--- ∞0∞--- NGUYỄN THỊ TRÚC LY PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH Eleutherine subaphylla Gagnep.. --- ∞0∞--- NGUY
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian: Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10/2019 - 07/2020
+ Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh
+ Phòng 19, Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học,
01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh
+ Phòng 44, Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, Thạnh Lộc 29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP Hồ Chí Minh.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh
- Vi nấm C albicans được cung cấp bởi Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và môi trường
Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm, microwave, bếp điện, cân kĩ thuật, máy vortex, máy sấy
2.2.2.2 Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri, lame, pipet (thủy tinh và pipetman), becher, erlen, ống đong, phễu, bộ nhuộm gram, đũa thủy tinh, que cấy, que cấy trang, đèn cồn, tăm bông vô trùng
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
Môi trường nutrient agar (NA), môi trường potato dextrose agar (PDA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA), cồn 70 o C
- Dung môi để chiết cao từ bột củ sâm đại hành: Petroleum ether (60-90), n- hexane, chloroform (CHCl3), ethanol và methanol
- Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxide (DMSO) Ống mẫu Mc Farland 0,5:
- Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 10 8 vi khuẩn/mL
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát khả năng kháng C albicans
Chiết với các dung môi
Cô thành cao dược liệu Định danh tên khoa học
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Chạy cột sắc kí thu phân đoạn
Khảo sát khả năng kháng C albicans của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
C albicans tốt nhất tiếp tục chạy sắc kí thu nhận chất
Xác định cấu trúc hợp chất có khả năng kháng
Sắc kí bản mỏng (TLC)
Khảo sát khả năng kháng C albicans của hợp chất thu được bằng phương pháp tự sinh đồ
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE
Thừa kế quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi n-hexane từ công trình nghiên cứu trước, tiếp tục thực hiện quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi ethyl acetate để thực hiện tiếp các thí nghiệm
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ
Bột dược liệu từ củ sâm đại hành được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực khác nhau
Tiến hành ngâm phân đoạn bột dược liệu với ethanol 96 o trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50 o C và bốc hơi hết dung môi để thu cao thô Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao thô được hòa tan với nước theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate và nước Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
A: khối lượng cao thu được
B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
❖ Đếm tổng số nấm men - nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí
Phơi khô dưới nắng hoặc sấy 50 o C/72 giờ
Thêm nước theo tỉ lệ 1:10 Phần dịch còn lại
Chiết lỏng - lỏng với ethyl acetate
Chiết lỏng - lỏng với n-hexane
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Từ dung dịch mẫu thử 10 -1 , pha loãng bằng dung dịch NaCl 0.85% để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10 -2 , 10 -3 ,… Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40-45 o C Dùng pipet vô trùng hút vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15-20 mL môi trường Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37 o C/ 24-48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28-30 o C/ 5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm nem - nấm mốc
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25 - 250
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1 g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1g (mL) mẫu (CFU/g hay CFU/mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: hệ số pha loãng thứ i v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL).
ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT
Sắc kí cột (SKC) được tiến hành trên cột thủy tinh, tùy vào lượng cao và chất hấp thu mà chọn cột phù hợp, làm khô cột và cân silicagel cần dùng, pha dung môi giải ly
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
Nhồi một ít bông gòn dưới đáy cột để silica gel không chảy ra ngoài Sau đó, cho silica gel vào dung môi giải ly, rồi rót nhẹ vào cột Để một cốc thủy tinh nhỏ (50 mL) phía dưới cột, sau khi rót hết silica gel vào thì xả cột để cố định silica gel, rót thêm dung môi vào cột để ổn định hệ Với chất nhồi cột là silica gel pha thường Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Hòa mẫu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc thủy tinh để hấp thụ mẫu, trộn mẫu và silicagel cho đến khi được một hỗn hợp khô Cho hết hỗn hợp đó vào cột và rót dung môi giải ly vào Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu cho một ít bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định, tiếp tục châm dung môi giải ly vào (Trương Minh Lương và cs., 2009) Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng mẫu cần sắc kí (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với những hỗn hợp các chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Các hệ dung môi được sử dụng để chạy cột dành cho cao ethyl acetate lần lượt theo tỉ lệ là n-hexane : ethyl acetate (75 : 25), n-hexane : ethyl acetate (50 : 50), n- hexane : ethyl acetate (25 : 75), n-hexane : ethyl acetate (0 : 100) và ethyl acetate : methanol (90: 10), tỉ lệ về thể tích Sau đó sẽ thu được 5 phân đoạn, mỗi hệ dung môi được sử dụng để chạy cột tương ứng với 1 phân đoạn: ES-EA1, ES-EA2, ES-EA3, ES-EA4, ES-EA5 Các phân đoạn sau khi thu được sẽ đem đi khảo sát khả năng kháng C albicans Sau đó, lựa chọn phân đoạn có khả năng kháng C albicans tốt nhất tiếp tục đem đi tiến hành chạy sắc kí cột để thu các hợp chất
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
Hình 2.3 Sơ đồ tách các phân đoạn từ cao ethyl acetate
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG C albicans CỦA CAO CHIẾT
2.7.1 Khảo sát khả năng kháng C albicans của các cao chiết từ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Chuẩn bị huyền dịch nấm C albicans
+ Vi nấm C albicans được cung cấp bởi Khoa Dược, Đại học Y Dược
TP Hồ Chí Minh được cấy ria nấm trên môi trường thạch Sabouraud, ủ
+ Lấy khuẩn lạc riêng lẻ cấy vào Sabouraud lỏng, ủ 37 o C trong 24 giờ
+ Đo OD600 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng 0,08 - 0,1 tương ứng với 0,5 McFarland, mật độ tế bào đạt 10 6 CFU/mL
+ Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi nấm, dùng một que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm
+ Trải đầy vi khuẩn từ que gòn lên mặt thạch Sabouraud đã hong khô trước đó Trải bằng cách cấy vạch que gòn lên mặt thạch, xong lại xoay
ES - EA3 (7,6 g) Cao ethyl acetate (58 g)
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY mặt thạch 60 o rồi cấy vạch 1 lần nữa, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi nấm lên mặt thạch
+ Hòa tan cao chiết với dimethyl sulfoxide (DMSO) theo tỉ lệ 1 : 5, hỳt 70 àL dịch chiết bơm vào lỗ 6 mm đó đục bằng dụng cụ vụ trựng (trong đó có một giếng không bơm dịch chiết mà bơm dung môi DMSO làm giếng đối chứng)
+ Đặt đĩa petri vào tủ lạnh, để yên trong 15 phút cho huyền dịch khuếch tán vào lớp thạch và ủ ở 4 o C
+ Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện với hệ dung môi đã khảo sát
2.7.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi nấm C albicans
- Nguyên tắc: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory
Concentration – MIC) là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng nấm ở đó nấm không phát triển hoặc phát triển ít hơn 3 khuẩn lạc
- Mục đích: Nhằm xác định sự kìm hãm tăng trưởng của vi nấm thử nghiệm khi được ủ chung với cao chiết, khảo sát trong 72 giờ (Espinel Ingroff và cs., 2002)
+ Môi trường SDA đã được hấp vô trùng ở 121 o C/ 20 phút để tiến hành tăng sinh vi nấm thử nghiệm
+ Chuẩn bị môt dãy ống nghiệm (11 ống) đã hấp tiệt trùng
- Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được thực hiện như sau:
+ Pha loãng cao chiết với DMSO 10%, từ dung dịch gốc có nồng độ
1000 àg/mL, cao chiết thử nghiệm được pha loóng theo cấp số nhõn thành các nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
+ Cho cao chiết vào dãy ống nghiệm với độ pha loãng khác nhau và trộn đều cao chiết với DMSO 10%
+ Đổ cao chiết từ các ống nghiệm ra đĩa rồi cho môi trường SDA vào và trộn đều Sau đó, để môi trường khô hoàn toàn
+ Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh:
• Cấy ria nấm trên môi trường thạch SDA, ủ ở 37 o C trong 48 giờ
• Lấy khuẩn lạc riêng lẻ cấy vào SDB lỏng, ủ 24 giờ ở 37 o C
• Đo OD530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,1 tương ứng với McFarland 0.5 sau đó pha loãng dịch nấm để đạt mật độ tế bào đạt 10 6 CFU/mL
+ Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch vi nấm đã chuẩn bị chấm lên đĩa môi trường có chứa cao chiết Trong đó, có một đĩa chỉ chứa môi trường được làm đĩa đối chứng
Kết quả: Đọc kết quả dựa trên sự tăng trưởng của vi nấm thử nghiệm (Espinel Ingroff và cs., 2002) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.7.3 Khảo sát khả năng kháng C albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ
Phương pháp tự sinh đồ bằng cách phun dịch khuẩn:
- Nấm được cấy trên môi trường thạch SDA có bổ sung kháng sinh cloramphenicol, ủ ở 30 o C/24 giờ
- Dùng que cấy cạo nhẹ bề mặt khóm nấm để lấy bào tử cho vào ống nước muối 0.85%
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
- Đo OD530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1x10 8 CFU/mL, sau đó pha loãng dịch nấm để đạt được nồng độ 10 6 CFU/mL
- Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
- Các tấm TLC sau khi được chạy sắc ký sẽ được làm khô hoàn toàn để loại bỏ dung môi trước khi thử hoạt tính kháng
- Các tấm TLC sau đó được cho vào đĩa petri vô trùng, cho dịch vi nấm vào
- Ủ 25 o C trong 48 giờ Nhận biết sự hiện diện của vi nấm bằng muối tetrazolium, muối này chuyển đổi dehydrogenase của vi sinh vật sống thành màu formazan (Shai và cs., 2008)
- Ủ 25 o C trong 24 giờ hoặc 37 o C trong 3-4 giờ
Các vùng màu trắng trên nền tím của tấm TLC biểu thị hoạt tính kháng nấm của mẫu (Shai và cs., 2008).
KHẢO SÁT CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG
Sắc kí bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60F254 (Merck 1,05715)
Cao chiết sau khi thu được hòa tan với dung môi thích hợp, cao chiết dung môi nào hòa tan với dung môi đó
Là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm, đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY trong của bình, cho một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5-10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng
Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng Thể tích dung dịch từ 0,001-0,005 mL đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,1-0,2 mL khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5-2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8-1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2-6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Ðặt bản nhôm gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Đọc kết quả:
Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách
PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
Sử dụng sắc kí cột pha rắn, sắc kí lỏng - lỏng, sắc kí bản mỏng điều chế (PTLC), sắc kí kết hợp với sắc kí bản mỏng (TLC) để phân lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn nhỏ có hoạt tính kháng.
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Avance 500, 1H- (500 MHz)và 13 C- (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY
