Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen abcd1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Xây dựng quy trình phát hiệnđột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắngTS.. Mục tiêu nghiên cứuXây dựng quy trình chẩn đoán gen ABCD1 gây bệnh Loạn dưỡng não chất trắng.Ứn

Xây dựng quy trình phát hiện

đột biến gen ABCD1 liên quan đến

loạn dưỡng não chất trắng

TS Triệu Tiến Sang

Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân

Y

Đặt vấn đề

▪ Triệu chứng: tê liệt hệ thần kinh, liệt chi dưới, mất thị lực

Gen ABCD1 và protein

- Protein ALDP: cấu tạo từ 745 axit amin

- Cho đến tháng 11/2020, xác định được 852 đột biến

không tái diễn gây bệnh (www.x-ald.nl)

Cơ chế gây bệnh

Kemp, Stephan

(2014)

Phương pháp chẩn đoán

Chẩn đoán sau sinh

MRI, Hóa sinh, Xét nghiệm gen

Phát hiện muộn.

Chẩn đoán trước sinh

Chọc ối, xét nghiệm gen

- Ảnh hưởng đến sức khỏe người

mẹ

- Phát hiện muộn.

Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu máu: một gia đình vợ chồng (vợ: N.T.T – 26 tuổi; chồng: V.Đ.H – 28 tuổi), bác trai bên vợ bị bệnh, bà ngoại mang gen, có tiền sử gia đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng

- Mẫu phôi thụ tinh nhân tạo: 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6

● Hóa chất sử dụng để tách ADN từ mẫu máu: kit G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology – Hàn Quốc).

● Hóa chất sử dụng để khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA)

● Hóa chất cho kỹ thuật PCR: GoTaq Green Mastermix 2X (Promega – Hoa Kỳ); nước khử ion

● Hóa chất chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR: agarose, TBE 1X, ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp – 1000 bp

và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific – Anh)

● Hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt yêu cầu về kỹ thuật

và an toàn phòng thí nghiệm tại Labo thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y

Hóa chất và vật liệu

Thiết

kế mồi

Tối ưu hóa cặp mồi và giải trình tự Sanger

Ứng dụng lên ADN tế bào phôi sinh thiết

Kết quả tách chiết và khuếch đại hệ gen

Nồng độ: 10,0 ng/µl; A260/A280 : 2,00

● Khuếch đại hệ gen tế bào phôi sinh thiết:

Kết quả giải trình tự exon mẫu

NTT-ABCD1

Phát hiện đột biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên

exon 1 của gen ABCD1 của mẫu NTT-ABCD1 (ADN của người

mẹ)

Kết quả thiết kế cặp mồi

Thiết kế cặp mồi nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến

c.854G>C

Kết quả tối ưu phản ứng PCR

199 bp

M: thang chuẩn marker 100

bp.

Phản ứng PCR với ADN của mẫu NTT-ABCD1

199 bp

M: thang chuẩn marker 100 bp.

Vị trí khoanh tròn đỏ thể hiện đột biến thay thế G thành C, thể

hiện kiểu gen dị hợp tử giống như kết quả NGS

Kết quả ứng dụng quy trình lên mẫu tế

bào phôi sinh thiết

M: Thang chuẩn marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1; TR1 – TR8: ADN của 8 mẫu tế bào phôi sinh thiết sau khuếch đại

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger

với ADN tế bào phôi

TR1 Bình thường, không mang

alen đột biến

Tương tự với mẫu TR5,

TR7.

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger

với ADN tế bào phôi

TR4 Bình thường, mang alen

đột biến

Tương tự với mẫu TR2, TR3,

TR8.

TR6 Bị bệnh.

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger

với ADN tế bào phôi

• 03 phôi (TR1, TR5, TR7) có kiểu gen đồng hợp kiểu

dại → Sàng lọc bất thường NST→ Chuyển phôi

• 04 phôi (TR2, TR3, TR4, TR8) có kiểu gen dị hợp

• 01 phôi (TR6) có kiểu gen đồng hợp đột biến

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger

với ADN tế bào phôi

PHÂN TÍCH STR LIÊN KẾT

Kết quả giải trình tự thế hệ mới ứng dụng

sàng lọc bất thường bộ NST

(A): TR1: Phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể: +11s; -11s (khảm 50%)

(B): TR5: Bình thường

(C): TR7: Phát hiện bất thường lệch bội NST: +4, -2, -6, -11, -18, +8, +17 (khảm 60%)

Kết luận

• Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng.

• Ứng dụng được quy trình chẩn đoán đột biến gen liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng trên mẫu tế bào phôi sinh

thiết

Xin chân thành cảm ơn!