Bài 9 hoạt tính enzyme amylase i xác định hoạt tính enzyme amylase theo phương pháp wohlgemuth

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Nguyễn Huỳnh Bảo Ngân Mai Nguyễn Thảo Nhi Vũ Thành Phú

221218122124342212603

BÀI 9: HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE

I XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁPWOHLGEMUTH

1 Nguyên tắc

Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và glucose Amylase có trong hầu hết các loại hạt chưa nảy mầm ở trạng thái không hoạt động Trong quá trình nảy mầm, amylase được hoạt hóa trở thành chất xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột thành các đoạn dextrin ngắn Trong điều kiện xác định, thời gian nảy mầm càng dài, hoạt tính enzyme amylase càng tăng.

Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định đến các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3% / KI 3% (thuốc thử Liugol).

Đơn vị hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở

37°C có Cl−¿¿

làm chất hoạt hóa.

2 Phương trình phản ứng

Tinh bột Amylase→ Glucose, maltose, dextrin

Hồ tinh bột + dung dịch I2 → hợp chất màu xanh tím

3 Dụng cụ hóa chất

Nguyên liệu

-Malt hạt: xay thành bột, mỗi nhóm 10g -Maltaz: chế phẩm amylase, mỗi nhóm 10g

-Tinh bột: dung dịch tinh bột 0,5% (đã hồ hóa hoàn toàn)

-Ống nghiệm Ф 12 - 10 ống + giá ống nghiệm (Bảng 1) -Chén cân + muỗng cân + bình định mức 100mL (ngâm malt) -Phễu lọc + 2 giấy lọc + erlen 100mL (lọc dịch chiết malt) -Pipette: 2 pipette 1mL

-Các dụng cụ khác: ống bóp + bình tia + giấy thấm

4 Cách tiến hành

Chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase

–Cân 10g malt xay (cả vỏ)/hoặc chế phẩm Maltaz, đem chuyển vào bình định mức 100mL, định mức đến 100mL bằng nước cất đến vạch, lắc thật kỹ.

-Ngâm malt/Maltaz trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức.

-Lọc dịch qua hai lớp giấy lọc mịn thu được dung dịch trong suốt chứa enzyme amylase (nên bỏ đi 50 giọt dịch lọc ban đầu, đến khi thu được dịch trong).

Khảo sát hoạt tính enzyme amylase

-Lấy 10 ống nghiệm Ф12 đánh số thứ tự từ 1 đến 10 -Hút vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch NaCl 0,5%

-Cho vào ống nghiệm [1] 1mL dịch chiết enzyme amylase từ malt và lắc kỹ Sau đó lấy 1mL từ ống nghiệm [1] cho vào ống nghiệm [2] và lắc kỹ Lập lại tương tự cho các ống tiếp theo cho đến ống [10] thì hút 1mL và bỏ đi.

- Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch tinh bột 0,5%, lắc đều, để vào tủ điều nhiệt ở 37°C, thỉnh thoảng lại lắc đều để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL H2SO4 10% (để chấm dứt hoạt tính enzyme) và 3 giọt thuốc thử Liugol, rồi lắc đều và quan sát sự thay đổi màu ở các ống nghiệm.

- Lấy thêm 1 ống nghiệm Ф12 đánh số thứ tự 11, hút vào 3mL nước cất, sau đó cho vào 3 giọt thuốc thử Liugol, lắc đều, sử dụng làm ống chuẩn để so màu.

-Đánh dấu ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất nơi đó xảy ra sự thủy phân hoàn toàn tinh bột, tức là ống dung dịch có màu vàng sáng và sau nó là ống có màu đỏ, đỏ tím (tinh bột chưa được thủy phân hoàn toàn)

-Bảng 1: trình bày kết quả thí nghiệm, ghi màu của dãy ống nghiệm vào bảng (xanh [x], tím [t], nâu [n], đỏ [d], cam [c], vàng [v])

V1 - thể tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống [1], V1 = 1mL V2 - thể tích dịch chiết enzyme amylase, V2 = 100mL

m: khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, m = 10000mg

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1mL dịch chiết enzyme (Nw)

Ở bước hút vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch NaCl 0,5%, mục đích để tạo môi trường hoạt

hóa cho enzyme amylase do có Cl−¿¿

phân li trong dung dịch NaCl Ở bước pha loãng nồng độ enzyme, mục đích để tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân toàn bộ 1mL dung dịch tinh bột 0,5% Thỉnh thoảng lại lắc đều ống nghiệm để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống, để cho enzyme có thể xúc tác đều cho phản ứng trong dung dịch Ở bước thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL H2SO4 10%, mục đích để bất hoạt enzyme do H2SO4 làm biến tính bất thuận nghịch enzyme, từ đó kết thúc phản ứng thủy phân tinh bột Sau đó nhỏ lugol vào để kiểm tra sự có mặt của tinh bột Trong các ống nghiệm từ 1 đến 4, sau khi nhỏ lugol màu dung dịch không đổi (màu vàng giống với ống 11), không có tinh bột trong dung dịch, chứng tỏ lượng tinh bột ban đầu đã bị thủy phân hoàn toàn Trong các ống nghiệm từ 5 đến 10, sau khi nhỏ lugol màu dung dịch thay đổi sang màu cam, đỏ, tím tùy vào nồng độ enzyme, trong dung dịch vẫn còn tinh bột, ít nhất là ống 5 và nhiều nhất là các ống 7,8,9,10, chứng tỏ vẫn còn tinh bột chưa được enzyme thủy phân hết Nồng độ enzyme càng nhiều, hoạt tính càng tăng và ngược lại Như vậy, nồng độ enzyme thấp nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột (màu dung dịch không đổi sau khi nhỏ lugol) là n/16, tương ứng với ống nghiệm 4 Vì vậy nhóm em chọn F=16 của ống

nghiệm 4 để tính kết quả Kết quả của nhóm thu được: lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 37°C là một đơn vị Wohlgemuth (W=1,25); hoạt độ enzyme amylase có trong 1mL dịch chiết enzyme là 80 đơn vị Wohlgemuth.

7 Nhận xét

Công thức tính lượng enzyme cho vào ống nghiệm do chỉ lấy 1mL dịch chiết enzyme amylase từ 100mL dịch chiết enzyme amylase có chứa 10g malt.

So sánh hoạt độ enzyme amylase với các nhóm khác:

Hoạt độ enzyme amylase (đơn vị Wohlgemuth) 80

Hoạt độ enzyme amylase có trong 1mL dịch chiết enzyme dao động trong khoảng

II ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN TINHBỘT CỦA ENZYME AMYLASE

1 Nguyên tắc thí nghiệm

Emzyme là xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của emzyme bị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH, nồng độ emzyme.

Amylase là emzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose và glucose Trong hệ tiêu hoá, emzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thuỷ phân tinh bột đã hồ hoá trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thuỷ phân tạo glucose thấm qua thành ruột.

Mục đích của bài thí nghiệm này là kiểm tra ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân tinh bột của enzyme amylase.

- Dịch chiết enzyme amylase - Dung dịch đệm pH = 6,0

4 Cách tiến hành

4.1 Tạo ống màu mẫu

- Dán nhãn cho 2 ống nghiệm mẫu lần lượt là [1] và [2]

- Ở ống [1] lấy 2mL dung dịch tinh bột 1,0% sau đó thêm vào 3 giọt thuốc thử Liugol rồi lắc đều ( ống có màu xanh do phản ứng giữa tinh bột và liugol)

- Ở ống [2] lấy 2mL dung dịch glucose 0,5% sau đó thêm vào 3 giọt thuốc thử Liugol rồi lắc đều ( ống có màu vàng do màu của Liugol)

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase

- Lấy 3 ống nghiệm Ф18 dán nhãn đánh số từ 1 đến 3

- Dùng pippet hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự như sau: 5,5mL dung dịch đệm pH=6 + 4mL dung dịch tinh bột 0,5% + 0,5mL dịch chiết enzyme amylase (tổng cộng trong 1 ống nghiệm có 10mL) sau đó lắc đều.

- Nhiệt độ thí nghiệm: ống 1 đặt ở nhiệt độ phòng 30℃

ống 2 đặt trong tủ sấy 50℃

ống 3 đặt trong tủ sấy 70℃

- Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thuỷ tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu, nhận xét, giải thích.

- Lưu ý: dùng thuốc thử Liugol đã pha loãng 10 lần để nhỏ vào dung dịch thử để tránh màu quá đậm.

5 Phương trình phản ứng

- Sự thuỷ phân tinh bột bằng emzyme amylase trải qua các giai đoạn sau:

6 Nhận xét

- Khả năng thuỷ phân tinh bột của emzyme amylase hay còn gọi là hoạt tính của emzyme amylase sẽ phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng của emzyme cũng tăng

theo cho đến khi đạt nhiệt độ tối ưu, khi vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme sẽ biến tính là hoạt tính giảm dần Mỗi emzyme khác nhau sẽ có cho mình một nhiệt độ tối ưu để hoạt tính lớn nhất, và nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase trong bài là 70℃

- Nhận xét màu của 3 mẫu khi đã nhỏ liugol vào:

Ở ống 30℃ có màu xanh vàng chứng tỏ phản ứng thuỷ phân xảy ra yếu, lượng tinh bột

nhiều hơn 2 ống kia, nhiệt độ phòng không phải là nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động,

Ở ống 50℃ có màu vàng xanh (hơi khác màu ống mẫu) tức là phản ứng thuỷ phân tinh bột

của enzyme amylase đã xảy ra mạnh hơn ở ống nhiệt độ phòng nhưng vẫn còn một ít lượng tinh bột

Ở ống 70℃ có màu vàng sáng (giống với màu của ống mẫu nhất) chứng tỏ lượng tinh bột

trong ống đã được emzyme amylase thuỷ phân hết thành glucose.

- Theo lý thuyết thì emzyme amylase hoạt động tốt nhất ở khoảng nhiệt từ 50-60℃ nhưng trong

bài thì khoảng nhiệt tốt nhất lại ở 70℃ có thể đến từ các nguyên nhân sau:

Nhiệt độ tủ sấy chưa đạt tới 70℃

nhiệt độ tối ưu hơn

Sai số trong quá trình thí nghiệm

Các nhóm mở tủ sấy nhiều lần dẫn đến thay đổi nhiệt độ tủ - Một vài điều lưu ý để thí nghiệm tốt hơn:

Lặp lại thí nghiệm nhiều lần để tăng độ chính xác Sử dụng đồng hồ đếm giây để xem thời gian chính xác

Pha loãng thuốc thử liugol 10 lần (1 Liugol + 9 nước cất) để quan sát màu thí nghiệm tốt hơn

- Emzyme amylase dùng để thuỷ phân tinh bột đóng vai trò quan trọng như trong quá trình tiêu hoá, công nghệ thực phẩm, sản xuất giấy, công nghệ dệt,…