cấu trúc của Fasciola hepatica

có màu hơi nâu do mật của vật chủ ăn vào

Hình 2.1 Hình dạng của sán lá gan (Fasciola hepatica)

2.1.1.2 Hình thái bên ngoài

Phần cuối phía trước của cơ thể được phân biệt thành một hình nón miệnghoặc thùy đầu hình tam giác, tạo cho nó vẻ ngoài như vai Thùy đầu, ở đỉnh của

nó, có một lỗ hơi hình tam giác gọi là miệng Có hai giác hút cơ, một giác hútmiệng ở đầu trước bao quanh miệng và một giác hút lớn ở bụng hoặc ổ cối nằm ởgiữa bụng, cách mút miệng khoảng 3 đến 4 mm

Các giác hút là các cơ quan cơ giống như chiếc cốc, chúng được sử dụng

để gắn vào vật chủ bằng cách tạo áp suất thấp Bên cạnh khẩu độ miệng, trên cơthể có hai "lỗ" cố định: một ở giữa bụng, phía trước mút bụng là nơi đặt lỗ sinhdục chung hoặc tuyến sinh dục, và lỗ kia nằm ở đầu sau của cơ thể, được gọi là

lỗ bài tiết

Ngoài những khe hở này, một lỗ mở tạm thời của kênh Laurer xuất hiệntrong mùa sinh sản trên bề mặt lưng ngay phía trước giữa cơ thể Hậu môn yếu doống tiêu hóa chưa hoàn chỉnh

2.2.2 Hệ thống sinh sản của Fasciola Hepatica

Hệ sinh sản của Fasciola Hepatica:

Fasciolapatica là loài lưỡng tính nhưng thường xảy ra quá trình thụ tinh chéo

Cơ quan sinh sản phát triển tốt và phức tạp

2.2.2.1 Hệ thống sinh sản nam của Fasciola Hepatica

Hệ thống sinh sản nam bao gồm tinh hoàn, ống dẫn tinh, túi tinh, ống phóngtinh, xơ hoặc dương vật, tuyến tiền liệt và tâm nhĩ sinh dục Chúng có số lượng làhai, hình ống phân nhánh nhiều và đặt cái này phía sau cái kia (tức là sắp xếp songsong) ở phần giữa phía sau của cơ thể Trên thực tế, chúng chiếm không gianchính từ phía sau phần giữa cơ thể của Fasciola Các tế bào lót thành tinh hoàn tạo

ra tinh trùng Một ống dẫn tinh hoặc ống dẫn tinh hẹp và mảnh phát sinh từ mỗitinh hoàn và chạy về phía trước Hai ống dẫn tinh hợp nhất với nhau gần ổ cối(mút bụng) và giãn ra để tạo thành một túi tinh cơ bắp, dài, rộng, giống như túihoặc túi tinh Nó phục vụ mục đích lưu trữ tinh trùng Túi tinh tiếp tục đi về phíatrước vào một ống rất hẹp và cuộn lại gọi là ống xuất tinh Xơ (dương vật) là mộtcấu trúc cơ bắp và thon dài để ống phóng tinh mở vào Xơ lông mở ra bằng lỗ sinh

dục nam ở tâm nhĩ sinh dục chung Lông của F indica được bao phủ bởi các gainhỏ.Ống phóng tinh được bao quanh bởi nhiều tuyến tiền liệt đơn bào Các tuyếnnày mở vào ống phóng tinh và sự tiết ra của chúng (kiềm) giúp tinh trùng dichuyển tự do trong quá trình giao hợp Tâm nhĩ sinh dục là một buồng chung chocác lỗ sinh dục nam và nữ, nó mở ra bên ngoài bởi một tuyến sinh dục nằm ở phíabụng trước ổ cối Xơ gan có thể bị đẩy ra ngoài qua tuyến sinh dục trong quá trình

giao hợp Xơ hoặc dương vật, túi tinh và tuyến tiền liệt được bao quanh trong mộtbao xơ hoặc túi xơ chung

Hình 2.2 Cấu tạo của sán lá gan 2.2.2.2 Hệ sinh sản cái của Fasciola Hepatica

Hệ thống sinh sản cái bao gồm buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung, tuyếnvitelline, tuyến Mehlis và ống Laurer:

Buồng trứng đơn, hình ống, phân nhánh nhiều và nằm ở phía trước tinhhoàn, phía bên phải của 1/3 phía trước cơ thể.Tất cả các nhánh của buồng trứng

mở ra một ống ngắn và hẹp gọi là ống dẫn trứng Ống dẫn trứng đi xiên xuống và

đổ vào ống dẫn trứng giữa Từ điểm nối của ống dẫn trứng và ống noãn giữa phátsinh một tử cung phức tạp rộng có trứng hoặc viên nang đã được thụ tinh Tử cung

mở ra bằng lỗ sinh dục nữ vào tâm nhĩ sinh dục chung ở bên trái lỗ sinh dục nam

Tử cung tương đối nhỏ và nằm ở phía trước tuyến sinh dục Phần cuối của tử cung

có các thành cơ, được gọi là metraterm giúp đẩy trứng ra ngoài và đôi khi cũngnhận được xơ trong quá trình giao hợp Ở cả hai bên và phía sau tinh hoàn cónhiều nang tạo thành nhung mao, tuyến noãn hoàng hoặc tuyến vitelline tạo ralòng đỏ và chất liệu vỏ chứa albumin cho trứng Các tuyến vitelline mở ra bằng

các ống dẫn nhỏ thành một ống vitelline dọc ở mỗi bên Hai ống dọc được nối vớinhau bằng ống vitelline ngang đặt phía trên giữa cơ thể Ống vitelline ngang bịsưng lên ở trung tâm tạo thành bể chứa lòng đỏ hoặc bể chứa vitelline Từ nơichứa lòng đỏ, một ống vitelline ở giữa bắt đầu và chạy về phía trước để nối vớiống dẫn trứng Một khối gồm nhiều tuyến Mehlis đơn bào được tìm thấy nằmxung quanh điểm nối của ống dẫn tinh giữa, ống dẫn trứng và tử cung Sự tiết racủa tuyến Mehlis bôi trơn đường di chuyển của trứng trong tử cung và có thể làmcứng vỏ trứng, nó cũng có thể kích hoạt tinh trùng Điểm nối của ống dẫn trứng vàống noãn giữa bị sưng lên tạo thành ootype ở một số loài sán lá như F indica,trong đó các bộ phận của trứng được tập hợp lại và trứng được tạo hình, nhưngF.patica lại thiếu một ootype (theo một số cơ quan nghiên cứu) Từ ống dẫn trứng

phát sinh một ống Laurer hẹp, nó chạy thẳng đứng lên trên Ống này tạm thời mở

ra ở mặt lưng trong mùa sinh sản và đóng vai trò như âm đạo vết tích để phục vụnhư ống giao hợp

Hình 2.3 Cấu tạo hệ thống sinh sản của sán lá gan

2.2.3 Cơ chế lây truyền của Fasciola Hepatica

Các giác hút là các cơ quan cơ giống như chiếc cốc, chúng được sử dụng

để gắn vào vật chủ bằng cách tạo áp suất thấp Bên cạnh khẩu độ miệng, trên cơthể có hai "lỗ" cố định: một ở giữa bụng, phía trước mút bụng là nơi đặt lỗ sinhdục chung hoặc tuyến sinh dục, và lỗ kia nằm ở đầu sau của cơ thể, được gọi là

lỗ bài tiết

Hình 2.4 Vòng đời của sán lá gan

2.2.4 Biểu hiện lâm sàng của Fasciola Hepatica

Một số biểu hiện khi nhiễm sán lá gan:

- Đau ở trên góc phần tư bên phải của bụng

- Sốt (không liên tục)

- Gan sưng to, có thể đau hoặc không đau

- Khó chịu (một cảm giác chung của tình trạng không khỏe)

- Giảm cân không rõ nguyên nhân

- Da tái xanh

- Phát ban (nổi mề đay) xuất hiện trong khoảng 20% trường hợp Các triệuchứng khác như chóng mặt và đổ mồ hôi cũng có thể xảy ra khi mắc bệnhsán lá gan, điều này chủ yếu gặp ở trẻ Nốt dưới da và thở khò khè có thểxảy ra khi sán cư trú ở các cơ quan khác

- Người bị nhiễm trùng do ăn gan sống của động vật bị nhiễm bệnh có thể bịđau họng nặng và sưng thanh quản Những người bị viêm ống mật có thểgặp triệu chứng đau bụng nghiêm trọng cùng với sốt dai dẳng và vàng da

- Người bị bệnh viêm tụy có thể gặp phải các triệu chứng nặng hơn như đaubụng nặng, sốt, buồn nôn và nôn mửa, điều này chủ yếu xảy ra ở trẻ em

2.2.5 Phương pháp chuẩn đoán

Các xét nghiệm là phương pháp để chẩn đoán xác định bệnh và mức độ bệnh, baogồm:

- Soi phân, dịch tá tràng hoặc dịch mật theo phương pháp Kato: tìm thấytrứng sán lá gan trong phân hoặc trong dịch tá tràng, dịch mật cho phépchẩn đoán xác định tình trình trạng nhiễm ký sinh trùng Tỷ lệ soi thấytrứng trong các mẫu bệnh phẩm là không cao Bệnh nhân cần được lấy mẫulàm xét nghiệm liên tục trong 3 ngày

- Công thức máu: số lượng bạch cầu tăng cao, ưu thế bạch cầu ái toan

- Xét nghiệm huyết thanh tìm kháng thể sán lá gan trong máu bằng phươngpháp miễn dịch ELISA Kháng thể có thể tồn tại kéo dài sau khi điều trịthành công nên không dùng để chẩn đoán xác định bệnh Các kháng thểIgG, IgM, IgE luôn tăng trong các trường hợp nhiễm sán lá gan

- Test trong da

- Siêu âm bụng: cho hình ảnh tổn thương nhu mô gan dạng tổ ong hoặc tụdịch dưới bao gan, hình ảnh các ổ áp xe Sán lá gan trên siêu âm có thểquan sát được với hình ảnh giống chiếc lá, dẹt nếu kích thước lớn

- CT scan bụng: khảo sát hình ảnh đường mật tốt hơn siêu âm bụng Giãn nởcác ống dẫn mật, không gây tắc nghẽn là hình ảnh đặc trưng trong bệnh sán

lá gan

- Chụp cộng hưởng từ

Hình 2.5 Sán lá gan được quan sát

trên tấm ảnh siêu âm

2.2.6 Tác hại của Fasciola Hepatica trên cừu

Fasciola hepatica thường xâm nhập vào gan của cừu qua dạ dày và ruột non, sau đó

di chuyển qua các mô gan, gây viêm nhiễm và tổn thương cho gan Điều này có thểdẫn đến việc suy giảm chức năng gan và giảm hiệu suất sản xuất của cừu

Khi cừu bị nhiễm ký sinh trùng này, hệ thống tiêu hóa và hấp thụ dưỡng chất bị ảnhhưởng Điều này dẫn đến suy giảm khả năng cận thị và tăng cân, giảm năng suấtthịt, sữa và lông của cừu Do đó, nó có thể gây thất thu kinh tế đáng kể cho ngườichăn nuôi

Fasciola hepatica gây ra triệu chứng sức kháng trong cừu, bao gồm tiêu chảy, sốt,yếu đuối và thiếu máu Các triệu chứng này có thể dẫn đến sự suy yếu và mất sứckháng, làm cho cừu dễ bị các bệnh khác tấn công

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

3.1 Thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu được lấy mẫu phân của các con cừu trong các trang trại có cừu bị nhiễmbệnh hoặc nghi ngờ bị nhiễm, các mẫu được bảo quản trong ống nghiệm ở nhiệt độ4°C, còn trong quá trình chuyển mẫu thì lưu giữ mẫu ở -80°C

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Xét nghiệm phân trực tiếp

Để kiểm tra ký sinh trùng, đổ khoảng 30 ml nước muối thông thường (dung dịchđẳng trương natri clorua 0,9%) vào thùng chứa mẫu và đặt ở nhiệt độ phòng (20–22°C) trong 30 phút Mẫu trộn với nước muối thông thường được đưa qua sàng để loại

bỏ các hạt phân lớn ra khỏi mẫu Sau khi hoàn thành bước này, hỗn hợp đã qua được

đổ vào ống Eppendorf và ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng trong 4 phút Một giọt trầm tíchđược lắng đọng trên phiến kính và được kiểm tra trực tiếp ở độ phóng đại hiển vi 4, 10

và 40 ×

3.2.2 Sử dụng formalin etyl axetat

Một vài gam kết tủa mẫu phân đi qua rây trong ống nghiệm được trộn với khoảng

9 ml formalin 10% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó thêm 2–3 ml etylaxetat vào mỗi ống Đậy nắp và lắc mỗi ống trong 30 giây Sau đó, để loại bỏ khí sinh

ra trong ống, nắp ống được tháo nhẹ nhàng và mẫu được ly tâm ở mức 2.500 vòngtrong 4 phút Mỗi ống bao gồm bốn lớp (từ dưới lên trên: trầm tích mẫu phân,formalin, mảnh vụn và ethyl acetate tương ứng) Lớp mảnh vụn được loại bỏ bằngdụng cụ và sau đó tất cả chất chứa trong đường ống ngoại trừ cặn đều bị loại bỏ Từkết tủa thu được, một giọt được đặt trên phiến kính và được kiểm tra ở độ phóng đạihiển vi 4, 10 và 40 ×

3.2.3 Tách triết DNA

Một bộ dụng cụ tách DNA cụ thể (MBST Co.) đã được sử dụng để tách DNA từcác mẫu phân theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ dụng cụ Để phá vỡ vỏ trứngFasciola và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích xuất DNA trước khi chiết xuất,quá trình lắng đọng từng mẫu phân được đưa qua sàng ở bước đầu tiên được siêu âm ởđiện áp 90V và 5 giây trong 5 lần Sau đó, 300 µl mẫu được đổ vào ống nghiệm 1,5

ml và tiến hành chiết DNA Trứng được phân lập từ tử cung của một số loài giun sánFasciola được phân lập từ gan của động vật bị nhiễm bệnh tại lò mổ và được xác định

và xác nhận về mặt hình thái đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cựccho quy trình siêu âm và chiết xuất Sau mỗi bước siêu âm trong 5 giây, một giọt mẫuđược đặt trên phiến kính để kiểm tra xem trứng có bị vỡ không Ngoài ra, sau bướcchiết xuất trên các mẫu đối chứng, nồng độ DNA chiết xuất được đo bằng máyNanodrop

3.2.4 Phản ứng PCR

Thành phần tham gia phản ứng: PCR được thực hiện với thể tích cuối cùng là

25 µl, bao gồm 12,5 µl hỗn hợp chính, 2 µl mồi (F và R), 2 µl DNA chiết xuất và 8,5

Tỉ lệGC

Kíchthướcsảnphẩm