CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hệ enzyme proteaseProtease proteinase, peptidase, hoặc enzym phân giải protein là một nhóm phức tạp của các enzym được tìm thấy trong nhiều loại sin
TỔNG QUAN
Tổng quan về hệ enzyme protease
Protease (proteinase, peptidase, hoặc enzym phân giải protein) là một nhóm phức tạp của các enzym được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật, bao gồm cả thực vật, động vật và vi sinh vật Chúng thực hiện nhiều chức năng thiết yếu trong các quá trình khác nhau, chẳng hạn như tiêu hóa, kiểm soát sự tăng sinh, sự phát triển và chết của tế bào, điều hòa tổng hợp protein và sự suy thoái Chúng cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc sao chép và lây lan của vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng.
Enzyme phân giải protein thuộc nhóm hydrolase Chúng thủy phân liên kết peptit của protein ở giữa chuỗi axit amin (endopeptidases) hoặc ở đầu của nó (exopeptidases).
1.1.1 Các tính chất của hệ enzyme protease Điểm đẳng điện
Mỗi emzyme thuộc hệ protease khác nhau có điểm đẳng điện khác nhau như papain 8.75, casein 4.6, bromelain 9.55, … Độ pH tối ưu Độ pH có sự chênh lệch giữa các enzyme trong hệ protease nhưng chúng được chia theo 3 mức
- Protease acid có pH tối ưu từ 2 – 4
- Protease trung tính có pH tối ưu từ 7- 8
- Protease kiềm có pH tối ưu từ 9 – 11
Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dipepton.
Hình 1.1 Hai cách cắt Protein của enzyme protease
- Cách 1: Enzyme sử dụng acid như Aspartate, Glutamate, … để phân cực nước, sau đó tiến hành phá vỡ liên kết peptide trong phân tử protein
- Cách 2: Enzyme hoạt hoá để được coi như là 1 nucleotide tấn công trực tiếp vào liên kết peptide của protein, tạo chất trung gian là nước liên kết cộng hoá trị với nửa đầu N – terminus, sau đó, nước được kích hoạt để phân cắt hoàn toàn liên kết peptide
Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin NhómChymotripsin: bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin,elastase Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cystein proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính.
Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi poly peptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
- Phân loại dựa trên độ pH tối ưu
Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.
Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9 – 11.
Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, … hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8
- Dựa trên nguồn cung cấp
Có 3 nguồn cung cấp enzyme protease từ thiên nhiên: động vật, thực vật và vi sinh vật(tảo, vi khuẩn)
Trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin.
Tạng: là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease là renin (Chymosin) Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi cazein thành para-casein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất
Các loại nội tạng khác: Gan, lá lách, thận, phổi, cơ hoành tim, huyết, các loại bộ phận này đều chứa enzyme chúng tồn tại trong tế bào Chỉ có một số loại được sản xuất dưới dạng chế phẩm như: gan, tim lợn để tách aspartac-glutamate aminotransferase, huyết tương ( từ huyết ) để tách ra trombia ( Proenzyme chống đông máu ).
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa ( Pineapple plant ).
Hình 1.2 Casein biến đổi thành paracasein nhờ renin
Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt , chế biến sữa, Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica) được sử dụng thủy phân protein tự nhiên.
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men.
Nguồn vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng
500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai lọai trên Do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở
Hình 1.3 Dứa và Đu đủ khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticis, và một số giống chi Clostridium.
Nấm mốc: Nhiều loại nấm có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.terricola, A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm và trung tính Một số nấm mốc như: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat.
Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cúư ít hơn nấm mốc và vi khuẩn Tuy nhiên ngưòi ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, Strerimosus Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase ( Nhật ) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid.
Tổng quan về enzyme Bromelain
Bromelain là một loại enzym phân giải protein sulfhydryl chính được tìm thấy trong cây dứa ( Ananas comosus ) được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20 † nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa † mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau
Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ.
Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Bromelain thân 1.2.1 Một số tính chất của Bromelain
- Trọng lượng phân tử: 33.200 - 33.500 Da
- Thể tích riêng phần: 0,743 ml/g
- Hằng số khuếch tán: 7,77-10 cm.sec
- Độ nhớt bên trong: 0,039 dl/gam
- Tỷ số ma sát f/fo: 1,26
- Sự hấp thụ Al %cm: 20,1 a cm
- Điểm đẳng điện: Bromelain thân có pI 9,55, Bromelain quả có tính acid nên có pI 4,6
- Bước sóng hấp thụ cực đại: 280nm
- Nhiệt độ phản ứng tối ưuL 55 C 0
- Do có thành phần gồm nhiều phân tử enzym nên cơ chất xúc tác của bromelain rất đa dạng Nó có thể phân hủy protein, peptit, este
- Nhóm cần thiết để bromelain xúc tác là nhóm sulfhydryl trong chuỗi peptit. Ngoài ra, nhóm cacboxyl và nhóm hydroxyl trong cấu trúc phân tử của bromelain cũng độc lập với hoạt tính của enzym.
- Bromelain thân là glycoproteinase gồm phần protein và phần phi protein Phần phi protein là một glucide, ở mỗi phân tử gồm 3 manose, 1 xylose, 1 fructose và
2 glucosamine Glucosamine là phần nối trực tiếp với mạch polipeptide của phần protein Sợi hydrate carbon liên kết hoán vị với polypeptide.
Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của Bromelain thân
- Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần acid amin ở bromelain thân và quả thay đổi khác nhau Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả
- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của Bromelain thân có acid amin đầu – NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –NH2 là alanine.
- Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt)
- Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác.
- Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain.
- Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
- Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và amino acid Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, amino acid và peptide.
- † giai đoạn đầu, Zn rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt 2+ động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein nhờ amin, carboxyl…)
Enzyme – SH + Zn Enzyme – S – Zn + H 2+ +
- Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định.
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính
Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, …
Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của chất hoạt hóa, thời gian phản ứng. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Ảnh hưởng của pH pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định, mà phụ thuộc vào bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, nhiệt độ và bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt cũng như thời gian phản ứng. Ảnh hưởng của kim loại và một số chất khác
- Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain Ví dụ: KCN, thioglycolic acid, cystein, sulfid, cianit…
- Bromelain bị ức chế bởi những ion hoạt hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –
SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa, như: iodoacetate, bromoacetate, H2O2, methyl bromur…
- Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain.
- Theo Murachi, thì khi không có chất hoạt hóa, bromelain chỉ phát huy được 60-
70 % hoạt tính tối đa trên casein và enzyme có hoạt tính tối đa khi có sự hiện diện 0,005 M cystein.
Các chất bảo vệ enzyme
Tác nhân bảo vệ có vai trò quan trọng trong quá trình đông khô Một chất bảo vệ tốt phải bảo vệ tế bào ở nhiệt độ thấp trong suốt quá trình lạnh đông, dễ làm khô và tạo hỗn hợp ổn định, dễ hòa tan lại vào nước Nhiều nhóm chức đã được kiểm tra về khả năng bảo vệ của chúng: polyol, polysaccharide, disaccharide, amino acid, protein, muối, vitamin, khoáng, acid hữu cơ Tuy nhiên khả năng bảo vệ của từng nhóm chức thay đổi đối với từng loại phân tử sinh học Có 4 nhóm ngăn chặn tác hại của quá trình đông khô đã đ ợc nghiên cứu, kiểm tra:ƣ
- Đường: trehalose, lactose, maltose, sucrose, fructose, glucose bổ sung với tỉ lệ
- Acid amin: natri glutamate (2.5%), dịch trích nấm men (4%).
- Dung dịch đệm phosphate. Đường tái sắp xếp cấu trúc của n ớc trong phân tử protein khi hòa tan lại vàoƣ n ớc và ngăn cản sự uốn cong, hợp nhất bằng cầu nối hydro giữa các gốc phân cực củaƣ protein.
Acid amin bảo vệ bằng cách phản ứng với nhóm carboxyl của protein và nhóm amin của tác nhân bảo vệ nhờ đó mà nó ổn định cấu trúc của protein cystein ngăn cản sự oxi hoá nhóm –SH thành cầu nối -S-S-
Polyol làm cho dung dịch chứa chúng nhanh chóng bị kết tinh trong quá trình đông khô nhờ vậy có thể bảo vệ đ ợc các phân tử sinh họcƣ
QUY TRÌNH SẢN XUẤT
Phương pháp thu nhận
Enzyme bromelain có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả Việc thu nhận và tinh sạch bromelain có thể thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 2.1 Quy trình sản xuất Bromelain
Trong quy trình thu nhận Bromelain chia thành 3 giai đoạn chính: Thu dịch enzyme thô, thu nhận chế phẩm enzyme thô và tinh sạch enzyme
Bước 1 Chuẩn bị nguyên liệu.
Nguyên liệu được sử dụng có thể là thịt, thân, vỏ hoặc chồi dứa Ngoài ra ta có thể sử dụng các phế phẩm dứa từ những cơ sở sản xuất.
Dứa sau khi thu nhận được rửa bằng nước sạch để loại bỏ đất cát. Bước 2 Xay nhuyễn.
Dứa sau khi được rửa sach sẽ được xay nhuyễn hoặc nghiền nát Sau đó vắt kỹ để thu được tối đa dịch chiết
Phá vỡ tế bào dứa giúp trích ly enzyme bromelain tốt nhất.
Tách một phần hoặc toàn bộ các cặn còn lại trong dịch ép, quá trình này hao hụt khoảng 15% khối lượng dịch ép.
Dịch lọc được ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C.
Loại bỏ chất xơ và thu được dịch chiết có chứa bromelain.
2.1.2 Thu nhận chế phẩm enzyme thô Để thu nhận chế phẩm enzyme thô người ta thường sử dụng phương pháp kết tủa Ngoài ra còn có các phương pháp khác như màng siêu lọc (UF), màng ái lực, phương pháp CMC.
Các phân tử protein đều tích điện âm và chính những điện tích âm này kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước (ở trong dung dịch, do đó protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng Để có thể kết tủa được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelain là acetone và ethanol, ngoài ra còn có các muối trung tính ở nồng độ cao (Ammonium sulfate)
Bromelain trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh. Như vậy nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0 đến 4°c và acetone tinh khiết ở 20 °C Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelain- ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh Sau khi thu được kết tủa, tủa bromelain phải được rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelain không bị biến tính. Đối với ammonium sulfate thường được sử dụng với nồng độ bão hòa là 0,7 (70% bão hòa) Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường.
Thông thường nếu sử dụng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate thi cứ 60kg nguyền liệu tươi sẽ thu được khoảng 1kg bromelain thô.
- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hòa ammonium sulfate là 70%) Để yên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc dộ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96 ° (cũng đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 0 °c trong 3-4 giờ Ly tâm hổn hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào một thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm Để yên trong một giờ ở nhiệt độ 0-4°C Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa Thêm hai thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4 °C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.
Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách phân đoạn các thành phần trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng.
Dung dịch enzyme sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn Sau đó chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme.
Màng siêu lọc: màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua Các sợi này được chế tạo từ các loại polimer bền như fluoro polimer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone (GR) Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp Ví dụ, cô đặc protein: dùng màng FS, GR; cô đặc enzyme: dùng màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.
- Áp suất: thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m màng trong 1 2 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị cực đại Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm Tốc độ dòng chảy nên được chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ứng với hiệu số PI1-PI2 ở trong khoảng 0,5-3 bar Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1 max) là 7 bar, áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI2 min) là 0,5 bar.
Các kiểu siêu lọc: có ba kiểu hệ thống siêu lọc
- Kiểu một bước (single pass operation)
Sơ đồ 2.1 Siêu lọc kiểu một bước
- Kiểu lô (batch operation): chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
Sơ đồ 2.2 Siêu lọc kiểu lô
- Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ô trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
Sơ đồ 2.3 Siêu lọc kiểu không đổi thể tích Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc
- Có thể chọn lựa màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao
Phương pháp tinh sạch enzyme bromelain
Enzyme bromelain được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex
2.2.1 Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
Hình 2.3 Phương pháp thẩm tích
Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH 7,2 Sau khi tất cả enzyme đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1L dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay đung dịch đệm bên ngoài một lần Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzyme sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp.
2.2.2 Tinh sạch bằng sắc ký sephadex
Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 100°C trong một giờ rồi nhồi vào cột(kích thước cột 23,5x0,9cm) Đặt một cái phễu thủy tinh phía trên cột, cho sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục đến khi nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt khí Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng l mL/7 phút
Hòa enzyme thô vào dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M với tỷ lệ 100 mg enzyme thô/1mL dung dịch đệm, pH 7,2 Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2mL/7phút Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO để thử (NH3)2 4) SO2 4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tánh của enzyme Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian 1 giờ.
Bromelain thân: khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 thì thấy có một thành phần chính và 5 thành phần phụ.
Bromelain quả: khi dùng sắc ký sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ
Phương pháp đông khô
2.3.1 Khái niệm Đông khô là quá trình làm mất hơi nước của sản phẩm bằng cách trực tiếp chuyển ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua trạng thái lỏng ở điều kiện áp suất rất thấp.
Sản phẩm thu được bằng phương pháp đông khô giữ lại gần như đầy đủ tính chất đặc trưng ban đầu: tính chất sinh học, màu sắc, hình dạng Sản phẩm có thể tồn trữ lâu dài trong bao bì chống ẩm và không phụ thuộc vào điều kiện chống ẩm.
2.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô
Quá trình đông khô được chia làm 3 giai đoạn
- Giai đoạn làm lạnh: trong giai đoạn này vật liệu sấy được làm lạnh từ nhiệt độ môi trường (khoảng 20 C) xuống đến nhiệt độ -10 C – 15 C (sấy thăng hoa liên tục) hoặc 0 0 0 có thể làm lạnh vật liệu trong buồng lạnh riêng (từ -20 C đến -70 C) Trong giai đoạn 0 0 này không gian của bình thăng hoa được hút chân không và áp suất trong bình giảm, do đó phần áp suất hơi nước trong không gian bình cũng giảm so với phần áp suất hơi nước trong lòng vật liệu sấy Điều đó dẫn tới hiện tượng thoát ẩm từ vật liệu sấy vào không gian bình thăng hoa Như vậy kết thúc giai đoạn làm lạnh nhiệt độ của vật liệu sấy nhỏ hơn nhiệt độ điểm ba thể Áp suất trong bình thăng hoa cũng nhỏ hơn áp suất của điểm ba thể.
- Giai đoạn thăng hoa: trong giai đoạn này, nước trong vật liệu sấy bắt đầu thăng hoa mãnh liệt Độ ẩm của vật liệu sấy giảm rất nhanh và gần như tuyến tính Như vậy giai đoạn thăng hoa có thể xem là giai đoạn có tốc độ sấy không đổi.
- Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại: sau giai đoạn thăng hoa, do trạng thái của nước trong vật liệu sấy nằm trên điểm ba thể nên ẩm trong vật liệu sấy trở về dạng lỏng Vì khi đó áp suất trong bình thăng hoa vẫn được duy trì bé hơn áp suất khí trời nhờ bơm chân không và vật liệu sấy vẫn tiếp tục được gia nhiệt nên ẩm vẫn không ngừng từ dạng lỏng lên dạng hơi và đi vào không gian bình thăng hoa Như vậy giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy chân không bình thường.
ỨNG DỤNG
Hỗ trợ điều trị thoái hoá xương khớp
Thoái hóa khớp (OA) là bệnh rối loạn thoái hóa, cơ xương thường gặp nhất, đặc trưng bởi phản ứng viêm mãn tính, biểu hiện lâm sàng bằng đau khớp và giảm khả năng vận động Thường được điều trị bằng thuốc chống viêm Một số nghiên cứu đã được thực hiện trên các phương pháp điều trị viêm khớp chỉ ra rằng bromelain có thể là một phương pháp tốt để đối phó với bệnh này do hoạt tính giảm đau và chống viêm mạnh mẽ của nó Bromelain góp phần làm giảm sự mất cân bằng oxy hóa và sự biểu hiện của các chất trung gian gây viêm, bao gồm bradykinin, thromboxan A2 và PGE 2. Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng sử dụng bromelain trong điều trị kết hợp với các chất dinh dưỡng khác, chẳng hạn như natri diclofenac, rutin, trypsin hoặc nghệ, mang lại hiệu quả nâng cao đáng kể trong điều trị các bệnh đau khớp thoái hóa.
Các công dụng của thuốc Bromelain có thể kể đến như
- Giảm sưng viêm ở mũi và xoang sau chấn thương hoặc phẫu thuật.
- Điều trị viêm loét đại tràng.
- Làm mềm da, tăng cường tái tạo và loại bỏ các mô chết do bỏng.
- Ngăn ngừa sự tích tụ dịch trong phổi (chứng phù phổi).
- Kích thích co thắt cơ và làm chậm quá trình đông máu.
- Cải thiện sự hấp thụ các thuốc kháng sinh.
- Ngăn ngừa một số tế bào ung thư.
- Giảm chứng khó tiêu và đau dạ dày.
- Hỗ trợ cơ thể loại bỏ chất béo nhanh hơn mức bình thường.
- Hạn chế đau nhức cơ bắp sau khi tập thể dục thể thao ở cường độ cao. Loại thuốc này còn đặc biệt được dùng để điều trị các bệnh liên quan đến đường hô hấp như viêm phế quản, viêm xoang… mang lại công dụng rất khả quan.
Cũng như hầu hết các loại tân dược khác, Bromelain cũng có khả năng tương tác với một số tên thuốc nhất định Người điều trị cần hiểu rõ việc này để có thể tránh được các kết quả không mong muốn Những sản phẩm y học có thể tương tác với loại enzym này bao gồm
- Một trong những tác dụng của Bromelain là làm tăng lượng Amoxicillin trong cơ thể.
- Do đó, dùng đồng thời 2 loại thuốc này với nhau sẽ dẫn đến tình trạng dư thừa và tăng các tác dụng phụ của Amoxicillin như lở miệng, dị ứng da, chảy máu bất thường v.v…
Thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline
- Lượng kháng sinh mà cơ thể hấp thụ sẽ tăng lên đáng kể khi dung nạpBromelain Vì vậy, tương tự như trường hợp Amoxicillin, điều trị bằng loại enzym này cùng với một số thuốc kháng sinh có nguy cơ làm tăng các tác dụng phụ của thuốc (nhóm Tetracyclin).
- Các kháng sinh thuộc nhóm Tetracyclin được xác định là Demeclocyline, Minocycline và Tetracycline.
Thuốc chống đông máu (thuốc kháng tiểu cầu)
- Bromelain sẽ làm chậm quá trình đông máu ở một mức độ nhất định Vì vậy, việc uống thuốc này song song với các loại thuốc có tác dụng chống đông máu đồng nghĩa với việc tăng nguy cơ người được điều trị bị bầm tím và chảy máu.
- Cần ghi nhớ các loại thuốc làm chậm đông máu thường gặp như: Aspirin, Clopidogrel, Diclofenac, Ibuprofen, Naproxen, Dalteparin, Enoxaparin, Heparin, Warfarin…
Trong một số trường hợp, thuốc sẽ có thể gây ra những tác dụng phụ (mức độ nhẹ) như:
- Kỳ kinh nguyệt kéo dài, rong kinh.
Thông thường, những người sử dụng Bromelain ở liều lượng cao và kéo dài sẽ phải gặp các tác dụng phụ trên.
3.3 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Bromelain tương tác trực tiếp với protein myofibrillar, thủy phân fibrin và mô liên kết, phân giải protein thành các phân tử nhỏ như peptide và amino acid, phá vỡ các sợi cơ và gân, đồng thời làm cho thịt mềm và mịn.
Việc sử dụng bromelain để thủy phân collagen tạo gelatin có thể làm đặc và nhũ hóa thức ăn, tăng hàm lượng thức ăn dễ tiêu hóa và hấp thu.
Ngoài ra, ngày nay enzyme Bromelain còn được ứng dụng trong việc sản xuất nước mắm ngắn ngày