báo cáo thí nghiệm môn thí nghiệm hóa học và hóa sinh thực phẩm enzyme

– Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định đến khi các sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌCBỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

MÔN THÍ NGHIỆM HÓA HỌC VÀ HÓA SINH THỰC PHẨMENZYME

Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị NguyênNhóm 2 – HK232 – Buổi chiều thứ 6 – Tuần 13

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2024

A XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁPWOHLGEMUTH

I Nguyên tắc

– Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và glucose – Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định đến khi các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3%/KI 3% (thuốc thử Liugol).

– Đơn vị hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 37ºC có Cl– làm chất hoạt hóa.

II Chuẩn bị thí nghiệm

– Bộ cối chày sứ

2 Nguyên liệu, hóa chất– Nguyên liệu: malt hạt

– Hóa chất:

+ Thuốc thử Liugol: dung dịch I2 0,3% hoặc dung dịch KI 3% + Dung dịch NaCl 0,5%

+ Dung dịch H2SO4 10%

III Tiến hành thí nghiệm

– Cân 10g malt bằng cân hai số lẻ, cho vào cối sứ, sau đó giã nhuyễn bằng chày sứ – Cho 10g malt đã giã nguyễn (kể cả vỏ) vào bình định mức 100 mL

– Cho nước cất vào bình định mức, còn chừa 1 khoảng trống để lắc – Ngâm malt trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dung dịch trong bình – Sau 60 phút, dùng nước cất định mức lên vạch mức 100 mL, lắc đều.

– Lọc dịch qua 2 lớp giấy lọc để thu được dịch trong suốt chứa enzyme amylase (bỏ khoảng 50 giọt ban đầu), dùng erlen 100ml để chứa dịch đã lọc trong.

– Lấy 10 ống nghiệm đã được chuẩn bị từ trước, cho vào mỗi ống nghiệm 1 mL NaCl 0,5% bằng pipette 1mL

– Cho vào ống nghiệm đầu tiên 1 mL dịch chiết enzyme amylase, lắc đều Sau đó lấy 1mL từ ống [1] cho vào ống [2], lắc kỹ Rửa sạch pipette trước khi hút ống tiếp theo Lặp lại tương tự cho tới ống [10] thì hút 1 mL bỏ đi.

– Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1 mL hồ tinh bộ 0,5% (cắm thẳng pipette vào gần sát dung dịch, không để dính lên thành ống nghiệm), lắc đều để vào tủ điều nhiệt ở 37ºC, thỉnh thoảng lại lắc đều để kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống.

– Sau 30 phút thì lấy ra, cho vào mỗi ống 1 mL H2SO4 10% (để chấm dứt hoạt tính của enzyme) và 3 giọt thuốc thử Liugol, sau đó lắc đều Quan sát sự thay đổi màu ở các ống nghiệm.

– Đánh dấu ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất nơi đó có sự thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống có dung dịch màu vàng sáng, có thể so sánh màu với ống chuẩn, sau đó là ống có màu đỏ, đỏ tím, tức là tinh bột chưa được thủy phân hoàn toàn).

Bảng 1 trình bày kết quả thí nghiệm, ghi màu của dãy ống nghiệm vào bảng (xanh [x], tím [t], nâu [n], đỏ [đ], cam [c], vàng [v]).

IV Kết quả thí nghiệm và tính toán kết quả1 Kết quả thí nghiệm

Stt ống nghiệm12345678910

Bảng 1 Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

Khi dùng ống chuẩn để so sánh màu, nhằm chọn lựa ống làm chuẩn để tính các giá trị bên dưới thì ống nghiệm 1 cho ra màu tương đối giống với ống chuẩn Do đó, nhóm chọn ống số 1 để thực hiện tính toán các giá trị liên quan đến phương pháp với: V1 = 1 : thể tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống [1], mL

V2 = 100 : thể tích dịch chiết enzyme amylase, mL

m = 10g = 10000 mg : khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mg – Một đơn vị Wohlgemuth (W): W ¿ n

5 F ¿

5× 32 ¿ 0,625

trong đó: F: độ pha loãng chọn được trên bảng trên (F của ống 4: 16) – Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzyme (Nw):

Nw=nV1.W=

1 ×0,625=160(Nw )

V Giải thích hiện tượng và biện luận so sánh kết quả1 Giải thích hiện tượng

Enzyme amlase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bột, còn thuốc thử Liugol để nhận biết sự có mặt của tinh bột trong dung dịch.

Cho amylase vào dung dịch NaCl 0,5% để hoạt hóa amylase Sau đó cho các ống nghiệm vào tủ sấy ở 37ºC thì ở nhiệt độ này enzyme amlylase sẽ hoạt động tốt nhất, cho nên phản ứng sẽ diễn ra nhanh chóng để có kết quả rõ hơn Sau khi lấy khỏi tủ sấy thì nhỏ dung dịch H2SO4 10% để quá trình thủy phân ngừng hoạt động (tăng pH môi trường dẫn đến enzyme bị bất hoạt).

⇒ Ở cả 10 ống trong thí nghiệm trên đều xảy ra phản ứng thủy phân tinh bột thành các phân tử đường đơn, đường đôi và dextrin nhờ xúc tác là enzyme amylase theo phương trình sau:

Tinh bột E α−amylase (Termamyl)→ glucose + maltose + hỗn hợp dextrin (α + β))

Tuy đều có cùng một cơ chế phản ứng, tuy nhiên lượng cơ chất và lượng enzyme cho vào ở mỗi ống là khác nhau Ở thí nghiệm này, lượng enzyme cho vào từ ống [1] đến ống [10] giảm dần theo cấp số nhân, ứng với độ pha loãng enzyme đi từ 2 đến 210 Do đó, sự chênh lệch về lượng giữa nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất càng về sau sẽ càng lớn.

Tinh bột Liugol→ phức xanh tím

Ống nghiệm số [1], [2], [3], [4] sau khi nhỏ Liugol vào thi có màu vàng Điều này chứng tỏ tinh bột ở cả 4 ống này đều được thủy phân hoàn toàn Ống [5] có màu nâu cam chứng tỏ tinh bột bì thủy phân gần hết nên màu nhạt hơn nhiều Từ ống [6] tới ống [10] thì màu dung dịch chuyển dần từ màu tím → xanh tím → xanh → xanh đen Điều này chứng tỏ tinh bột ở các ống này bị thủy phân rất ít, ở 2 ống cuối thì gần như không bị thủy phân.

+ Từ ống [5] sang ống [6] có sự chuyển màu từ vàng cam sang tím cho thấy ống [5] là ống có nồng độ enzyme tối thiểu để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột có trong ống nghiệm.

2 Biện luận kết quả

Có thể thấy kết quả của lớp đều có sự khác biệt nhỏ về cường độ màu nhưng nói chung vẫn khá tương đồng với nhau về kết quả: ống nghiệm bắt đầu chuyển màu ở ống số 5 (W = 0,625) Nguyên nhân của sự khác biệt có thể là do:

– Trong quá trình cho vào tủ sấy, nhóm không lắc đều ống nghiệm dẫn đến lượng tinh bột còn bát vào thành → lượng tinh bột bị thủy phân ít hơn lượng tinh bột cho vào.

– Trong quá trình trích 1 mL từ ống này sang ống khác, nhóm lắc ống nghiệm chưa đều, thao tác hút dung dịch và rửa pipette không kỹ dẫn đến lượng enzyme có trong mỗi ống không hoàn toàn giống như trong lý thuyết tính toán.

– Sau khi lấy ra khỏi tủ sấy, việc cho H2SO4 để kết thúc quá trình thủy phân có sự sai lệch về thời gian Do đó, lượng tinh bột có thể được thủy phân tiếp nên dẫn đến sự khác nhau về ống nghiệm có lượng enzyme tối thiểu để thủy phân hoàn toàn tinh bột.

B ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HỦYTINH BỘT CỦA ENZYME AMYLASE

I Nguyên tắc thí nghiệm

Enzyme là xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzyme bị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme.

Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và glucose Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thủy phân tinh bột đã hồ hóa trong thức ăn, và các enzyme còn lại sẽ kết thúc quá trình thủy phân tạo glucose thấm qua thành ruột.

Nhiệt độ là tác nhân vật lí ảnh hưởng đến vận tốc hóa học cũng như phản ứng enzyme Amylase, cũng như các loại enzyme khác là đều có khoảng nhiệt độ tối ưu để xúc tác, cho ra hiệu suất phản ứng được cao và trong một khoảng thời gian cần thiết Trong những điều kiện sinh lý nhất định, khi tăng nhiệt độ thì vận tốc phản ứng cũng tăng lên Tuy nhiên, khi qua ngưỡng nhiệt tối ưu (Topt) thì vận tốc enzyme bắt đầu giảm xuống Đa số các enzyme có nhiệt độ tối ưu (Topt) vào khoảng 40 – 60ºC, ở nhiệt độ này vận tốc phản ứng rất lớn Khi nhiệt độ lên 80ºC hầu hết các enzyme đều bị biến

tính không thuận nghịch dẫn cấu trúc không gian bị thay đổi, làm cho enzyme không còn khả năng kết hợp được với cơ chất.

Do đó, mục đích bài thí nghiệm này là kiểm tra ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ và nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase.

II Chuẩn bị thí nghiệm

III Tiến hành thí nghiệm

1 Tạo ống màu mẫu cho cả 2 thí nghiệm

– Ống 1: 2mL dung dịch tinh bột 1% + 3 giọt thuốc thử Liugol – Ống 2: 2mL dung dịch glucose 0,5% + 3 giọt thuốc thử Liugol

Giải thích: Do thành phần chính của Liugol là Iod và KI nên tạo phức với tinh bột vì vậy mà ống 1 có màu xanh tím; còn ở ống 2, cấu trúc của glucose là monosaccharide

nên không thể tạo phức với Iod, do đó màu vàng ở ống 2 là màu thuốc thử Liugol được pha loãng.

2 Tiến hành thí nghiệm

Bước 1: Lấy 3 ống nghiệm đánh số 1, 2, 3; sau đó thêm vào mỗi ống 5,5mL dịch

đệm pH = 6,0; 4mL dung dịch tinh bột 0,5% và 0,5 mL dịch chiết enzyme amylase.

Bước 2: Cho các ống 2 vào tủ sấy ở nhiệt độ 50ºC, ống 3 vào tủ sấy ở nhiệt độ 70ºC,

còn ống 1 bỏ ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Sau 15 phút, lấy mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ phân biệt lên đĩa thủy

tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu.

Lưu ý: thuốc thử Liugol đã được pha loãng 2 lần.

IV Kết quả và giải thích kết quả1 Kết quả

Sau khi chờ thí nghiệm khoảng 15 phút và nhỏ Liugol vào, có thể thấy cường độ màu của 3 mẫu ở nhiệt độ phòng, 50ºC và 70℃ có sự chênh lệch không nhiều, và đều

là màu vàng sáng giống với ống màu mẫu [2] Điều này chứng tỏ lượng tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn.

2 Biện luận

Vì không thu được tinh bột nên có thể khẳng định, enzyme termamyl đã xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột theo phương trình sau:

Tinh bột E α−amylase(Termamyl), pH =6,0→ α−dextrin + glucose + maltosedextrin + glucose + maltose

Do kết quả thí nghiệm thu được ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau sau 15 phút là giống nhau nên nhóm không thể kết luận được nhiệt độ tối ưu của enzyme termamyl Vì vậy, nhóm đã tiến hành tham khảo kết quả với các nhóm khác và nhận thấy rằng kết quả của đa số các nhóm đều có sự tương đồng với kết quả của nhóm trong việc xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme.

Do đó, sau khi tìm hiểu một số bảo cáo và tham khảo các nhóm khác, nhóm rút ra một số giải thích cho việc không thu được kết quả không mong muốn như sau:

– Termamyl có khoảng nhiệt độ hoạt động rộng (30ºC – 100ºC)1 nên nhiệt độ của bài thí nghiệm là chưa đủ để có thấy rõ sự khác biệt Điều này gần đúng so với lý thuyết, phụ thuộc vào nguồn và bản chất của enzyme amylase.

– Thao tác tay chưa được chuẩn của sinh viên trong việc chuyển từ malt đã nghiền qua bình định mức.

– Quá trình thực hiện thí nghiệm trong tủ sấy không đảm bảo được nhiệt độ chúnh xác do sự đóng mở cửa nhiều lần của nhiều nhóm.

– Lượng hồ tinh bột có thể đã bị thủy phân một phần trước nên khi thêm xúc tác là enzyme termamyl vào thì tinh bột sẽ bị thủy phân hoàn toàn trong khoảng thời gian nhanh chóng.

– Lượng termamyl mỗi nhóm lấy là chưa thực sự giống nhau mà chỉ xấp xỉ 0,5ml dẫn đến thời gian thủy phân tinh bột không giống nhau.

1Tanyolaç, Deniz, Belma Işık Yürüksoy, and Ahmet R Özdural "Immobilization of a thermostable α-amylase, Termamyl®, amylase, Termamyl®,

onto nitrocellulose membrane by Cibacron Blue F3GA dye binding." Biochemical engineering journal 2.3 (1998): 179-amylase, Termamyl®, 186.

C TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYMEI Cơ sở lý thuyết

Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu của enzyme Bài thí nghiệm này sẽ tiến hành nghiên cứu tính đặc hiệu của enzyme invertaza và α–amylase là termamyl trên 2 cơ chất là saccharose và tinh

– Dung dịch enzyme termamyl, enzyme investaza – Thuốc thử Liugol, hồ tinh bột 1%, saccharose 5% – Thuốc thử Fehling.

III Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ đã được rửa sạch, sấy khô Đánh số các ống nghiệm từ 1 đến 4

Bước 1: Sử dụng pipet 10ml rút các dung dịch cho vào 4 ống nghiệm theo hướng

dẫn sau: ống [1] và [2] 5ml dung dịch saccharose 5%, ống [3] và [4] 5ml dung dịch hồ tinh bột 1%.

Bước 2: Thêm vào ống [1] và ống [3] mỗi ống 1ml dung dịch enzyme invertaza,

ống [2] và [4] mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme termamyl.

Bước 3: Lắc đều, để ống nghiệm vào tủ sấy ở 37ºC trong 15 phút (lưu ý luôn điều

chỉnh nhiệt độ của tủ sấy ở khoảng này)

Bước 4: Lấy 4 ống nghiệm ra, cho vào ống [1] và [2] mỗi ống 5ml dung dịch

Fehling và đặt ở bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút (ống 3 và 4 vẫn ở nhiệt độ phòng) Sau 2 phút, lấy ống [1] và [2] ra làm nguội ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Cho vào ống [3] và [4] mỗi ống 2 giọt thuốc thử Liugol Quan sát kết quả

và giải thích.

IV Hiện tượng và phương trình phản ứng1 Hiện tượng

Sau khi hoàn tất các bước thí nghiệm, dung dịch trong suốt ban đầu của các ống nghiệm đã có những biến đổi như sau:

+ Ống 1: dung dịch thu được có màu nâu đỏ đậm và lượng lớn kết tủa.

+ Ống 2: dung dịch thu được trong suốt, có ánh đỏ gạch và có lượng ít kết tủa ở đáy.

+ Ống 3: dung dịch thu được màu xanh đen đậm.

+ Ống 4: dung dịch thu được có màu xanh lam đậm, nhạt màu hơn so với ống [3].

2 Giải thích hiện tượng và phương trình phản ứng

– Bản chất của 2 phép thử với Fehling và Liugol:

+ Phép thử với Fehling: phép thử này là cách sử dụng dung dịch Fehling A có chứa CuSO4 và dung dịch Fehling B chứa tartrat kép trong môi trường kiềm để khử đường đơn có chứa gốc andehit trong dung dịch phân tích tạo thành Cu2O kết tủa màu đỏ gạch.

+ Phép thử với Liugol: Dung dịch Liugol, hay còn được gọi là nước iod hoặc dung dịch iod mạnh, là một dung dịch có chứa KI cùng I2 tan trong nước Mà I2 tác dụng với tinh bột sẽ cho ra phức màu xanh tím do ở nhiệt độ thường tinh bột có cấu trúc lò xo xoắn, cấu trúc này sẽ hấp phụ các phân tử I2 lại.

– Giải thích và phương trình:

+ Ống 1: enzyme invertase thuỷ phân lượng lớn saccharose thành glucose và fructose Dung dịch đường sau đó có chứa glucose sẽ có tính khử cao, khử Cu2+ thành Cu2O sau khi cho dung dịch Fehling vào Ở nhiệt độ cao, hầu hết saccharose bị thủy phân tạo nên một lượng lớn kết tủa, làm cho dung dịch có màu nâu đỏ đậm Vì vậy, có thể kết luận, enzyme invertaza đặc hiệu cho phản ứng thủy phân saccharose thành glucose và fructose Phương trình phản ứng:

C12H22O11 (saccharose) + H2O Invertaza , 37℃

→ C6H12O6 (glucose) + C6H12O6 (fructose)

RCHO + 2Cu2+100℃

→ RCOO⁻ + Cu2O↓ + 3H2O

(với RCHO là glucose và fructose)

Tuy nhiên, dung dịch thu được có màu nâu đó đậm là do Cu2O là kết tủa không bền, dễ bị oxy hóa trong không khí thành CuO làm cho dung dịch dễ bị sẫm màu.

Cu2O + O2 → 2CuO

+ Ống 2: termamyl đã không xúc tác cho phản ứng thủy phân saccharose và dẫn đến việc Fehling không tạo nhiều kết tủa màu nâu đỏ với đường khử như ống 1 Tuy nhiên, nếu quan sát kĩ, ta sẽ thấy được một lượng nhỏ kết tủa đọng lại ở đáy ống Điều này có thể lý giải là do ban đầu saccharose không tác dụng với enzyme termamyl nên tạm thời chưa thủy phân ra glucose và fructose nhưng sau khi đun nóng cách thủy ở 100ºC trong 2 phút, có thể saccharose đã bị thủy phân tạo ra một ít glucose và fructose nên

khi cho thuốc thử Fehling vào vẫn thu được kết tủa màu đỏ gạch ở đáy ống nghiệm Phương trình phản ứng tương tự như phản ứng ở ống 1.

+ Ống 3: enzyme invertaza không xúc tác với hồ tinh bột để thủy phân nên lượng hồ tinh bột vẫn còn nguyên vẹn so với ban đầu Do đó, khi cho Liugol vào hàm lượng rất lớn tinh bột, chúng tạo ra một phức màu xanh đen đậm trong dung dịch.

+ Ống 4: thu được dung dịch ngả màu xanh lam đậm nhưng không quá đậm màu Điều này là do enzyme amylaza có khả năng thuỷ phân tinh bột thành hỗn hợp dextrin từ lớn đến nhỏ, và cuối cùng là glucose Vì glucose không tạo phản ứng với iodine trong dung dịch Liugol nên dung dịch trong ống này không thể tạo ra màu xanh đen như ống thứ ba Tuy nhiên, nếu lượng tinh bột chưa bị thuỷ phân trong mẫu vẫn đủ lớn để tạo ra một phản ứng màu đặc trưng với iodine trong dung dịch Liugol, cho màu xanh tím Từ đây, có thể kết luận rằng, enzyme termamyl (bản chất là α–amylase) đặc hiệu với phản ứng thủy phân tinh bột ra dextrin, oligosaccharide và glucose, vậy nên khi cho Liugol vào sẽ thu được các sắc màu tùy vào lượng tinh bột mà enzyme thủy phân được.

Tinh bột Termamyl→ hỗn hợp dextrin + oligosaccharide + glucose

V So sánh kết quả với các nhóm

Nhìn chung, các nhóm đều ra màu sắc khá giống nhau, chỉ khác về cường độ màu và lượng kết tủa thu được Điều này có giải thích là do lượng thuốc thử Fehling và