BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- LÊ THỊ TRÚC LINH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC 43300 KHÁNG METHICILLIN MRSA TỪ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10/2019 – 7/2020
Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3)
Phòng 19, Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ hóa học, 01 Mạc Đỉnh Chi phường Bến Nghé Quận 1
Phòng 44, Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ hóa học, TL29 phường Thạnh Lộc quận 12.
Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được thu hái ở tỉnh Tây Ninh được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên
Chủng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa Biotek
2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
❖ Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: cân phân tích, tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy cô quay chân không, máy vortex, kính hiển vi,…
Dụng cụ: bình chiết dược liệu, phễu lọc, bếp cách thủy, tủ sấy, lọ bi thủy tinh, đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, erlen, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn, bông không thấm nước…
Dung môi để chiết cao diệp hạ châu đắng: ethanol 96º, n-hexane, ethyl acetate, nước
Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Ống mẫu Mc Farland 0,5:
- Dung dịch BaCl 2 1% 0,05 ml Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 10 8 vi khuẩn/mL
Nước muối sinh lý 0,85%, NA (Nutrient Agar), MHA (Muller Hinton Agar), Sabourard dextrose.
Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, sơ đồ bố trí thí nghiệm:
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.3.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
❖ Thu nhận mẫu Địa điểm: Tây Ninh
Thu nhận mẫu: Chọn những mẫu cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) đắng khỏe mạnh, tăng trưởng tốt, không sâu bệnh, dập úng
(Phyllanthus amarus) Định danh tên khoa học
Chạy cột sắc ký thu phân đoạn Bột dược liệu
Chiết với các dung môi
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Cô thành cao dược liệu
Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT
Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đem về rửa sạch đất, phơi khô tự nhiên sau đó nghiền nhỏ thành bột khô và lưu trữ cho lần sử dụng kế tiếp
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
Mục địch: xác định loại dung môi thích hợp cho hiệu suất cao
Yếu tố khảo sát bao gồm: dung môi trích ly gồm n-hexane, ethanol 96º, ethyl acetate và nước
Các yếu tố được giữ cố định trong thí nghiệm này bao gồm: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu so với thể tích dung môi được cố định ở mức 1:5, nhiệt độ chiết suất được duy trì ở nhiệt độ phòng và thời gian trích ly được thiết lập là 72 giờ.
Bột dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau Tiến hành ngâm phân đoạn 3 kg bột dược liệu với 2.5 L ethanol 96º trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50ºC và bốc hơi hết dung môi để thu cao thô Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao thô được hòa tan với một xíu nước và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng phương pháp như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
A: khối lượng cao thu được
B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết cao diệp hạ châu đắng
2.3.4 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn là phương pháp kiểm tra khả năng kháng khuẩn của thuốc đối với vi khuẩn hiếu khí và nấm Phương pháp này giúp xác định số lượng vi khuẩn và nấm có thể tái sinh sau khi tiếp xúc với thuốc, đồng thời phát hiện các vi khuẩn có khả năng sống sót trong thuốc theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
❖ Đếm tổng số nấm men - nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Chiết lỏng - lỏng với ethyl acetate
Chiết lỏng - lỏng với n-hexane
Phơi khô dưới nắng hoặc sấy 50ºC/72 giờ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT
Pha loãng mẫu thử với NaCl 0,85% để tạo loạt dung dịch pha loãng theo cấp số nhân Làm nóng môi trường cấy, sau đó làm nguội đến 40-50ºC Cho 1 mL mẫu thử vào đĩa petri đã chứa môi trường Đổ 15-20 mL môi trường vào mỗi đĩa Xoay đĩa cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ để trộn đều mẫu thử Để thạch đông tự nhiên, lật ngược đĩa và ủ ở 37ºC trong 24-48 giờ để đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí hoặc 28-30ºC trong 5 ngày để đếm tổng số nấm men - nấm mốc.
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25-250
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1 g (mL) mẫu (CFU/g hay CFU/mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: hệ số pha loãng thứ i v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL)
2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết
❖ Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao chiết từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (Orho và cs., 2015) Trải dịch vi khuẩn thử nghiệm (mật độ 10 8 CFU/ml) lên đĩa môi trường MHA Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng Các cao
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT chiết được hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) (theo tỷ lệ 1:5) và nhỏ vào mỗi giếng khoảng 70 μl Ủ 37 o C/18-24 giờ và đọc kết quả vòng kháng khuẩn
❖ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà tại đó cao chiết có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi sinh vật Để xác định MIC của các cao chiết từ dược liệu với các vi sinh vật chúng tôi áp dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (CLSI, 2010) Từ dung dịch gốc cú nồng độ 1000 àg/mL, cao chiết thử nghiệm đượcpha loãng theo cấp số nhân thành các nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 Sau đó trộn 2,5 mL dung dịch cao chiết đã pha vào 22,5 mL thạch MHA Tiến hành nhỏ 2 àL dịch vi khuẩn (cú nồng độ 10 6 tế bào/mL) lờn đĩa thạch MHA có chứa nồng độ cao chiết thử nghiệm, ủ trong 37ºC/18-24 giờ Đọc kết quả ở nồng độ thấp nhất mà các vi sinh vật bị ức chế sự phát triển
2.3.6 Phương pháp sắc ký bản mỏng
- Phương pháp sắc ký bản mỏng được thực hiện trên tấm silica gel F254, (Merck)
- Cao chiết thu được sẽ được hòa tan với nước
- Sử dụng ống vi quản, chấm các cao đã được pha loãng vào tấm TLC cách mép đáy 1.5 cm và cách bề mặt dung môi từ 0.8-1 cm Các vết ở 2 bên bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ
- Đặt các tấm TLC đã được chấm vào ly thủy tinh có chứa dung môi và được đậy kín để tránh dung môi bay hơi
- Dung môi chạy đến khoảng 80% tấm TLC thì lấy ra để nhiệt độ phòng để các bản mỏng được khô hoàn toàn
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT
Sau khi sấy khô, các tấm TLC được chiếu dưới tia UV ở bước sóng 254 nm hoặc phun dung dịch 𝐻 2 𝑆𝑂 4 10% trong EtOH, tiếp theo làm nóng trên bếp điện 1-2 phút, 105ºC.
2.3.7 Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột được thực hiện bằng silica gel Merck pha thường, có kích thước hạt trung bình từ 0,040-0,063 mm Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất, ta tiến hành sắc ký cột pha thường kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để phân tách ra các phân đoạn nhỏ với hệ dung môi rửa giải khác nhau.
- Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột
- Cho một ít bong gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài
- Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều
- Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột
• Nghiền nhuyễn cao khô với một ít silica gel thành hỗn hợp bột khô, mịn và đồng nhất
• Cho hết hỗn hợp vừa nghiền vào cột đã chuẩn bị sẵn bằng phễu thủy tinh
• Tiếp đó, cho từ từ dung môi vào cột để tiến hành phân lập
Các hệ dung môi được sử dụng để chạy cột lần lượt theo tỉ lệ thể tích là n- hexane: ethyl acetate (75:25), n-hexane: ethyl acetate (50:50), n-hexane: ethyl acetate (25:75), n-hexane: ethyl acetate (0:100), ethyl acetate: methanol (90:10)
Sau đó sẽ thu được 5 phân đoạn, mỗi hệ dung môi được sử dụng để chạy cột tương
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
GVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT ứng với 1 phân đoạn: PA-E1, PA-E2, PA-E3, PA-E4, PA-E5 Các phân đoạn sau khi thu được sẽ đem đi khảo sát khả năng kháng MRSA Sau đó, lựa chọn phân đoạn có khả năng kháng MRSA tốt nhất tiến hành chạy sắc ký cột một lần nữa để thu các hợp chất và cuối cùng là đem các chất sau khi chạy cột phân đoạn tốt nhất đi xác định cấu trúc
2.3.8 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ
- Mục đích: Phát hiện hợp chất có hoạt tính sinh học trực tiếp ngay trên sắc ký đồ
