VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
- Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
- Trại dưa lưới An Nhơn – Khu phố Tân Phú, Phường Tân Bình, Thành phố Dĩ
- Thời gian thực hiện từ tháng 05/2020 - 08/2020
Cây dưa lưới giống Taki được trồng tại trại dưa lưới An Nhơn
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Phòng chuẩn bị môi trường, phòng hấp khử trùng, phòng bảo quản hóa chất, nồi hấp, máy nước cất, lò vi sóng, tủ lạnh, tủ sấy, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, đĩa Petri, Erlen, eppendorf, bercher, đũa thủy tinh
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Kiểm tra tỷ lệ sống của hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L sau khi bảo quản bằng dung môi acetone và nitơ lỏng
• Mục đích thí nghiệm: Kiểm tra tỷ lệ sống của hạt phấn sau khi bảo quản, nhằm tìm ra điều kiện thí nghiệm bảo quản thích hợp đảm bảo được tỷ lệ sống cao của hạt phấn dưa lưới
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt phấn dưa lưới trước khi hoa nở một ngày và hạt phấn sau khi bảo quản
• Điều kiện thí nghiệm: Dung dịch TTC 10 %
• Mô tả thí nghiệm: 0,05 g hạt phấn dưa lưới được tách phấn từ hoa đực dưa lưới trước khi hoa nở một ngày và được sấy ở nhiệt độ 38 o C trong thời gian 1,5 giờ trước khi bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày ở nhiệt độ 5 o C và nitơ lỏng bảo quản trong 5 ngày, đối với nghiệm thức đối chứng 0,05 hạt phấn được thu từ hoa đực dưa lưới trước khi hoa nở một ngày được sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm Các nghiệm thức sẽ được kiểm tra tính sống bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm TTC Sau 72 giờ nhuộm với TTC tiến hành ghi nhận kết quả, hạt phấn sống sẽ bắt màu đỏ bên trong màng tế bào, hạt phấn chết sẽ không bắt màu hoặc có màu đen
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần
• Thời gian theo dõi: 2 tuần
Tỷ lệ hạt phấn sống (%) = ố ạ ấ ò ố ổ ố ạ ấ ộ ườ X 100 Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05, phân hạng Duncan
Bảng 2.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm kiểm tra tỷ lệ sống của 0,05 g hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone trong thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày ở nhiệt độ 5 o C và nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
2.2.2 Quan sát hình thái hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L
• Mục đích thí nghiệm: Xác định và mô tả hình thái hạt phấn trước và sau khi bảo quản của từng nghiệm thức
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt phấn dưa lưới trước khi hoa nở một ngày, hạt phấn dưa lưới sau khi bảo quản
• Mô tả thí nghiệm: Hạt phấn sau khi thu nhận trước khi hoa nở một ngày và hạt phấn sau khi bảo quản trong dung môi acetone và nitơ lỏng, được nhuộm trong thuốc nhuộm acetocarmine theo sơ đồ 2.1 và quan sát dưới kính hiển vi quang học
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần
• Thời gian theo dõi: 2 tuần
• Chỉ tiêu đánh giá: Hình thái của hạt phấn sau khi bảo quản
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
Sơ đồ 2.1: Quy trình nhuộm hạt phấn dưa lưới bằng thuốc nhuộm acetocarmine
Ngâm trong acid HCl 10 % trong 15 phút
Ngâm trong acid HCl 10 % trong 1 phút
Ngâm hạt phấn trong thuốc nhuộm acetocarmine trong 20 phút Đặt mẫu trong acid acetic 45 %
Quan sát dưới kính hiển vi
Bảng 2 2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm quan sát hình thái của hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone trong thời gian
3 ngày, 5 ngày, 7 ngày ở nhiệt độ 5 o C và nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
2.2.3 Khảo sát tỷ lệ đậu trái từ sự thụ tinh của hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L sau khi bảo quản bằng dung môi acetone và nitơ lỏng với hoa cái
• Mục đích thí nghiệm: Khảo sát tỷ lệ đậu trái từ sự thụ tinh của hạt phấn dưa lưới sau khi bảo quản của từng nghiệm thức
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt phấn trước khi hoa nở một ngày (nghiệm thức đối chứng) và hạt phấn được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone và nitơ lỏng
• Điều kiện thí nghiệm: 0,05 g hạt phấn dưa lưới được sấy ở nhiệt độ 38 o C trong thời gian 1,5 giờ trước khi được bảo quản bằng dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 oC sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
• Mô tả thí nghiệm: Sử dụng 0,05 g hạt phấn được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ 5 o C trong thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 0,05 g hạt phấn
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
23 bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thụ phấn, đối với nghiệm thức đối chứng 0,05 hạt phấn được thu từ hoa đực dưa lưới trước khi hoa nở một ngày được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thụ phấn Các nghiệm thức đều thụ phấn cho hoa cái dưa lưới trước khi hoa nở một ngày, hoa cái dưa lưới được bao bằng giấy chống thấm nước trước và sau khi thụ phấn để tránh ảnh hưởng từ nguồn phấn hoa khác Sau 3 ngày tính từ ngày thụ phấn tiến hành ghi nhận kết quả
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần
• Thời gian thực hiện: 3 tuần
• Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ đậu trái (%) / Cây (sau 7 ngày tính từ ngày thụ phấn)
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05, phân hạng Duncan
Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tỷ lệ đậu trái từ sự thụ tinh của hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L sau bảo quản
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
2.2.4 Khảo sát khối lượng trái dưa lưới Cucumis melo L
• Mục đích thí nghiệm: Khảo sát khối lượng trái từ quá trình thụ tinh của hạt phấn dưa lưới sau khi bảo quản của từng nghiệm thức
• Vật liệu thí nghiệm: Trái dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone và nitơ lỏng
• Điều kiện thí nghiệm: Trái dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 o C, sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
• Mô tả thí nghiệm: Trái dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 o C, sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày Sau đó tiến hành cân khối lượng trái
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần
• Thời gian thực hiện: 3 tuần
• Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng trái / cây
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05, phân hạng Duncan
Bảng 2.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát khối lượng quả dưa lưới từ sự thụ tinh của hạt phấn dưa lưới Cucumis melo L sau bảo quản
2.2.5 Khảo sát tỷ lệ hạt chắc của trái dưa lưới Cucumis melo L
• Mục đích thí nghiệm: Khảo sát tỷ lệ hạt chắc từ trái dưa lưới
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone và nitơ lỏng
• Điều kiện thí nghiệm: Hạt dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 o C, sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
• Mô tả thí nghiệm: Hạt dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 o C, sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày Tiến hành giải phẫu trái thu nhận hạt và đếm số lượng hạt chắc và lép, tính tỷ lệ hạt chắc của trái
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
• Thời gian thực hiện: 3 tuần
• Chỉ tiêu đánh giá: Тỷ lệ һạt сһắс (%) = ố ượ ạ ắ ổ ố ạ ắ à é X 100
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05, phân hạng Duncan
Bảng 2.5 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát tỷ lệ hạt chắc của trái dưa lưới Cucumis melo L
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
2.2.6 Khảo sát tỷ lệ nảy mầm từ hạt của trái dưa lưới Cucumis melo L
• Mục đích thí nghiệm: Khảo sát tỷ lệ nảy mầm từ hạt của trái dưa lưới
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt trái dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản trong 1 mL dung môi acetone và nitơ lỏng
• Điều kiện thí nghiệm: Hạt trái dưa lưới từ sự thụ tinh của 0,05 g hạt phấn được bảo quản bằng 1 mL dung môi acetone ở nhiệt độ tủ lạnh 5 o C, sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và bảo quản bằng nitơ lỏng trong thời gian 5 ngày
• Mô tả thí nghiệm: Hạt chắc dưa lưới sau khi được thu nhận từ trái Tiến hành khử trựng bằng cỏch khử Javel 10% 2 lần (10 phỳt/lần) và cấy trờn mụi trường MS ẵ đa lượng Sau đó, bảo quản mẫu ở điều kiện tối Sau 7 ngày, thực hiện đếm số hạt nảy mầm của từng nghiệm thức, tính tỷ lệ nảy mầm của hạt
• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần
• Thời gian thực hiện: 2 tuần
• Chỉ tiêu đánh giá: Тỷ lệ (%) = ố ượ ạ ổ ố ạ X 100 Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05, phân hạng Duncan
Bảng 2.6 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nảy mầm từ hạt của trái dưa lưới Cucumis melo L
Phương pháp bảo quản Thời gian bảo quản
Nghiệm thức Đối chứng 0 ngày ĐC
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
