Tbkt cnsh n1

Huỳnh Văn Biết Sinh viên thực hiện: Nhóm 1 DÙNG KỸ THUẬT MULTIPLEX NESTED PCR - ICT ĐỂ PHÁT HIỆN HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG... ĐẶT VẤN ĐỀ - Ung thư cổ tử cung CT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINHKHOA HỌC SINH HỌC

Báo cáo Seminar

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Văn Biết Sinh viên thực hiện: Nhóm 1

DÙNG KỸ THUẬT MULTIPLEX NESTED PCR - ICT ĐỂ PHÁT HIỆN

HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1

NỘI DUNG THỰC HIỆN

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

- Ung thư cổ tử cung (CTC) là bệnh ung thư phổ biến thứ 3 ở phụ nữ trên toàn thế giới, ước tính có 569.847 ca mắc mới và 311.365 ca tử vong trong năm 2018.

- Việc phát hiện sớm bằng tế bào học, các kỹ thuật Công nghệ Sinh

học để xét nghiệm Human Papilloma virus là cần thiết, giúp nâng

cao khả năng phòng ngừa, điều trị sớm tổn thương cổ tử cung nhằm giảm tỷ lệ tử vong của bệnh và nghiên cứu triển khai vaccine

phòng ngừa Human Papilloma virus ở phụ nữ trẻ tuổi.

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Virus HPV2.1.1 Khái niệm

- HPV là những virus nhỏ không có vỏ bọc, đường kính khoảng 55 nm, chứa bộ gen DNA vòng sợi đôi, có thể được chia thành ba vùng: sớm, muộn và LCR (vùng kiểm soát dài).

2.1.2 Virus HPV 16 & 18

- Bộ gen của HPV 18 đã được tích hợp vào bộ gen của tế bào Điều thú vị là bộ gen của virus đã bị chia cắt ở phần cuối của “vùng đầu” thành hai phần trong mỗi bản sao hợp nhất

- HPV 16 gây ra hơn 50% ca ung thư cổ tử cung và HPV 18 gây ra 10 – 20%; chúng chiếm khoảng 70% số ca ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới.

2.2 Các con đường lây truyền virus HPV

Có thể bị nhiễm HPV khi quan hệ tình dục qua đường miệng, âm đạo, hậu môn với người bị nhiễm bệnh.

HPV chủ yếu lây truyền qua đường 6 tình dục do da tiếp xúc trực tiếp với da, niêm mạc miệng, hầu họng hoặc tiếp xúc với dương vật, tử cung, âm đạo, hậu môn của người bị nhiễm bệnh.

HPV cũng có thể lây nhiễm qua những vật dụng của người bị bệnh đã dùng như cắt móng tay, kim bấm sinh thiết

2.3 Các phương pháp phát hiện virus HPV

Phương pháp xét nghiệm Papanicolaou (Pap) test

phết mỏng cổ tử cungPhương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp Real-time PCR (Real time -

Polymerase Chain Reaction ) Phương pháp khuếch đại gen lồng đa mồi (Multiplex Nested PCR) kết hợp sắc ký miễn dịch (ICT)

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các đoạn gen HPV L1 được xây dựng thành các plasmid (pGEM-T Easy Vector System, Madison, WI, USA) và được sử dụng làm mẫu thử để đánh giá hiệu suất của phương pháp

PCR được thực hiện trong Hệ thống PCR GeneAmp 9600 (PerkinElmer Cetus, Emeryville, CA) QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) đã được sử dụng để tách DNA HPV

3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Trình tự của các primer được sử dụng cho lần chạy đầu tiên của phản ứng nestedPCR để tăng cường gen HPVL1 như: + Mồi MY11 5’-GCMCAGGGWCATAAYAA TGG-3’

- Sản phẩm PCR có 220 cặp bazơ (bp) được sử dụng làm khuôn mẫu cho lần chạy thứ hai của PCR Sau khi thêm các primer đặc hiệu gen HPV thì cho chạy thêm 15 chu kỳ PCR

- Dải ICT bao gồm ba vùng bề mặt: vùng sợi thủy tinh, vùng màng nitrocellulose (NC) và vùng giấy lọc dày Tổng cộng 10 µl của các sản phẩm PCR được tăng cường được nhỏ lên dải ICT, tiếp theo là việc thêm 40 µl phosphate buffer (10 mM, pH 7,4) Kết quả được đọc sau khi ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

D-HPV165’-Dig-labeled-ATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAA-3’F-HPV185’-FITC-labeled -TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’B-GP6(+) 5’-biotin-labeled-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ này mô tả thử nghiệm bộ quy tắc cách tiến hành và kết quả đại

diện của phép thử ICT để phát hiện HPV 16 và 18

09

4 KẾT QUẢ

Hệ thống phân tích kết hợp một quy trình PCR lồng nhau để tăng cường độ nhạy của việc kiểm tra theo sau bởi một bước ICT để phát hiện nhanh chóng HPV16 và HPV18 Số lượng bản sao của DNA HPV trong các mẫu kiểm tra dao động từ 0 đến 104 Sau Multiplex Nested PCR, độ dài của các sản phẩm PCR là 99 bp cho HPV16 và 101 bp cho HPV18.

Hình 4.1 Giới hạn phát hiện của phép thử PCR-ICT được

đánh giá bằng cách sử dụng một loạt các plasmid pha loãng chứa gen virus HPV 16 hoặc HPV 18 làm khuôn mẫu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lục Thị Vân Bích, Cao Minh Nga, Hồ Lê Ân và Huỳnh Ngọc Phương Thảo (2011) Khảo sát tình hình nhiễm HPV và các genotýp HPV (Human Papilloma virus) ở phụ nữ Việt Nam trong độ tuổi từ 18- 69 bằng kỹ thuật sinh học phân tử Y học Thành phố Hồ Chí Minh 15(2):190-194 2 Lê Quang Vinh, Phạm Thị Thanh Yên, Nguyễn Khánh Dương, Lê Hoàng Linh, Đào Duy Quân và cộng tác viên (2015) Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm

Human Papilloma virus ở cán bộ nữ Bệnh viện Phụ Sản Trung ương Phụ Sản 13(2):9-11.

3 Bosch, F X., Burchell, A N., Schiffman, M., Giuliano, A R., de Sanjose, S., Bruni, L., Tortolero-Luna, G., Kjaer, S K., and Muñoz, N (2008) Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia Vaccine 26 Suppl 10, K1-16.

4 Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R L., Torre, L A., and Jemal, A (2018) Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA Cancer J Clin 68(6): 394-424

5 Harper, D M., and DeMars, L R (2017) HPV vaccines - A review of the first decade Gynecol Oncol 146(1): 196-204

6 Kim, K., Hwang, D., Kim, S., Park, S O., Cha, H., Lee, Y., Cho, J., Kwak, S K., and Choi, N (2020) Cyclic Aminosilane‐Based additive ensuring stable Electrode– Electrolyte interfaces in Li‐Ion batteries Advanced Energy Materials 10(15)

7 Kuo, Y B., Li, Y S., and Chan, E C (2015) Rapid identification of HPV 16 and 18 by multiplex nested PCR-immunochromatographic test J Virol Methods 212: 8-11

8 Lagheden, C., Eklund, C., Lamin, H., Kleppe, S N., Lei, J., Elfström, K M., Sundström, K., Andrae, B., Sparén, P., and Dillner, J (2018) Nationwide comprehensive human papillomavirus (HPV) genotyping of invasive cervical cancer Br J Cancer 118(10): 1377-1381 9 Meijer, C J., Snijders, P J., and Castle, P E (2006) Clinical utility of HPVgenotyping Gynecologic Oncology 103(1): 12–17

10 Muñoz, N., Bosch, F X., de Sanjosé, S., Herrero, R., Castellsagué, X., Shah, K V., Snijders, P J., and Meijer, C J (2003) Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer N Engl J Med,348(6): 518- 527

11 Paek, S H., Lee, S H., Cho, J H., and Kim, Y S (2000) Development of rapid onestep immunochromatographic assay Methods 22(1): 53-60 12 Pinidis, P., Tsikouras, P., Iatrakis, G., Zervoudis, S., Koukouli, Z., Bothou, A., Galazios, G., and Vladareanu, S (2016) Human Papilloma Virus' Life

Cycle and Carcinogenesis Maedica (Bucur) 11(1): 48-54.

13 Qu, W., Jiang, G., Cruz, Y., Chang, C J., Ho, G Y., Klein, R S., and Burk, R D (1997) PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer systems J Clin Microbiol 35(6): 1304-1310.

14 Tsao, K., Huang, C., Kuo, Y., Chang, T., Sun, C., Chang, C A., Yang, S., and Chan, E (2010) Prevalence of human papillomavirus genotypes in northern Taiwanese women Journal of Medical Virology 82(10): 1739–1745

15 Vince, A., Kutela, N., Iščić-Beš, J., Harni, V., Ivanišević, M., Sonicki, Z., Čulig, Z., and Poljak, M (2002) Clinical utility of molecular detection of human 16 papillomavirus in cervical samples by hybrid capture technology Journal of Clinical Virology.

16 Yu, L., Majerciak, V., and Zheng, Z M (2022) HPV16 and HPV18 Genome Structure, Expression, and Post-Transcriptional Regulation Int J Mol Sci 23(9).

11

CHÂN THÀNH CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE!