Nghiên cứu hoạt tính sinh học và phân lập hợp chất saponin từ cao chiết ethanol của rễ cây phát lộc

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ THỊ NGÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT SAPONIN TỪ CAO CHIẾT ETHANOL CỦA RỄ CÂY PHÁT LỘC Dracaena braunii Engl.L

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ THỊ NGÀ

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT SAPONIN TỪ CAO CHIẾT ETHANOL CỦA RỄ

CÂY PHÁT LỘC (Dracaena braunii Engl.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT SAPONIN TỪ CAO CHIẾT ETHANOL CỦA RỄ

CÂY PHÁT LỘC (Dracaena braunii Engl.)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Nguyễn Đức Hùng và TS Nguyễn Thị Hải Yến, và sự hợp tác trong nghiên cứu với Phòng thí nghiệm Dược liệu học, Trường Đại học Bourgogne Franche-Comté, Cộng hòa Pháp Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2023

Tác giả luận văn

Lê Thị Ngà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Hùng

và TS Nguyễn Thị Hải Yến đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc

sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, và tập thể cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Dược liệu học, Trường Đại học Bourgogne Franche-Comté, Cộng hòa Pháp đã hỗ trợ

và giúp đỡ tôi trong nghiên cứu phân lập các hợp chất

Sau cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên, đóng góp ý kiến, giúp đỡ tôi trong quá trình học tâp, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2023

Tác giả luận văn

Lê Thị Ngà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Huyết giác (Dracaena) 3

1.1.1 Chi Huyết giác (Dracaena) 3

1.1.2 Cây Phát lộc (Dracaena braunii Engl.) 4

1.2 Sơ lược về hợp chất saponin 4

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu phân lập hợp chất thiên nhiên 6

1.3.1 Nhóm phương pháp thu thập, tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết 6

1.3.2 Phân tích thành phần hóa học bằng phản ứng định tính 7

1.3.3 Đánh giá hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu thực vật 8

1.3.4 Nhóm phương pháp tách chiết, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin 9

1.4 Tình hình nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất saponin từ một số loài thuộc chi Huyết giác 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.1.1 Vật liệu thực vật 24

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 24

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp giải phẫu thực vật 25

2.2.2 Phương pháp tạo cao chiết từ rễ cây Phát lộc 25

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ rễ cây Phát lộc 25

2.2.4 Phương pháp tách chiết thành phần saponin từ rễ cây Phát lộc 25

2.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả về đặc điểm hình thái, giải phẫu của cây Phát lộc 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Phát lộc 27

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của cây Phát lộc 28

3.2 Kết quả về tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết từ rễ cây Phát lộc 31

3.3 Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất saponin từ cao chiết ethanol của rễ cây Phát lộc 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Kiến nghị 41

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Diễn giải tiếng Việt 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon 13 1D NMR One dimensional nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

chiều 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton 2D NMR Two dimensional nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2

chiều APG Angiosperm Phylogeny Group Hệ thống phân loại sinh học

thực vật

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác proton-proton

DMSO Dimethyl sulfoxide

ESI-MS Electrospray Ionisation Mass

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng trung

bình

ROESY Rotating Frame Overhauser

Enhancement Spectroscopy

Quang phổ Overhauser khung

xoay nâng cao

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

TOCSY Total Correlated Spectroscopy Phổ tương tác proton-proton

toàn phần

VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký lỏng chân không

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol của rễ cây Phát lộc 31 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 1 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh của một số loài thuộc chi Huyết giác 3

Hình 1.2 Hình ảnh loài Phát lộc 4

Hình 1.3 Saponin steroid khung spirostane (a) và khung furostane (b), và saponin triterpenoid (c) 5

Hình 1.4 Các hợp chất saponin steroid phân lập từ loài D draco 17

Hình 3.1 Cây Phát lộc thu tại thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên 28

Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang rễ cây Phát lộc 29

Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây Phát lộc 30

Hình 3.4 Giải phẫu cắt ngang thân cây Phát lộc 31

Hình 3.5 Hình ảnh kháng khuẩn của cao chiết ethanol của rễ cây Phát lộc đối với các chủng vi khuẩn 32

Hình 3.6 Sắc ký bản mỏng của hợp chất 1 (DBR22b-5) 34

Hình 3.7 Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1 34

Hình 3.8 Phổ NMR 13C tổng của hợp chất 1 35

Hình 3.9 Phổ NMR 1H tổng của hợp chất 1 35

Hình 3.10 Phổ NMR HSQC tổng của hợp chất 1 36

Hình 3.11 Phổ NMR COSY tổng của hợp chất 1 37

Hình 3.12 Phổ NMR HMBC tổng của hợp chất 1 38

Hình 3.13 Phổ NMR TOCSY tổng của hợp chất 1 39

Hình 3.14 Phổ NMR ROESY tổng của hợp chất 1 39

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 40

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thực vật được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trên toàn thế giới và các loại thuốc mới tiếp tục được phát triển dựa trên những nghiên cứu mới nhất của các loài thực vật Newman và Cragg (2012) đã phân tích tầm quan trọng của các loại thuốc ngăn ngừa khối u ở người trên thế giới từ năm 1940-2010 Theo đó, vị trí của các hợp chất thiên nhiên trong sự phát triển các loại thuốc là không thể phủ nhận, đặc biệt là trong lĩnh vực điều trị ung thư với nhiều loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên hoặc dẫn xuất từ tự nhiên Cùng với sự phát triển của y học hiện đại, nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh mẽ đã được tìm ra Là hợp chất được tìm thấy phần lớn trong thực vật, saponin có khả năng tạo bọt trong môi trường lỏng Trong thực vật, saponin hiện diện ở hầu hết các

bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, lá, hoa và hạt Nhiều nghiên cứu đã chứng minh saponin có các hoạt tính sinh học mạnh mẽ như chống viêm nhiễm, kháng ung thư, kháng vi khuẩn, ngăn ngừa các bệnh tim mạch và tăng cường hấp thụ

Cây Phát lộc (Dracaena braunii Engl.) là một loài thuộc chi Huyết giác (Dracaena), họ Măng tây (Asparagaceae) Chi Huyết giác gồm 153 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như châu Phi và châu Á Cây Phát lộc (Dracaena

braunii Engl.), tên đồng nghĩa Dracaena sanderiana Sander, là một loài cây cảnh có thể

được tìm thấy rộng rãi ở châu Phi và châu Á Tại Việt Nam, loài cây này phân bố nhiều ngoài tự nhiên và được trồng trong nhà với mục đích làm cảnh Đây một loài thuộc chi Huyết giác vốn đã được biết tới là nguồn các hợp chất sinh học có hoạt tính sinh học mạnh mẽ Nghiên cứu dịch chiết ethanol của loài cây này đã chứng minh khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào về xác định các hợp chất hóa học của cây Phát lộc, cũng như đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đó, nhất là khi loài cây này có thể được tìm thấy dễ dàng ngoài tự nhiên Do đó, việc tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này là rất cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn nhằm tìm ra các hợp chất mới có đặc tính dược học, làm cơ

sở cho việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và phân lập hợp chất saponin từ cao chiết ethanol của rễ cây

phát lộc (Dracaena braunii Engl.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích được đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài phát lộc

- Đánh giá được hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol của rễ cây phát lộc

- Phân lập và xác định được cấu trúc của hợp chất saponin từ cao chiết ethanol của

rễ cây phát lộc

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài phát lộc

- Tạo cao chiết ethanol của rễ cây phát lộc

- Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol của rễ cây phát lộc

- Phân lập và xác định được cấu trúc của hợp chất saponin từ cao chiết ethanol của

rễ cây phát lộc

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Huyết giác (Dracaena)

1.1.1 Chi Huyết giác (Dracaena)

Chi Huyết giác (danh pháp khoa học: Dracaena, đồng nghĩa Pleomele, là một chi

khoảng 153 loài cây thân gỗ hoặc cây bụi dạng mọng nước trong họ Asparagaceae Trước đây, chi Huyết giác từng được xếp trong họ Tóc tiên (Ruscaceae) hoặc tách ra

cùng chi Huyết dụ (Cordyline) vào họ riêng của chính chúng là Dracaenaceae hay trong

họ Thùa (Agavaceae) Phần lớn các loài có nguồn gốc ở châu Phi và các đảo cận kề, với chỉ một ít loài có tại Nam Á và một loài tại khu vực nhiệt đới Trung Mỹ [33], [43] Ở

Việt Nam, chi Huyết giác bao gồm một số loài đã được tìm thấy như D conchinchinesis,

D cambodiana, D angustifolia, D draco, D fragrans, D braunii, D cinnabari, D surculosa, D deremensis, D elliptica, D gracillis Một số loài của chi Huyết giác được

sử dụng trong y học cổ truyền Phần lõi màu đỏ bên trong thân cây già đã phơi khô, sấy

hoặc cây đã chết của loài D cambodiana được sử dụng làm dược liệu chữa trị chấn

thương bị tụ máu, sưng bầm, bế kinh, tê môi, đau nhức xương khớp, u hạch, mụn nhọt

Phần lõi gỗ của loài D conchinchinesis có vị ngọt, tính bình, có tác dụng tiêu huyết ứ,

thông mạch, hoạt huyết, chỉ huyết, hạ nhiệt, chống thoát mồ hôi và chống bệnh scorbut

Theo đông y, phần rễ và hoa của loài D angustifolia có tính giải nhiệt, giải độc Nước

sắc lá dùng chữa lỵ, chữa bệnh bạch đới và bệnh lậu Kinh nghiệm dân gian dùng rễ và hoa trị lỵ ra máu Hoa sao vàng sắc đặc trị hen Lá giã nát, vắt lấy nước để nhuộm xanh bánh đúc [4]

Hình 1.1 Hình ảnh của một số loài thuộc chi Huyết giác [44]

Những loài thuộc chi Huyết giác thường là cây bụi, dạng gỗ nhỏ hoặc dạng gỗ; thân phân nhánh ít, trên thân thường có sẹo lá Lá mọc trên thân, thường tập trung ở

đỉnh, có cuống hoặc không; phiến lá hình dải, hình mũi giáo, dai, dày hoặc mỏng Cụm hoa chùm, chùy, bông hoặc chùm tán dạng đầu, mọc từ ngọn thân hoặc đầu cành Hoa đều, lưỡng tính, có cuống; lá bắc nhỏ Bao hoa 6 mảnh, phần dưới dính nhau ít nhiều thành ống, hình trụ, hình chuông, hình phễu phần trên của bao hoa có 6 thùy, xếp thành

2 vòng bằng nhau hoặc xếp thành 3 thùy trong dài hơn Hoa khi nở sẽ cong ra ngoài Quả mọng, hình cầu, 3 cạnh tù Hạt 1-3, hình cầu, vỏ hạt nạc, dày, phôi nhỏ, nội nhũ sừng [2]

1.1.2 Cây Phát lộc (Dracaena braunii Engl.)

Cây Phát lộc (Dracaena braunii Engl.), tên đồng nghĩa Dracaena sanderiana

Sander, được đặt theo tên của nhà làm vườn người Đức gốc Anh Henry Frederick Conrad Sander (1847–1920) Loại cây này đã trở thành loại cây trồng trong nhà phổ biến nhất ở một số vùng của Ấn Độ, nơi cây thường được nhập khẩu từ Trung Quốc và Đài Loan Tại Việt Nam, loài cây này phân bố rộng ngoài tự nhiên và được trồng trong nhà với mục đích làm cảnh

Hình 1.2 Hình ảnh loài Phát lộc;

Phát lộc là dạng cây bụi, cao 0,5-1 (1,5) m, thân không phân nhánh, đường kính 0,5-1 cm, thẳng, có nhiều lóng, dài 5-10 cm, có đốt Lá mọc cách trên thân, có cuống dài 5-10 cm, phía dưới dạng bẹ ôm lấy thân; phiến lá hình mũi giáo, kích thước 5-12 x 2-3 cm, màu xanh nhạt có sọc trắng dọc, chóp nhọn dài, gốc hình nêm [1] Đây là một loài thuộc chi Huyết giác vốn đã được biết tới là nguồn các hợp chất sinh học có hoạt tính sinh học mạnh mẽ [10], [20], [37] Nghiên cứu dịch chiết ethanol của loài cây này

đã chứng minh khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ [28]

1.2 Sơ lược về hợp chất saponin

Saponin, bắt nguồn từ tiếng Latin sapo (xà phòng), là một nhóm glycoside có khối lượng phân tử cao, bao gồm một nửa đường liên kết với phần aglycon là triterpene hoặc steroid Saponin dễ tan trong ethanol, methanol, butanol, nước và các hỗn hợp cồn nước, khó tan hoặc không tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực Saponin có thể được tìm thấy ở thực vật và động vật Ở thực vật, saponin được tìm thấy Một số loại thực vật

có chứa saponin đã được sử dụng hàng trăm năm để làm xà phòng như Saponaria

officinalis, Chlorogalum pomeridium, Quillaja saponaria, Sapindus saponaria, Sapindus mukurossi Saponin là thành phần của nhiều loại thuốc thực vật và thuốc dân

gian, đặc biệt là từ phương Đông Do đó, sự quan tâm lớn đã được thể hiện trong các đặc tính dược lý và sinh học của saponin

(c) Hình 1.3 Saponin steroid khung spirostane (a) và khung furostane (b),

và saponin triterpenoid (c) Saponin có thể được phân thành hai nhóm dựa trên bản chất của khung aglycon Nhóm đầu tiên bao gồm các saponin steroid, hầu như chỉ có trong thực vật hạt kín một

lá mầm Nhóm thứ hai bao gồm các saponin triterpenoid, phổ biến nhất và xuất hiện chủ yếu ở thực vật hạt kín hai lá mầm Các saponin steroid bao gồm một aglycon steroid, một khung spirostane gồm 27 carbon, thường bao gồm một cấu trúc sáu vòng (Hình 1.3a) Trong một số trường hợp, nhóm hydroxyl ở vị trí 26 tham gia vào liên kết glycosid, và do đó cấu trúc aglycon vẫn là 5 vòng Điều này được gọi là một khung furostane (Hình 1.3b) Các saponin triterpenoid bao gồm một aglycon triterpenoid, bao gồm một khung gồm 30 carbon có cấu trúc năm vòng (Hình 1.3c) Theo Haralampidis

và cộng sự (2002), người ta biết rất ít về các enzyme và con đường sinh hóa liên quan đến quá trình sinh tổng hợp saponin ở thực vật Nhóm nghiên cứu đã đánh giá quá trình sinh tổng hợp saponin triterpenoid và đề cập đến những tiến bộ gần đây trong hai lĩnh

vực chính của quá trình sinh tổng hợp saponin, đó là quá trình glycosyl hóa sapogenin

và quá trình tạo vòng của 2,3-oxidosqualene [11]

Các hoạt tính gây độc tế bào đã được mô tả đối với nhiều hợp chất saponin, và các nghiên cứu về chủ đề này vẫn tiếp tục xuất hiện từ những năm 1960 trở lại đây [8] Kể

từ đó, nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào và chống khối u của saponin đã được tiến hành [13], [17], [18], [29] Hợp chất này có thể hoạt động như các chất chống ung thư tiềm năng bằng cách ức chế sự hình thành tế bào ung thư hoặc bằng các tác dụng chống tăng sinh trực tiếp hoặc gây độc tế bào chống lại các tế bào ung thư [17], [18], [29] Hầu hết các nghiên cứu này được thực hiện trong môi trường ống nghiệm, và chỉ 10% trong số đó đã đạt đến giai đoạn tiền lâm sàng Điều thú vị là hầu hết các hợp chất đã được thử nghiệm trên chuột, và chỉ 24% các nghiên cứu được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư ở người Những nghiên cứu chính là dòng tế bào ung thư cổ tử cung (Hela), tế bào ung thư vú (MCF-7, MDA-MB43), tế bào ung thư gan (HepG2), tế bào gây bệnh bạch cầu nguyên bào (HL-60), tế bào ung thư đại trực tràng (Caco-2, HT-29, HCT116, SW480) [43]

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu phân lập hợp chất thiên nhiên

1.3.1 Nhóm phương pháp thu thập, tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết

a Thu thập, định danh loài Thiên môn ráng dựa trên đặc điểm hình thái so sánh

Tổ chức thu thập mẫu vật, mô tả đặc điểm hình thái, giải phẫu và một số thông tin

về phân loại học, sinh thái của Thiên môn ráng:

- Bước 1: Thiên môn ráng được tiến hành điều tra thực địa thu thập mẫu tiêu bản với đầy đủ các thông tin liên quan bao gồm: mẫu tiêu bản, ảnh màu, phân bố của loài, sinh thái

- Bước 2: Xác định tên khoa học của Thiên môn ráng theo phương pháp hình thái

so sánh, cụ thể như sau:

+ Tên khoa học của loài được xác định bằng phương pháp hình thái so sánh bằng cách sử dụng các sách chuyên khảo về phân loại thực vật của Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển 1 và 3; Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam; Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam; Umberto Quattrocchi (2012), CRC world dictionary of medicinal and poisonous plants; Christophe Wiart (2006), Ethnopharmacology of medicinal plants: Asia and the Pacific; Donald G Barceloux (2008), Medical toxicology of natural substances;…

+ Một số trang web để tra cứu mẫu type và các thông tin khác bao gồm:

http://www.tropicos.org/;

https://www.kew.org/science/collections/herbarium;

http://www.missouribotanicalgarden.org/;

http://www.worldfloraonline.org//;

b Xử lý mẫu thực vật

Mẫu nghiên cứu sau khi thu thập sẽ được thái nhỏ, phơi trong bóng mát và được sấy khô ở nhiệt độ 600C đến khối lượng không đổi Sau đó, mẫu nghiên cứu sẽ được nghiền nhỏ và chiết hồi lưu bằng phương pháp chiết xuất bằng dung môi EtOH/H2O 75%/35% có hỗ trợ vi sóng (600C, 200W, 30 phút) và/hoặc sóng siêu âm (30 phút) Dịch tổng sẽ được cất thu hồi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethanol

1.3.2 Phân tích thành phần hóa học bằng phản ứng định tính

a Cách tiếp cận

Mẫu thực vật sẽ được phân tách thành những phân đoạn nhỏ, sau đó dùng các phản ứng hóa học đặc trưng, bao gồm các phản ứng kết tủa và phản ứng tạo màu để nhận biết được các hợp chất có trong dịch chiết

b Phương pháp nghiên cứu

* Định tính alkaloid

Lấy một phần cặn chiết ethanol cho thêm 5 mL H2SO4 5%, lắc đều và lọc qua giấy lọc Chia đều dịch lọc qua 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL Nhỏ vào mỗi ống lần lượt các thuốc thử sau:

- Ống nghiệm 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff Nếu xuất hiện màu da cam thì trong ống nghiệm có alkaloid

- Ống nghiệm 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer Nếu xuất hiện kết tủa trắng thì trong ống nghiệm có alkaloid

* Định tính flavonoid

Lấy một phần cặn chiết ethanol cho thêm 10 mL CH3OH, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc Lấy 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg và nhỏ vào vài giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút Nếu dung dịch có màu từ vàng,

đỏ đến xanh thì trong ống nghiệm có flavonoid

ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có xuất hiện màu xanh ngọc bích thì trong ống nghiệm có terpenoid

* Định tính glycoside tim

Phản ứng Keller-Kilian: lấy một phần cặn chiết ethanol cho thêm 1 mL dung dịch

1 (100 mL acid acetic loãng + 1 mL FeCl3 5%), lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm

và nhỏ vào từ từ theo thành ống nghiệm 1 mL dung dịch 2 (100 mL H2SO4 đậm đặc + 1

mL FeCl3 5%) Nếu xuất hiện màu đỏ hay đỏ nâu giữa 2 lớp chất lỏng thì trong ống nghiệm có glycoside tim

* Định tính cumarin

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 mL dịch chiết Nhỏ 3 mL NaOH 10% vào ống nghiệm 1 Đun sôi cả 2 ống nghiệm rồi để nguội Quan sát thấy ống nghiệm 1 có kết tủa màu vàng, trong khi ống nghiệm 2 vẫn trong thì kết luận trong ống nghiệm 1 có cumarin

* Định tính saponin

Phản ứng tạo bọt: cho 0,5 g mẫu khô nghiền nhỏ vào trong ống nghiệm rồi cho thêm 5 mL nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Nếu xuất hiện bọt bền vững bên trong ống nghiệm thì kết luận có saponin

Phản ứng Salkowski: cho 2 g mẫu khô nghiền nhỏ vào trong ống nghiệm rồi cho thêm 6 mL EtOH, đun sôi khoảng 15-20 phút Lọc lấy dịch lọc và nhỏ vào 2 ống nghiệm

1 và 2 mỗi ống 3-5 giọt dịch lọc (ống nghiệm 1 chứa 5 mL HCl 0,1N và ống nghiệm 2 chứa 5 mL NaOH 0,1N) Quan sát hiện tượng bên trong 2 ống nghiệm: nếu độ bền của bọt bên trong ống nghiệm 2 bền hơn ống nghiệm 1 thì chứng tỏ mẫu nghiên cứu có chứa saponin steroid, ngược lại là saponin triterpene

1.3.3 Đánh giá hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu thực vật

a Cách tiếp cận

Mẫu thực vật sẽ được sấy ở nhiệt độ cao (100-105oC) cho tới khi khối lượng không đổi Sau đó, hàm lượng saponin toàn phần trong cây Thiên môn ráng sẽ được định lượng theo phương pháp Namba và cộng sự (1974) dựa trên sự phân cực của các dung môi khác nhau Saponin sẽ thu được dưới dạng toàn phần, sau đó được đem đi cân và tính khối lượng của saponin toàn phần trong nguyên liệu

b Phương pháp nghiên cứu

Hàm lượng saponin toàn phần được định lượng theo phương pháp của Namba và cộng sự: cân 5g mẫu khô cho vào bình Shoxlet chiết với 250 mL EtOH ở 90oC Quay cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethanol Hòa tan cặn chiết với 50 mL H2O Dung dịch được lắc với diethyl ether (20 mL x 5 lần), sau đó chắt bỏ lớp diethyl ether Lớp nước được lắc với n-BuOH (20 mL x 6 lần), sau đó chiết lấy lớp n-BuOH và rửa với nước cất 3 lần Dịch n-BuOH được cất thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm cho đến khi thu được cặn, làm khô bằng phương pháp đông khô chân không thu được saponin toàn phần Cân và tính khối lượng saponin toàn phần trong nguyên liệu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:

M = a

b x 100 Trong đó:

M: hàm lượng saponin toàn phần (%)

a: khối lượng saponin toàn phần (g)

b: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

1.3.4 Nhóm phương pháp tách chiết, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin

a Phương pháp tách chiết hợp chất saponin từ cây Thiên môn ráng bằng sắc ký

* Cách tiếp cận

Cặn chiết là một hỗn hợp bao gồm nhiều hợp chất khác nhau về đặc tính hóa học, vật lý và sinh học Để thu được hợp chất đơn tinh khiết thì cần phối hợp sử dụng nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, đặc biệt là phương pháp sắc ký Việc lựa chọn được phương pháp sắc ký thích hợp, thiết lập được hệ dung môi phù hợp với mục đích tách chất đơn tinh khiết là điều kiện rất quan trọng để đạt được mục tiêu đề ra Do đó, chúng tôi sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau, phối hợp sử dụng đồng thời pha đảo

và pha thuận để tách được hợp chất đơn tinh khiết

* Phương pháp nghiên cứu

Một số phương pháp sắc ký sẽ được sử dụng để tách chiết và phân lập saponin từ cặn chiết ethanol và thu được saponin tinh khiết bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc

ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng chân không (VLC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký lỏng hiệu năng trung bình (MPLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Pha tĩnh được sử dụng trong các phương pháp sắc ký là pha thuận silical gel 60 và pha đảo silica gel RP-18

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thuận 60 (Merck, 15–40 μm) và silica gel pha đảo RP-18 (Silicycle, 75–200 μm) Sắc ký lớp mỏng sẽ được đặt dưới đèn UV 254 nm trước khi nhuộm màu Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một dạng tăng cường của sắc ký lớp mỏng (TLC) Nguyên lý hoạt động của HPTLC tương tự như TLC Pha động được sử dụng là: CHCl3/MeOH/H2O 85/15/2; 75/25/3; 70/30/5; 65/31/6; 60/32/7

- Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được thực hiện trên cột thủy tinh chịu lực Cột được lấp đầy bởi pha tĩnh (Sephadex LH-20, Silica gel pha thường và pha đảo) và được rửa giải bằng các dung môi khác nhau Dịch chiết thô sẽ được hòa tan trong một lượng EtOH tối thiểu và được bơm vào cột Chất rửa giải được thu thập dưới dạng các phân đoạn Các phân đoạn thường được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng để đánh giá việc tách các thành phần có thành công hay không Pha động được sử dụng là MeOH 100%, EtOH 100%

- Sắc ký lỏng chân không (VLC)

Sắc ký lỏng chân không được được thực hiện trên phễu lọc và bình lọc hút chân không để tăng tốc độ của dòng dung dịch rửa giải VLC chủ yếu được sử dụng để phân đoạn các hỗn hợp chất ban đầu trước khi thực hiện các bước tách phân đoạn khác như MPLC và HPLC Pha tĩnh được làm sạch bằng MeOH và cân bằng bằng dung môi rửa giải Các phân đoạn sau đó sẽ được thu thập với các tỷ lệ dung môi khác nhau Pha tĩnh được sử dụng là Silica gel pha thường (60 Å, 15-40 µm, Merck) và pha đảo (RP-18 Spherical C18, 300 Å, 75-200 µm, Silicycle) Pha động được sử dụng là CHCl3/MeOH/H2O 75/25/3; 70/30/5, 60/32/7 (pha thuận) và MeOH/H2O 0/1, 1/1, 1/0; EtOH/H2O 0/1, 1/1, 1/0 (pha đảo)

- Sắc ký lỏng hiệu năng trung bình (MPLC)

Sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC) là một trong những kỹ thuật sắc ký cột, trong đó mẫu sẽ được phân đoạn nhỏ hơn dưới áp suất MPLC cho phép tinh sạch số lượng hợp chất lớn, phân đoạn nhanh hơn và tinh sạch chất lượng hơn Pha tĩnh được sử dụng là silica gel pha thường (60 Å, 15-40 µm, Merck) và pha đảo (RP-18 Spherical C18, 300 Å, 75-200 µm, Silicycle) Pha động được sử dụng là CHCl3/MeOH/H2O 75/25/3; 70/30/5, 60/32/7 (pha thuận) hoặc MeOH/H2O (20/80, 30/70, 40/60, 50/50)

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là kỹ thuật hữu ích hơn được sử dụng để phân tích các chất dưới áp suất tối

đa 300 bar ở chế độ phân tích và 100 bar ở chế độ bán điều chế Kỹ thuật này được áp dụng để phân lập, tách và tinh sạch các hợp chất trong một hỗn hợp, cũng như để hiển thị các mối quan hệ thực vật giữa các loài khác nhau dựa trên sự so sánh sắc ký giữa thành phần hóa học của chúng Pha tĩnh được sử dụng là Column Luna 5μ C18(2) 100

Å, 250 x 4.6 mm, 5 μm, 1mL/min Pha động được sử dụng là Acetonitrile-H2O (TFA 0.01%)

- Thuốc thử

Thuốc thử vanilin sulfuric: hỗn hợp bao gồm 1 g vanilin, 2 mL axit sulfuric và 100

mL EtOH 95% Sau khi được ngâm trong bể có chứa thuốc thử, các sắc ký lớp mỏng này được làm khô ở 110° C trong vài phút Một số màu sắc xuất hiện tùy thuộc vào loại hợp chất Saponin thường hiện chủ yếu màu xanh lá cây trên sắc ký bản mỏng

b Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất saponin phân lập được từ mẫu thực vật

* Cách tiếp cận

Quá trình xác định cấu trúc của một chất yêu cầu phải tập hợp và phân tích nhiều nguồn dữ liệu khác nhau Cấu trúc của chất được xác định phải phù hợp với tất cả thông tin từ các nguồn dữ liệu Hiện nay, cấu trúc của hợp chất hữu cơ được xác định bằng việc sử dụng nhiều phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS), phổ tử ngoại/khả kiến (UV/Vis)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1D & 2D NMR), kết hợp với phổ khối lượng (ESI-MS) để xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được Đồng thời, các phân tử đường trong chuỗi oligosaccarit của hợp chất sẽ được xác định bằng phương pháp thủy phân axit và phân tích sắc ký khí [13] Mỗi hợp chất tinh khiết sẽ được thủy phân và sau đó được phân tích bằng TLC tráng silica gel bằng cách so sánh với các mẫu chuẩn Ngoài ra, dư lượng đường sẽ được phân tích bởi sắc ký khí Cấu hình tuyệt đối của hợp chất sẽ được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu với các dẫn xuất thiazolidine được điều chế theo cách tương tự từ đường chuẩn thương mại

* Phương pháp nghiên cứu

- Phổ khối lượng (ESI-MS)

Phổ khối lượng thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của hợp chất nghiên cứu, bằng cách sử dụng từ trường và điện trường để bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ thành các ion phân tử hoặc các mảnh ion mang điện tích trong chân không Dựa trên số khối của ion phân tử M+, công thức phân tử của hợp chất có thể xác định được Phổ khối lượng HR-ESI-MS and ESI-MS của các hợp chất saponin phân lập được

sẽ được đo trên máy Bruker micrOTOF II mass spectrometer

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1D & 2D NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hữu hiệu nhất hiện nay Cấu trúc của các hợp chất, cũng như là cấu trúc lập thể của phân tử có thể được xác định bằng việc sử dụng các kỹ thuật phổ NMR 1 chiều và 2 chiều Nguyên lý của phương pháp này là sự cổng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ

1H và 13C dưới tác dụng của từ trường ngoài và được hiển thị bằng độ dịch chuyển hóa

học (δ) và hằng số tương tác spin – spin (J) Phương pháp phổ NMR 1 chiều bao gồm

1H và 13C, trong khi phương pháp phổ NMR 2 chiều bao gồm HSQC, HMBC, COSY, TOCSY, ROESY

- Phổ proton 1H-NMR:

Độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton trong phổ proton 1H-NMR được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của các nguyên tử cũng như cấu trúc hóa học của phân tử Độ dịch chuyển hóa học của mỗi loại

proton là khác nhau do chúng ở trong các từ trường khác nhau Cấu trúc hóa học của hợp chất được xác định bằng những thông tin từ độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin – spin

Theo dữ liệu từ các nghiên cứu trước đây, một hợp chất saponin thường có 3 vùng dịch chuyển hóa học:

+ Từ 0,5 ppm đến 3 ppm: các proton của aglycon, thường là các nhóm metyl, metylen và metan

+ Từ 3 ppm đến 4,5 ppm: các proton của phân tử đường, ngoại trừ các anomer + Từ 4,5 ppm đến 6 ppm: các anomer của phân tử đường (proton H-1) có tín hiệu thường có dạng doublet rộng hoặc singlet, và các proton etyl của aglycon

- Phổ cacbon 13C-NMR:

Phổ cacbon 13C-NMR hiển thị các tín hiệu về vạch cacbon Các nguyên tử cacbon

sẽ cộng hưởng ở các từ trường khác nhau và hiển thị tín hiệu phổ khác nhau Thang đo TMS của phổ cacbon 13C-NMR có độ rộng từ 0 ppm đến 240 ppm

Tương tự như phổ proton 1H-NMR, vùng dịch chuyển hóa học của một hợp chất saponin trên phổ proton 13C-NMR được chia thành 3 vùng:

+ Từ 10 ppm đến 60 ppm: các cacbon của aglycon

+ Từ 60 ppm đến 90 ppm: các cacbon của phân tử đường (ngoại trừ anomer) và một số cacbon hydroxyl của aglycon

+ Từ 90 ppm đến 110 ppm: các cacbon của anomers

+ Từ 110 ppm trở lên: các cacbon ethy, cacbon của axit cacbonxylic, andehyt, ester

và keton

- Phổ NMR HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation):

Phổ HSQC cho biết sự liên quan trực tiếp giữa tín hiệu proton và cacbon, cho phép xác định sự chuyển dịch hóa học của các nhóm metyl, metylen và metan

- Phổ NMR HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation):

Dữ liệu từ phổ HMBC thể hiện tương tác xa (2 khớp nối và 3 khớp nối) giữa cacbon

và proton trong phân tử Dạng phổ này rất hữu ích trong việc xác định cấu trúc của aglycon, trình tự của các phân tử đường trong chuỗi oligosaccarit và vị trí gắn chuỗi này vào aglycon

- Phổ NMR COSY (Correlated Spectroscopy):

Phổ COSY hiển thị các tương tác giữa proton – proton (2 khớp nối geminal hoặc

3 khớp nối vicinal) Dạng phổ này dùng để xác định cấu trúc của các phân tử đường, đồng thời để kiểm tra các vị trí của proton trên aglycon

- Phổ NMR TOCSY (Total Correlation Spectroscopy):

Phổ TOCSY hiển thị tất cả các liên kết của proton trong cùng một hệ spin Tương

tự như phổ COSY, dạng phổ này cũng dùng để xác định cấu trúc của các phân tử đường, đồng thời để kiểm tra các vị trí của proton trên aglycon

- Phổ NMR ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy):

Phổ ROESY hiển thị các tương tác không gian của các proton mà không tính đến

độ dài của các liên kết Dựa vào kết quả của phổ ROESY để xác định cấu trúc không gian của phân tử, cũng như là kiểm tra các kết quả của phổ HMBC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Varian INOVA 600 (Agilent Technologies) tại tần số hoạt động 600 MHz Điều kiện vận hành sẽ được thực hiện như sau:

+ Phổ proton 1H: bước sóng 600 MHz, chiều rộng quét 8 kHz, điểm lấy mẫu 66k, chiều rộng phổ 7804 Hz, tích tu 32 xung, nhiệt độ 304 K

+ Phổ cacbon 13C-NMR: bước sóng 150 MHz, chiều rộng quét 32 kHz, điểm lấy mẫu 160k, chiều rộng phổ 30000 Hz, tích tu 8000 xung, nhiệt độ 304 K

+ Với phổ 2 chiều NMR (HSQC, HMBC, COSY, TOCSY, ROESY): thời gian pha trộn trong thí nghiệm ROESY được thiết lập ở mức 500 ms Phổ TOCSY thu được bằng cách sử dụng trình tự khóa spin MLEV17 tiêu chuẩn và thời gian trộn 60 ms Phổ TOCSY, ROESY và HSQC được ghi lại bằng chế độ phasesensitive Kích thước của

ma trận dữ liệu thu nhận tương ứng là 2048 × 256 ở F2 và F1, và không lấp đầy đến 2k trong F1 đã được thực hiện trước khi biến đổi Fourier Các chức năng cửa sổ hình sin hoặc chuông hình sin, với sự thay đổi tương ứng được tối ưu hóa cho mọi phổ, được sử dụng để nâng cao độ phân giải và hiệu chỉnh đường cơ sở được áp dụng trong

cả hai chiều

+ Pyridine-d 5 được sử dụng là chất nội chuẩn, sử dụng ống mẫu vi mô 5 mm Độ

dịch chuyển hóa học sẽ được tham chiếu với tín hiệu của pyridine-d 5 (δH 7.22, δC 123.8)

* Phương pháp thủy phân axit và phân tích sắc ký khí

Các phân tử đường trong chuỗi oligosaccarit của hợp chất saponin sẽ được xác định theo các bước sau đây:

3 mg mẫu tinh khiết sẽ được thủy phân với 5 mL 2N aq CF3COOH trong 3 giờ ở nhiệt độ 95oC Sau khi được chiết bằng CH2Cl2 (3 x 5 mL), lớp nước được làm bay hơi nhiều lần cho đến khô bằng MeOH, sau đó được phân tích bằng TLC trên silical gel (dung môi sử dụng là CHCl3/MeOH/H2O) bằng cách so sánh với các mẫu xác thực.Phần đường còn lại được hòa tan trong 100 mL anhydrous pyridine, sau đó bổ sung 0,06 mol/L ester hydrochloride Hỗn hợp sẽ được khuấy ở nhiệt độ 60oC trong vòng 1 giờ, sau đó bổ sung 150 µL hexamethyldisilazane/trimethylchlorosilane 3:1 Hỗn hợp tiếc tục được khuấy ở nhiệt độ 60oC trong vòng 30 phút Phân kết tủa sẽ được ly tâm và phần nổi phía trên sẽ được cô đặc dưới dòng N2 Phần cặn sẽ được chiết phân đoạn lần lượt

bằng 1 mL n-hexane và 1 mL H2O Sau đó, 1 µL phần hexane sẽ được phân tích bởi sắc

ký ga (GC) Cấu hình tuyệt đối sẽ được chứng minh bằng cách so sánh thời gian lưu (retention time) với các dẫn xuất thiazolidine được điều chế theo cách tương tự từ đường chuẩn

c Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất saponin phân lập được

từ mẫu thực vật

* Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu

diệt các tế bào ung thư trong điều kiện môi trường nhân tạo in vitro

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các dòng tế bào ung thư được cung cấp bởi trung tâm ACCC, Hoa Kỳ (American Type Culture Collection), nhằm đánh giá hoạt

tính gây độc tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư của các saponin phân lập

được và được thực hiện theo phương pháp của Cory (1991) [29] Sử dụng muối tetrazolium (MTS - (5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyl-thiazoly)-3-(4-sulfophenyl) tetrazolium) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTS sẽ biến đổi thành màu tím formazan

Các hợp chất saponin phân lập được từ cây Thiên môn ráng sẽ được tiến hành thử

hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư theo các bước sau :

- Lựa chọn dòng tế bào ung thư để tiến hành thử nghiệm

- Tế bào ung thư được nuôi cấy với mật độ 5x103 tế bào trên đĩa 96 giếng (Falcon), được ủ trong thời gian 48 giờ trước khi xử lý trong môi trường RPMI 1640 (Corning)

có bổ sung FBS 10% (Dutcher) Các tế bào sau đó sẽ được đánh giá với các hợp chất phân lập được với các nồng độ từ 1 tới 50 µM trong thời gian 36 giờ với môi trường không có FBS (200 µL/ giếng) được sử dụng làm đối chứng Khả năng sống của tế bào

sẽ được đánh giá bằng phương pháp so màu MTS Cụ thể, 20 µL chất thử MTS sẽ được thêm vào mỗi giếng và mật độ quang (Optical density - OD) sẽ được đọc bằng các sử dụng đầu đọc vi tấm (Spark®, Tecan) ở bước sóng 490 nm trên máy quang phổ sau 1 giờ

- Fluorouracil (5-FU) sẽ được sử dụng làm đối chứng dương và được thử nghiệm

ở các nồng độ 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM và 50 µM FBS 10% được sử dụng làm đối chứng âm Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và các giá trị trung bình được tính toán Kết quả tính được là phần trăm ức chế thể hiện bằng sự giảm hấp thụ của các mẫu được xử lý với chất thử so với đối chứng không được xử lý với chất thử Đường cong theo nồng độ được xây dựng và nồng độ gây ức chế 50% tế bào (IC50) được xác định cho mỗi hợp chất Chất thử có giá trị IC50 < 20µM được coi là có hoạt tính gây độc tế bào

vi khuẩn được quan sát thấy sau khi ủ ở 28 °C trong hai ngày Mức độ kháng khuẩn được xác định bằng đường kính (mm) của các vùng ức chế xung quanh giếng

* Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết hoặc hợp chất saponin phân lập được từ Thiên môn ráng được xác định theo phương pháp của Tabart et al (2009) sử dụng α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) thu nhặt các gốc tự do Sử dụng 100 µL dịch chiết ở

5 thang nồng độ gồm 0,5, 2, 8, 32 và 64 µg/mL, thêm vào 2,9 mL dung dịch DPPH 0,1

mM trong metanol, lắc và đặt trong tối 30 phút, ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm Sự ức chế gốc tự do của các mẫu thí nghiệm được tính theo công thức sau: Hoạt độ DPPH (%) = 100 × (Ac - As)/Ac, trong đó Ac: độ hấp thụ đối chứng, As: độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm Hoạt tính kháng oxy hóa là được xác định dựa trên EC50

giá trị (nồng độ của các mẫu thu nhặt gốc tự do DPPH là 50%)

1.4 Tình hình nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất saponin từ một số loài thuộc chi Huyết giác

Phân tích dữ liệu từ bộ cơ sở dữ liệu khoa học trên hệ thống SciFinder, Elsevier, Pubmed cho thấy, nghiên cứu thành phần hóa học tách chiết từ chi Huyết giác

(Dracaena) đã được tiến hành từ năm 1980, trong đó có một số nghiên cứu về tách chiết

hợp chất saponin từ chi thực vật này Cụ thể, năm 1999, Mimaki và cộng sự đã nghiên

cứu và phân lập được 9 hợp chất saponin từ phần trên mặt đất của loài D draco, bao

gồm (25R)-spirost-5-ene-3-ol

3-O-{O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)--D-glucopyranoside} (1), spirosta-5,25(27)-diene-1,3-diol rhamnopyranosyl-(1→2)-O-α-L-arabinopyranoside} (2), (23S)-spirosta-5,25(27)-

1-O-{O-α-L-diene-1,3,23-triol

(23S,24S)-spirosta-α-L-arabinopyranoside} (7), (23S)-spirosta-5,25(27)-diene-1,3,23-triol rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside} (8), (23S)-spirosta-5,25(27)-diene-

1-O-{O-α-L-1,3,23-triol

1-O-{O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside} (9) (Hình 1.4) Kết quả đánh giá hoạt tính kiểm soát quá trình tăng

sinh của các hợp chất saponin này trên dòng tế bào gây bệnh bạch cầu nguyên bào ở

người HL-60 cho thấy, các hợp chất saponin 1 và 5 có hoạt tính kiểm soát quá trình tăng

sinh tế bào mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 1,3 và 2,6 µg/mL so với đối chứng là etoposide IC50 = 0,3 µg/mL (Hình 1.4) [20]

7 8

9

Hình 1.4 Các hợp chất saponin steroid phân lập từ loài D draco

Năm 2000, Yokosuka và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất saponin từ loài D

surculosa thu hái tại Nhật Bản, bao gồm surculoside A (10), surculoside B (11),

surculoside C (12),

(25S)-1-[(-D-glucopyranosyl)oxy]-3-hydroxy-22α-methoxyfurost-5-en-26-yl -D-glucopyranoside (13),

(25R)-17α-hydroxyspirost-5-en-3-yl O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)--D-glucopyranoside (14), hydroxyspirost-5-en-3-yl O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[α-L-rhamnopyranosyl-

(25R)-17α-(1→4)]--D-glucopyranoside (15), (25S)-3-hydroxyspirost-5-en-1-yl

O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)--D-fucopyranoside (16), fucopyranosyl)oxy]-3-hydroxy-22R-methoxyfurost-5-en-26-yl -D-glucopyranoside

(25S)-1-[(-D-(17),

(25S)-3-hydroxy-22R-methoxy-1-[(2-O-α-L-rhamnopyranosyl--D-fucopyranosyl)oxy]furost-5-en-26-yl -D-glucopyranoside (18) Năm 2002, Yokosuka

và cộng sự tiếp tục tiến hành phân lập hợp chất saponin steroid từ loài thực vật này, kết

quả thu được 4 hợp chất mới có cấu trúc là

saponin 15-17 có hoạt tính kiểm soát quá trình tăng sinh tế bào với giá trị IC50 lần lượt

là 5,2; 4,2 và 8,7 µg/mL so với đối chứng là etoposide IC50 = 0,22 µg/mL [46], [47]

Trong nghiên cứu của González và cộng sự (2003) trên loài D draco thu thập tại

đảo Canary, 11 hợp chất saponin steroid đã được phân lập từ thân của loài thực vật này,

bao gồm draconin A (24), draconin B (25), draconin C (26),

methoxy-(25R)-

furost-5-en-3,26-diol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)][α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]--D-glucopyranoside, methyl protodioscin) (33),

(23S,24S)-spirosta-5,25(27)-diene-1,3,23,24-tetrol

1-O-{O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside} 24-O--D-fucopyranoside (34) Kết quả đánh giá hoạt tính gây

độc trên dòng tế bào gây bệnh bạch cầu nguyên bào ở người HL-60 của 10 hợp chất

phân lập được (24-33) cho thấy, hợp chất 24, 27, 29-31 có hoạt tính mạnh với giá trị

IC50 lần lượt là 9,7; 2,0; 7,2; 3,7; 7,3 µM, trong khi hợp chất 25 có hoạt tính yếu hơn với

giá trị IC50 là 39,0 µM [9] Cũng quan tâm đến các hợp chất thiên nhiên của loài D

draco, Hernández và cộng sự (2006) đã phân lập được 19 hợp chất, trong đó có 1 hợp

chất saponin steroid từ lá của loài thực vật này Hợp chất saponin này được xác định là

icodeside (35) Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư HL-60, A-431, Hela và SK-OV-3 cho thấy, hợp chất 35 có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào ung

thư HL-60 và A-431, và có hoạt tính yếu hơn trên dòng tế bào ung thư Hela và

(39) [25] Năm 2008, Tapondjou và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất saponin steroid

từ thân loài D mannii, bao gồm mannioside A (40), floribundasaponin A (41),

spiroconazole A (42) Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy, hợp chất 40 và 41 có tác

dụng ức chế mạnh và hợp chất 42 có tác dụng ức chế trung bình đối với bệnh phù nề

bàn chân do carrageenan gây ra ở chuột cống [40] Từ thân và cành của 2 loài D

deisteliana và D arborea, Kougan và cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất saponin

steroid bao gồm diosgenin deistelianoside A (43), deistelianoside B (44),

arboreasaponin A (45), arboreasaponin B (46), neoruscogenin

1-O-α-L-arabinopyranoside (47), neoruscogenin

1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[-D-xylopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranoside (48), neoruscogenin

1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside (49), floribundasaponin A (50), manioside A (51), spiroconazole A (52) Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc trên dòng

tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 và HCT 116 cho thấy, hợp chất 52 có tác dụng ức

chế với giá trị IC50 lần lượt là 1,67 và 2,04 µM khi so sánh với đối chưng dương là paclitaxel với giá trị IC50 lần lượt là 3,21 và 1,49 nM, trong khi các hợp chất 44, 45, 48

và 51 có tác dụng ức chế yếu với các dòng ung thư trên [16]

Cũng trong năm 2010, Xu và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất saponin steroid

từ thân tươi loài D angustifolia, bao gồm angudracanoside A (53), angudracanoside B

(54), angudracanoside C (55), angudracanoside D (56), angudracanoside E (57),

angudracanoside F (58),

(25R)-ruscogenin-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-4-O-sulfo--D-arabinopyranoside (59), 1,3,22,26-tetrol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O--D-xylopyranosyl-(1→3)-

26-O--D-glucopyranosylfurosta-5-ene-α-L-arabinopyranoside (60),

(25S)-ruscogenin-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O--D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosde (61), terreside (62), alliospiroside A (63) Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp chất saponin trên đối với

chủng nấm Candida albicans, C glabrata, C krusei, Cryptococcus neoformans, và

Aspergillus fumigatus cho thấy, hợp chất 59 và 60 có hoạt tính mạnh kháng chủng nấm

C neoformans với giá trị IC50 lần lượt là 9,5 và 20,0 μg/mL khi so sánh với đối chứng dương là Amphotericin B với giá trị IC50 là 2,5 μg/mL [23] Năm 2013, Huang và cộng

sự tiếp tục nghiên cứu và phân lập được 2 hợp chất saponin steroid khác từ loài D

angustifolia là

3-O-{α-L-rhamnopyranoside(1→2)-O-[α-L-rhamnopyranoside(1→3)]-β-D-glucopyranosyl} spirost-5-ene-1β,3β-diol (64), spirost-5-ene-1,3-diol 3-O-[α-L-rhamnopyranoside (1→2)-β-D-glucopyranosyl] (65)

(1,3,22R,25S)-Hợp chất 64 có hoạt tính kháng viêm mạnh và ức chế tạo anion superoxide và giải phóng

elastase với giá trị IC50 lần lượt là 18,55 μM và 1,74 μM khi so sánh với đối chứng dương là LY294002 có giá trị IC50 lần lượt là 2,00 μM và 4,94 μM [14]

Cũng quan tâm đến các hợp chất hóa học của các loài thuộc chi Dracaena, Rezgui

và cộng sự (2013) đã phân lập được 11 hợp chất saponin steroid từ thân và rễ của loài

D marginata Cấu trúc của các hợp chất này được xác định là

(25S)-26-(β-D-glucopyranosyloxy)-3β,22α-dihydroxyfurost-5-en-1β-yl

O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside (66),