Bài giảng thí nghiệm vi sinh vật học môi trường

Sau khi quan sát xong nâng ống kính lên cao, lấy tiêu bản ra Lưu ý: khi sử dụng ốc chuyển sơ cấp luôn vừa chỉnh, vừa nhìn khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản, tránh trường hợp vật kính

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI KHOA HĨA VÀ MƠI TRƯỜNG Bộ môn kỹ thuật quản lý môi trường Bài Giảng THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC MƠI TRƯỜNG Giảng viên: Ths Nguyễn Thanh Hòa Email: nthoa@tlu.edu.vn Tel: 0904727546 Hà Nội, 9/2021 BÀI QUAN SÁT VI KHUẨN 1.1 Giới thiệu kính hiển vi sử dụng kính hiển vi 1.1.1 Cấu tạo kính hiển vi - Thị kính (1): hệ thấu kính, độ phóng đại 7; 8; 10 lần - Giá điều chỉnh vật kính (2) - Vật kính (3): thấu kính có độ phóng đại 10, 20, 40 100 lần - Các ốc chuyển (sơ cấp, thứ cấp) (4,5) - Khay kính đặt tiêu (6) - Đèn, gương (7), kính tụ quang (8): tạo ánh sáng hội tụ, tăng cường độ sáng tập trung vào mẫu vật - Vi chỉnh (9): dịch chuyển mẫu vật (trước sau trái-phải) 1.1.2 Sử dụng kính hiển vi Điều chỉnh nguồn sáng Lắp tiêu lên khay kính, sử dụng vật kính có độ phóng đại 10 trước, dùng ốc chuyển (sơ cấp thứ cấp) để điều chỉnh, sau quan sát thấy vi sinh vật chuyển sang vật kính có độ phóng đại cao (40) Sau quan sát xong nâng ống kính lên cao, lấy tiêu (Lưu ý: sử dụng ốc chuyển sơ cấp vừa chỉnh, vừa nhìn khoảng cách vật kính tiêu bản, tránh trường hợp vật kính va chạm, tiếp xúc mạnh gây vỡ lam kính hỏng vật kính) Bảo quản: Dùng bơng sạch, tẩm cồn lau vật kính, đặt khăn khơ mềm lên khay kính, hạ cho vật kính tiếp xúc với khăn Đặt kính hiển vi hộp để tránh bụi hạn chế ẩm 2.2 Làm tiêu nhuộm màu vi sinh vật Để quan sát hình dạng, cấu trúc, di động tính chất nhuộm màu vi sinh vật (vi khuẩn) kính hiển vi cần tiến hành làm tiêu vi sinh vật 2.2.1 Tiêu sống: Để quan sát hình dạng, khả di động, khả tạo bào tử sinh sản VSV - Tiêu giọt ép: Lấy lượng nhỏ canh trường lên phiến kính(sử dụng pipet que cấy), dàn mỏng Đặt kính nghiêng 60o cho cạnh kính tiếp xúc với giọt canh trường, từ từ hạ xuống để toàn giọt canh trường tiếp xúc với kính (tránh bọt khí) Chờ ổn định 1-2’ đem quan sát kính hiển vi - Tiêu giọt treo: Dùng phiến kính có lỗ lõm, lấy canh trường lên kính, lật ngược đặt lên phiến kính cho giọt canh trường lơ lửng lỗ 2.22 Nhuộm màu VSV: Nguyên tắc: dựa khả hấp phụ thuốc nhuộm dạng aniline kiềm trung tính VSV Mục đích: quan sát hình dạng, khả tạo bào tử, nha bào, tính chất nhuộm màu VK, … - Tiêu VSV sống nhuộm màu: thường dùng thuốc nhuộm có nồng độ 1%-1o/oo Thuốc nhuộm thường dùng fuchsin kiềm Sau nhuộm quan sát tế bào VSV có màu đậm so với màu kính trường Cách nhuộm (tiêu trần): lấy giọt nhỏ thuốc nhuộm lên phiến kính, dùng que cấy vơ trùng lấy canh trường VSV dàn lên giọt thuốc nhuộm, sau đem quan sát - Tiêu VSV chết nhuộm màu: để nhận biết số bào quan VSV nha bào, bào tử,… Cách nhuộm: lấy lượng canh trường thích hợp, dàn mỏng lên phiến kính, sau để khơ tự nhiên (cố định tiêu bản), nhuộm màu cách nhỏ thuốc nhuộm lên Tùy theo mục đích nghiên cứu, sử dụng cách: + Nhuộm đơn giản: sử dụng loại thuốc nhuộm (fucsine xanh metylen), ứng dụng quan sát hình dạng, nha bào + Nhuộm phức tạp: nhuộm nhiều loại thuốc nhuộm, ứng dụng nhuộm gram 2.3 Thực hành: Quan sát hình thái vi khuẩn (sử dụng tiêu trần) Vẽ hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn, chuỗi,…) Đánh giá chất lượng canh trường: khiết hay không khiết BÀI QUAN SÁT NẤM MỐC VÀ TẢO 2.1 Nấm mốc Vi nấm tên chung loại nấm hiển vi có cấu tạo dạng sợi  Cấu trúc: Cấu tạo dạng sợi, đơn bào đa bào phân nhánh mạnh Sợi nấm gọi khuẩn ty: - Khuẩn ty chất: đâm sâu vào môi trường, giúp hệ sợi bám chặt vào môi trường lấy chất dinh dưỡng - Khuẩn ty khí sinh: phát triển bề mặt mơi trường, nhận oxi từ khơng khí, mang quan sinh sản (bào tử) - Ở nấm đơn bào (Mucor, Rhizopus) khuẩn ty khơng có vách ngăn - Ở nấm đa bào (Penicillium, Aspergillus) khuẩn ty có vách ngăn  Đặc tính sinh lý: Nấm mốc dinh dưỡng cacbon theo kiểu dị dưỡng (sử dụng cacbon dạng tinh bột, xenlulo) Hơ hấp hiếu khí nhờ khuẩn ty khí sinh Phương thức sinh sản: + sinh sản hữu tính + sinh sản dinh dưỡng đoạn sợi nấm + sinh sản vơ tính bào tử (chủ yếu) Nấm mốc đơn bào: bào tử nang Nấm mốc đa bào: bào tử đính  Các nhóm nấm mốc điển hình Nấm mốc đa bào Sợi nấm đa bào, phân nhánh mạnh, sinh sản vơ tính bào tử đính Các chủng khác thường có màu sắc bào tử đính khác + Nấm Aspergillus: Đầu sợi nấm phình to, mang tế bào nhỏ thể bình Từ tế bào thể bình hình thành bào tử nhỏ đính vào tạo thành chuỗi.Cuống bào tử đính khơng có vách ngăn Các chủng khác có màu bào tử đính khác nhau: A Oryza: vàng hoa cau A Niger: màu đen A Uzami màu nâu đen A Flavus màu vàng chanh + Nấm penicillium: cuống bào tử đính phân nhánh phân đốt dạng chổi Màu bào tử đính: P nigricans vàng lục P notatum màu xanh lục P Pasteuricenus màu lục xẫm Nấm mốc đơn bào : Sợi đơn bào, phân nhánh, sinh sản bào tử nội sinh Sợi nấm màu trắng, bào tử màu đen già giống điển hình Mucor Rhizopus Nấm Mucor : cuống bào tử nang phân nhánh mọc lên vị trí sợi nấm Nấm Rhizopus : cuống bào tử nang hình thành nơi sợi nấm ăn sâu vào môi trường, cuống mọc thành cụm Chân cuống mọc nhiều sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường gọi rễ giả 2.2 Tảo Hình dạng kích thước : Tảo đơn bào : có kích thước nhỏ, 5-10 µm (hình trịn, lê,…) Tảo đơn bào : có 1, 2, tiên mao Có loại khơng có tiên mao (Chlorella) Tảo đa bào : - Dang xoắn (tế bào tảo xếp chuỗi) : spirulina - Dạng sợi : sợi đơn giản, đồng nhất, phân nhánh, phân đốt (zignema) - Dạng dị sợi : không đồng kích thước chiều dài, phân nhánh mạnh hơn, khơng phân đốt (stigeolenium) Cấu tạo : - Có sắc tố - Điểm mắt - Khơng bào khí Đặc điểm sinh lý : - Tự dưỡng quang - Sinh sản : sinh sản dinh dưỡng (bằng gãy khúc phân đơi) ; vơ tính bào tử ; hữu tính hợp tử 2.3 Thực hành : - Quan sát nấm mốc (màu sắc, hình dạng): + Đơn bào + Đa bào - Quan sát tảo: tảo đơn bào, đa bào (vẽ hình) BÀI PHÂN TÍCH COLIFORM VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI TRONG NƯỚC THẢI Coliform tên gọi chung nhóm trực khuẩn ngắn, khơng tạo bào tử, nhuộm gram âm, hơ hấp tùy tiện, có khả lên men lactoza sinh khí 48g 35oC 37oC Coliform phân thành loại:  Fecal – coli (E.coli) : có nguồn gốc từ phân (người, động vật máu nóng) Vì có mặt chúng nước dấu hiệu chứng tỏ nước bị nhiễm phân hay nhiễm nước thải sinh hoạt E coli phát triển hiếu khí mơi trường Endo (ở 37 oC) cho khuẩn lạc màu đỏ, ánh kim  Non Fecal-coli: có nguồn gốc khác (từ đất, cỏ) Trong mơi trường lỏng chứa lauryl sulfat (có thành phần lactoza N hữu cơ) Coliform hơ hấp yếm khí, sinh (là khí H2S, NH3, indole, skatole, ) Các khái niệm biểu thị: Tổng Coliform: MPN/100ml Chỉ số Coli: số tế bào Coli/1 lit nước Chuẩn độ Coli: số ml nước có tế bào Coli 3.1 Phân tích coliform phương pháp nhiều ống Nguyên tắc: dựa khả lên men đường lactoza sinh nhiều khí nhiệt độ 35oC37oC Kết tính dựa bảng thống kê MPN Lấy mẫu: Dùng bình thủy tinh túi lấy mẫu chuyên dụng vơ trùng, lấy mẫu trung bình nguồn cần kiểm tra Mẫu lấy xong cần phân tích Nếu chưa phân tích ngay, phải giữ mẫu nhiệt độ 2-3oC không ngày Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Môi trường Kesler: Pepton 5g Na2SO3 0,5 g Lactoza: 7,5 g H2O 1000ml KH2PO4 : 1,5 g pH 7,5 Có thể sử dụng mơi trường tổng hợp Lauryl sulfat: (pha theo hướng dẫn hộp) Nước muối sinh lý 0.85%: pha 8.5 g NaCl lit nước Dùng pipet hút vào ống nghiệm ml nước muối sinh lý, nút ống nghiệm không thấm nước thang trùng 110oC 30’ Sau thang trùng, lấy ống để nguội trước pha loãng mẫu Thực hành: Chuẩn bị dãy ống (mỗi dãy ống) Phân phối ống nghiệm ml môi trường pha lauryl sulfat, cho vào ống ống durham úp ngược, đậy nút không thấm nước Khử trùng môi trường 30’ nhiệt độ 110oC Sau lấy để nguội đến nhiệt độ phịng - Tiến hành phân tích: Pha lỗng mẫu: Tùy theo độ ô nhiễm mẫu: Nước ngầm, nước ao hồ, sông suối, nước thải trước xử lý hay sau xử lý,… mà định độ pha loãng cần thiết cho đảm bảo độ xác phân tích Mẫu pha lỗng nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp (10-1 – 10-5) Cấy mẫu pha lỗng vào mơi trường lauryl sulfat Chuẩn bị dãy (mỗi dãy ống), dãy ứng với mức pha loãng Lấy ml mẫu pha lỗng cấy vào ống Ví dụ: Dãy A: ống x 1ml (nồng độ 100 - khơng pha lỗng) Dãy B: ống x 1ml (nồng độ 10-1 - pha loãng 10 lần) Dãy C: ống x 1ml (nồng độ 10-2 - pha loãng 100 lần) hoặc: Dãy A: ống x 1ml (nồng độ 10-1 - pha loãng 10 lần) Dãy B: ống x 1ml (nồng độ 10-2 - pha loãng 100 lần) Dãy C: ống x 1ml (nồng độ 10-3 - pha loãng 1000 lần) Đặt ống nghiệm cấy mẫu vào tủ ấm, nuôi nhiệt độ 37oC 48 Những ống có lên men sinh khí ống Durham (ống Durham lên chứa khí) xác định dương tính, kết tính từ nồng độ pha lỗng cao ngược lại, tra bảng số MPN ứng với dãy pha lỗng chọn để có giá trị Coliform tổng chuẩn độ Coli 2.2 Định lượng E.coli Môi trường Endo: Lactoza: 10 g Na2SO3 (10%): 25 ml Pepton: 10 g Agar: 18-20 g K2HPO4: 3,5 g Fuchsin kiềm (bão hòa cồn 96o): ml Nước 1000ml Có thể sử dụng mơi trường Endo bán sẵn thị trường pha theo hướng dẫn, sau pha xong khử trùng 110oC 15’ Sau lấy phân phối vào hộp petri vô trùng (độ dày lớp Endo hộp khoảng 1.5mm) Đậy nắp hộp lại để nguội đến nhiệt độ môi trường Thực hành định lượng E.coli: pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp nước muối sinh lý Cấy mơi trường Endo: lấy 0.1 ml mẫu pha lỗng cấy lên hộp môi trường Endo (làm hộp song song), trang đều, nuôi 37oC 24 Nếu có E.coli mơi trường chuyển màu tím hồng khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim (khuẩn lạc có màu vàng Salmonella) II.3 Đánh giá kết Tra bảng xác định số MPN, chuẩn độ Coli Định lượng khuẩn lạc E.coli, tính số chuẩn độ Coli: + Chỉ số: c = a x f/3 (tế bào/lít) + Chuẩn độ Coli: b = 1000/c, (ml) Trong đó: a: tổng số khuẩn lạc có hộp petri thí nghiệm f: hệ số pha loãng b: chuẩn độ Coli, ml c: số Coli, tế bào/lit So sánh với Qui chuẩn hành tương ứng thơng số Coliform (ví dụ: nước thải sinh hoạt QCVN 14:2008/BTNMT) Nhận xét BÀI XÁC ĐỊNH NHU CẦU OXY SINH HÓA BOD 4.1 Định nghĩa Nhu cầu oxy sinh hóa BOD lượng oxy cần thiết để vi sinh vật oxy hóa chất hữu có khả phân huỷ sinh học 4.2 Lấy mẫu bảo quản Trong khoảng thời gian từ lúc mẫu lấy đến phân tích, mẫu nước phân huỷ đáng kể dẫn đến giá trị BOD mẫu giảm dần.Vì tốt phân tích mẫu sau lấy Trong trường hợp khơng phân tích cần giữ lạnh mẫu nhiệt độ đóng băng vịng 24 Đưa mẫu 200C trước phân tích 4.3 Bộ đo BOD Oxitop * Cấu tạo: - Thiết bị khuấy từ làm việc điện áp 230V/50Hz 120V/60Hz - Chai ủ màu tối tích 510ml - Các từ - Sensor BOD - Ống cao su chứa viên NaOH tinh thể để hấp thụ CO2 - Các bình định mức thể tích mẫu * Ngun tắc hoạt động: Quá trình ủ mẫu tiến hành hệ kín.Vi sinh vật sử dụng O2 q trình phân huỷ làm lượng O2 giảm dần, đồng thời khí CO2 tạo thành trình phân huỷ hạt kiềm hấp thụ làm áp suất chai giảm dần Sự giảm áp suất chuyển qua vi xử lý sensor chuyển thành giá trị BOD tương ứng 4.3.1 Xử lý mẫu - Trung hòa mẫu: dùng dung dịch NaOH 1N (hoặc đặc hơn) H2SO4 1N (hoặc đặc hơn) điều chỉnh pH mẫu khoảng 6,5 – 7,5 Thể tích axit bazơ cho vào khơng nên vượt q 0,5% thể tích mẫu Cần thiết dùng dung dịch đặc - Nước thải sinh hoạt thông thường không chứa chất độc đồng thời có đủ chất dinh dưỡng vi sinh vật thích hợp nên lấy phân tích mà khơng cần bổ sung vi sinh vật chất dinh dưỡng 4.3.2Cách tiến hành - Chọn thể tích mẫu: Thể tích mẫu lấy phụ thuộc vào khoảng giá trị BOD mẫu (xem bảng) Giá trị BOD mẫu ước đoán qua giá trị COD - Thông thường BOD = 50-80%COD Dựa vào giá trị lấy thể tích mẫu tương ứng bình định mức sẵn có Thể tích mẫu (ml) Khoảng BOD (mg/l) Hệ số 432 – 40 365 – 80 250 – 200 164 – 400 10 97 – 800 20 43,5 - 2000 50 - Đổ mẫu nước vào chai ủ mẫu - Cho khuấy từ vào - Đặt ống cao su lên miệng chai - Cho vào ống cao su viên NaOH Chú ý không để NaOH rơi vào mẫu - Vặn chặt sensor vào chai - Cài đặt thời gian sensor - Giữ chai thiết bị khuấy từ tủ 20oC ngày Trong q trình xác định đọc kết BOD sau khoảng thời gian khác nhau: ví dụ BOD3, BOD5, BOD7,… Kết BOD5 (mg/l) = D  hệ số D: số sensor BOD sau ngày Đánh giá kết