TỔNG QUAN
Giới thiệu chung về chất kháng sinh
1.1.1 Lịch sử phát hiện chất kháng sinh:
Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại về chất kháng sinh của Alexander Fleming (1982) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệsản xuất chất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sửdụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác
Liên tiếp sau đó là những phát hiện khác của: Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng
Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại trực khuẩn này
Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn
Mặc dù vậy, trong thực tế mãi tới năm 1929 thuật ngữ "Chất kháng sinh" mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về Penicillin
- Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn
- Theo quan niệm truyền thống kháng sinh được định nghĩa là những chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn Ngày nay kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi, hiện nay kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp nhất có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh
- Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động là các thành phần cấu tạo cơ bản của tế bào vi khuẩn và phát huy tác dụng: kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, đặc biệt có hiệu quả ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phát triển mạnh, bằng cách:
+ Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: các kháng sinh nhóm beta-lactam, fosfomycin và vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo được khung murein - tức là vách không được hình thành Tế bào con sinh ra không có vách, vừa không sinh sản được vừa dễ bị tiêu diệt hoặc bị li giải, đặc biệt ở vi khuẩn Gram-dương Như vậy, những kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn nhưng chỉ với những tế bào đang phát triển (degenerative bactericide)
+ Gây rối loạn chức năng màng bào tương: chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc; khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài ào ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ polymyxin B, colistin Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối (absolute bactericide), tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ - không nhân lên
+ Ức chế sinh tổng hợp protein: tham gia sinh tổng hợp protein ngoài ribosom còn có các ARN thông tin và các ARN vận chuyển Điểm tác động là ribosom 70S của vi khuẩn: tại tiểu phần 30S ví dụ như aminoglycosid (nơi ARN thông tin trượt qua), tetracyclin (nơi ARN vận chuyển mang acid amin tới) hoặc tại tiểu phần 50S (nơi acid amin liên kết tạo polypeptid) như erythromycin, cloramphenicol, clindamycin Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển
+ Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: gồm ba cấp độ:
(1) Ngăn cản sự sao chép của ADN mẹ tạo ADN con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzym gyrase làm ADN không mở được vòng xoắn, như nhóm quinolon
(2) Ngăn cản sinh tổng hợp ARN, ví dụ do gắn vào enzym ARN-polymerase như rifampicin
(3) Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết cho tế bào: quá trình sinh tổng hợp acid folic – coenzym cần cho quá trình tổng hợp các purin và pyrimidin (và một số acid amin) bị ngăn cản bởi sulfamid và trimethoprim
➢ Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào Nếu vi khuẩn không bị li giải hoặc không bị nắm bắt (thực bào) và tiêu diệt, thì khi không còn tác động của kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn sẽ có thể hồi phục/ sống trở lại (reversible) Chỉ cần 1 tế bào sống sót, với tốc độ sinh sản nhanh chóng, sau vài giờ số lượng tế bào vi khuẩn đã không thể đếm được (ví dụ E coli nếu 20 phút “đẻ 1 lứa” thì sau 5 giờ: từ
1 tế bào mẹ - ban đầu phát triển thành 215 tế bào và sau 10 giờ là 2 30 – hơn 1 tỷ); sẽ nguy hiểm hơn nữa nếu tế bào sống sót đó đề kháng kháng sinh
Chất kháng sinh Penicillin
- Năm 1928, Flemming là nhà vi khuẩn học làm việc tại Bệnh viện Saint Mary ở London Trong khi kiểm tra các đĩa nuôi cấy chứa vi khuẩn, ông phát hiện hiện tượng khác thường: nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng vi khuẩn đã bị phá hủy Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi khuẩn Loại nấm mọc giống như dạng các bụi cây này sau được đặt tên khoa học là penicillium notatum, còn chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn được đặt là pennicillin Ban đầu, Penicillin được dùng chữa các vết thương bề mặt, nó chỉ mang lại thành công nhất định vì trong Penicillin thô có rất ít các hoạt chất Flemming đã cố gắng tách Penicillin nguyên chất nhưng không thành công
1.2.2 Lịch sử sản xuất Penicillin:
- 10 năm sau khi phát hiện Penicillin, ở Oxford, dưới sự chỉ đạo của Howara Walter Florey nhà giải phẫu bệnh học người Australia và Ernst Boris Chain đã nghiên cứu với mục đích là chế tạo Penicillin trên quy mô công nghiệp Nhiều kỹ thuật như dùng tia cực tím, tia X và các chất hóa học tác động đến cấu trúc di truyền của nấm đều được sử dụng nhằm tạo ra chủng Penicillin với sản lượng cao Năm 1943, dự án chế tạo Penicillin đứng thứ nhì trong danh sách các công trình ưu tiên sau dự án Mahattan chế tạo bom nguyên tử Năm 1944, một ca chữa trị bằng Penicillin tốn 200 đô-la, tuy nhiên, giá này nhanh chóng giảm xuống, rẻ hơn cả giá đóng gói sản phẩm Năm 1945, Flemming, Chain và Florey được trao tặng giải thưởng Nobel y học.
Công thức cấu tạo của Penicillin
- Penicillin là kháng sinh thuộc nhóm Betalactam do trong cấu trúc có vòng Betalactam, được bán tổng hợp (trừ Penicillin G)
- Các loại Penicillin khác nhau ở nhóm thế R
- Sự thay đổi trong nhóm thế R dẫn đến thay đổi tính bền vững với các enzyme Penicillinase, Betalactamase và thay đổi phổ kháng khuẩn.
Những vi sinh vật sản sinh Penicillin và đặc điểm dinh dưỡng của chúng
Những vi sinh vật sinh Penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium và Aspergillus Nhưng các chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh Những chủng đầu tiên được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trên cơ sở chất tự nhiên tạo thành 10-
15 đv/ml kháng sinh Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những khuẩn ty bạc trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơ chất cũng có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định Đặc tính này đặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp Các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh Chúng ta cần phải nhận thức rằng các nấm penicillium thường dễ biến đổi về hình thái và giảm khả năng sinh kháng sinh Khi xảy ra biến đổi thì sẽ sinh ra hàng loạt những chủng mới từ giống cơ bản và nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật lúc này là phải chọn lại những khuẩn lạc khỏe có nhiều ưu điểm, tiếp theo cần phải tiến hành những biện pháp bảo quản thích hợp Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển:
+ Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế bào chất chưa phân hoá Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính
+ Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong không bào dần dần biến mất Ở cuối giai đoạn này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ
+ Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế bào chất rất ưa kiềm
+ Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm
+ Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không bào, ở giữa có một hoặc một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến mất Tính ưa kiềm tiếp tục giảm
+ Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được dạng hình trống nhưng không còn những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặc màu hồng đồng đều Các hạt chất béo không còn Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân.
Cơ sở sinh tổng hợp Penicillin từ nấm mốc
Quá trình lên men Penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng (ứng với những giai đoạn phát triển I, II, III) và pha sinh Penicillin (ứng với những giai đoạn IV, V, VI) Nguồn carbon trong lên men Penicillin bằng nấm Penicillium chrysogenum có thể là glucoza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, các axit hữu cơ (lactic, axetic, formic), các axit amin…đường lactoza cho hiệu suất Penicillin cao nhất và thường được dùng trong công nghiệp Nấm thường sử dụng đường lactoza chậm Vì vậy, trong thực tế lactoza được dùng phối hợp cùng đường khác (glucoza, sacaroza…) trong môi trường dinh dưỡng Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza và axit lactic của cao ngô Sa đó lactoza mới được sử dụng (chủ yếu trong pha tạo Penicillin) Khi trong môi trường cạn lactoza và không bổ sung các chất dinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ Penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điểm này Nguồn nitơ dùng trong sinh tổng hợp Penicillin có thể là những hợp chất hữu cơ (axit amin, pepton, protein) và vô cơ (amoniac, các muối amon và nitrat) Amoniac được nấm penicillium chrysogenum đồng hoá nhanh hơn cả Trong quá trình nuôi cấy N-NH3 được tạo thành từ cao ngô do phản ứng khử amin các hợp chất nitơ Nấm mốc sử dụng N-NH3 trước tiên và nồng độ của chất này trong thời gian đầu tăng lên, vì tốc độ tạo thành nó nhanh hơn tốc độ sử dụng, tiếp theo đó được giảm rất nhanh cùng với tốc độ sinh trưởng, phát triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệ sợi của mốc bị tự phân Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc vào nguồn cacbon trong môi trường Trong trường hợp nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hoặc các nguồn cacbon dễ tiêu hoá khác, amoniac được sử dụng nhanh hơn khi môi trường có lactoza Nitrat được nấm mốc đồng hoá khi trong môi trường không có nguồn nitơ hữu cơ Lưu huỳnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp của nấm mốc Nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat của kali, natri và amon Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin, biotin, tiamin…hoặc trạng thái liên kết yếu là tốt hơn cả Nhiều công trình nghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặt đồng thời L-sixtin và sunfat thì lưu huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân tử Penicillin hơn lưu huỳnh của các gốc sunfat Song, dùng axit amin trong sản xuất không kinh tế cho nên người ta thường dùng tiosunfat natri (Na2S2O3) Lưu huỳnh của chất này rất dễ di động Trong môi trường dinh dưỡng có tiosunfat cùng với cao ngô hiệu suất Penicillin có thể tăng hai lần Cơ chế biến đổi các hợp chất lưu huỳnh từ dạng oxy hoá sang dạng khử có thể theo sơ đồ của Arnstein (1954) như sau: Sunfat Sunfit Tiosunfit sixtin Trong tế bào sixtin dễ biến thành sixtein và ngược lại Sixtein có một ý nhĩa lớn như một tác nhân khử nhờ nhóm sunfuhydrin (-SH) pH môi trường thích hợp cho penicillium chrysogenum phát triển nằm trong khoảng 6 - 6.5 Môi trường kiềm hoặc axit hơn đều làm cho mốc phát triển chậm Trong quá trình lên men pH môi trường thay đổi tuỳ thuộc vào tốc độ sử dụng các hợp chất cacbon và N-NH3
QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP
Đặc điểm chung
Công nghệ lên men sản xuất Penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sáng chế thường cũng chỉ giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh Penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau (xem sơ đồ hình 2.1)
+ Lên men sản xuất Penicillin tự nhiên (thường thu Penicillin V hoặc Penicillin G) + Xử lý dịch lên men tinh che thu bán thành phẩm Penicillin tự nhiên
+ Sản xuất các Penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu Penicillin tự nhiên)
+ Pha chế các loại thuốc kháng sinh Penicillin thương mại
Hấp thụ bằng than hoạt tính
Chuẩn bị lên men
2.2.1 Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất:
- Giống dùng để lên men Penicillin là P chrysogenum đây là loại nấm sợi bào tử hở Khi mới phát hiện trong môi trường đặc, chúng tạo ra hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng Sau khi nuôi cấy một ngày, khuẩn ty bắt đầu chuyển sang màu xanh xám và đính bào tử bắt đầu xuất hiện Thời gian này xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trong các đính bào tử Các bào tử lần lượt được tạo thành theo thời gian nuôi cấy và cuối cùng thì màu của nấm Penicillin sẫm hơn
Hấp thụ bằng than hoạt tính
Sản xuất Penicillin bán tổng hợp
Sản xuất Penicillin thương mại
Hình 2.1 Sơ đồ sản xuất Penicillin
- Giống công nghiệp P.chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh ở 70 0 C hoặc bảo quản trong nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra trên môi trường thạch hộp để hoạt hoá và nuôi thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri được cấy chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, rồi sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian … và cuối cùng là trên thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọng của công đoạn nhân giống là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo đúng thời điểm cho các công đoạn nhân giống ke tiếp và cuối cùng là cung cấp đủ lượng giống đạt các yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tiễn, để đảm bảo cho quá trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấp sao cho mật độ giống trong dịch lên men ban đầu khoảng 1 – 5.109 bào tử / m 3
- Thành phần môi trường nhân giống cần được tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, các chất khoáng và các thành phần khác, đảm bảo cho sự hình thành và phát triển thuận lợi của pellet
2.2.2 Chuẩn bị môi trường lên men và thiết bị:
– Chuẩn bị môi trường lên men:
+ Cân đong, pha chế riêng rẽ các thành phần môi trường lên men trong các thùng chứa phù hợp
+ Thanh trùng gián đoạn ở 121 0 C (hay thanh trùng liên tục ở khoảng 140-146 0 C) hoặc lọc qua các vật liệu siêu lọc rồi mới bơm vào thùng lên men
Nếu đặc tính công nghệ của thiết bị lên men cho phép, có thể pha chế rồi thanh trùng đồng thời dịch lên men trong cùng một thiết bị Tất cả các cấu tử bổ sung vào môi trường lên men đều phải được xử lý khử khuẩn trước và sau đó bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn
– Thiết bị lên men: Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng Thường thanh trùng bằng hơi quá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian 3 giờ Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cả các thiết bị phụ trợ khá Trong quá trình lên men luôn cố gắng duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chế rủi ro do nhiễm tạp
– Không khí thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc
2.2.3 Chuẩn bị môi trường nhân giống
Chuẩn bị môi trường nhân giống: Để làm môi trường nhân giống người ta cũng chuẩn bị như môi trường lên men nhưng chúng không chứa lactose (nếu có chỉ chứa một lượng nhỏ), một số khoáng chất và tiền khoáng chất Mặt khác thành phần môi trường nhân giống cần được tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, các chất khoáng và các thành phần khác, đảm bảo cho sự hình thành và phát triển thuận lợi của pellet
Sau khi làm ẩm môi trường đến độ ẩm nhất định, người ta sẽ phân phối chúng vào các dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay các bình tam giác) với khối lượng bằng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy nút bông và đem thanh trùng ở 121 o C (0,5 at) trong
Kỹ thuật lên men
2.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt: Áp dụng từ lâu, hiện nay hầu như không còn được triển khai trong sản xuất lớn nữa Gồm 2 phương pháp:
- Lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactoza)
- Lên men trên bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường cơ bản lactoza- nước chiết ngô)…
- Quá trình nhân giống bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm Trong các nhà máy, mỗi lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống Một ống dùng kiểm tra trước khi sản xuất, một ống dùng để sản xuất và một ống dùng để bảo quản
- Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200 – 250 ml và chuẩn bị 50 g môi trường như phần trình bày ở trên Môi trường đã được thanh trùng và làm nguội đến 30 o C
- Đổi 10 ml đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn với nước Bằng biện pháp vô trùng (thực hiện trong các tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên lắc cho thật đều và chuyển chúng sang tủ ấm 30 – 37 o C Nuôi trong điều kiện này chỉ đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường
Chuẩn bị môi trường nhân giống
Chuẩn bị môi trường lên men
Hình 2.3 Sơ đồ công nghệ lên men nổi Penicillin
- Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1 Cứ lần lượt thực hiện tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3 … cho đến khi đủ 5 – 10% giống cho sản xuất
- Mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần, trong trường hợp quá một ký người ta nuôi trên những khay
- Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, thường là dùng những chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen tạo ra những chủng siêu tổng hợp kháng sinh Theo Talaro (0993), từ chủng Penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng tổng hợp 6mg/ml, hiện nay người ta đã có những chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả năng sinh tổng hợp 85000mg/ml Penicillin
- Đối với phương pháp lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose), khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội đến 30 o C, tiến hành trộn giống vào với tỉ lệ từ 5 – 10% Các khay xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ có một khoảng cách nhất định để thoáng khí và thoáng nhiệt Quá trình lên men kéo dài 6 – 7 ngày ở nhiệt độ 24 – 28 o C
- Nấm Penicillin trong quá trình phát triển thường tạo ít nhiệt hơn nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả năng phát triển và sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí bằng quạt gói có lắp hệ thống làm sạch
Bảng 2.1 Môi trường lỏng dùng trong nuôi cấy bề mặt thu nhận Penicillin bao gồm:
- Ưu điểm của phương pháp này là đường lactose được nấm mốc đồng hóa chậm nên không xảy ra hiện tượng dư thừa đường trong tế bào, còn dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, các chất khoáng và các chất sinh trưởng, trong đó phenylalanin khi bị thủy phân sẽ tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử Penicillin
Khi lên men trong môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường là 0,2 – 0,8 kg phenylacetic/m 3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khi được khử trùng sẽ được phân phối vào các khay có kích thước giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đây các khay này không được đục lỗ vì phải chứa môi trường lỏng Chiều cao của dung dịch môi trường trong các khay là 3- 4 cm Người ta cũng tiến hành lên men trong khoản thời gian 6 -7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24 -
28 o C Tiến hành lên men trong điều kiện môi trường lỏng này, lượng Penicillin G được tổng hợp tăng rõ rệt còn hàm lượng các Penicillin khác cũng giảm đi Để hạn chế quá trình oxi hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau đó tương đối ổn định và vào cuối quá trình lên men thường trong khoảng pH = 6,8 -7,4 Khi sử dụng cơ chất chính là lactose, người ta đã xác định được Penicillin chỉ được tổng hợp và tích tụ mạnh mẽ trong môi trường khi nấm mốc đã sử dụng đường này và khi lactose có dấu hiệu cạn kiệt thì sợi nấm cũng bắt đầu tự phân Vì vậy người ta thường kết thúc quá trình lên men vào thời điểm sắp hết đường lactose.
Kỹ thuật lên men chìm
Kỹ thuật lên men chìm là kỹ thuật được áp dụng trong hầu hết các cơ sở sản xuất Penicillin công nghiệp hiện nay và thường được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) một hay một vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men trước (hoặc không)
Trong phương pháp lên men chìm thì môi trường được sử dụng là môi trường lỏng, người ta dùng cao ngô, glucose, hydrol, lactose, các muối amon, thiosufat, photphat kali hoặc natri, các muối sufat magie, natri, đồng …
Trong quá trình len men chìm người ta nhân giống trong môi trường lỏng Mục đích của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tế bào cao (thường tính tổng số lượng tế bào/ml)
- Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống nghiệm sang những bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào các bình lên men dung tích từ 1 lít cho đến hàng ngàn lít Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì ở khoảng 26 + 1 o C và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng
Bảng 2.2 Nhân giống Penicillin trong môi trường với các thành phần sau :
Cao ngô 2% Glucose 2% Sunfat natri 0.05%
Nitrat amon 0.125% Sunfat magie 0.025% CaCO3 0.5% Kaliphophat monoboric
- Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sản xuất Penicillin được vận hành theo phương pháp lên men hai pha:
- Pha thứ nhất nuôi thu sinh khối trong khảng 2-3 ngày Trong pha này hệ sợi phát triển rất mạnh vì các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào hấp thụ rất mạnh, tốc độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh, sự tạo thành Penicillin mới bắt đầu
- Pha thứ hai lên men thu sản phẩm Ở pha này hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt giá trị khoảng 7 – 7,5 Trong pha này Penicillin được tạo thành với mức độ cực đại
- Giống nấm mốc Penicillin chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc, tuy nhiên trong quá trình tổng hợp Penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh nên trong suốt quá trình lên men việc thổi khí là điều cần thiết
- Trong hầu hết các trường hợp người ta thay thế phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactoza bằng đường glucoza Lượng glucoza này có thể được bổ sung liên tục hay bán liên tục nhưng phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucoza trong suốt quá trình vận hành pha sau để duy trì nồng độ glucoza luôn ở mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều Penicillin
- Trong thực tiễn, để tránh xảy ra thiếu hụt nhất thời glucoza, người ta có thể kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactoza (khi đó, nếu chưa bổ sung kịp glucoza thì nấm mốc sẽ tự điều chỉnh để sử dụng đường lactoza nên không xảy ra hiện tương tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ trong nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2S04 để vừa cung cấp thức ăn N và S, vừa sử dụng đê điều chỉnh pH trong quá trình lên men (pH dịch lên men ban đầu thường được điều chỉnh về khoảng pH = 6,5
- 6,8 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4); nồng độ NH 4+ thường khống chế trong khoảng 0,3 - 0,4 kg/m 3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám… Tiền chất tạo nhánh phenylacetic trong lên men sản xuất Penicillin G (hoặc phenooxyacetic trong lên men sản xuất Penicillin V) được bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) trong suốt thời gian pha lên men Penicillin, để duy trì nồng độ trong khoảng 0,1 - 1,0 kg/m 3 dịch (nếu ít quá nấm mốc sẽ tổng hợp đổng thời nhiều Penicillin khác, nếu nhiều quá sẽ gây độc cho nấm và tăng cường thúc đẩy quá trình hydroxyl hóa sản phẩm Penicillin)
Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế ở 30 o C, sau đó sang pha sau giữ ở 22-25 o C Tốc độ sục khí và khuấy trộn được điều chinh để duy trì nồng độ oxy hòa tan trong dịch trong khoảng 30% Trong điều kiện trên thời gian lên men mỗi mẻ thường kéo dài khoảng 144-180 giờ Kết thúc quá trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh rồi chuyển sang công đoạn trích ly và tinh chế thu Penicillin
• Đặc điểm về thiết bị lên men:
Quá trình lên men sản xuất Penicillin ngày nay chủ yếu được tiến hành trong thiết bị lên men chìm chế tạo bằng nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuôc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy, kết hợp bố trí hệ vách dẫn dòng trong thùng) Công suất khuấy trộn tiêu hao được thiết kê khoảng 3kW/m Y giờ Không khí nén đã vô khuẩn được cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát dưới đáy (hay phía dưới cánh tuốc-bin) Bên trong thiết bị được lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu quả trong suốt quá trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến trong khoảng 150 - 300m 3 , hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%
V (phụ thuộc vào kỹ thuật và thiết bị phá bọt) Thiết bị nhâu giông sản xuất có dung tích khoảng 10% V thiết bị lên men, được thiết kế tương tự và thường được ghép cứng với thiết bị lên men Toàn bộ thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn và hệ thống các trang thiết bị phụ trợ được thiết kế và lắp đặt đảm bảo có thể vệ sinh và thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nhất nên bố trí sao cho có thể áp dụng chế độ thanh trùng đồng thời cho toàn bộ hệ thiết bị này) Các thông số kiểm tra quá trình lên men bao gồm: pH môi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước và cấu trúc pellet, nồng độ các cấu tử cơ chất, nồng độ Penicillin, thành phần khí thải và các chỉ tiêu kiểm tra về vi sinh vật Việc giám sát và điều chỉnh quá trình lên men được xây dựng trên cơ sở khai thác cả hai kiểu tương tác trực tuyến (Online control) và tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả năng đáp ứng của hệ thiết bị hiện có Đồng thời xu hướng máy tính hóa trong kiểm tra và giám sát quá trình lên men đang dần chiếm ưu thế trong sản xuất công nghiệp
Hình 2.4 Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất Penicillin
Hiệu quả kinh tế chung của quá trình lên men
Năng lực sinh tổng hợp và tích tụ Penicillin trong dịch lên men là kết quả của mối tương tác đồng thời của hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp của chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị và năng lực đáp ứng các yêu cầu công nghệ của thiết bị, chế độ giám sát và điều chỉnh các thông số công nghệ, năng lực và kỹ năng vân hành của công nhân… Với nguồn cơ chất chính là glucoza và lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza được nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường được sử dụng để duy trì sự sống sót của hệ sợi, còn lại chỉ khoảng 10% được nấm mốc sử dụng để tổng hợp Penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ và lưu huỳnh để tổng hợp Penicillin tương ứng là 20% và 80% Nồng độ Penicillin G trong dịch lên men những năm 80 – 90 của thế kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất khoảng 40 – 50 kg Penicillin G/ m3 dịch lên men)
Xử lý dịch lên men và tinh chế thu Penicillin tự nhiên
Có ba phương pháp thu nhận và tinh chế Penicillin từ môi trường nuôi cấy, đó là:
• Trích ly bằng dung môi hữu cơ
Trong ba phương pháp trên thì phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ được sử dụng nhiều hơn cả, phương pháp này dựa trên những ưu điểm sau:
• Muối của Penicillin rất dễ tan trong nước
• Acid Penicillin rất đẽ tan trong dung môi hữu cơ
Hình 2.5 Các công đoạn chính xử lý dịch lên men và tinh chế thu Penicillin 2.6.1 Lọc dịch lên men:
- Mục đích: Penicillin là sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, ngay sau khi kết thúc quá trình lên men người ta thường tiến hành lọc ngay để giảm tổn hao do phân huỷ
Sinh khối nấm Lọc sợi nấm
Dung môi, phụ gia, axit
Hấp thụ bằng than hoạt tính
Kali acetat hoặc natri acetat
Dung môi Rửa tinh thể
Tinh chế thu hồi Penicillin
Penicillin và giảm bớt khó khăn khi tinh chế, do các tạp chất tạo ra khi hệ sợi nấm tự phân
- Thiết bị lọc: phổ biến là thiết bị lọc hút kiểu băng tải hoặc kiểu thùng quay Thông thường, người ta chỉ cần lọc một lần rồi làm lạnh dịch ngay để chuyển sang công đoạn tiếp theo Chỉ trong những trường hợp rất đặc biệt mới cần phải xử lý kết tủa một phần protein và lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hâu quả làm cho dịch khó lọc hơn
- Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia súc
Penicillin thường được trích ly ở dạng axít ra khỏi dịch lọc bằng dung môi amylacetat hoặc butylacetat ở pH = 2,0 – 2,5, nhiệt độ 0 – 30C Nhằm hạn chế lượng Penicillin bị phân huỷ, quá trình trích ly được thực hiện trong thời gian rất ngắn trong thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, trong thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ các thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn… để hạn chế tổn thất do phân huỷ Penicillin Dịch lên men sau khi lọc được bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 hoặc H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi trích ly vào trong thiết bị
Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4 – 10V dịch lọc /1V dung môi Trong một số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta có thể áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly Penicillin bằng amylacetat hoặc butylacetat; tiếp theo Penicillin lại được trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 – 7,5, thường là dung dịch KOH loãng hoặc dung dịch NaHCO3; sau đó Penicillin lại được trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi ít hơn
2.6.3 Tẩy màu: Để tẩy màu và loại bỏ một số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa Penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến nhất là than hoạt tính Sau đó than hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiết bị lọc hút băng tải hoặc thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc được đưa đi chưng thu hồi dung môi và xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho các mẻ sau
2.6.4 Kết tinh, lọc, rửa và sấy thu Penicillin tự nhiên:
Việc kết tinh Penicillin V hay Penicillin G dưới dạng muối có thể được thực hiện rất đơn giản, bằng cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) hoặc người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó bổ sung BuOH đe Penicillin tự kết tinh Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả kết tinh là: nồng độ Penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh … Sau khi kết tinh, tinh thể Penicillin được lọc tách bằng máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, có thể tiến hành hòa tan và kết tinh lại Penicillin Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không dưới 99,5%, chúng được lọc tánh tinh thể; tiếp theo rửa và làm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi trên máy lọc băng tải rồi sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối Penicillin Sản phẩm này, một phần được sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh Penicillin; còn lại, phần lớn được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm Penicillin và cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất ra các sản phẩm Penicillin có độ tinh khiết rất cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm một số giải pháp công nghệ khác.
Sản xuất các Beta-Lactam bán tổng hợp từ Penicllin G
2.7.1 Nhu cầu sản xuất các Penicillin bán tổng hợp:
Tác dụng điều trị chính của Penicillin và các kháng sinh khác thuộc họ P-lactam được xác định là: cấu trúc Penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptit D-alanin-D- alanin, là hợp phần cấu trúc của lớp peptido-glucan thành te bào Do sự tương đồng về đặc tính và cấu trúc này làm cho hoạt tính các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp te bào bị biến đổi, các enzym này đã nhân “nhầm” cơ chất Kết quả là phần thành tế bào mới tổng hợp với sự “nhầm lẫn” trên sẽ không được hình thành, làm cho thành te bào của mầm bệnh chỉ có từng phần hay chúng hoàn toàn không có thành te bào do đó chúng dễ dàng bị tự phân trong môi trường và bị các công cụ tự vệ của cơ thể bệnh nhân tiêu diệt Đồng thời, các kháng sinh P-lactam còn liên ket đặc hiệu với một số protein trên màng tế bào chất (đen nay đã xác định được chín protein trên) Sự liên kết này đã làm “bất hoạt” và “hòa tan” các protein đặc hiệu trên màng, dẫn đến làm mất hoạt tính polymeraza và ATPaza (người ta đã xác định được trong môi trường kháng sinh chỉ có các D-alanin -cacboxylpeptidaza còn hoạt động và một số ACPaza này lại có hoạt tính B-lactamaza yeu) Ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy ảnh hưởng của pencillin đen các chuyển hóa photpholipit trong tế bào
Tuy nhiên nhiều trường hợp điều trị với Penicillin đã xuất hiện dấu kháng thuốc Nguyên nhân chính của hiện tượng kháng Penicillin này là chúng tổng hợp được một trong hai enzym Penicillinaza và đặc biệt là enzym P-lactamaza Gen mã hóa sinh tổng hợp enzym P-lactamaza được lưu giữ trên các plasmid (hoặc trasporon) Vì vây, cùng với thời gian điều trị, năng lực kháng thuốc của chúng sẽ trở nên thành thục Để vô hiệu khả năng kháng thuốc nêu trên, về nguyên lý, giải pháp đơn giản hơn cả là làm vô hiệu khả năng tương tác của enzym với cơ chất bằng cách làm biến đổi cấu trúc phân tử Penicillin Để tạo ra các Penicillin khác nhau, trên nguyên tắc có thể hoàn thiện theo hướng lên men trực tiếp với các tiền chất tạo nhánh thích hợp để thu các Penicillin mong muốn hay lên men không sử dụng tiền chất thu axit 6- aminopenicillanic làm nguyên liệu để tổng hợp ra các Penicillin khác Tuy nhiên, bằng con đường lên men trực tiếp cho đến nay người ta mới chỉ có khả năng lên men được một vài loại Penicillin Trong khi đó, con đường kinh te hơn cả và được triển khai trong sản xuất lớn lại là chỉ lên men trực tiếp thu Penicillin G (hoặc Penicillin V) làm ra nguyên liệu, để từ đó tổng hợp ra Penicillin bán tổng hợp khác Ngoài ra, bằng con đường bán tổng hợp Penicillin G hoặc Penicillin V, có thể sản xuất ra một số dẫn xuất p -lactam có giá trị như các cepalosporin bán tổng hợp hay các Penicillin có hoạt tính kìm hãm P- lactamaza
2.7.2 Sản xuất axit 6- aminopenicillanic và sản xuất Penicillin bán tổng hợp
Axit 6- aminopenicillanic tuy không có hoạt tính kháng khuẩn, nhưng có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp ra nhiều loại Penicillin khác nhau và cả cephalosporin Để sản xuất axit 6- aminopenicillanic, con đường hiệu quả hơn cả hiện nay là lên men sản xuất Penicillin G (hoặc Penicillin V); sau đó áp dụng phương pháp hóa học hay sử dụng enzym acylaza để phân cắt mạch nhánh bên
Phương pháp hóa học có hiệu suất chuyển hóa cao, tới 90-95%, và tốc độ phản ứng nhanh, song lại tiêu hao nhiều năng lượng, nhiều dung môi và chứa đựng nguy cơ ô nhiễm môi trường cao Trong khi đó, phương pháp enzym, tuy hiệu quả chuyển hóa thấp hơn nhưng điều kiện phản ứng êm dịu và mang lại hiệu quả kinh te cao hơn nên được triển khai phổ biến trong thực tiễn sản xuất công nghiệp Đồng thời, cũng nhờ ưu thế trên, phương pháp enzym được hoàn thiện liên tục và ngày nay đã đạt được ưu thế vượt trội so với phương pháp hóa học
• Thiết bị sử dụng trong sản xuất Penicillin
Hình 2.7 Thiết bị sấy chân không Hình 2.9 Thiết bị lọc sinh học
Hình 2.6 Thiết bị lọc than hoạt tính Hình 2.8 Thiết bị sấy
SẢN PHẨM
Tiêu chuẩn chất lượng
Penicillin được sản xuất dưới các loại chế phẩm dạng viên, thuốc tiêm hoặc bột pha tiêm, thuốc nước Tùy thuộc vào từng loại chế phẩm và thành phần mà chúng có các tiêu chất lượng khác nhau Tuy nhiên vẫn có các tiêu chuẩn chất lượng chung như sau:
• Định tính: có phản ứng đặc trưng của từng loại Penicillin trong chế phẩm
• Định lượng: hàm lượng của từng hoạt chất trong chế phẩm phải nằm trong giới hạn cho phép
• Tạp chất: Bất kì pic tạp chất nào không được lớn hơn tổng diện tích hai pic chính của dung dịch đối chiếu trên sắc kí đồ
• Thử vô khuẩn: chế phẩm phải vô khuẩn hoặc đạt phép thử về độ vô khuẩn
• Nội độc tố vi khuẩn: phải ít hơn 0,13 EU/ml
Các dòng sản phẩm và tiêu chuẩn chất lượng của từng sản phẩm
Hình 3.1 Thuốc tiêm BezylPenicillin natri
Là natri (2S, 5R, 6R) – 3,3 – dimethyl - 7 – oxo – 6 – [(phenylacetyl)amino]– 4 – thia – 1 – azabicyclo[3.2.0] heptan – 2 – carboxylat, được sản xuất bằng cách nuôi cấy chủng Penicilium notatum hoặc các chủng cùng họ hay điều chế bằng phương pháp khác; phải chứa từ 96% đến 102% C16H17N2NaO4S tính theo chế phẩm đã làm khô
- Tính chất: bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Rất tan trong nước, thực tế không tan trong dầu béo và dầu paraffin
- Độ hấp thụ: độ hấp thụ tại các bước sóng 325nm và 280nm không được lớn hơn 0,1 và tại cực đại hấp thụ 264nm phải từ 0,8 đến 0,88 tính theo dung dịch không pha loãng
- Tạp chất liên quan: tất cả các tạp chất: với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu Các tạp chất bao gồm:
+ Acid (2S, 5R, 6R) – 6 – [[(4 – hydroxyphenyl) acetyl] amino] - 3,3 – dimethyl - 7 – oxo – 4 – thia – 1 – azabicyclo[3.2.0] heptan – 2 – carboxylic
+ Các acid peniciloic của benzylPenicillin
+ Các acid peniloic của benzylPenicillin
+ Acid 2 – ethylhexanoic: không được quá 0,5%
- Mất khối lượng do làm khô: không được quá 1%
- Nội độc tố vi khuẩn: phải nhỏ hơn 0,16 EU/ml
- Bảo quản: trong bao bì kín Nếu chế phẩm là vô khuẩn, bảo quản trong bao bì kín và vô khuẩn
• PhenoxymethylPenicillin (Chế phẩm dạng viên nén):
PhenoxymethylPenicillin là acid (2S,5R,6R)-3,3–dimethyl-7-oxo-6- ((phenoxyacetyl)-amino)-4-thia-l-azabicyclo(3.2.0)heptan-2-carboxylic, được sản xuất bằng cách nuối cấy chủng Penicillium notatum hoặc các chủng cùng họ trong môi trường có chứa tiền chất thích hợp, hay bằng các phương pháp khác Tổng hàm lượng của phenoxymethylPenicillin và 4-hydroxy-phenoxymethylPenicillin phải từ 95% đến 100,5%, tính theo chế phẩm khan
- Tính chất: bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Dễ tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96%
- Góc quay cực riêng: Từ +186 đến +200 tính theo chế phẩm khan
- Tạp chất liên quan: không được quá 1%
- 4-HydroxyphenoxymethylPenicillin kali: Không được quá 4% tính theo chế phẩm khan
- Bảo quản: trong bao bì kín
- Loại thuốc: kháng sinh nhóm Penicillin
Hình 3.2 Viên nén Phenoxymethyl Penicillin
- Là viên nén chứa phenoxymethylPenicillin
- Hàm lượng phenoxymethylPenicillin, C16H18N2O5S, từ 90% đến 120% so với lượng ghi trên nhãn
- Bảo quản : Tránh ấm và ánh sáng, ở nhiệt độ không quá 30℃
- Hàm lượng thường dùng: 200000 đơn vị (IU); 400000 đơn vị (IU)
• Benzathine benzylPenicillin (chế phẩm dạng thuốc tiêm):
Hình 3.4 Thuốc tiêm Benzathine benzylPenicillin
Benzathin benzylpenicilin có tác dụng kháng khuẩn tương tự như benzylPenicillin Tuy nhiên nồng độ thuốc trong máu thấp nên chỉ nhạy cảm với một số vi sinh vật nhất định như Streptococcus nhóm A, Corynebacterium diphtheria, xoắn khuẩn Treponema, …
- Tính chất: bột màu trắng, rất khó tan trong nước, dễ tan trong dimethylfomamid và formamid, khó tan trong ethanol 96%
- Giới hạn acid – kiềm: lượng dung dịch Sodium hydroxide 0,02N để chuyển màu của chỉ thị xanh bromothymol (đã được bổ sung vào trong mẫu thử) qua màu xanh da trời không quá 0,2 ml
- Tạp chất liên quan: khi sử dụng phương pháp sắc kí lỏng, trên sắc kì đồ của dung dịch thử:
- Diện tích của pic tương ứng với tạp chất C (acid benzylpeniciloic benzathid) không được lớn hơn hai lần tổng diện tích hai pic chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu
- Bất kì pic phụ nào khác không được lớn hơn tổng diện tích hai pic chính của dung dịch đối chiếu
- Thử vô khuẩn: nếu chế phẩm dự định dùng để sản xuất thuốc tiêm mà không tiến hành tiệt khuẩn nữa thì phải đạt phép thử về độ vô khuẩn
- Nội độc tố vi khuẩn: phải ít hơn 0,13 EU/ml
- Định lượng: hàm lượng benzathine benzylPenicillin bằng hàm lượng của BenzylPenicillin nhân với hệ số 1,36
- Bảo quản: trong đồ bao gói kín Nếu là nguyên liệu vô khuẩn: trong đồ bao gói kín, vô khuẩn và tránh sự xâm nhập của vi khuẩn
Hình 3.5 Penicillin V Kali Định lượng:
- Phương pháp sắc ký lỏng
- Pha động: Nước – acetonitril – acid acetic băng (650:350:5,75)
- Dung dịch phân giải: Dung dịch có chứa 2,5 mg benzylpenicilin kali và 2,5 mg phenoxymethylpenicilin kali trong 1 ml, pha trong pha động
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch phenoxymethylpenicilin kali chuẩn có nồng độ khoảng 2,5 mg/ml, pha trong pha động
- Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên rồi nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 400 000 đơn vị phenoxymethylpenicilin hòa trong pha động vừa đủ 100,0 ml, lắc kỹ trong 5 min, lọc Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (30 cm X 4 mm), được nhồi pha tĩnh C (3 μm đến 10 μm) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/min Thể tích tiêm: 10 μl
- Bảo quản: Tránh ẩm và ánh sáng, ở nhiệt độ không quá 30 °C
- Hàm lượng thường dùng 200 000 đơn vị (IU); 400 000 đơn vị (IU)
- Là bột kết tinh vô khuẩn của bezylbenicillin kali hoặc benzylPenicillin natri đóng trong ống thủy tinh hàn kín hoặc lọ thủy tinh nút kín Chỉ pha với “nước vô khuẩn để tiêm” ngay trước khi dùng
- Hàm lượng C16H17N2NaO4S hoặc C16H17N2KO4S phải từ 95% đến 102% so với lượng ghi trên nhãn
- Tính chất: bột kết tinh trắng, vị hơi đắng, hơi có mùi đặc biệt
- Giới hạn acid – kiềm: từ 5,5 đến 7,5
- Độ trong và màu sắc dung dịch: dung dịch phải trong và không màu
- Mất khối lượng do làm khô: không được quá 1%
Hình 3.6 Bột pha tiêm Benzyl Penicillin
- Chất gây sốt: phải đáp ứng yêu cầu về thử chất gây sốc
- Thử vô khuẩn: chế phẩm phải vô khuẩn
- Định lượng: hoạt lực lý thuyết của 1mg bezylPenicillin natri là 1670 đơn vị, của bezylPenicillin kali là 1600 đơn vị
- Là viên nén chứa phenoxymethyPenicillin kali
- Hàm lượng phenoxymethylPenicillin, C16H18N2O5S, từ 90% đến 120% so với lượng ghi trên nhãn
- Mất khối lượng do làm khô: Không được quá 1,5%
- Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng
- Bảo quản : Tránh ẩm và ánh sáng, ở nhiệt độ không quá 30℃
- Hàm lượng thường dùng: 200000 đơn vị (IU); 400000 đơn vị (IU)
Ứng dụng
Thuốc kháng sinh Penicillin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, từ đó tiêu diệt chúng Tùy vào phổ tác dụng của từng kháng sinh mà nó có thể dùng trong điều trị một số nhiễm trùng cụ thể
Hình 3.7 Viên nén Penicillin V kali