--- ∞0∞--- NGUYỄN CHÂU KHOA PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus sp.. --- ∞0∞--- NGUYỄN CHÂU KHOA PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SI
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 7 năm 2020
＋ PTN Công nghệ Vi Sinh-cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương
＋ Phòng 19, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh
＋ Phòng 4.4, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, TL29, phường Thạnh Lộc, Quận 12, TP HCM.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu
Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum et thonn) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chủng nấm Candida albicans, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum được cung cấp bởi
Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
- Cồn 96 o , 70 o , NaCl, HCl, NaOH, H2SO4
- Nguồn dinh dưỡng: glucose, pepton
- Các muối khoáng: CaCO3, MgSO4
- Các dung môi: ethyl acetat, methanol, chloroform và nước
- Nước muối sinh lý 0.85%, nước cất
2.2.3 Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, máy đo OD, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lò vi sóng,…
- Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, que cấy trang, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt,…
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.3.2 Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26
Kế thừa từ nghiên cứu “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Bacillus sp
RD26 để nâng cao hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp quy
Lên men và thu dịch
Cô quay dịch thu được với dung môi
Thu được cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26
Khảo sát các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Phân lập và tinh chế hợp chất thu được Đánh giá một số hoạt tính thu được từ hợp chất
Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh từ cao
Xác định nồng độ kháng nấm tối thiểu (MIC) từ cao chiết BR-M
Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ
SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA hoạch thực nghiệm” (Dương Nhật Linh và cs., 2018) trước đó đã xác định công thức môi trường tối ưu hóa để lên men chủng Bacillus sp RD26 (pepton: 7,36 g/L, glucose: 15 g/L, CaCO3: 0,72 g/L, MgSO4: 0.6 g/L)
Vi khuẩn Bacillus sp được hoạt hóa bằng cách nuôi cấy một phần sinh khối trong môi trường dinh dưỡng NB ở nhiệt độ 37 độ C trong 36 giờ, với tốc độ lắc 200 vòng/phút.
Nhân giống: Bổ sung 10% dịch vi khuẩn Bacillus sp đã được hoạt hóa vào
100 mL môi trường canh vô trùng (Pepton 7.36 g, Glucose 15 g, CaCO3 0.72 g, MgSO4 0.6 g, nước cất 1000 mL, pH 7±0.1) Nuôi lắc ở 37 o C/36h, tốc độ lắc 200 vòng/phút (Grahovac và cs., 2015)
Lên men: Bổ sung 10% dịch khuẩn nhân giống cấp 2 vào 1L môi trường tối ưu hóa đã được hấp vô trùng Nuôi ở 37 o C/ 36h (Bisht và cs., 2011)
2.3.3 Thu nhận cao chiết từ dịch ngoại bào bằng dung môi methanol
Hoạt hóa chủng như mục 3.3.2
Sau thời gian lên men đem ly tâm 10.000 vòng/ phút trong vòng 10 phút ở
4 o C rồi thu dịch nổi Tiến hành thu cao chiết chủng Bacillus bằng cách cho dịch thu được và dung môi methanol vào bình cô quay Sau đó, đem cô quay đuổi bỏ dung môi để thu được cao chiết
Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
2.3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết chủng Bacillus sp
● Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh
- Cấy ria nấm trên môi trường thạch SDA, ủ ở 37 o C trong 48h
- Lấy khuẩn lạc riêng lẻ cấy vào SDB lỏng, ủ 24h ở 37 o C
- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,1tương ứngvới McFarland 0.5 sau đó pha loãng dịch nấm để đạt mật độ tế bào đạt
- Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
❖ Vi nấm T rubrum, T mentagrophytes, M canis, M gypseum:
- Nấm được cấy trên môi trường thạch SDA có bổ sung kháng sinh cloramphenicol, ủ ở 30 o C/72h
- Dùng que cấy cạo nhẹ bề mặt khóm nấm để lấy bào tử cho vào ống nước muối 0.85%
- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1x10 8 CFU/mL, sau đó pha loãng dịch nấm để đạt được nồng độ 10 6 CFU/mL
- Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn, người ta sử dụng tăm bông vô trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn đã loãng và xoay đĩa góc 60 độ để trải đều vi khuẩn lên môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn Quá trình này được thực hiện cho đến khi bề mặt thạch ráo.
- Dùng dụng cụ đục lỗ, đục 4 lỗ trên đĩa, mỗi lỗ khoảng 6mm
- Dùng pipet hút 70 μL dịch lọc cho vào giếng Một giếng bơm nước cất làm giếng đối chứng
- Để yên trong vòng 15 phút cho cao chiết khuếch tán đều vào lớp thạch
- Sau đó, đem nuôi ở 28 o C trong vòng 4-5 ngày đối với vi nấm Sau 4-5 ngày, đọc kết quả vòng kháng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
● Kết quả: Cao chiết được cho là có khả năng kháng nấm khi xung quanh giếng không có vi nấm mọc
2.3.3.3 Xác định nồng độ kháng nấm tối thiểu (MIC) từ cao chiết chủng Bacillus sp RD26
Nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu mà tại đó, cao chiết chủng
Bacillus sp có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh
- Môi trường SDA đã được hấp vô trùng ở 121 o C/ 20 phút
- Chuẩn bị một dãy ống nghiệm (10 ống) có chứa nước cất đã được hấp vô trùng
- Pha loãng cao chiết với nước cất, từ dung dịch gốc có nồng độ 1000 àg/mL, cao chiết thử nghiệm được pha loóng theo cấp số nhõn thành cỏc nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16
- Cho cao chiết vào dãy ống nghiệm với độ pha loãng khác nhau và trộn đều cao chiết với nước cất
- Đổ cao chiết từ các ống nghiệm ra đĩa rồi cho môi trường SDA vào và trộn đều Sau đó, để cho môi trường được khô hoàn toàn
- Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh tương tự mục 3.3.3.1
- Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch vi nấm đã chuẩn bị chấm lên đĩa môi trường có chứa cao chiết Trong đó, có một đĩa chỉ chứa môi trường được làm đĩa đối chứng
● Kết quả: Sau 36-48h nuôi cấy, đọc kết quả MIC MIC là đĩa cuối cùng mà vi nấm không có khả năng phát triển Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.3.4 Khảo sát các phân đoạn của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên tấm silica gel F254, (Merck)
- Cao chiết thu được sẽ được hòa tan với nước
- Sử dụng ống vi quản, chấm các cao đã được pha loãng vào tấm TLC cách mép đáy 1.5 cm và cách bề mặt dung môi từ 0.8-1 cm Các vết ở 2 bên bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ
- Đặt các tấm TLC đã được chấm vào ly thủy tinh có chứa dung môi và được đậy kín để tránh dung môi bay hơi
- Dung môi chạy đến khoảng 80% tấm TLC thì lấy ra để nhiệt độ phòng để các bản mỏng được khô hoàn toàn
Sau khi sấy khô, các tấm TLC được chiếu dưới tia UV ở bước sóng 254 nm
2.3.5 Sắc ký cột cao chiết
Cao chiết có hoạt tính kháng cao nhất được sử dụng để sắc ký cột pha thường kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau (Singh và cs., 2018)
● Chuẩn bị cột sắc ký:
- Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô
- Một cột sắc ký được giữ bằng một miếng bông ở phía dưới
- Cân một lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh trộn đều với dung môi
- Cho hỗn hợp silica gel lên cột và cho dung môi vào Sau đó, mở xả dung môi để ổn định cột
- Nghiền nhuyễn cao khô với một ít silica gel thành hỗn hợp bột khô, mịn và đồng nhất
- Cho hết hỗn hợp vừa nghiền vào cột đã chuẩn bị sẵn bằng phễu thủy tinh
- Tiếp đó, cho từ từ dung môi vào cột để tiến hành phân lập
2.3.6 Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ
● Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh:
- Nấm được cấy trên môi trường thạch SDA có bổ sung kháng sinh cloramphenicol, ủ ở 30 o C/72h
- Dùng que cấy cạo nhẹ bề mặt khóm nấm để lấy bào tử cho vào ống nước muối 0.85%
- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1x10 8 CFU/mL, sau đó pha loãng dịch nấm để đạt được nồng độ 10 6 CFU/mL
- Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
- Các tấm TLC sau khi được chạy sắc ký sẽ được làm khô hoàn toàn để loại bỏ dung môi trước khi thử hoạt tính kháng
- Các tấm TLC sau đó được cho vào đĩa petri vô trùng, cho dịch vi nấm vào
- Các đĩa được ủ 37 o C trong vòng 24-48h Sau 24-48h đọc kết quả vết kháng
● Kết quả: Phân đoạn được cho là có khả năng kháng khi có vết trắng xuất hiện trên nền tím
2.3.7 Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất thu nhận được
- Sử dụng sắc ký cột pha thường để phân lập, tinh chế hợp chất từ cao chiết
- Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các phương pháp vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo
- Phương pháp phổ cộng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn) tại Viện Công nghệ Hóa học
2.3.8 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính oxy hóa và gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7)
Hợp chất BR03 được gửi thử hoạt tính chống oxy hóa (DPPH) và gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) tại phòng SHPT – BM Di truyền trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh
