- Thẩm định phương pháp:+ Phương pháp phân tích được thẩm định các chỉ tiêu: độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, tính tương thích hệ thống và giới hạn định lượng theo các hướng dẫn c
Lí do nghiên cứu; cách chuẩn bị mẫu, dụng cụ, hóa chất; Các thiết kế nghiên cứu
Lí do nghiên cứu (Đặt vấn đề)
- Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (Chronic obstructive pulmonary disease -
COPD), đặc trưng bởi sự tắc nghẽn hô hấp và sự thông khí kém Tính đến năm 2015,
COPD đã ảnh hưởng đến khoảng 2,4% dân số toàn cầu COPD được chẩn đoán ở các bệnh nhân có các triệu chứng đờm, ho và khó thở mạn tính, xác định bệnh dựa vào việc đo chức năng thông khí của phổi Điều trị COPD cần chú trọng đến cá thể hóa điều trị, điều trị các bệnh đồng mắc, điều trị dự phòng để tránh các đợt cấp và làm chậm quá trình tiến triển bệnh Bên cạnh đó, các biện pháp khác như hỗ trợ cai nghiện thuốc lá, phục hồi chức năng hô hấp, giáo dục bệnh nhân cũng có vai trò quan trọng trong việc điều trị và quản lí bệnh nhân COPD.
Salbutamol sulfat hay được biết là bis [(1RS) -2 - [(1, 1- dimethylethyl) amino]
-1- [4- hydroxy-3- (hydroxymethyl) phenyl] ethanol] sulphate, là -adrenoceptor chất chủ vận được sử dụng để làm giảm co thắt phế quản trong các tình trạng như hen suyễn và COPD Bromhexin hydrochlorid có tên hóa học là trans-4 - ((2- amino-3, 5- diBromobenzyl) amino) cyclohexanol hydrochlorid Trên lâm sàng, Bromhexin tăng cường vận chuyển chất nhầy bằng cách giảm độ nhầy dính của chất nhầy và kích hoạt biểu mô có lông chuyển giúp long đàm.
- Kết hợp bromhexin và salbutamol được sử dụng để điều trị hen suyễn và viêm phế quản.
- Sal và Brom có thể gặp ở dạng đơn lẻ hay dạng kết hợp cả hai hoạt chất này trong các dạng dược phẩm như viên nén, si-rô Các phương pháp áp dụng trong định lượng các hoạt chất này đã được sử dụng như quang phổ, HPTLC và Rp-HPLC Tuy nhiên, cho tới thời điểm này, ở Việt Nam chưa có nhóm tác giả nào báo cáo qui trình định lượng đồng thời Salbutamol và Bromhexin trong dạng bào chế si-rô Do đó, đề tài này nhằm mục tiêu xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời Sal và Brom trong dạng chế phẩm si-rô thuốc bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Kết quả của đề tài này có thể cung cấp thêm một phương pháp kiểm nghiệm nhằm đảm bảo kiểm soát tốt chất lượng dược phẩm trước khi đến tay người bệnh.
Chuẩn bị mẫu, dụng cụ, hóa chất
- Si-rô Salmodil Expectorant do hãng dược phẩm FDC Limited, Ấn Độ với số đăng kí lưu hành VN-17229- 13 được mua tại thị trường Việt Nam (100ml có chứa 40mg Salbutamol sulfat và 80mg hoạt chất Bromhexin hydrochlorid).
- Hệ thống sắc kí Agilent 1260, đầu dò PDA, sử dụng phần mềm ChemStation phiên bản B.04.32 (Agilent – Đức)
- Máy lọc nước siêu sạch (Pall – Mĩ)
- Máy đo pH S220K và cân phân tích MS105DU 0,01mg (Metler Toledo – Thụy Sĩ)
- Máy siêu âm SH180 (Elma – Đức).
- Hóa chất: Methanol (Fischer – Mĩ), acid phosphoric và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck – Đức).
- Chất đối chiếu: Salbutamol sulfat số lô: QT105 060913; Bromhexin hydrochlorid số lô: QT0008 050115 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:
+ Dung môi pha loãng: hỗn hợp methanol và nước chứa 0,07% orthophosphoric (OPA) tỉ lệ 1:1.
+ Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn đối chiếu trong methanol để có được nồng độ 1000g/ml và 2000g/ml lần lượt cho Salbutamol và Bromhexin Từ dung dịch chuẩn gốc trên, thực hiện pha loãng để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 4-24g/ml và 8-48g/ml.
Thiết kế nghiên cứu
3.1 Quy trình xử lí mẫu
- Chuẩn bị mẫu: 5ml si-rô được chuyển vào bình định mức 50ml chứa 35ml methanol, sau khi siêu âm không gia nhiệt trong 5 phút, thêm methanol vừa đủ thể tích
- Sử dụng pipet lấy 5ml thể tích dung dịch được chuyển vào bình định mức 20ml và pha loãng đến vạch bằng hỗn hợp methanol và nước 0,07% orthophosphoric tỉ lệ 1:1
- Dung dịch sau khi pha loãng được lọc qua màng lọc PTFE kích thước lỗ lọc 0,45μm (Sartorius, Đức), thu dung dịch để tiêm sắc kí.m (Sartorius, Đức), thu dung dịch để tiêm sắc kí.
3.2 Phương pháp phân tích, định lượng
+ Phương pháp HPLC định lượng Sal và Brom trong si-rô đã được thực hiện với các điều kiện sau: cột Phenomenex Genimi NX-C18 (250mm x 4,6mm; 5m); Pha động: methanol - acid phosphoric 0,07% (59:41, tt/tt); đầu dò UV tại bước sóng225nm; Tốc độ dũng 0,9ml/phỳt; Thể tớch tiờm 20àl và duy trỡ nhiệt độ buồng cột25oC.
+ Phương pháp phân tích được thẩm định các chỉ tiêu: độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, tính tương thích hệ thống và giới hạn định lượng theo các hướng dẫn của ICH[18] và theo qui định của Sổ tay hướng dẫn đăng kí thuốc, phụ lục 8, Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lí Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013
+ Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng TB ± SD Dữ liệu và hình ảnh được xử lí bằng phần mềm ChemStation Microsoft Excel được áp dụng để tính toán thống kê(trung bình, SD, %RSD).
Tổng quan về HPLC; Rp-HPLC; nguyên tắc tiến hành
4.1 Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao
- HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
- Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và yêu cầu của công việc Có thể thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến trong thực tế:
+ Sắc ký phân bố (bao gồm cả sắc ký cặp ion)
+ Sắc ký trao đổi ion
+ Sắc ký các đồng phân quang học
- Pha tĩnh cho hầu hết các kỹ thuật sắc ký lỏng ở trên là dẫn chất khác nhau của siloxan hoặc polymer (polysaccharrid, polystyren) tuỳ thuộc vào kỹ thuật Pha tĩnh thường là hạt hình cầu đường kính 3 - 10 um Kích thước hạt càng nhỏ, chiều cao H của đĩa càng giảm nên số đĩa lý thuyết càng tăng.
- Nhưng mặt khác, kích thước hạt nhỏ, lực cản đối với dòng pha động lớn Vì vậy hạt càng nhỏ đòi hỏi áp suất đầu vào càng lớn.
- Pha động là vấn đề mấu chốt cho sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ và trao đổi ion, là thứ yếu cho các kỹ thuật còn lại.
- Sắc ký phân bố: chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:
- SK pha thường (Normal phase chromatography):
+ Pha tĩnh: phân cực do chất mang được phủ hoặc liên kết với những chất phân cực (nước, B-oxydipropionitril, PEG, trimethylenglycol ).
+ Pha động: DM hữu cơ ít phân cực Trong NP, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động NP dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
- Sắc ký pha đảo (Reversed phase chromatography):
+ Pha tỉnh: là những chất lỏng ít phân cực (hydrocarbon ).
+ Pha động: là DM phân cực (nước, methanol, acetonitril ) Trong RP pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng RP Dung môi sử dụng trong RP làdung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà rẻ tiền Do đó, RP được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn NP.
- Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
+ Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
+ Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)
+ Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)
+ Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
+ Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích
+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
- Pha động trong sắc ký pha đảo
- Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
+ Hòa tan mẫu phân tích
+ Phù hợp với đầu dò
+ Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh
+ Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao
+ Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).
- Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất.
Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
- Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…
- Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.
4.3 Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
- Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:
- Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:
Với: + CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
+ CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
- tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
- tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.
- tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử
Hình 1 Thời gian lưu của cấu tử phân tích
- k’ được định nghĩa theo công thức sau:
Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
- Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
- Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
- Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.
- Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao
- Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được:
Với: + W1/2 : là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trớ ẵ chiều cao mũi (phỳt)
+ W: là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
- Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
- Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:
- Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).
4.4 Nguyên tắc tiến hành thí nghiệm
- Hỗn hợp Salbutamol (Sal) và Bromhexin (Brom) trong si-rô thuốc có thể được tách và định lượng bằng phương pháp HPLC do cấu trúc của hai chất này có nhóm phân cực và sự khác biệt về ái lực tương đối của các phân tử khác nhau đối với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách Quá trình phân tách sắc kí thực hiện trờn cột Phenomenex Genimi NX-C18 (250mm ì 4,6mm, 5àm) Pha động sử dụng hỗn hợp dung môi methanol – acid orthophosphoric 0,07% tỉ lệ 59:41 (tt/tt), chế độ đẳng dòng, duy trì ở tốc độ 0,9ml/phút, nhiệt độ buồng cột 25oC Bước sóng phát hiện là 225nm Xác định độ tuyến tính tốt, từ đó miền giá trị tuyến tính xác định từ đối với Sal và đối với Brom.
Kết quả và ý nghĩa liên hệ giữa lý thuyết và thực nghiệm thu được.10 5 Kết quả
Khảo sát các điều kiện sắc ký
- Nghiên cứu ban đầu thực hiện thăm dò một số hệ pha động trên cột Phenomenex Genimi NX-C18 và ghi nhận tín hiệu ở bước sóng 225nm Pha động là methanol, acetonitril, nước có thêm các acid (formic, acetic, orthophosphoric) điều chỉnh với các điều kiện tỉ lệ khác nhau Chọn điều kiện sắc ký sao cho peak Sal và Brom tách khỏi nhau và tách rời khỏi các peak tạp Peak đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số peak sắc ký đạt yêu cầu.
- Hình 2 cho thấy sự tương tác của tỉ lệ phần trăm methanol và nồng độ OPA trong hỗn hợp pha động Nồng độ OPA ảnh hưởng không nhiều đến hệ số kéo đuôi của Salbutamol (Hình 2a) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ OPA thì giúp cải thiện hệ số bất đối xứng của tín hiệu Brom (Hình 2b) Nồng độ OPA và methanol đồng ảnh hưởng đến thời gian lưu của tín hiệu peak Brom (Hình 2) và độ phân giải của Sal và Brom (Hình 2c,d) Tăng nồng độ OPA và methanol dẫn đến giảm thời gian phân tích Tuy nhiên, ở tỉ lệ methanol – nước có chứa 0,07% OPA (59:41, tt/tt) thời gian phân tích phù hợp ( hai pic chửa tách hẳn, còn xen phủ
Câu 10 [4] : Cho các nhận định sau :
(1) Hệ số phân bố K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. (2) Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc bản chất hai pha.
(3) Hệ số chọn lọc luôn luôn lớn hơn 1.
(4) Đồ thị sự phụ thuộc của nồng độ pha tĩnh với nồng độ pha động có dạng lồi thì pic sắc ký sẽ dạng đổ đầu.
