phân lập và tinh chế hợp chất kháng staphylococcus aureus atcc 43300 kháng methicillin mrsa từ cao chiết diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- LÊ THỊ TRÚC LINH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC 43300 KHÁNG METHICILLIN MRSA TỪ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

LÊ THỊ TRÚC LINH

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT KHÁNG

Staphylococcus aureus ATCC 43300 KHÁNG

METHICILLIN (MRSA) TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ

CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

LÊ THỊ TRÚC LINH

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT KHÁNG

Staphylococcus aureus ATCC 43300 KHÁNG

METHICILLIN (MRSA) TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ

CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC-Y DƯỢC

Trang 3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn cô ThS Dương Nhật Linh đã tận tâm hướng

dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Tấn Phát và

các anh chị tại Viện Công nghệ Hóa học- số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 44 Viện Công nghệ Hóa học, TL 29, Phường Thạnh Lộc, Quận 12 đã hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị và phương pháp thực hiện để hoàn thành đề tài

Em cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và các anh chị trong Phòng thí nghiệm Công

nghệ Vi sinh- Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hết lòng giúp đỡ em giải quyết những vấn đề xảy ra trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Và cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ, những người đã sinh thành,

nuôi nấng và dạy dỗ con trưởng thành Gia đình đã luôn bên cạnh con, dành những lời động viên lúc con gặp khó khăn nhất, giúp con vững bước trên con đường đã chọn

Kính chúc quý thầy cô, anh chị, các bạn và cả gia đình dồi dào sức khỏe Bình Dương, tháng 8 năm 2020

Trang 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) 5 1.1.1 Phân loại Staphylococcus aureus 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu MRSA trên thế giới và Việt Nam 5

1.2 Tổng quan về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 9

1.2.1 Phân loại khoa học 9

1.2.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 9

1.2.3 Thành phần hóa học 10

1.2.4 Tác dụng dược lý 11

1.2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 13

1.3 Khái quát về phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất 14

Trang 5

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 24

2.3.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu 25

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết 26

2.3.4 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 27

2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết 28

2.3.6 Phương pháp sắc ký bản mỏng 29

2.3.7 Phương pháp sắc ký cột 30

2.3.8 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ 31

2.3.9 Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất thu được 32

Trang 6

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây 34

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 34

3.3 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 35

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết 36

3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA……….38

3.6 Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate 39

3.7 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các cao phân đoạn ethyl acetate 40

3.8 Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp tự sinh đồ 42

3.9 Khảo sát các phân đoạn của cao PA-E3 43

3.10 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PA02 46

Trang 7

DANH MỤC VIẾT TẮT

Cs : Cộng sự

MRSA : Staphylococcus aureus kháng methicillin

MHA : Muller Hinton Agar DMSO : Dimethyl sulfoxid NA : Nutrient Agar ĐC : Đối chứng

MIC : Minimum Inhibitory Concetration

Trang 8

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 25

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết cao diệp hạ châu đắng 27

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao ethyl acetate 40

Sơ đồ 3.2 Quy trình phân lập chất của phân đoạn PA-E3 45

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Khối lượng và hiệu suất thu hồi cao ethanol 34 Bảng 3.2 Khối lượng và hiệu suất thu hồi cao từ các dung môi 34 Bảng 3.3 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn có trong cao chiết 36 Bảng 3.4 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của cao chiết từ diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus) 36

Bảng 3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết (1000 µg/mL) 38 Bảng 3.6 Khối lượng của các phân đoạn thu được 40 Bảng 3.7 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn từ diệp hạ

châu đắng (Phyllanthus amarus) 41

Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR của PA02 và Quercetin đo trong DMSO-d6 46

Trang 10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình vi thể của S.aureus 5

Hình 1.2 Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 9

Hình 1.3 Lá và hoa diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 10

Hình 1.4 Công thức hóa học của phyllanthin, hypophyllanthin 11

Hình 3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 37

Hình 3.2 MIC kháng MRSA của cao ethyl acetate 39

Hình 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA của các phân đoạn từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 42

Hình 3.4 (A) Sắc ký lớp mỏng (TLC) chiếu UV (B) Sắc ký lớp mỏng (TLC) sau khi phun muối tetrazolium 42

Hình 3.5 Sắc ký bản mỏng (TLC) của phân đoạn PA-E3.5 43

Hình 3.6 Sắc ký bản mỏng (TLC) của phân đoạn PA-E3.5.2 44

Hình 3.7 Sắc ký bản mỏng (TLC) của chất PA02 44

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của PA02 48

Trang 11

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết 35 Biểu đồ 3.2 So sánh kết quả kháng MRSA của các cao chiết từ cây diệp hạ

châu đắng (Phyllanthus amarus) 37

Biểu đồ 3.3 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các phân đoạn 41

Trang 12

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong vài năm gần đây, hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn đã trở thành mối lo ngại hàng đầu trong lĩnh vực y tế của nhiều quốc gia trên thế giới Sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh làm ảnh hưởng đến việc điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ngày càng khó khăn hơn Lần đầu tiên, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố một danh sách 12 loại siêu vi khuẩn nguy hiểm hàng đầu thế giới Các vi khuẩn này hiện nay đã trở thành mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe con người Các vi khuẩn trong danh sách của WHO được liệt kê theo 3 nhóm, dựa trên mức độ cấp bách mà chúng ta cần tới loại thuốc mới để điều trị chúng.Trong đó có

các vi khuẩn kháng kháng sinh phổ biến là Enterococcus faecium kháng

vancomycin, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là nguyên nhân gây

nên sự kháng thuốc trên toàn cầu

Vi khuẩn MRSA là vấn đề của cả thế giới khi chúng kháng phần lớn các loại kháng sinh đang được sử dụng trong lĩnh vực y tế Gần đây hơn, Kleven và cộng sự đã báo cáo sự gia tăng các trường hợp nhiễm khuẩn MRSA khởi phát tại bệnh viện ước tính khoảng 18.900 trường hợp trong năm 2005 ở Hoa Kì Tương tự, Châu Âu, tỷ lệ nhiễm MRSA chỉ có 0.5% ở Iceland nhưng lại tới 44% ở Hy Lạp từ 1999 đến 2002 (Tiemersma và cs., 2004) Nhiềm trùng MRSA là mầm bệnh có khả năng đe dọa tính mạn con người như nhiễm trùng máu, nhiễm trùng vết mổ, có thể gây hoại tử, viêm phổi gây chết người (Helen và cs., 2008) Do đó, tìm ra nguồn thuốc mới hiện nay là một vấn đề vô cùng cấp thiết

Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất từ tự nhiên.Và như thế, người ta có thể sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật đã cung cấp cho con người nhiều loại

Trang 13

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT thuốc quý có tác dụng phòng và điều trị bệnh tật nguy hiểm (Phan Quốc Kinh, 2011) Tuy nhiên, còn có rất nhiều cây thuốc được sử dụng trong đông y và theo kinh nghiệm dân gian chữa các bệnh như ung thư và các bệnh viêm nhiễm nhưng chưa được nghiên cứu một cách khoa học để làm rõ công dụng và phát triển trở

thành thuốc Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) là một loại thảo dược

nhiệt đới nhỏ phân bố rộng rãi, thân cây có thân màu xanh lá cây và cao tới 10-60 cm Trong y học cổ truyền, diệp hạ châu đắng được sử dụng cho các đặc tính bảo vệ gan, chống tiểu đường, hạ đường huyết, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn (Adeneye và cs., 2006a, b), còn có thể chống lại virus viêm gian B (Thyagarajan và cs., 1988; Wang và cs., 1995), chống ung thư (Joy và cs., 1988) Vào năm 2000, Odetola và Akojothy đã tìm thấy dịch chiết từ cây có khả năng chống tiêu chảy Cây diệp hạ châu đắng chủ yếu chứa lignans (phyllanthine và hypophyllanthine) (Sharma và cs., 1993; Somanabandhy và cs., 1993), geraniin và 5 flavonaoids, các chất thủy phân tannins như: Phyllanthusiin D (Houghton và cs., 1996), amariin (Foo, 1993), amarulone (Rao và Bramley., 1971)

Hiện nay, trên thế giới có một số bài báo đã nghiên cứu và công bố hoạt tính kháng khuẩn từ cây diệp hạ châu đắng Theo Pathak và cộng sự (2017) đã tách

chiết được hợp chất có khả năng kháng các vi khuẩn như Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Proteus vulgaris and Serratia marsescens Theo nghiên cứu của

Oluboyo và cộng sự (2016), đã nghiên cứu cao chiết ethanol của cây diệp hạ châu

đắng có khả năng kháng với S.aureus và P.aeruginosa có đường kính vòng kháng

khuẩn lần lượt là 17,82 mm và 10,82 mm ở nồng độ 10 mg/mL (Oluboyo và cs., 2016) Nhưng ở Việt Nam vẫn còn ít công trình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cây diệp hạ châu đắng và cùng với những lý do trên nên tôi quyết định

thực hiện tiếp đề tài này “Phân lập và tinh chế hợp chất kháng Staphylococcus

aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) từ cao chiết diệp hạ châu

đắng (Phyllanthus amarus) ”

Trang 14

- Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao chiết phân đoạn từ diệp hạ

châu đắng (Phyllanthus amarus)

- Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus) đối với MRSA

- Khảo sát các cao chiết phân đoạn từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus

amarus) bằng phương pháp sắc lý lớp mỏng (TLC)

- Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng MRSA

Trang 15

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 16

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)

1.1.1 Phân loại Staphylococcus aureus

Theo Buchanan và Gibbons (1994), Staphylococcus aureus được phân loại như sau:

Trang 17

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường

đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều Staphylococci không di động,

không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định

Hầu hết các S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Một vài loài

kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những loài này ngày

càng tăng Methicilin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) rất phổ biến và hầu

hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác Trong phòng thí nghiệm,

người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S aureus, và người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử

trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar., 2005) Các chủng MRSA mang gen mã hóa

protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (như

methicillin) ( Lee và cs., 2018)

Tại Hà Lan, một quốc gia áp dụng chính sách 'tìm kiếm và tiêu diệt', một nghiên cứu gần đây cho thấy chỉ 0,03% bệnh nhân là người mang MRSA Hơn nữa, kiểu gen tiết lộ rằng hầu hết các chủng MRSA ở Hà Lan không liên quan đến nhau, và do đó việc nhiễm bệnh có lẽ không phải là kết quả của lây nhiễm (Wertheim và cs., 2004) MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện và cộng động ở những người khỏe mạnh khác Tần xuất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những bệnh nhây gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người/ hội chứng suy giảm miễn dịch mẵ phải (HIV/AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1995 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119% hay 14% mỗi năm (Klein và cs., 2007), khoảng 1650 trường hợp nhiễm trùng dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs., 2009), 11.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2013) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs., 2010) Các tình trạng liên quan đến việc nhiễm

Trang 18

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT MRSA thường được báo cáo bao gồm: sốc nhiễm trùng (56%), viêm phổi (32%), viêm nội tâm mạc (19%), nhiễm khuẩn huyết (10%) và viêm mô tế bào (6%) (Carrol và cs., 2008)

Tỷ lệ nhiễm MRSA đã tăng lên trong 10 năm qua, với số lần xuất viện của bệnh nhân nhiễm trùng da và mô mềm do MRSA gây ra tăng gấp ba lần kể từ năm 2004 (Mera và cs., 2011) Methicillin, giống như tất cả các penicillin Cơ chế đề

kháng của S aureus đối với methicillin là biến đổi protein bám penicillin (PBP),

chịu trách nhiệm duy trì và hình thành vách tế bào vi khuẩn Các chủng MRSA đã thu được một loại protein mới, được gọi là PBP2a, không bị ảnh hưởng bởi

methicillin và có thể thay thế các PBP khác, do đó cho phép S aureus sống sót với

sự hiện diện của methicillin PBP2a được mã hóa bởi gen mec A, đây là dấu hiệu đặc trưng của MRSA Trái ngược với gen penicillinase, mecA không cư trú trên một plasmid mà trên nhiễm sắc thể, được nhúng vào một yếu tố di truyền lớn có tên là Staphylococcal Chromosome Cassette mec hoặc SCC mec Sự hiện diện của PBP2a có nghĩa là MRSA không chỉ kháng với methicillin mà còn với tất cả các

loại kháng sinh β-Lactam, bao gồm cả penicillin tổng hợp, cephalosporin và

carbapenem (Katayama và cs., 2000) Hơn 50% các chủng MRSA kháng với các loại thuốc như macrolide, lincosamide, fluoroquinolones và aminoglycoside; và 30% kháng với trimethoprim-sulfamethoxazole (Archer, 1998) Harbarth và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự khác biệt trong dịch tễ học của vi khuẩn đa kháng tại Hoa Kỳ và Đức Tỷ lệ kháng kháng sinh nói chung ở Đức thấp hơn ở Mỹ, nhưng không thấp hơn một số quốc gia châu Âu khác như Hà Lan Lý do cho sự khác biệt giữa Hoa Kỳ và Đức không rõ ràng, nhưng có thể liên quan đến sự khác biệt trong việc sử dụng phòng thí nghiệm để chẩn đoán nhiễm trùng và các quy trình thí nghiệm chính xác được sử dụng, cũng như sự khác biệt về dòng vô tính giữa các vi khuẩn lưu hành, thực hành kê đơn kháng sinh, sự khác biệt trong dân số bệnh nhân và các yếu tố văn hóa Để nhấn mạnh về mối đe dọa tiềm tàng của MRSA gây ra cho hệ thống chăm sóc sức khỏe ở Châu Phi, một báo cáo toàn cầu đầu tiên của

Trang 19

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT WHO về kháng kháng sinh được công bố năm 2014 đã ghi nhận rằng, ở một số vùng của Châu Phi có đến 80% trường hợp nhiếm MRSA khiến việc điều trị bằng kháng sinh tiêu chuẩn không còn hiệu quả Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp

Để đối phó với tình hình kháng kháng sinh, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật cho các loại thuốc kháng sinh và phương pháp điều trị thay thế (Wang và cs., 2010).Vancomycin là kháng sinh

được lựa chọn để điều trị nhiễm trùng MRSA Tuy nhiên sự xuất hiện của S aureus kháng vancomycin (VRSA) và vancomycin-trung gian S.aureus (VISA) đã khiến

việc điều trị kháng khuẩn trở nên khó khăn Do đó, các hợp chất mới được điều chế để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi các vi sinh vật này đã được phát triển và nghiên cứu rộng rãi (Lora-Tamayo và cs., 2012)

❖ Tình hình ở Việt Nam

Sự lây nhiễm MRSA dẫn đến nhiều ca tử vong ở các bệnh viện tại Việt Nam MRSA là nguyên nhân chính gây ra nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện và cộng động ở những người khỏe mạnh khác Các vi khuẩn này có thể sống ký sinh ở vùng da hoặc vùng tai - mũi - họng mà không gây ra bệnh Những người nhiễm MRSA được gọi là vật chủ MRSA thường kéo theo sự đề kháng các kháng sinh

khác là vì cơ chế đề kháng của S aureus đối với methicillin là biến đổi protein bám

penicillin (PBP) chỉ do một gen quy định (mecA) và kháng thuốc kiểu này là kháng thuốc một cấp, nghĩa là một khi đã đề kháng được methicillin thì vi khuẩn đề kháng được tất cả các kháng sinh - lactam và có thể kháng các kháng sinh khác nữa (Phạm Hùng Vân, 2005) Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành

phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm

cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs., 2006) Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp

Trang 20

1.2 Tổng quan về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

1.2.1 Phân loại khoa học

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu Tên khoa học: Phyllanthus amarus Tên thường gọi: cây chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất,

cam kiềm, trân châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu

Theo Hemant Dhongade (1999), diệp hạ châu đắng được phân loại như sau

Loài Amarus Schum.et Thom

Hình 1.2 Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

(http://tropical.theferns.info/viewtropical.php?id=Phyllanthus+amarus)

1.2.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Diệp hạ châu đắng là một loại cây thảo, sống quanh năm, cao 20-30 cm, có thể lên đến 60-70 cm, thân nhẵn, có màu xanh Lá đơn, mọc so le, xếp thành 2 dãy, mỗi cành giống như một lá kép lông chim gồm nhiều lá Phiến lá hình bầu dục đầu tròn có mũi nhọn, màu xanh lục, đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới Hoa mọc ở kẽ lá,

Trang 21

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, mùa hoa: tháng 4-6, mùa quả:

tháng 7-9 Chi Phyllanthus L có nhiều loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong đó đáng chú ý là hai

loài P urinaria và P.amarus có hình dáng gần giống nhau nhưng P.amarus thân có màu xanh, quả nang nhẵn, có tên gọi là diệp hạ châu đắng, còn P urinaria thân có

màu đỏ, quả nang có gai, có tên gọi là diệp hạ châu ngọt hay cây chó đẻ răng cưa Cả hai loài này mọc rải rác ở khắp nơi,phân bố khắp các vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, cây mọc hoang trên đất ẩm, ở khắp các địa phương trừ vùng núi cao, lạnh Diệp hạ châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bầu cỏ, ruộng cao, nương rẫy và vườn nhà, Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh vào mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu nêncây thường được thu hái vào cuối mùa hè vì trong thời gian này cây đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ và chứa lượng hoạt chất cao nhất (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Hình 1.3 Lá và hoa diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

Trang 22

β-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT rutin), tanin (acid elagic; acid 3, 3’, 4-tri-methyl elagic; acid galic), phenol, acid hữu cơ (Acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic), lignan (phyllanthin, hypophyllanthin)

- Các thành phần khác: N-octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triaontanol phylanthurinol acton

Lá diệp hạ châu đắng chứa chất đắng không có quinin hoặc alkaloid, lá khô chứa các chất đắng hypophyllanthin (0,05%) và phyllanthin (0,35%), các chất này gây độc đối với cá và ếch Trong cây có niranthin, nirtetralin, phylteralin, quercetin, niruroidin, isobubialin, epibubialin, isoquercitrin, astragalin, rutin và các cơ (ascorbic, geraniinic, amariinic, phenolic và repandusinic)

Hình 1.4 Công thức hóa học của phyllanthin, hypophyllanthin

1.2.4 Tác dụng dược lý

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đã được chứng minh có rất nhiều

tác dụng dược lý Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus) có tác dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do

làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết (Đỗ Huy Bích và cs., 2004) Bên cạnh đó, diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus) còn được sử dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa

Trang 23

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết

Nước sắc của diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương như Escherichia coli (Akinjogunla và cs., 2010), Staphylococcus aureus (ETTA và cs., 2011), Salmonella typhi (Flora và Folasade., 2008), Shigella flexerneri, Shigella shiga, Baccillus subtilis,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp (Adegoke và cs., 2010) Chất kháng

khuẩn tan nhiều trong ether dầu hỏa, ether ethylic, methanol (Nguyễn Thị Hồng và cs., 2002) Phân đoạn chiết với butanol có hoạt tính bảo vệ gan cao nhất, liều uống 50 mg/kg có tác dụng bảo vệ 35-85%, phân đoạn chiết với nước có tác dụng bảo vệ gan nhẹ 20- 40%

Từ Tích Tổ (2008) cho rằng trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

có các thành phần: flavonoid, alkaloid và các hợp chất phyllanthin, hypophyllathin, niranthin, phylteralin có tác dụng ức chế mạnh virus gây viêm gan (HBV) Diệp hạ

châu đắng (Phyllanthus amarus) ức chế virus viên gan thông qua việc ức chế

enzyme DNA polymerase của HBV từ đó ức chế sự sao chép tế bào của virus viêm gan, làm cho virus không nhân lên được và bị đào thải do không bám vào được DNA, làm giảm hoạt độ của HBsAg và anti-HBs, giúp phục hồi enzyme transminase từ 50-97%, Bilirubin trở về bình thường (Trần Thị Nhã Thi.,2011) Bên cạnh đó, phyllanthin và hypophyllanthin còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống chống tính độc hại tế bào gây bởi carbon tetrachlorid và galactosamin

Triterpentriacontanol trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng

bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây bởi galactosamin Acid galic chứa trong cây có tác dụng kháng khuẩn yếu nhưng phenolic và flavonoid có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh hơn (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).Vậy, diệp hạ

châu đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng dược lý trên hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu,

hệ sinh dục… nhưng tác động rõ rệt nhất là trên gan

Trang 24

1.2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

Theo nghiên cứu của trường đại học dược Santa Catarina (Brazil, 1984) đã phát hiện alkaloid có trong diệp hạ châu đắng có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật

Tại Việt Nam, diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được nghiên cứu đầu

tiên vào năm 1967 tại viện đông y Hà Nội trong điều trị sơ gan cổ trướng

Năm 1985, Syamsunder và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất của diệp hạ châu

đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng bảo vệ gan chống lại carbon tetrachloride và

galactosamine và ethanol gây độc cho gan trong tế bào gan chuột (Syamsunder và cs., 1985)

Năm 1993, Sharma và cộng sự đã tìm thấy được trong lá của P.amarus có

chứa Phyllanthin (0,7%) và Hypophyllanthin (0,3%) cao hơn so với các bộ phận khác trong cây

Năm 2003, Onocha và cộng sự đã nghiên cứu rằng cao chiết methanol của

P.amarus có hoạt tính kháng nấm Candida albicans và ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherica coli và Proteus sp

Theo Kumaran và cộng sự (2005) nghiên cứu cao chiết methanol của P

amarus cho thấy có chứa các hợp chất phenols, flavonoids, flavonols có hoạt tính

chống oxy hóa bắt các gốc tự do là 38,67% (Kumaran và cs., 2005)

Năm 2007, Nguyễn Trọng Tuân và cộng sự đã phân lập và nhận danh cấu trúc của alkaloid từ lá diệp hạ châu đắng là chất Isobubbialine

Năm 2007, Dhandapani và cộng sự đã báo cáo rằng cao chiết từ lá và rễ của

P.amarus có hoạt tính kháng lại tám loại vi khuẩn thử nghiệm như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Staphylococcus albus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Proteus vulgaris

Năm 2011, Mali và cộng sự đã nghiên cứu cao chiết của Phyllanthus amarus

có khả năng chống viêm khớp

Trang 25

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Năm 2010, Adegoke và cộng sự, cao chiết ethanol của lá cây diệp hạ châu

đắng (Phyllanthus amarus) có sự hiện diện của alkaloid, tannin và flavonoid và có tác dụng kháng lại các vi khuẩn Staphylococcus aureus, E coli và Klebsiella Spp

với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 20 mm (Adegoke và cs.,2010)

Theo Okolo và cộng sự (2012) nghiên cứu cao chiết của P.amarus cho thấy khả năng kháng Pseudomonas auregenosa, Escherichia coli, Staphylococus aureus và Candida albican ở nồng độ ức chế tối thiểu thấp tới 100 ppm Và còn cho thấy

sự hiện diện của terpenoid ở thân, lá, hạt và rễ của cây

Năm 2013, Ogunjobi và cộng sự đã báo cáo rằng cao chiết từ ethanol và nước

của P amaruscó khả năng kháng khuẩn tốt, kháng S.aureus (20,2 mm), E.coli (15,3 mm) trong khi đó cao chiết kháng nấm Aspergillus niger (18,2 mm)

Năm 2016, Pathmavathi và cộng sự đã nghiên cứu rằng chiết xuất n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol của lá P.amarus có hoạt tính kháng khuẩn

gây bệnh ở người và kháng nấm

Gần đây nhất, năm 2019, Trần Vinh Phương và cộng sự đã nghiên cứu cho kết

quả rằng dịch chiết từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) nồng độ 1.000 mg/mL có đường kính vòng kháng khuẩn đối với V parahaemolitycus là 16,6-21,4 mm và Vibrio sp là 17,6-23,6 mm Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ tiêu diệt tối thiểu đối với V parahaemolyticus và Vibrio sp tương ứng là 125 và

Cao dược liệu được phân thành ba loại:

Trang 26

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%.Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc

Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet, chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method), ….(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.3.2 Kỹ thuật chiết (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài) Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa

Trang 27

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.3.3 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các

dung môi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến

dung môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n-hexane, ether ethyl, chloroform,

ethyl acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Trang 28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester -O-, aldehyd -CH=O, ceton -CO-, ester -COO- .) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.3.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi.Có thể

dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ cao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60ºC) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007)

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,…

- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Mất khổi lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng

- Các chế phẩm có chứa các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, động vật không thể xử lý theo quy trình làm giảm lượng vi khuẩn: tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 5 x 104 CFU/g (CFU/mL), nấm

và mốc không quá 500 trong 1 g (mL), không được có Salmonella trong 10 g (mL), mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Trang 29

Staphylococcus aureus trong 1 g (mL), tổng số enterobacteria không quá

500 trong 1 g (mL)

1.3.5 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Sắc ký bản mỏng còn được gọi là sắc ký phẳng (Planar Chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thụ, trong đó pha động là một dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng bằng một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic

Bình sắc ký: chậu, hũ hay lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, ví dụ như silica gel, alumin… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit (1 μL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với các vận tốc khác nhau, đi phía sau mức của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.3.6 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là phương pháp tách các chất dựa vào độ phân cực của từng chất Tùy theo tính chất mục đích của người thí nghiệm mà ta sử dụng loại sắc ký cột ướt hoặc khô

Trang 30

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Nhồi cột ướt: dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex

Nhồi cột khô: dùng các chất hấp phụ tính trương nở như Al2O3, CaCO3

Tùy độ phân cực khác nhau của các loại hợp chất mà chúng được hòa tan cùng với dung môi chạy và chạy ra ngoài bình hứng Đây là phương pháp tách chất mang tính cơ bản vì có rất nhiều chất có độ phân cực giống hoặc tương đương giống nhau nên khi chiết ra không chỉ chứa duy nhất một chất mà có thể chứa thêm chất khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

1.4 Khái quát về phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

1.4.1 Phương pháp khuếch tán

❖ Nguyên tắc

Chất thử từ đĩa giấy hay từ giếng đục trong thạch sẽ khuếch tán vào môi trường thạch được cấy vi khuẩn hay vi nấm thử nghiệm Mức độ tác động của chất thử được đánh giá dựa vào đường kính vòng tác động

Phương pháp khuếch tán cho kết quả định tính và bán định lượng hoạt tính của chất thử

❖ Môi trường cơ bản thực hiện thử nghiệm

Môi trường thạch Mueller Hinton Agar (MHA) là môi trường tốt nhất để thử nghiệm (đối với vi khuẩn dễ mọc) vì các lý do sau:

• Cho kết quả có tính lặp lại cao khi thử nghiệm với các loạt môi trường

• Ít chất ức chế đối với sulfonamide, trimethprim và tetracycline

• Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc

• Một số lượng lớn các dữ liệu và kinh nghiệm là có từ kháng sinh đồ thực hiện trên môi trường này

Đối với các vi khuẩn khó mọc thì tiêu chuẩn môi trường phải được biến đổi cho phù hợp, bổ sung các chất đối với mỗi loại vi khuẩn

❖ Quy trình thực hiện thử nghiệm khuếch tán

Trang 31

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Lượng cao chiết ban đầu đưa vào sàng lọc được xác định sơ bộ theo 1 mg dược liệu khô và được hòa tan trong dung dịch DMSO

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, vi nấm được điều chỉnh đến ở nồng độ 108

CFU/ml Môi trường sử dụng là Muller Hinton Agar (MHA) vô trùng được đổ vào mỗi đĩa petri là 20 ml và ủ cùng tác nhân gây bệnh được trải trên đĩa

Dùng ống thép vô trùng đường kính 6 mm đục trên thạch 4 giếng và thêm vào đó 70 µL dịch chiết đã chuẩn bị Dùng parafin dán kín đĩa petri và ủ ở 37ºC trong 18 đến 24 giờ đối với vi khuẩn và 28ºC trong 48 giờ đối với vi nấm gây bệnh Lặp lại thí nghiệm 3 lần và ghi nhận kết quả ức chế của dịch chiết (Rajasekaran và cs., 2008; Kalita và cs., 2012)

1.4.2 Phương pháp pha loãng liên tiếp

Nguyên tắc: Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng của chất thử đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ chất thử khác nhau mà ta xác định được nống độ ức chế tối thiểu của chất thử có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi sinh vật

Chất thử được pha loãng thành dãy nồng độ từ cao đến thấp theo cấp số nhân Tác động kháng vi sinh vật được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của chất thử (Minimum Inhibitory Concetration - MIC) Đây là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ ức chế được sự phát triển của vi sinh vật Phương pháp có ý nghĩa định lượng MIC càng thấp chất thử tác động càng mạnh

Phương pháp này được Ủy Ban Quốc Gia về các Chuẩn Mực Phòng Thí Nghiệm Lâm Sàng (CLSI) chấp thuận và biện luận theo CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute)

Phương pháp chuẩn của CLSI có thể được biến đổi để phù hợp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng chủng loại vi sinh vật khác nhau, hoặc thuận tiện hơn, kinh tế hơn, dễ thực hiện và nhanh hơn,… với điều kiện phương pháp biến đổi cho kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn, có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng

Trang 32

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Kết quả của các phương pháp thử nghiệm chịu ảnh hưởng của các điều kiện thử nghiệm như mật độ tế bào vi sinh vật, môi trường thử, thời gian đọc kết quả, pH môi trường, … vì vậy cần phải tiêu chuẩn hóa các điều kiện trên Để chuẩn hóa các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất tự nhiên hay tổng hợp hóa học, CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) đã qui định các điều kiện thí nghiệm để đảm bảo độ lặp lại và tính liên thông giữa các phòng thí nghiệm trong các tiêu chuẩn đang được áp dụng trên thế giới:

Các tiêu chuẩn về phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:

CLSI, 2008, M27-A3: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm men

CLSI, 2008, M38-A2: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm sợi

CLSI, 2009, M7-A8: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn hiếu khí

1.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham

khảo

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo

trên máy Avance 500, 1H- (500 MHz)và 13C- (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

Trang 33

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 34

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được thu hái ở tỉnh Tây

Ninh được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên

Chủng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) được

cung cấp bởi công ty Nam Khoa Biotek

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

❖ Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: cân phân tích, tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy cô quay

chân không, máy vortex, kính hiển vi,…

Dụng cụ: bình chiết dược liệu, phễu lọc, bếp cách thủy, tủ sấy, lọ bi thủy tinh, đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, erlen, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn,

bông không thấm nước… ❖ Hóa chất

Dung môi để chiết cao diệp hạ châu đắng: ethanol 96º, n-hexane, ethyl

acetate, nước

Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO)

Trang 35

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS DƯƠNG NHẬT LINHGVHD 2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT Ống mẫu Mc Farland 0,5:

- Dung dịch H2SO4 1% 9,95 ml - Dung dịch BaCl2 1% 0,05 ml

Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 108 vi khuẩn/mL ❖ Môi trường

Nước muối sinh lý 0,85%, NA (Nutrient Agar), MHA (Muller Hinton Agar), Sabourard dextrose

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Trang 36

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.3.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu

❖ Thu nhận mẫu

Địa điểm: Tây Ninh

Thu nhận mẫu: Chọn những mẫu cây diệp hạ châu (Phyllanthus

amarus) đắng khỏe mạnh, tăng trưởng tốt, không sâu bệnh, dập úng

Chiết với các dung môi

Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch Cô thành cao dược

liệu

Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch

Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu

nhận chất Xác định nồng độ ức

chế tối thiểu MIC