TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- HÀ LONG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC 43300 MRSA TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 07 năm 2020
+ PTN Công nghệ Vi Sinh - cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương + Phòng 19, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học,
01 Mạc Đĩnh Chi, Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh
+ Phòng 4.4, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, TL29, Thạnh Lô ̣c, Quận 12, TP Hồ Chí Minh.
Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
Chủng S aureus ATCC 43300 (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa Biotek.
Môi trường – hóa chất
- Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA)
- Cồn 96 o , 70 o , NaCl, HCl, NaOH, H2SO4 10%
- Các dung môi : n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol và nước
- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất
Thiết bị và dụng cụ
- Máy ly tâm - Máy vortex
- Máy đo pH - Máy chụp hình
- Kính hiển vi - Tủ lạnh
- Cân điện tử - Tủ cấy
- Nồi hấp vô trùng - Đĩa petri
- Lọ thủy tinh - Ống đong
- Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng ( 100-1000 𝜇L, 20-200 𝜇L)
- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, qua cấy trang
2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thừa kế quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi n-hexane từ công trình nghiên cứu trước, tiếp tục thực hiện quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi ethyl acetate để thực hiện tiếp các thí nghiệm
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ
Tiến hành sấy khô củ sâm đại hành 50 o C trong 72 giờ và xay nhuyễn sau khi định danh tên khoa học được Bột dược liệu thu được được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực khác nhau Tiến hành ngâm phân đoạn bột dược liệu với ethanol 96 o trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50 o C và bốc hơi
SVTH: Hà Long hết dung môi để thu cao thô Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao thô được hòa tan với nước theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate và nước với tỉ lệ 1:1 Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Khi có cao chiết ethyl acetate tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Sau đó sắc ký cột cao chiết ethyl acetate thu các phân đoạn, khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy để chọn ra phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA Tiến hành khảo sát kháng MRSA của phân đoạn kháng mạnh nhất bằng phương pháp hiện hình sinh học Sau đó tiến hành sắc ký cột phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA để thu nhận chất Khi chất được tinh sạch thì tiến hành gửi giải phổ 13 C-NMR, 1 H-NMR để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất thu được
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
H: hiệu xuất chiết suất A: khối lượng cao thu được B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
Sâm đại hành Định danh tên khoa học
Chiết với các dung môi
Cô thành cao dược liệu
Khảo sát khả năng kháng MRSA Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Chạy cột sắc ký thu phân đoạn
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và hiện hình sinh học
Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất
Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV (Bộ y tế, 2009)
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO 1% theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
- Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabouraud dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Từ dung dịch mẫu thử 10 -1 , pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85% để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10 -2 , 10 -3 ,… Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40-45 o C Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15-20 mL môi trường Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37 o C/ 24-48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28-30 o C/5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm men – nấm mốc
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25-250
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1 g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1 g (mL) mẫu (CFU/g hay CFU/mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: hệ số pha loãng thứ i v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL).
Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300
- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn MRSA:
+ Vi khuẩn S aureus ATCC 43300 (MRSA) cung cấp bởi công ty Nam Khoa
Biotek được cấy vào môi trường NB, ủ ở 37 o C
+ Sau 6 giờ tăng trưởng, huyền dịch vi khuẩn đạt được hay hơn độ đục tiêu chuẩn 0,5 McFarland tương đương mật độ tế bào đạt 1-2 x 10 8 CFU/mL + Dùng nước muối sinh lý vô trùng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn đang tăng trưởng đến độ đục chuẩn 0,5 McFarland
+ Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng 1 que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm
+ Trải đầy vi khuẩn từ que gòn lên mặt thạch Mueller Hinton (MHA) đã hong khô trước đó Trải bằng cách cấy vạch que gòn lên mặt thạch, xong lại xoay mặt thạch 60 o rồi cấy vạch một lần nữa, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi khuẩn lên mặt thạch
+ Hòa tan cao chiết với dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% theo tỉ lệ 1:5, lấy 20 àL dịch pha loóng bằng micropipet tẩm vào đĩa giấy, để trong đĩa petri vụ trùng cho đến khi bay hết dung môi
+ Dùng kẹp vô trùng gắp các đĩa giấy đặt vào các đĩa petri đã trải huyền dịch vi khuẩn trước đó, sử dụng một đĩa giấy tẩm nước cất vô trùng để làm đối chứng
+ Đặt đĩa petri vào tủ lạnh, để yên trong 15 phút cho huyền dịch khuếch tán vào lớp thạch và ủ ở 4 o C
+ Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện với hệ dung môi đã khảo sát.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với
- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn MRSA với mật độ tế bào 10 6 CFU/mL:
+ Dùng vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào canh trường để mọc tốt Điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn tương đương với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có nghĩa là lượng vi khuẩn đạt 10 8 tế bào/mL
+ Pha loãng 1/100 ống vi khuẩn 10 8 tế bào/mL với nước muối sinh lý 0,85%
Khi đó, ống đạt 10 6 tế bào/mL
+ Từ dung dịch gốc cú nồng độ 1000 àg/mL, cao chiết thử nghiệm được pha loãng với DMSO 1% với tỉ lệ 1:5 theo cấp số nhân thành các nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128
+ Trộn 2,5 mL dung dịch cao chiết đã pha vào 22,5 mL thạch MHA
+ Nhỏ 2 àL dịch vi khuẩn (cú nồng độ 10 6 tế bào/mL) lờn đĩa thạch MHA có chứa nồng độ cao chiết thử nghiệm, ủ trong 37 o C trong 18-24 giờ + Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện với hệ dung môi đã khảo sát.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)
- Chuẩn bị ống vi quản:
+ Lấy ống vi quản có đường kính 1-2 mm, dài 5 cm Cầm hai đầu ống vi quản, hơ đoạn giữa ống trên một đèn cồn, vừa hơ vừa xoay vòng vòng
+ Khi nhận thấy thủy tinh mềm dẻo như muốn nóng chảy, nắm hai đầu ống kéo dang ra xa (về hai phía), thủy tinh của ống sẽ dãn dài ra
+ Từ tấm bản mỏng thương mại, cắt thành bản nhỏ với kích thước phù hợp + Dùng bút chì vạch nhẹ mức xuất phát (cách mép dưới 1 cm) và mức tiền tuyến dung môi (cách mép trên 0,5 cm)
+ Hòa tan cao khô với dung môi hòa tan Chấm dung dịch cao lên mức xuất phát trên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng bằng một ống vi quản, các vết cách nhau 1 cm, giữ cho vết chấm không lan rộng ra trên bản, vết phải có đường kính từ 2-5 mm Dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm + Cho 10 ml dung môi vào bình, chiều dày của lớp dung môi trong bình giải ly không được cao quá 1 cm Bình cần được bão hòa dung môi bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc
+ Đặt tấm lớp mỏng đã chấm trước đó vào bình, để cho các vết chấm ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1,0 cm Khi dung môi lên đến mức tiền tuyến dung môi của bản thì nên lấy ản ra khỏi bình giải ly
+ Sau khi giải ly xong, đặt tấm bản mỏng dưới đèn chiếu tia UV 254 nm và
366 mm và quan sát các vết hiện rõ dưới đèn UV
+ Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện với hệ dung môi đã khảo sát.
Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh)
Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký lớp mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau
+ Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột
+ Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài
+ Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều
+ Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột
+ Nghiền nhuyễn cao khô với một ít silica gel thành hỗn hợp bột khô, mịn và đồng nhất
+ Cho hết hỗn hợp vừa nghiền vào cột đã chuẩn bị sẵn bằng phễu thủy tinh.
Phương pháp hiện hình sinh học
- Pha loãng vi khuẩn MRSA với nước muối sinh lý NaCl 0,85%, so với ống 0,5 McFarland sao cho dịch khuẩn pha loãng có nồng độ 10 6 CFU/mL
- Tiến hành giải ly tấm sắc ký với hệ dung môi thích hợp
- Cho dịch khuẩn có nồng độ 10 6 CFU/mL vào đĩa petri vô trùng, sau đó gắp tấm sắc ký đã giải ly vào đĩa chứa dịch khuẩn thử nghiệm Tiến hành ủ 25 o C trong 48 giờ
- Gắp tấm sắc ký ra khỏi đĩa, phơi khô Sau đó phun hoặc nhúng muối tetrazolium vào tấm sắc ký Tiến hành ủ 37 o C trong 3-4 giờ và đọc kết quả
Phương pháp xác định cấu trúc
Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn) tại Viện Hóa Học
