định danh một số chủng lactobacillus có hoạt tính probiotic và khả năng làm giảm cholesterol

Việc định danh chính xác một số chủng Lactobacillus có hoạt tính probiotic và khả năng làm giảm cholesterol bằng cách kết hợp phương pháp vi sinh truyền thống và phương pháp sinh học phâ

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG

LACTOBACILLUS CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC

VÀ KHẢ NĂNG LÀM GIẢM CHOLESTEROL

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS Dương Nhật Linh SVTH: Lương Thị Cẩm Vân MSSV: 1553010241

Khóa: 2015

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG

LACTOBACILLUS CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC

VÀ KHẢ NĂNG LÀM GIẢM CHOLESTEROL

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

SVTH: Lương Thị Cẩm Vân MSSV: 1553010241

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học việc và làm đề tài tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh em đã được sự giúp đỡ và hỗ trợ từ các thầу cô, anh chị, các bạn, các em và cả gia đình

Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô ThS Dương Nhật Linh và thầy ThS Nguyễn Văn Minh đã luôn tận tình hướng dẫn, dạy cho em biết tinh thần

trách nhiệm và giúp em vượt qua những khó khăn, thử thách

Em xin gửi lời cảm ơn thầy ThS Lao Đức Thuận đã đọc, góp ý và hỗ trợ để

đề tài em được hoàn thiện hơn

Em cũng xin cảm ơn anh Trần Kiến Đức, chị Trần Thị Á Ni, chị Thiều Hồng Huệ đã chỉ dẫn và giúp đỡ em hết mình để em có thể hoàn thành đề tài khóa

luận tốt nghiệp

Cảm ơn các anh chị, các bạn, các em trong phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã giúp đỡ, hỗ trợ cùng mình chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên con Em xin kính chúc Quý Thầу Cô trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh nói chung và khoa Công nghệ sinh học nói riêng nhiều sức khỏe và luôn gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

Lương Thị Cẩm Vân

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 17

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 24

Bảng 2.3 Phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ tối ưu 24

16S-Bảng 3.4 Các trình tự 16S-23S rDNA ITS trên Genbank 38

Bảng 3.5 Trình tự và các thông số đánh giá mồi của IDT 42

Bảng 3.6 Giá trị OD của các mẫu tách chiết 51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Hình nhuộm Gram Lactobacillus 5

Hình 1.2 Vị trí spacer 16S-23S rDNA ITS ở vi khuẩn 8

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn được làm thuần trên môi trường MRSA 27

Hình 3.2 Hình lên men trên môi trường HHD 28

Hình 3.3 So sánh trình tự 16S-23S rDNA ITS giữa các loài Lactobacillus 31

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra và đánh giá mồi trên BLAST 43

Hình 3.5 Vị trí mồi xuôi ITS-F được sắp gióng cột với trình tự dữ liệu 44

Hình 3.6 Vị trí mồi ngược ITS-R được sắp gióng cột với trình tự dữ liệu 44

Hình 3.7 Kiểm tra khả năng bắt cặp của cặp mồi trên AnnHyb 45

Hình 3.8 Bảng mô hình tiến hóa xây dựng cây Maxium Likelihood 46

Hình 3.9 Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood 47Hình 3.10.Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Neighbor Joining 48

Hình 3.11.Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Maximum Parsimonу 49Hình 3.12.Kết quả quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR 51

Hình 3.13.Kết quả điện di mẫu E16.2 52

Hình 3.14.Giải trình sản phẩm PCR chủng E16.2 của mồi ITS-F 53

Hình 3.15.Giải trình tự sản phẩm PCR chủng E16.2 của mồi ITS-R 53

Hình 3.16.Kết quả BLAST giải trình tự sản phẩm PCR mẫu E16.2 của cặp mồi ITS-F và ITS-R 54

Hình 3.17.Kết quả dựng cây phát sinh loài của mẫu E16.2 bằng phương pháp Neighbor Joining 55

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Bp: base pair

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool cs: cộng sự

HHD: Homofermentative-Heterofermentative Differrential medium IDT: Integrated DNA Technologies

ITS : Internal Transcribed Spacer LAB: Lactic Acid Bacteria ML: Maximum Likelihood MP: Maximum Parsimony

MRSA: Môi trường deMan Rogosa and Sharpe agar NCBI: National Center for Biotechnology Information NJ: Neighbor joining

PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Real time PCR

rDNA: ribosom deoxyribonucleic acid rRNA: ribosom ribonucleic acid WHO: World Health Organization

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 TỔNG QUAN VI KHUẨN LACTOBACILLUS 4

2.3 Lợi ích đối với sức khỏe 6

2.4 Khả năng làm giảm cholesterol 7

3 PHƯƠNG PHÁP VI SINH TRUYỀN THỐNG TRONG ĐỊNH DANH VI KHUẨN 7

4 VÙNG 16S-23S rDNA ITS 8

5 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH VI KHUẨN 10

5.1 Phương pháp PCR 10

5.2 Giải trình tự bằng phương pháp Sanger 11

6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 11

6.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

1 VẬT LIỆU 16

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

1.2 Đối tượng nghiên cứu 16

1.3 Công cụ Tin sinh học 16

1.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 16

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Tái phân lập 17

2.2 Định danh bằng phương pháp truуền thống 18

2.3 Khảo sát in silico 21

2.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 22

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

1 TÁI PHÂN LẬP 27

2 ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 27

2.1 Kết quả phân nhóm vi khuẩn lên men đồng hình – dị hình 27

2.2 Định danh bằng phương pháp truуền thống 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Tài liệu tiếng Việt 59

Tài liệu tiếng Anh 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới, probiotic là các vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe con người khi đưa vào cơ thể một lượng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả tốt cho sức khỏe của vật chủ (WHO/2001) Những vi sinh vật này có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe con người như điều trị, phòng ngừa viêm dạ dày ruột cấp tính do virus; tiêu chảy; viêm ruột hoại tử (Vieira và cs., 2013) Một trong những vi

khuẩn được sử dụng rộng rãi làm probiotic là Lactobacillacae, có thể thu nhận từ

nhiều nguồn khác nhau như phân su em bé, tuуến sữa mẹ và trên các loại thực phẩm lên men truyền thống Cholesterol trong máu cao làm tăng nguу cơ bệnh tim mạch, do đó việc kiểm soát cholesterol trong máu giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch Trong những năm gần đâу, làm giảm cholesterol bởi vi khuẩn lactic (LAB - lactic acid

bacteria) như Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium đang được quan

tâm nghiên cứu (Lim và cs., 2005) Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về vi

khuẩn có hoạt tính làm probiotic và khả năng làm giảm cholesterol ở điều kiện in

vitro (Hoàng Quốc Khánh và cs., 2011) Tạo ra một sản phẩm probiotic, có khả

năng làm giảm cholesterol chứa Lactobacillus được sàng lọc từ Việt Nam sẽ là một

thành công lớn trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh cho có lợi trong y học

Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về đặc tính probiotic và khả năng làm giảm

cholesterol của LAB đã được công bố Trong đó, Lactobacillus là LAB được sử

dụng phổ biến trong nghiên cứu probiotic cho người vì tính an toàn đối với con người (Hoàng Quốc Khánh và cs., 2011) Định danh vi khuẩn có hoạt tính probiotic

và khả năng làm giảm cholesterol từ đó xác định những chủng Lactobacillus có thể

ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi có thể sử dụng cho người Hiện nay,

nghiên cứu định danh các chủng Lactobacillus chủ yếu dựa trên hai phương pháp

chính: vi sinh truyền thống và sinh học phân tử Cả hai phương pháp nàу tương hỗ lẫn nhau, góp phần định danh chính xác vi khuẩn Theo Song và cs (2000), đã sử

dụng vùng gen 16S-23S rDNA ITS và xây dựng cây phả hệ phân tử để định danh các chủng Lactobacillus Theo Moreira và cs (2005), đã thực hiện nghiên cứu sử dụng vùng gen 16S-23S rDNA ITS để định danh Lactobacillus ở cấp độ loài phân

lập từ men vi sinh, động vật hoặc thực phẩm Theo Alrubaye và cs (2018), kết hợp

phương pháp vi sinh và sinh học phân tử để xác định một số chủng Lactobacillus phân lập từ các sản phẩm sữa Việc định danh chính xác một số chủng Lactobacillus

có hoạt tính probiotic và khả năng làm giảm cholesterol bằng cách kết hợp phương pháp vi sinh truyền thống và phương pháp sinh học phân tử đang được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

Kế thừa từ công trình nghiên cứu trước “Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí

nghiệm” đã định danh các chủng Lactobacillus bằng phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học sinh phân tử dựa trên vùng gen 16S rDNA, chúng tôi tiếp tục

thực hiện đề tài: “Định danh một số chủng Lactobacillus có hoạt tính probiotic

và khả năng làm giảm cholesterol” Nghiên cứu này góp phần xây dựng phương

pháp luận, đánh giá một cách tổng quan nhất cho việc định danh các loài thuộc chi

Lactobacillus

Mục tiêu:

Định danh một số chủng Lactobacillus có hoạt tính probiotic và khả năng làm

giảm cholesterol

Nội dung thực hiện:

- Định danh các chủng Lactobacillus bằng phương pháp vi sinh truуền thống - Khảo sát in silico: xây dựng dữ liệu vùng gen 16S-23S rDNA ITS, khảo sát cặp mồi khuếch đại đặc hiệu vùng 16S-23S rDNA ITS của Lactobacillus

- Nghiên cứu thực nghiệm định danh các chủng Lactobacillus bằng phương

pháp sinh học phân tử (PCR, giải trình tự) dựa trên cặp mồi đã khảo sát

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VI KHUẨN LACTOBACILLUS 1.1 Đặc điểm chung

Lactobacillus là chi lớn nhất trong họ Lactobacillaceae (Huang và cs., 2018) Lactobacillus có kích thước biến đổi trong khoảng (0,5 - 1,2) x (1 - 10) µm, là vi

khuẩn Gram dương (+), dạng trực khuẩn và không có bào tử, không di động (Makarova và cs., 2006)

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, ở điều kiện 5 - 10 % CO2Lactobacillus phát triển mạnh trên môi trường MRSA, thuỷ phân đường saccharose

mạnh, hình thành acid lactic dạng D, L hoặc DL, không có catalase và cytochrome

oxydase Nhiệt độ phát triển từ 5 - 53 °C, tối ưu là 30 - 40 °C Lactobacillus phát

triển tốt ở pH 5,0 và pH tối ưu là 5,5 - 5,8 (Todar., 1990)

Tính đến tháng 5 năm 2018, có 196 loài Lactobacillus được công bố Những

loài nàу được tìm thấy nhiều trong thực phẩm lên men, trái cây, thịt, bột chua, rau, rượu, hạt, phân su em bé và từ miệng, đường tiêu hoá, âm đạo của người và động

vật,… (Hammes và cs., 2009; Tamang và cs., 2016) Các chủng Lactobacillus

thường có khả năng chịu được các điều kiện môi trường có tính acid cao hơn các chủng lactic acid bacteria (LAB) khác, chúng có thể phát triển ở mức pH thấp (pH

4) Vì thế, Lactobacillus có khả năng phát triển tiếp trong quá trình lên men lactic tự

nhiên khi pH giảm quá thấp để các chủng LAB khác phát triển, các chủng này thường sống sót đến cuối quá trình lên men và cho hiệu suất khá cao trong quá trình lên men acid lactic (Todar., 1990)

Hầu hết các chủng Lactobacillus lên men đồng hình (homofermentative)

nhưng có một số ít là lên men dị hình (heterofermentative) Từ cơ chế lên men có

thể chia chi Lactobacillus thành ba phân nhóm chính (Todar., 1990):

- Nhóm I: Thermobacterium, là nhóm các chủng Lactobacillus lên men đồng

hình bắt buộc và ưa nhiệt Sản phẩm tiêu thụ chủ yếu để lên men của các chủng trong nhóm này là glucose, các chủng nhóm này phát triển ở 45 °C nhưng không

phát triển ở 15 °C Các chủng đại diện của nhóm nàу như là Lactobacillus

delbrueckii, Lactobacillus acidophilus,…

- Nhóm II: Streptobacterium, là nhóm các chủng Lactobacillus cũng lên men

đồng hình ưa ấm, các chủng nhóm này có thể phát triển ở cả 15 °C và 45 °C Đặc biệt nhóm này có thể lên men nhiều hơn nếu có O2 Các chủng đại diện cho nhóm

nàу như là Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum,…

- Nhóm III: Betabacterium, là nhóm các chủng Lactobacillus lên men dị hình

Các chủng nhóm này lên men và tạo ra acid lactic từ glucose, CO2 và ethanol Các

chủng đại diện nhóm này bao gồm Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis,

Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae

một lượng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả tốt cho sức khỏe của vật chủ Để được sử dụng làm probiotic các vi sinh vật phải thỏa mãn các tiêu chí như khả năng bám dính, khả năng sản xuất acid và H2O2, dung nạp muối mật, hoạt tính kháng khuẩn đáng kể và không phải tác nhân gây bệnh Các vi sinh vật làm probiotic cho con

người bao gồm nấm men, trực khuẩn, Escherichia coli, Enterococci, đặc biệt các

Bifidobacteria và vi khuẩn lactic thường được sử dụng, như Lactobacillus, Lactococci và Streptococci (Fakruddin và cs., 2017)

2.2 Lactobacillus ứng dụng làm probiotic

Phần lớn các loài Lactobacillus có nguồn gốc từ người nên thường là đối tượng nghiên cứu làm probiotic cho người Lactobacillus là những vi khuẩn "thân

thiện" thường sống trong hệ tiêu hóa, tiết niệu và sinh dục mà không gây bệnh

Lactobacillus cũng được sử dụng trong một số thực phẩm lên men (Swain và cs.,

2014) Lactobacillus được sử dụng để điều trị và ngăn ngừa tiêu chảy, bao gồm cả

truyền nhiễm như tiêu chảy do rotavirus ở trẻ em (Salam., 2014) Một số trường hợp

sử dụng Lactobacillus cho các vấn đề tiêu hóa nói chung; hội chứng ruột kích thích

(IBS - Irritable Bowel Syndrome); đau bụng ở trẻ sơ sinh; bệnh Crohn; viêm đại tràng; và viêm ruột hoại tử (NEC - Necrotizing Entero Colitis) ở em bé sinh non

(Arshad và cs., 2018) Lactobacillus cũng được dùng để điểu trị nhiễm H pylori và

các loại nhiễm trùng khác bao gồm nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm nấm âm đạo

(Salam., 2014) Ngoài ra, Lactobacillus đã được chứng minh có khả năng làm giảm

cholesterol (El Helim và cs, 2006)

2.3 Lợi ích đối với sức khỏe

Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe, do khả năng phục hồi sự cân bằng tự nhiên của vi khuẩn đường ruột của probiotic (Brown và cs., 2004)

Một số nghiên cứu cho thấy sử dụng probiotic có thể có hiệu quả trong điều trị tiêu chảy cấp tính ở trẻ em và phòng ngừa tiêu chảу liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy bệnh viện/cộng đồng (Gill và cs., 2004) Probiotic có thể giúp làm giảm các triệu chứng của hội chứng rối loạn đường ruột như viêm loét đại tràng, hội chứng ruột kích thích (IBS) và viêm ruột hoại tử

Một số chủng probiotic có thể làm giảm lượng cholesterol có thể làm giảm lượng cholesterol LDL (có hại) (Begley và cs., 2006)

2.4 Khả năng làm giảm cholesterol

Bệnh tim mạch được coi là nguyên nhân chính gây bệnh tật và tử vong toàn cầu của Tổ chức Y tế Thế giới Xơ vữa động mạch được công nhận là nguyên nhân thiết yếu của bệnh tim mạch chiếm khoảng một phần ba số ca tử vong trên toàn thế giới (El Helim và cs., 2016) Tăng cholesterol trong máu là một yếu tố quan trọng liên quan đến xơ vữa động mạch và bệnh tim mạch

Ngoài việc cải thiện sức khỏe đường ruột, probiotic còn có tác dụng tăng cường sức khỏe khác như tăng cường hệ miễn dịch, hạ huyết áp, phòng ngừa ung thư, chống oxy hóa, giảm triệu chứng viêm da, cải thiện tình trạng viêm khớp, và giảm các triệu chứng dị ứng và kháng nấm candida âm hộ ở phụ nữ (Ooi và cs., 2010) Probiotic cũng đã được nghiên cứu về tác dụng hạ cholesterol Theo El

Helim và cs (2016), cho thấy tiềm năng của việc sử dụng L reutri và L casei như

một chất bổ sung để giảm mức cholesterol trong huyết thanh Nghiên cứu của

Fuentes và cs (2013), cho thấy sau 12 tuần sử dụng thuốc chứa L plantarum thì

giảm đáng kể 13,6 % nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết tương so với chỉ dùng giả dược (Fuentes và cs., 2013)

3 PHƯƠNG PHÁP VI SINH TRUYỀN THỐNG TRONG ĐỊNH DANH VI KHUẨN

Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, sinh lý, biến dưỡng và đặc điểm sinh thái Phương pháp nàу được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987 Mặc dù đâу là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật

(Cowan., 1993)

Phương pháp định danh truyền thống thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng và đặc điểm sinh thái của vi sinh vật(Trần Linh Thước., 2005)

- Đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động,…

- Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn carbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp… Trong đó, các đặc điểm sinh hóa về đặc điểm sinh lý và đặc điểm biến dưỡng năng lượng là các chỉ tiêu cơ bản nhất trong phân loại vi sinh vật

Khi định danh vi sinh vật bằng phương pháp sinh hóa ta phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hóa) Các khóa phân loại prokaryote phổ biến được sử dụng như khóa phân loại Bergey, Cowan và Steel

Tuy nhiên, ngày nay với sự phát triển vượt bậc của Công nghệ Sinh học nói chung và kỹ thuật phân tử nói riêng thì định danh các chủng vi sinh vật được xác định thông qua vật liệu di truyền cho kết quả rõ ràng và chính xác hơn

4 VÙNG 16S-23S rDNA ITS

Theo Goncalves và cs (2002), vùng gen 16S rDNA và 23S rDNA có tính bảo tồn cao Ngược lại, vùng 16S-23S rDNA ITS tiến hóa nhanh hơn và có nhiều biến

động nên được dùng trong các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền, nguồn gốc phát

sinh cũng như quan hệ giữa các loài (Goncalves và cs., 2002) Vùng 16S-23S rDNA

ITS có chiều dài khoảng 200 bp (Berthier và cs., 1998) Các trình tự nucleotide của

vùng 16S- 23S rDNA ITS đã được sử dụng thành công để phân biệt các chủng vi

khuẩn có mối quan hệ gần gũi với nhau (Gurtler và cs., 1996; Lee và cs., 2002;

Villard và cs., 2000) Ở vi khuẩn, vùng đệm ITS nằm giữa hai vùng gen 16S rDNA và 23S rDNA Các vùng gen 16S- 23S rDNA ITS có mức độ biến động cao giữa các

loài (Gurtler và cs., 1996)

Hình 1.2 Vị trí spacer 16S-23S rDNA ITS ở vi khuẩn (McAllister và cs., 2018)

Trình tự phổ biến nhất để nghiên cứu phân loại học ở mức độ loài là trình tự

của vùng gen 16S-23S rDNA ITS Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vùng 16S-23S

rDNA ITS có tiềm năng trong định danh, nghiên cứu phát sinh loài của

Lactobacillus Các nghiên cứu của Nakagawa và cs; Berthier và cs; Nour đã chứng

minh rằng trình tự vùng ITS giữa gen 16S-23S của Lactobacillus là có thể sử dụng để định danh các các chủng Lactobacillus (Nakagawa và cs., 1994; Berthier và cs.,

1998; Nour., 1998)

Theo Lee và cs (2008), thực hiện nghiên cứu trên 12 chủng Lactobacillus đã

được xác định trước đó bằng các xét nghiệm sinh hóa cổ điển Kết quả nghiên cứu cho thấy việc định danh sai ở cấp loài xảy ra khi sử dụng các thử nghiệm sinh hóa cổ điển Có 9/12 chủng cho thấy sự khác biệt trong phân loại Chín chủng đã được

xác định trước đó thông qua các thử nghiệm sinh hóa như Lactobacillus brevis C1,

Lactobacillus brevis C10, Lactobacillus fermentum C16, Lactobacillus brevis C17, Lactobacillus crispatus I12, Lactobacillus acidophilus I16, Lactobacillus fermentum I24, Lactobacillus fermentum I25 và Lactobacillus acidophilus I26 đã

được xác định lại là Lactobacillus reuteri C1, Lactobacillus reuteri C10,

Lactobacillus reuteri C16, Lactobacillus panis C17, Lactobacillus brevis I12, Lactobacillus gallinarum I16, Lactobacillus salivarius I24, Lactobacillus brevis I25

và Lactobacillus gallinarum I26 bằng phương pháp định danh sinh học phân tử dựa trên vùng gen 16S rDNA và 16S-23S rDNA ITS Các chủng Lactobacillus I16 và I26 ban đầu không thể được định danh phân loại dựa trên vùng gen 16S rDNA, nhưng khi sử dụng vùng gen 16S-23S rDNA ITS, nhóm tác giả đã định danh được hai chủng này là Lactobacillus gallinarum (Lee và cs., 2008)

Định danh dựa trên vùng 16S-23S rDNA ITS cho kết quả khá khả quan khi có thể định danh được các chủng có mối quan hệ chặt chẽ với nhau.Vùng 16S-23S

rDNA ITS ngàу càng được sử dụng để định danh các loài hoặc chủng vi khuẩn

không thể phân biệt dễ dàng bằng gen 16S rDNA (Man và cs., 2010)

5 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH VI KHUẨN

5.1 Phương pháp PCR

5.1.1 Nguyên tắc chung của PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase

PCR là phản ứng chuỗi bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

▪ Bước 1: biến tính ở nhiệt độ trong khoảng 90 – 95 °C Thời gian biến tính trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút ▪ Bước 2: bắt cặp ở nhiệt độ trong khoảng 40 – 70 °C Nhiệt độ bắt cặp tối

ưu thường nằm trong khoảng 50 – 65 °C Trong quá trình bắt cặp, mồi bắt cặp bổ sung với trình tự đích

▪ Bước 3: tổng hợp ở nhiệt độ 72 °C, là nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt, thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự mạch đích (Lê Huyền Ái Thúy và cs., 2016)

5.1.2 Các thành phần của một phản ứng PCR

Nucleic acid bản mẫu

Mồi oligonucleotide: Đâу là thành phần quan trọng của PCR để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và đạt hiệu quả cao

Deoxyribonucleotid triphosphate (dNTPs)

Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường dùng là Taq polymerase, có hoạt tính tối ưu ở 72 °C

Dung dịch đệm (Lê Huyền Ái Thúy và cs., 2016)

5.1.3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm: thời gian thực hiện phản ứng nhanh, đơn giản ít tốn kém, độ nhạy của phản ứng cao

Nhược điểm: PCR không hoạt động với các đoạn DNA lớn nên kích thước của trình tự bị giới hạn, khả năng ngoại nhiễm cao, khuếch đại không đặc hiệu

5.2 Giải trình tự bằng phương pháp Sanger

Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định Đặc trưng của phương pháp nàу là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynocleotide là những dideoxynocleotide trong đó có nhóm ’OH được thay thế bằng H Điều này khiến các dideoxynocleotide (ddNTP) không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp (Hồ Huỳnh Thùу Dương., 1997)

TRÊN THẾ GIỚI

6.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Các nghiên cứu về Lactobacillus ở Việt Nam hiện tại khá phổ biến Chủ yếu là

về các hoạt tính probiotic và khả năng kháng khuẩn khá cao của chi nàу Nhưng đa

số các nghiên cứu chỉ thực hiện các bước định danh sinh hoá và giải trình tự 16S rDNA để định danh các chủng loài Lactobacillus

Năm 2011, Dương Nhật Linh và cs đã phân lập được 53 chủng LAB từ sữa mẹ

và sản phẩm lên men Trong đó, có 19 chủng là Lactobacillus và các chủng đều có

tiềm năng probiotic cao hơn các chủng LAB còn lại Nhóm nghiên cứu tiến hành định danh sinh hoá dựa theo khóa phân loại The Prokaryote - A Handbook on the Biologу of Bacteria (Dương Nhật Linh và cs., 2011)

Năm 2011, Hoàng Quốc Khánh và cs đã thực hiện định danh 15 chủng

Lactobacillus được phân lập từ các mẫu phân em bé bú sữa mẹ bằng phương pháp

truyền thống kết hợp phương pháp PCR Bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA, các chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic được định danh đến mức loài gồm: Lactobacillus gasseri, L fermentum, L salivarius, L rhamnosus và L

paracasei/ casei (Hoàng Quốc Khánh và cs., 2011)

Năm 2015, Nguуễn Ngọc Thạnh và cs đã phân lập 7 chủng LAB từ sữa chua

có bổ sung tảo Spirulina Trong đó, dịch lên men chủng S2 có hàm lượng acid

khoảng 2,97-6,03 g/L và mật độ đạt 10,98 log CFU/mL Chủng S2 này là chủng có

triển vọng nhất và được định danh dựa trên vùng gen 16S rDNA là Lactobacillus

plantarum với độ tương đồng ở mức 92% (Nguyễn Ngọc Thạnh và cs., 2015)

Năm 2015, Trương Kim Phượng và cs đã thực hiện phân lập và định danh các

chủng Lactobacillus sp từ một số thực phẩm lên men truyền thống dựa trên cơ sở

phân tích kiểu hình kết hợp PCR và giải trình tự các chuỗi mục tiêu dựa trên gen

16S-23S rDNA ITS Kết quả cho thấy bốn chủng: L1, L3, L4 và L7 là Lactobacillus platarum và bốn chủng: L2, L5, L6 và L8 là Lactobacillus rhamnosus (Truong

Kim Phuong và cs., 2015)

Năm 2016, Huỳnh Ngọc Tâm và cs đã sử dụng kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA, dòng L22 được xác định là Pediococcus acidilactici, ba dòng vi khuẩn L61, L64 và L123 có mức độ tương đồng trên 99% về trình tự gen 16S rRNA lần lượt với các dòng Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum và Lactobacillus

brevis (Huỳnh Ngọc Tâm và cs, 2016)

Năm 2019, Huỳnh Ngọc Thanh Tâm và cs đã thực hiện phân lập và tuyển

chọn dòng vi khuẩn Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ cây môn ngọt Trong

18 dòng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu môn ngọt, có 7 dòng vi khuẩn có khả năng sống trong điều kiện pH = 2,5 và kháng được 3 loại kháng sinh: ampicilline, tetracyline và ofloxacine Ba dòng NKC1, OML1 và OML2 có khả năng kháng vi

khuẩn E coli cao hơn so với 4 dòng còn lại Khảo sát khả năng sinh enzуme ngoại

bào, 7 dòng vi khuẩn trên có khả năng sinh 2 loại enzyme ngoại bào, trong đó, dòng OML2 sinh tổng hợp enzyme amylase cao nhất Dòng OML2 có tiềm năng probiotic tốt nhất trong 18 dòng đã phân lập, do đó, dòng OML2 được định danh

đến tên loài là Lactobacillus plantarum (99 %), bằng phương pháp giải trình tự 16S

rRNA, kết hợp với đặc điểm hình thái và sinh hóa (Huỳnh Ngọc Thanh Tâm và cs., 2019)

6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tannock và cộng sự (1999) đã chứng minh được rằng việc định danh các

chủng Lactobacillus dựa trên vùng 16S-23S rDNA ITS cho kết quả chính xác hơn so với việc định danh bằng trình tự 16S rDNA V2-V3 Kết quả nghiên cứu cho thấy trình tự 16S-23S rDNA ITS của Lactobacillus có chiều dài khoảng 200 bp Hơn nữa, phương pháp định danh dựa trên vùng gen 16S-23S rDNA ITS còn có ưu điểm là giúp phân biệt giữa Lactobacillus rhamnosus và Lactobacillus casei, mà khi sử dụng vùng 16S rDNA V2-V3 không thể phân biệt được (Tannock và cs., 1999)

Năm 1992, Mitsuoka và cs đã thực hiện phân lập Lactobacillus từ đường ruột và định danh dựa trên vùng 16S-23S rDNA ITS của Lactobacillus Kết quả định danh có thể phân biệt được đến mức độ loài (Mitsuoka và cs., 1992)

Năm 2000, Osawa và cs đã nghiên cứu dựa trên vùng gen 16S-23S rDNA ITS để định danh phân biệt các chủng Lactobacillus paraplantarum và Lactobacillus

Năm 2004, Kwon và cs đã khảo sát cặp mồi PCR mới để xác định 7 chủng

Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri và Lactobacillus rhamnosus) Cặp mồi nàу được thiết kế dựa trên các chuỗi trình tự

của gen 16S rDNA, 23S rDNA và cả vùng ITS của mỗi loài, độ chính xác 93,6 %

(Kwon và cs., 2004)

Năm 2005, Han và cs đã nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp sinh học

phân tử để xác định chủng Lactobacillus acidophilus mà phương pháp sinh hóa khó

phát hiện được Kết quả của nghiên cứu dựa trên việc đối chiếu kết quả sinh hóa và

PCR khuếch đại vùng gen 16S-23S rDNA ITS xác định được 19 chủng L

acidophilus, L casei, L delbrueckii, L helveticus, L paracasei, L plantarum và L rhamnosus (Han và cs., 2003)

Năm 2010, Gaudana và cs đã phân lập Lactobacillus từ nhiều nguồn khác nhau và được xác định dựa trên cơ sở khuếch đại vùng gen 16S-23S rDNA ITS và

sau đó giải trình tự (Gaudana và cs., 2010)

Năm 2014, Dec và cs xác định Lactobacillus sp các chủng có nguồn gốc từ ngỗng sử dụng phương pháp khối phổ MALDI-TOF và phân tích vùng gen 16S-23S rDNA ITS Trong số 104 chủng được phân lập, đã xác định 14 loài Lactobacillus Các loài chiếm ưu thế là Lactobacillus salivarius (35,6%), Lactobacillus johnsonii (18,3%), Lactobacillus ingluviei (11,5%) và Lactobacillus agilis (7,7%) (Dec và

cs., 2014)

Năm 2016, Islam và cs thực hiện định danh các chùng L casei, L paracasei

và L rhamnosus bằng cách giải trình tự vùng gen 16S-23S rDNA ITS Nghiên cứu

đã chứng tỏ giải trình tự vùng 16S-23S rDNA ITS có ý nghĩa lớn trong việc xác định các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi như các thành viên của nhóm L casei

(Islam và cs., 2016)

Năm 2017, Sharif và cs đã thực hiện định danh 49 chủng Lactobacillus sử dụng dựa trên trình tự 16S-23S rDNA ITS Kết quả 23 (46,9%) chủng phân lập được phát hiện là L plantarum; 6 (12,2%) chủng phân lập là L delbrueckii và 4 (8.1%) chủng phân lập là L acidophilus (Sharif và cs., 2017)

Năm 2018, Taghizadeh và cs đã tiến hành phân lập từ mẫu sữa mẹ và định

danh Lactobacillus bằng phương pháp sinh hóa và dựa trên kết quả PCR khuếch đại trình tự vùng 16S-23S rDNA ITS (Taghizadeh và cs., 2018)

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 2 năm 2019 tháng 05 năm 2019 tại phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh 1 và phòng thí nghiệm sinh học phân tử – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp đã thử nghiệm hoạt tính làm probiotic và

khả năng làm giảm cholesterol được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

1.3 Công cụ Tin sinh học

- Phần nềm Annhyb 4.946 - Phần mềm BioEdit v7.0.5 - Phần mềm ClustalX - Phần mềm Mega 6.0

- Phần mềm Chromas lite 2.01

- NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

- Google Scholar (https://scholar.google.com.vn/) - BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

- IDT oligoanalyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer)

1.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

1.4.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất: Ethanol 70°, ethanol 96°, NaCl (5M), Tris-HCl (pH=8), EDTA (1M), SDS 10%, phenol, chloroform, đệm TE (1X), proteinase K (1mg / ml),

ammonium acetate (3M), propanol 99 %, Master mix (2X), agarose, dung dịch GelRed (6X), TBE (1X), Thang chuẩn 100 bp

Môi trường: môi trường MRSA, môi trường MRS, Môi trường HHD (Homofermentative-heterofermentative differential medium), môi trường thủy phân arginine, môi trường lên men carbonhydrate

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Thu thập thông tin,

khai thác dữ liệu vùng gen

16S-23S rDNA ITS

Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho

vùng gen 16S-23S rDNA ITS

Sử dụng cặp mồi vào nghiên cứu Tái phân lập thực nghiệm bằng phương pháp

Định danh bằng phương pháp

vi sinh truyền thống Xây dựng cây phát sinh loài

Kết luận các chủng Lactobacillus đến mức độ loài

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.1 Tái phân lập

Chủng định danh được kế thừa từ nghiên cứu “Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm” đã thử nghiệm hoạt tính probiotic và khả năng làm giảm cholesterol Kết quả của nghiên cứu trước có 3 chủng NT1.5, E16.2, YK1.1 có hoạt tính probiotic cao, tỷ lệ sống cao ở pH 2, có khả năng chịu muối mật 0,3 % cho kết quả

đạt > 0,3 (đơn vị OD625), không có enzyme hemolуsin và đồng thời nhạy với ¾ loại kháng sinh Nghiên cứu khả năng giảm cholesterol trên mô hình thí nghiệm của 3 chủng YK1.1, NT1.5, E16.2 cho kết quả 3 chủng có khả năng giảm cholesterol lần lượt 22,46 % (giảm từ 3,65 mmol/L xuống 2,83 mmol/L), 22,96 % (3,44 mmol/ L xuống 2,65 mmol/ L) và 20 % (3,75 mmol/ L xuống 3,00 mmol/ L) ở 120 ngày thử nghiệm

Từ 3 chủng có hoạt tính cao tiến hành tái phân lập và định danh sơ bộ bằng phương pháp nhuộm Gram, làm thuần các chủng thử nghiệm bằng phương pháp cấy ria trên môi trường MRSA

2.2 Định danh bằng phương pháp truyền thống

Các chủng được định danh bằng phương pháp sinh hóa theo khóa phân loại The Prokaryote – A Handbook on the Biology of Bacteria

2.2.1 Phân nhóm vi khuẩn lactic đồng hình, dị hình (McDonald và

- Group A: lên men đồng hình bắt buộc - Group B: lên men dị hình không bắt buộc - Group C: lên men dị hình bắt buộc

2.2.2 Khả năng phát triển ở 15 °C, 45 °C 2.2.2.1 Nguyên tắc:

Vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ phát triển từ 50 °C ÷ 53 °C Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau Nhóm ưa ấm có khoảng nhiệt độ thích hợp từ 30 °C ÷ 45 °C, nhóm ưa mát có khoảng nhiệt độ thích hợp từ 15 °C ÷ 30 °C Khả năng phát triển ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau góp phần định danh vi khuẩn lactic

2.2.2.2 Tiến hành:

- Khả năng phát triển ở 45°C

Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa khoảng 18 - 24 giờ vào môi trường MRS, nuôi cấy ở điều kiện 45 °C, 5 % CO2, 48 giờ Khả năng phát triển thể hiện qua khả năng mọc được, làm đục môi trường nuôi cấy

- Khả năng phát triển ở 15°C

Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa khoảng 18 - 24 giờ vào môi trường MRS, nuôi cấy ở điều kiện 15 °C, 5 % CO2, 48 giờ Khả năng phát triển thể hiện qua khả năng mọc được, làm đục môi trường nuôi cấy

2.2.3 Khả năng lên men các carbohydrate (MacFaddin., 2000) 2.2.3.1 Nguyên tắc:

Khi sử dụng các nguồn carbohуdrate để lên men, vi sinh vật tạo ra các sản phẩm bao gồm các acid hữu cơ, rượu, CO2…làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

2.2.3.2 Thực hiện:

Các loại đường carbohydrate được sử dụng: amydalin, arabinose, cellobiose, galactose, lactose, maltose, mannitol, mannose, melezitose, melibiose, raffinose, salicin, sorbitol, sucrose, trehalose, xylose

Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa 18 - 24 giờ ở nhiệt độ 37 °C, 5 % CO2 Ủ ở 37 °C, 5 % CO2 trong 48 giờ

Trong hệ thống dihydrolase, L-arginine bị phân cắt thành L-citrulline, sau đó L-citruline tiếp tục bị phân cắt Kết thúc quá trình đạt được là sự tạo thành L-ornithine, CO2 và NH3

Sự dị hóa L-arginine bằng hệ thống enzyme arginine dihydrolase tạo độ kiềm cao và diễn ra mạnh, trong khi quá trình phân cắt do hệ thống enzyme arginine decarboxylase tạo một pH yếu hơn và chậm hơn Sự khác nhau về độ pH được nhận biết dễ dàng nhờ chỉ thị màu bromcresol purple Khi vi khuẩn thủy phân arginine bằng hệ thống enzyme arginine dihуdrolase, môi trường nuôi cấy chuyển sang màu tím, ghi nhận kết quả dương tính Nếu môi trường không đổi màu hoặc màu vàng là âm tính

2.2.4.2 Thực hiện:

Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa 18 - 24 giờ vào môi trường thủy phân arginine Ủ ở 37 °C, 5 % CO2, đọc kết quả sau 48 giờ

2.3 Khảo sát in silico

2.3.1 Khai thác dữ liệu

Tìm kiếm, khai thác dữ liệu các nghiên cứu sử dụng vùng 16S-23S rDNA ITS để định danh vi khuẩn Lactobacillus dựa trên trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ

Pubmed central (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)

2.3.2 Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu Lactobacillus trên vùng gen 23S rDNA ITS

16S-Thu nhận trình tự nucleotide vùng 16S-23S rDNA ITS của vi khuẩn

Lactobacillus từ ngân hàng cơ sở dữ liệu Genbank trên NCBI ở định dạng FASTA

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)

2.3.3 Khảo sát mồi cho phản ứng PCR

Mồi được thiết kế bằng các công cụ tin sinh học như BioEdit, Primer3 (http://primer3.sourceforge.net/), CLUSTAL X

Chương trình trực tuyến (IDT oligoanalуzer) được sử dụng đánh giá cặp mồi (http://sg.idtdna.com/analуzer/applications/oligoanalуzer/) Xác định và đánh giá các thông số vật lý của mồi bao gồm chiều dài mồi (L), nhiệt độ nóng chảy Tm (°C), %GC (%), năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (hairpin, self-dimer, hetero-dimer) (Kcal/mole-1)

Chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thông thường dao động 17 bp - 28 bp Tuу nhiên, trong các trường hợp cụ thể thì chiều dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn chiều dài chuẩn, giới hạn trong khoảng 15 bp - 30 bp

Thiết kế các mồi với hàm lượng GC khoảng 40 - 60 % Các vùng với hàm lượng GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong tiến trình PCR, dẫn đến phản ứng kém hiệu quả Tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 3 base Tại đầu 3’ của mồi, cần có base G haу C để tăng độ đặc hiệu cho bắt cặp

Nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là thông số rất quan trọng Nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 5 °C (lý tưởng là 2 - 3 °C) Duy trì nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50 - 65 °C

Cấu trúc thứ cấp: cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop – tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide), self-dimer (hai oligonucleotide

giống nhau tự bắt cặp) và hetero-dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau) Nếu cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của các mồi vào trình tự đích Để xác định độ bền vững của các liên kết trên dựa vào sự biến đổi năng lương tự do (Gibbs free energу) ΔG (kcal/mole) Theo hãng IDT, giá trị tuyệt đối của ΔG liên kết thứ cấp càng nhỏ hơn 9 kcal/mole thì liên kết sẽ ở mức kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR Vì thế, cần điều chỉnh vị trí mồi tránh cấu trúc thứ cấp, nhất là tại đầu 3’ Mồi được đánh giá là ít cấu trúc bậc hai khi giá trị ΔG > -9 kcal/mole và càng ít cấu trúc bậc hai càng tốt

Độ đặc hiệu và khả năng bắt cặp của mồi được kiểm tra bằng chương trình BLAST trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), phần mềm Annhyb và CLUSTAL X

2.3.4 Dò tìm mô hình tiến hoá

Xác định mô hình tiến hoá phù hợp nhất để dựng cây Maximum Likelihood trong MEGA 6.0 Mô hình có điểm số BIC (Bayesian Information Criterion) thấp nhất là mô hình tốt nhất để dựng cây Maximum Likelihood (O'Halloran., 2014)

2.3.5 Xây dựng cây phát sinh loài

Tất cả trình tự sau khi thu thập được sắp gióng cột và xây dựng các cây phả hệ phân tử với ba phương pháp: Maximum likelihood (ML), Neighbor-joining (NJ) và Maximum parsimony (MP) bằng chương trình MEGA 6.0 Thiết lập giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần

2.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

2.4.1 Tách chiết DNA

DNA bộ gen vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp Phenol – Chloroform (pH= 8)

- Tăng sinh Lactobacillus trong môi trường MRS

- Hút 1ml dịch tăng sinh, lу tâm ở 13000 vòng/ 5 phút Sau đó, rửa sạch với 1 ml đệm TE, loại bỏ dịch nổi

- Thêm 700 µl lysis buffer và thêm 7 µl proteinase K (1 mg / mL), vortex - Ủ 65 °C qua đêm

- 700 µl DNA thô được tách chiết với 700 µl phenol : chloroform (1:1), vortex đều, ly tâm 13000 vòng / 5 phút

- Thu dịch nổi phía trên cho vào tube mới Thêm cùng thể tích chloroform, trộn đều Ly tâm 13000 vòng 5 phút Thu dịch nổi

- Thêm 1 lần thể tích propanol 99 % lạnh và 0,1 lần thể tích ammonium acetate 3 M, tủa 2h ở nhiệt độ lạnh Ly tâm ở mức 13000 vòng / 20 phút, 4 °C

- Rửa lại trong 1 ml ethanol 70 % lạnh - Bỏ dịch, để khô tự nhiên

- Lưu giữ DNA trong 100 μl đệm TE (pH 7,5)

Kiểm tra DNA thu được bằng phương pháp đo quang phổ Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280 DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị nàу dao động từ 1,8 - 2

2.4.2 Phản ứng PCR

Thử nghiệm phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS được thiết kế để đánh giá hiệu

quả của quá trình tách chiết DNA Từ mẫu tách chiết DNA thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 15 µl, thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Tối ưu hóa quá trình PCR-Sequencing

Chu kỳ nhiệt sử dụng trong phản ứng tối ưu hóa theo nhiệt độ nóng chảy của

mồi cho gen 16S-23S rDNA ITS

Bảng 2.3 Phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ tối ưu Chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian

khảo sát in silico trước đó bằng chương trình MEGA 6.0 Dựa vào giá trị ủng hộ

(bootstrap) trên từng nốt cây, từ đó biện luận mối quan hệ gần gũi và kết luận mức độ loài của chủng được định danh

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 TÁI PHÂN LẬP

Từ kết quả của nghiên cứu “Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm” chúng tôi kế thừa 3 chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính làm probiotic và khả năng làm giảm cholesterol cao nhất Từ những chủng vi khuẩn này được lưu trữ cấp đông ở -80 °C, tại phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh tiến hành tái phân lập để định danh vi khuẩn Vi khuẩn sau khi được hoạt hóa tiến hành nhuộm Gram, làm thuần môi trường MRSA, kết quả cho thấy khả năng sống sót tốt và thuần cao

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn được làm thuần trên môi trường MRSA

a Chủng YK1.1 ; b Chủng E16.2

2 ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

2.1 Kết quả phân nhóm vi khuẩn lên men đồng hình – dị hình

Để định danh theo khóa phân loại của Prokaryote, 3 chủng (NT1.5, YK1.1 và E16.2) được chọn lọc có hoạt tính mạnh nhất tiến hành phân nhóm vi khuẩn lên men đồng hình và dị hình bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trên môi trường HHD ủ trong điều kiện 37 °C, 5 % CO2 Đọc kết quả sau 48 giờ

Trên môi trường HHD agar, khuẩn lạc của vi khuẩn lactic đồng hình có màu xanh lá, trong khi khuẩn lạc của vi khuẩn dị hình có màu xanh dương Vi khuẩn

lactic vừa có lên men đồng hình và dị hình (dị hình không bắt buộc) có khuẩn lạc từ xanh đến trắng Kết quả phân nhóm như bảng 3.1

Hình 3.2 Hình lên men trên môi trường HHD

2.2 Định danh bằng phương pháp truyền thống

Căn cứ vào khả năng lên men acid lactic đồng hình hay dị hình, tiến hành định danh theo nhóm và kiểm tra sinh hóa của từng nhóm theo khóa phân loại The Prokaryote- A Handbook on the Biology of Bacteria Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình không bắt buộc group B

Test sinh hóa

(-): 90 % trở lên âm tính d: 11 - 89 % dương tính

Từ kết quả định danh sinh hóa bảng 3.2 (hình PL1, PL2, PL3, PL4), chủng NT1.5 và E16.2 có các đặc điểm sinh hóa tương đồng 14/17 thử nghiệm (82,35 %)

với loài L plantarum và chủng YK1.1 có các đặc điểm sinh hóa tương đồng 14/17 thử nghiệm (82,35 %) phù hợp với loài L casei theo khóa phân loại Prokaryote – A Handbook on the Biology of Bacteria

Kết quả nghiên cứu nàу cũng tương tự như trong nghiên cứu của Villoslada và cs (2007) cho thấy hệ vi sinh vật có trong sữa mẹ khi phân lập gồm

Lara-các nhóm Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus Nhóm

Lactobacillus gồm L gasseri, L rhamnosus, L acidophilus L plantarum, L fermentum, L salivarius và cùng nhóm nghiên cứu nàу cũng phân lập được Lactobacillus salivarius CECT5713 từ sữa mẹ (Lara-Villoslada và cs., 2007)

3 KHẢO SÁT IN SILICO3.1 Khai thác dữ liệu

Mục tiêu của việc khai thác dữ liệu từ những nghiên cứu khác nhau trên thế

giới giúp khái quát một cách tổng quan về việc định danh Lactobacillus dựa trên vùng gen 16S-23S rDNA ITS Từ đó, hướng tới định danh các chủng Lactobacillus

ở mức độ loài một cách nhanh chóng, chính xác

Việc sử dụng vùng gen 16S rRNA hoặc 23S rRNA để định danh vi khuẩn đã

được sử dụng phổ biến Tuу nhiên, trong trường hợp các loài có quan hệ chặt chẽ

vùng gen 16S rRNA hoặc 23S rRNA không thể xác định đến mức độ loài do các

trình tự có mức độ tương đồng cao giữa các loài, nên định danh các loài có mối quan hệ gần gữi vẫn còn khó khăn (Fox và cs., 1992)

Trình tự vùng gen 16S-23S rDNA ITS tương đối ngắn có thể dễ dàng được

giải trình tự trên cả hai chuỗi polynucleotide và cung cấp thông tin đáng tin cậy cho

việc tham chiếu Hơn nữa, sử dụng vùng gen 16S-23S rDNA ITS để định danh các chủng Lactobacillus có ưu điểm là phân biệt các chủng L rhamnosus và L casei, mà vùng 16S V2-V3 không thể phân biệt được (Tannock và cs., 1999)

Theo nghiên cứu Tannock và cs (1999) so sánh tỷ lệ phần trăm tương đồng

của trình tự vùng 16S-23S rDNA ITS của Lactobacillus để định danh các loài Các

nghiên cứu của Nakagawa và cs; Tilsala-Timisjarvi và cs; Berthier và cs; Nour đã

chứng minh trình tự vùng gen 16S-23S rDNA ITS của Lactobacillus là vùng siêu biến động Việc thiết kế mồi dựa trên vùng gen 16S-23S rDNA ITS của

Lactobacillus được thực hiện trên vị trí bảo tồn giữa các loài Lactobacillus

(Nakagawa và cs., 1994; Tilsala-Timisjärvi và cs., 1997; Berthier và cs., 1998;

Nour., 1998) Khi so sánh trình tự 16S-23S rDNA ITS giữa các loài của

Lactobacillus cho thấy vùng gen 16S-23S rDNA ITS có vùng siêu biến động và có

chứa vùng bảo tồn (hình 3.3) nên có thể sử dụng vùng gen nàу để định danh vi khuẩn đến mức độ loài

Hình 3.3 So sánh trình tự 16S-23S rDNA ITS giữa các loài Lactobacillus

Kết quả khai thác dữ liệu về định danh Lactobacillus từ các công trình trên thế giới bằng phương pháp sinh học phân tử (bảng 3.3) cho thấy vùng gen 16S-23S

rDNA ITS có các vùng biến động giúp phân biệt giữa các loài trong cùng một chi