Dưa gang có đặc tính sinh trưởng tốt, khả năng thích nghi rộng với thổ nhưỡng và khí hậu ở nước ta nên được trồng phổ biến khắp các tỉnh thành Việt Nam.. Để đạt được năng suất cao, chất
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật và Sinh học phân tử- Khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Vườn dưa gang nhà anh Thuột, xã Hòa Phú, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh
Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 6 năm 2021
Cây dưa gang trái tròn của Công ty trách nhiệm hữu hạn hạt giống Nam Việt được trồng tại cơ sở 3 Bình Dương và xã Hòa Phú, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh
Công ty TNHH Một thành viên hạt giống Rạng Đông đã trồng giống dưa hoàng kim lai F1 RADO 163 tại Cơ sở 3 Bình Dương và xã Hòa Phú, huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh.
Hình 2.1 Hoa đực (A) và hoa cái (B) của cây dưa gang
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Găng tay cao su, khẩu trang y tế
Giấy wax, kẹp giấy, túi lưới bao trái
Bút lông dầu, băng keo giấy, kéo cắt giấy, thước đo, khăn chụp mẫu
Cân phân tích, cân đồng hồ, cân kỹ thuật
Tủ lạnh 4 o C và - 20 o C, tủ sấy
Lò vi sóng, nồi hấp vô trùng
Kéo cắt mẫu, đĩa petri, becher, erlen, chày nghiền mẫu, eppendorf
Máy ly tâm lạnh, máy PCR
Máy vortex, máy luân nhiệt
Hệ thống bồn điện di, hệ thống chụp ảnh và phân tích gene - Geldoc
Hình 2.2 Hoa đực (A) và hoa cái (B) của cây dưa hoàng kim
⮚ Hóa chất dùng trong tách chiết DNA
Dung dịch đệm PBS: NaCl (8 g), KCl (2 g), KH2PO4 (2 g), Na2HPO4 (1,15 g), bổ sung nước cất 1000 ml
Dung dịch đồng nhất mẫu (20 ml): NaCl 5M (1,6 ml); Tris-HCl (0,2 ml); EDTA 0,5M (0,04 ml); bổ sung nước cất 18,16 ml
Dung dịch phenol: chloroform: isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1
Dung dịch TE (Tris HCL 0,1 mM; EDTA 0,01 mM, pH = 8)
Nước cất vô trùng 2 lần
⮚ Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
⮚ Hóa chất dùng trong điện di
Thang DNA chuẩn 50 bp; 100 bp
Phương pháp
2.2.1 Thí nghiệm 1: Thụ phấn chéo hoa đực dưa hoàng kim với hoa cái dưa gang và thụ phấn chéo hoa đực dưa gang với hoa cái dưa hoàng kim
Mục đích thí nghiệm: Tạo trái lai dưa gang và dưa hoàng kim
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức (dưa gang tự thụ, dưa hoàng kim tự thụ, tổ hợp lai bố là dưa gang mẹ là dưa hoàng kim và tổ hợp lai bố là dưa hoàng kim mẹ là dưa gang) với 5 lần lặp lại và mỗi lần lặp lại 1 cây trên một nghiệm thức
Một ngày trước khi hoa dưa gang nở, người ta tiến hành bao hoa bằng túi giấy wax Sau đó, dùng phương pháp thủ công để thụ phấn của hoa đực dưa hoàng kim trực tiếp lên hoa cái dưa gang và tiếp tục bao lại bằng túi giấy wax Cuối cùng, khi bầu noãn phát triển sẽ bỏ túi giấy wax và thay bằng túi lưới bao trái.
Hoa cái dưa hoàng kim được bao lại bằng túi giấy wax trước khi nở một ngày Tiến hành thụ phấn với hoa đực dưa gang bằng phương pháp thủ công chậm phấn hoa trực tiếp Tiếp tục bao lại bằng túi giấy wax Sau khi thụ phấn bầu noãn phát triển thì bỏ túi giấy wax, bao lại bằng túi lưới bao trái
Thời gian thực hiện: Từ khi trồng đến khi ra hoa cái là 4 tuần, thời gian thụ phấn chéo đến khi thu trái là 5 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: quan sát so sánh hình thái trái lai và trọng lượng trái
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0.05, phân hạng Duncan
2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ hạt chắc/ hạt lép trên dưa gang, dưa hoàng kim trái đối chứng và trái lai
Mục đích thí nghiệm: Xem tỷ lệ hạt chắc/ hạt lép; số hạt chắc, hạt lép; trọng lượng hạt chắc và hạt lép
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức gồm: hạt trái dưa gang tự thụ, dưa hoàng kim tự thụ, tổ hợp lai bố dưa gang mẹ dưa hoàng kim và tổ hợp lai bố dưa hoàng kim mẹ dưa gang.
5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 1 trái trên một nghiệm thức
Trái đối chứng và trái lai sau khi hái tiến hành thu lấy hạt chắc và hạt lép riêng biệt phơi dưới ánh nắng nhẹ 2 ngày, tiến hành đếm cân đếm số hạt chắc và lép của trái đối chứng và trái lai
Cân tổng trọng lượng hạt chắc (g) Cân trọng lượng của 100 hạt chắc (g) Tính số hạt chắc theo công thức, đếm số hạt lép
Số hạt chắc (hạt) = 100 (hạt chắc) × tổng khối lương hạt chắc (g)
Tỷ lệ hạt chắc (%) = số hạt chắc tổng số hạt chắc và lép × 100
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0.05, phân hạng Duncan
2.2.3 Thí nghiệm 3: Tách chiết DNA bộ gen của dưa gang (vỏ, thịt trái), dưa hoàng kim ( vỏ, thịt xanh, thịt vàng)
Mục đích thí nghiệm: Thu nhận DNA bộ gen
Rửa dưa gang và dưa hoàng kim dưới vòi nước để loại bỏ cát bụi bám trên bề mặt trái Tiến hành cắt mẫu dưa gang thành 2 phần (vỏ và thịt trái), dưa hoàng kim
25 thành 3 phần (vỏ, thịt xanh và phần thịt vàng của trái) Rửa mẫu cắt của dưa qua 2 lần bằng nước cất và 1 lần bằng cồn 70 o Mẫu rửa xong được cân 0,2 g đều nhau, cho từng mẫu và vào eppendorf cắt làm nát mẫu Mẫu sau khi được làm nhuyễn thì cho
750 àl dung dịch đồng nhất mẫu Bổ sung thờm vào 30 àl dung dịch SDS Bổ sung thờm vào 20 àl Proteinase K (1 mg/ ml) Ủ mẫu qua đờm với nhiệt độ là 56 o C trong vòng 24 giờ
Ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, tách lấy dịch nổi và trộn với một thể tích dung dịch PCI tương đương theo tỷ lệ 25:24:1 phenol:chloroform:isoamylalcohol (2 lần) Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và thêm vào một thể tích chloroform tương đương rồi ly tâm.
13000 vòng/ phút trong 10 phút Thu dịch nổi và thêm vào một thể tích tương ứng isopropanol với 1/10 thể tích NaOAc, lắc đều mẫu và ủ mẫu trong 2 giờ ở 4 o C Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 20 phút, thu tủa và bổ sung thêm 1 ml ethanol 70 %, ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/ phút trong 10 phút Tủa được phơi ở nhiệt độ phòng trong
2 giờ Bổ sung thờm 100 àl TE (Tris HCL 0,1 mM; EDTA 0,01 mM), lưu trữ DNA ở - 20 o C trong một tháng
⮚ Quy trình điện di Điện di trên gel agarose: Chuẩn bị gel agarose, hòa tan 1,5 g agarose với 100 ml TBE 1X (10,8 g Tris HCl; 5,5 g acid boric, 4 ml EDTA 0,5 M) và đun đến khi agarose tan hoàn toàn làm nguội gel dưới vòi nước và đổ gel vào khay đã gắn lược Chuẩn bị mẫu: 5 àl DNA và 1 àl gel red, nạp mẫu vào giếng trờn gel agarose Dung dịch điện di TBE 1X , điện di ở điều kiện 100 V trong 30 phút
2.2.4 Thí nghiệm 4: PCR các gen mã hóa cho các enzyme trong con đường sinh tổng hợp sucrose
Mục đích thí nghiệm: Khuếch đại DNA, khảo sát sự hiện diện của các gen Phương pháp tiến hành:
Thực hiện phản ứng PCR trong tổng thể tớch 15 àl với bộ mồi (bảng 2.1), thành phần phản ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR được thể hiện trong (hình 2.3; 2.4; 2.5 và 2.6)
Ký hiệu Mồi 5’ – 3’ Kích thước (bp)
Bảng 2.1 Mồi sử dụng trong phản ứng PCR
⮚ Quy trình phản ứng PCR
Hỗn hợp dựng cho phản ứng PCR gồm: 7,5 àl Master mix; 0,5 àl mồi F; 0,5 àl mồi R, 1 àl DNA sau khi tỏch và 5,5 àl nước khụng chứa nuclease Chứng õm cú thành phần tương tự nhưng thay lượng DNA bằng lượng nước không chứa nuclease
Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR gen CLO
Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR gen AIN2
Quy trình điện di trên gel agarose bao gồm việc chuẩn bị gel agarose bằng cách hòa tan agarose vào dung dịch TBE 1X, làm nguội và đổ vào khay có gắn lược Sau đó, mẫu DNA được trộn với gel red và nạp vào giếng trên gel agarose Điện di được thực hiện trong dung dịch TBE 1X ở điện áp 100 V trong 30 phút để phân tách các phân tử DNA dựa trên kích thước và điện tích của chúng.
Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR gen SPS2
Hình 2.6 Chu trình phản ứng PCR gen SPP1
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
