Xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen mfn2 gây bệnh chacort marie tooth loại 2

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN MFN2 GÂY BỆNH CHACORT-MARIE-TOOTH LOẠI Mã số: < > Chủ nhiệm đề tài: TS BS Mai Phƣơng Thảo Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ 2016 “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN MFN2 GÂY BỆNH CHACORT-MARIE-TOOTH LOẠI Mã số: < > Chủ nhiệm đề tài TS BS Mai Phƣơng Thảo Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ 2016 “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Lê Đông Trúc Sinh lý động ĐH khoa học tự nhiên TS Nguyễn Tấn Công nghệ sinh ĐH Bách Khoa Trung học TPHCM TS Đỗ Đức Chức ĐH Y Dƣợc Minh cấu trúc gen TPHCM Đơn vị phối hợp chính: Nơi thực đề tài: Trung tâm Y Sinh học phân tử, ĐHYD TPHCM Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện ĐHYD TPHCM i “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU iv MỞ ĐẦU CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu: Nghiên cứu phát đột biến gen MFN2 tiến hành mẫu DNA từ máu ngoại vi ba thành viên đƣợc chẩn đốn mắc CMT2 gia đình Và mẫu DNA bố, mẹ Phƣơng pháp nghiên cứu CHƢƠNG KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Xây dựng quy trình giải trình tự DNA gen MFN2 Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 kỹ thuật MLPA KẾT LUẬN “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Thông tin đoạn mồi sử dụng nghiên cứu Bảng Tổng hợp đột biến gen MFN2 đối tượng nghiên cứu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification MC Mẫu chứng NST Nhiễm Sắc Thể PCR Polymerase chain reaction GTT Giải trình tự dNTP Deoxynucleotide triphosphate iii “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Xây dựng quy trình chẩn đốn đột biến gen MFN2 gây bệnh Chacort-Marie-Tooth loại - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: TS BS Mai Phƣơng Thảo Điện thoại: 091 832 9999 Email: maithao292@gmail.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Khoa Y, Bộ môn Sinh lý học - Thời gian thực hiện: 2015-2016 Mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA tồn exon vùng lân cận exon gen MFN2 Nội dung chính: Khảo sát tồn gen MFN2 ghi nhận đột biến kỹ thuật PCR Giải trình tự Sanger Phân tích kết phần mềm CLC Workbench so sánh kết với nghiên cứu trƣớc Kết đạt đƣợc: Ghi nhận SNP exon (c.-367A>G), intron (c.474+65C>T) exon 19 (c.*58A>G); đột biến chƣa xác định intron 11 (c.1160+45A>G) intron 16 (c.1873-64T>G) Thiết lập thành công kỹ thuật giải trình tự DNA xác định đột biến gen MFN2 gây bệnh CMT2 Quy trình ứng dụng để chẩn đoán gen MFN2 đối tƣợng khác “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" MỞ ĐẦU Bệnh lý thần kinh di truyền Charcot-Marie-Tooth (CMT) nhóm rối loạn đa dây thần kinh vận động cảm giác mạn tính Bệnh biểu triệu chứng lâm sàng nhƣ teo chi, kèm theo cảm giác gây biến dạng chi hay chi dƣới dạng bàn chân hình vịm, giảm phản xạ gân xƣơng [2] Một số trƣờng hợp nặng, bệnh có biểu giảm thính giác thị giác [7] Mặc dù không gây tử vong nhƣng tổn thƣơng vận động, cảm giác kèm biến dạng chi gây nhiều khó khăn cho ngƣời bệnh sinh hoạt thƣờng ngày Chẩn đoán bệnh CMT đƣợc thực dựa triệu chứng bệnh thay đổi khảo sát điện sinh lý CMT thƣờng đƣợc phân nhóm dựa vào kiểu tổn thƣơng tốc độ dẫn truyền thần kinh (Nerve Conduction Studies), CMT2-nhóm tổn thƣơng sợi trục (NCV ≥ 38m/s) phân nhóm bệnh [1], [8] Các nghiên cứu giới ghi nhận đột biến khoảng 14 gen khác chịu trách nhiệm cho CMT2, bao gồm: KIF1B (CMT2A1), MFN2(CMT2A2), RAB7 (CMT2B), TRPV4 (CMT2C), GARS (CMT2D), NEFL (CMT2E), HSPB1 (CMT2F), MPZ (CMT2I/J), GDAP1 (CMT2K), HSPB8 (CMT2L), DNM2 (CMT2M), AARS (CMT2N), LAMIN A (AR-CMT2A) MED25 (AR-CMT2B) [2], [7] Trong đó, đột biến gen MFN2 đƣợc ghi nhận nhiều (chiếm 33%) tổng số ca đƣợc chẩn đoán mắc CMT2 [10], [15] Nhận diện đƣợc đột biến gây bệnh có vai trị quan trọng việc chẩn đoán xác định tƣ vấn di truyền Mặc dù bệnh khơng gây tử vong nhƣng việc chẩn đốn xác bệnh vô cần thiết tránh việc sử dụng thuốc điều trị không gây tốn đem lại tác dụng phụ khơng mong muốn cho ngƣời bệnh, đồng thời tƣ vấn nguy mắc bệnh qua hệ Đột biến gen MFN2 đƣợc miêu tả lần vào năm 2004 Züchner cs [15] Các nghiên cứu sau cho thấy đột biến gen MFN2 nguyên nhân phổ biến CMT2 [13] Do đó, gen MFN2 ln “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" đƣợc chọn khảo sát trƣờng hợp chẩn đoán CMT2 lâm sàng MFN2 mã hố cho protein màng ngồi ty thể, đóng vai trị quan trọng q trình dung hợp ty thể, tạo lƣợng ATP cho tế bào thần kinh Cho đến nay, có 50 đột biến gen MFN2 gây bệnh CMT2 đƣợc mô tả toàn giới Hầu hết, đột biến ghi nhận MFN2 đột biến điểm, đồng hợp dị hợp, di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng Chỉ có trƣờng hợp ghi nhận đột biến lặn đột biến dị hợp tử kép Tần suất mắc bệnh khác tùy vào dân tộc, Na-Uy Tây Ban Nha 3,4% -16% Bên cạnh đó, báo cáo Mỹ đƣa tỉ lệ xuất đột biến có liên quan CMT2 MFN2 21%, xấp xỉ với nghiên cứu trƣớc Anh 22% 33% tỉ lệ xuất đột biến MFN2 khảo sát đối tƣợng CMT2 Hàn Quốc Đến nay, chƣa có nghiên cứu bệnh Charcot-Marie-Tooth đƣợc thực Việt Nam Chúng tiến hành đề tài nhằm xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát đƣợc tồn exon vùng lân cận gen MFN2, tiến đến ứng dụng chẩn đoán bệnh CMT2 cho ngƣời Việt Nam “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu: DNA từ máu ngoại vi gia đình (5 thành viên) đƣợc chẩn đốn mắc CMT2 Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết genomic DNA từ máu ngoại vi theo hƣớng dẫn sử dụng kit DNA Blood SV mini (GeneAll® Exgene™) Khảo sát đột biến kỹ thuật PCR-giải trình tự Thiết kế mồi: Các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để khuếch đại toàn 19 exon vùng lân cận exon dựa trình tự chuẩn gen MFN2 (NG_007945) Bảng Thông tin đoạn mồi sử dụng nghiên cứu CÁC CẶP MỒI SỬ DỤNG CHO GEN MFN2 Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon 78 Exon Exon 10-11 Exon Ký hiệu Trình tự mồi( 5'-3') M-1F M-1R M-2F M-2R M-3F M-3R M-4F M-4R M-5F M-5R M-6F M-6R M-7F M-8R M-9F M-9R M-10F M-11R M-12F AAA AGC GGG AAC CTC TAC TCC AC GTA GAA CAT GGCC GTG AAG GGT G CCC TCA GGG ATG AGT TTG TTT GG AGC AAC CAG CGA AAT CCT TCA CG TCT CAC CGT CCT TTG TTC TAG TC CCT TGT CTT CCT GGC CTC ATC TC GAG CTA GAA AGT GGT AAG AAC CAG GGA CAG GGA GTT ATT GTT TAA TGG TGC CTA CTC TTT GTC TCT CAG CAC GTC CTC ATT CTT GGT GAT CCA CG AGA AAG GGT AGC AGA TGG GC GGG ACA TCT GCA GGG TAC TG AAT CCG TTA ATG AGG GCC AG ATC CAG CAA AGT GGA TGG GAG GGC CAC CTA CAC TCA CTC TGG CAA GAG CCT CTC TGC TCT TCT TGC TGA GGA GTC TGT CAG TAG A CTC ACC AGG CTG TCT ATG TGG CAG GGT CCT CTT CTT ACC TG Sản phẩm PCR (bp) 686 435 401 342 358 451 666 320 667 1242 “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" 12-14 Exon 15 Exon 16-17 Exon 18 Exon 19 Exon Exon Exon M-14R M-15F M-15R M-16F M-17R M-18F M-18R M-19F M-19R M-19FS3 M-19FS2 M-3FN M-3RN M-4FN M-4RN M-5FN M-5RN CAG AAC CTG AAG GTA TCG AG TGG TAG AGC CCT GTC TCC AA ACC ACA GCT GCT GAC CTT AG GGA AAT TGA AGA GCC ACT CTG CCC CAT GAC TGG CCT CAA AG TGC TGG CAG GGA TAT AGA CA ATG AGC TAA ATC CCC ACC AG TGT GTG TCA AGC GTC CTT AG GCA GGA TGG AAC AGT GAG TC GTG TAA GGG ACG ATT GGA GTT TC CTC CCT GAT CTC CAG AAC CTT CG TCT TGA TTC TCC CCA AAG CA GCA GAG CAT TTC TAA GGC TA AGG TGG ACT CGT TTA GGG TA AAG CAT GTC CCT GCC TGG AA GCT GGT ATC TGC GTT GTG AA TCT CCC ATT CAC CTC CAC AG 416 933 370 2370 509 823 522 Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tương ứng với cặp mồi: Chu trình luân nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95°C (5 phút), theo sau 30 chu kỳ gồm biến tính 94°C (1 phút), gắn mồi 56°C (1 phút), tổng hợp chuỗi DNA 68°C (90 giây), kết thúc phản ứng giai đoạn kéo dài sản phẩm 68°C (5 phút) Phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Kiểm tra sản phẩm PCR điện di: sản phẩm PCR mong muốn cho băng có kích thƣớc so với thang chuẩn 50 bp hay 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) Giải trình tự phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣợc thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo chiều xi ngƣợc Trình tự DNA đƣợc đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50cm (Applied Biosystems, Mỹ) “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" Kết giải trình tự đƣợc phân tích phần mềm CLC Main Workbench 5.5 Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn kỹ thuật MLPA- Multiplex Ligation Probe Amplification Phản ứng MLPA sử dụng Kit P250-B1 DiGeorge (MRCHolland) chứa 38 mẫu dò lai đặc hiệu với 38 đoạn gen thƣờng xảy đột biến, ngồi cịn có đoạn nội chuẩn giúp kiểm chuẩn phản ứng PCR Các mẫu dò đƣợc thiết kế với trình tự acid nucleic giống hai đầu gắn mồi, vậy, cần sử dụng cặp mồi để khuếch đại toàn 38 mẫu dò tƣơng ứng với 38 gen khác với đoạn nội chuẩn Phản ứng MLPA đƣợc thực theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di máy ABI 3130 Genetic Analyzer Kết đƣợc phân tích phần mềm Coffalyser “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Xây dựng quy trình giải trình tự DNA gen MFN2 Gen MFN2 nằm nhiễm sắc thể 1, gồm 19 exon với chiều dài 33kb Đột biến genomic DNA khơng có tính khu trú vào vùng định mà phân bố khắp chiều dài gen Chúng tiến hành khuếch đại toàn 19 exon gen MFN2 14 phản ứng PCR với 14 cặp mồi cụ thể đƣợc trình bày Bảng với chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhƣ sau: Exon 1: 95°C phút; 40 chu kỳ gồm 95°C phút, 60°C phút; 68°C phút; kết thúc 68°C phút Các exon lại: 95°C phút; 40 chu kỳ gồm 95°C 30 giây, 60°C 30 giây; 68°C 90 giây; kết thúc 68°C phút Hình Kết PCR cặp mồi khuếch đại exon 1- 19 Thang chuẩn Giếng 1: Mồi 1F/R - 686bp 2: Nước (-) 3: Mồi 2F/R - 435bp 4: Nước (-) 5: Mồi 3F/R - 509bp 6: Nước (-) 7: Mồi 4F/R - 823bp 8: Nước (-) 9: Mồi 5F/R - 522bp 10: Nước (-) 11: Mồi 6F/R - 451bp 12: Nước(-) 13: Mồi 7F/8R - 666bp 14: Nước(-) 15: Mồi 9F/R - 320bp 16: Nước(-) 17: Mồi 10F/11R - 667bp 18: Nước(-) 19: Mồi 12F/14R - 1242bp 20: Nước(-) 21: Mồi 15F/15R - 416bp 22: Nước(-) 23: Mồi 16F/17R - 933bp 24: Nước(-) 25: Mồi 18F/19R - 370bp 26: Nước(-) 27: Mồi 19F/19R - 2370bp 28: Nước(-) Các sản phẩm PCR sau tinh đƣợc tiến hành giải trình tự chuỗi DNA theo kỹ thuật Sanger hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" cho kết trình tự chuỗi phù hợp với trình tự gen MFN2, chứng tỏ cặp mồi chúng tơi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen MFN2 Ứng dụng quy trình kỹ thuật thiết lập để khảo sát đột biến cho bệnh nhân đƣợc chẩn đốn nghi ngờ CMT2 Chúng tơi ghi nhận số Single Nucleotide Polymorphism (SNP) [3] exon 1, intron 5, exon 19 đột biến intron 11 intron 16 (Bảng 3.1) Hình 2A: Một đoạn kết giải trình tự exon gen MFN2 (đột biến c.367A>G) Hình 2B: Một đoạn kết giải trình tự intron gen MFN2 (đột biến c.474+65C>T Hình 2C: Một đoạn kết giải trình tự intron 11 gen MFN2 (đột biến c.1160+45A>G) Hình 2D: Một đoạn kết giải trình tự intron 16 gen MFN2 (đột biến c.1873-64T>G) Hình 2E: Kết giải trình tự exon 19 gen MFN2 (đột biến c.*58A>G) Bảng Tổng hợp đột biến gen MFN2 đối tượng nghiên cứu Exon Intron Exon 5’UTR Intron Thành viên Vị trí đột biến BN01 c.-367A>G Loại đột biến Đồng hợp BN03 BN04 BN05 c.-367A>G Dị hợp BN01 c.474+65C> T Đồng hợp Kết GTT SNP Nghiên cứu giới Hình 2A rs223605 Casasnova s cs, 2010 Hình 2B rs223605 Casasnova s cs, “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" Intron 11 Intron 16 Exon 19 BN03 BN04 BN05 c.474+65C> T Dị hợp BN01 c.1160+45A >G Đồng hợp BN03 BN04 BN05 c.1160+45A >G Dị hợp BN01 c.187364T>G Đồng hợp BN03 BN04 BN05 c.187364T>G Dị hợp BN01 c.*58A>G Đồng hợp BN03 BN04 BN05 2010 Hình 2C Hình 2D Hình 2E c.*58A>G Dị hợp rs104284 Casasnova s cs, 2010 Các đột biến đƣợc di truyền từ ngƣời bố không mắc bệnh cho ngƣời Ba đột biến c.-367A>G, c.474+65C>T c.*58A>G đƣợc báo cáo SNP nghiên cứu Casasnovas cs.[5] Do đó, chúng tơi cho đột biến nguyên nhân gây bệnh BN03, BN04 BN05 Hai đột biến lại nằm intron 11 (c.1160+45A>G) intron 16 (c.1873-64T>G) , chƣa đƣợc báo cáo sở liệu đột biến MFN2 giới Do nằm vùng intron nên đột biến ảnh hƣởng đến q trình sau phiên mã thay đổi hàm lƣợng protein Mfn2 tạo Mfn2 giảm/mất chức Chúng kiểm tra vị trí đột biến khơng nằm motif DNA bảo tồn cho trình ghép nối (splicing) intron 11 intron 16 Tuy nhiên để hiểu rõ hai đột biến ảnh hƣởng đến q trình ghép nối, cần có thí nghiệm kiểm tra mRNA gen MFN2 có tồn loại mRNA với độ dài khác q trình splicing khơng thể diễn intron 11 intron 16 Đồng thời, cần phải tiến hành giải trình tự vùng đột biến ngƣời bình thƣờng cỡ mẫu lớn để xác định đột biến có xuất cá thể bình thƣờng hay khơng (do khơng thấy xuất ngƣời mẹ) để có kết luận xác “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 kỹ thuật MLPA Các đột biến điểm, đột biến đoạn hay lặp đoạn exon có khả dẫn tới thay đổi trình tự acid amin đƣợc dịch mã, từ ảnh hƣởng đến chức protein Các đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 đƣợc phát kỹ thuật MLPA Trong báo cáo Polke cs ghi nhận đột biến hoàn toàn exon 7-8 khảo sát gen MFN2 gia đình kỹ thuật MLPA, kết đƣợc kiểm tra kỹ thuật long PCR [11] Các nghiên cứu gần Høyer cs tiến hành khảo sát song song gen MPZ MFN2 kỹ thuật MLPA chƣa phát đƣợc thêm đột biến lặp/mất đoạn sau nghiên cứu Polke cs [10], [17] Trong phạm vi đề tài này, tiến hành khảo sát nhằm tìm kiếm đột biến đoạn lặp đoạn có gen MFN2 cho mẫu DNA toàn thành viên gia đình Với thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng mẫu ngƣời bình thƣờng làm đối chứng, mẫu nƣớc làm chứng âm khơng chứa DNA Kết phân tích MLPA thành viên gia đình đƣợc phân tích phần mềm Coffalyser Tuy nhiên, chúng tơi khơng ghi nhận đột biến mất/lặp đoạn exon gen MFN2 (Hình 3A) Tỉ lệ đỉnh tín hiệu mẫu dò mẫu bệnh nhân (BN01, BN02, BN03, BN04, BN05) mẫu đối chứng (MC01, MC02) nằm khoảng bình thƣờng (trên giới hạn xanh lặp đoạn, dƣới giới hạn đỏ đoạn) Không ghi nhận đột biến lặp hay đoạn gen MFN2 kỹ thuật MLPA đối tƣợng đƣợc khảo sát 3A 3B “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử" Hình Kết phân tích MLPA gen MFN2 đối tượng nghiên cứu BN03 (A) MC01 (B) Vùng màu xám đại diện cho mẫu dò tham khảo, vùng màu tím đại diện cho mẫu dị phân tích lặp/mất exon gen MPZ, vùng tím nhạt đại diện cho mẫu dị phân tích lặp/mất exon gen MFN2 (đại diện mẫu bệnh nhân CMT2 - BN03, đại diện mẫu chứng MC01) KẾT LUẬN Qua kết đạt đƣợc, đƣa kết luận sau: Tối ƣu hoá phản ứng PCR - Các cặp mồi đƣợc chọn hoàn toàn đặc hiệu để khuếch đại toàn exon vùng lân cận gen mục tiêu MFN2, đảm bảo thông số lý thuyết lẫn thực tiễn - Tối ƣu hoá thành công phản ứng PCR xác định đƣợc độ đặc hiệu phản ứng thơng qua giải trình tự sản phẩm thu đƣợc Ứng dụng phƣơng pháp khảo sát phân tích đột biến gen - Phƣơng pháp khảo sát đột biến gen MFN2 đƣợc áp dụng cho ngƣời bệnh, chƣa phát đƣợc đột biến nhƣng xác định đƣợc SNP gen MFN2 - Kỹ thuật MLPA cho kết tốt ổn định chƣa ghi nhận đƣợc đột biến lặp/mất đoạn gen MFN2 “Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử"