Bài giảng thí nghiệm vi sinh vật học môi trường

Sau khi quan sát xong nâng ống kính lên cao, lấy tiêu bản ra Lưu ý: khi sử dụng ốc chuyển sơ cấp luôn vừa chỉnh, vừa nhìn khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản, tránh trường hợp vật kính

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

Bộ môn kỹ thuật và quản lý môi trường

Bài Giảng

THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC MÔI

TRƯỜNG

Giảng viên: Ths Nguyễn Thanh Hòa Email: nthoa@tlu.edu.vn

Tel: 0904727546

Hà Nội, 9/2021

BÀI 1 QUAN SÁT VI KHUẨN

1.1 Giới thiệu về kính hiển vi và sử dụng kính hiển vi

1.1.1 Cấu tạo kính hiển vi

- Thị kính (1): hệ 2 thấu kính, độ phóng đại 7; 8; 10 lần

- Giá điều chỉnh vật kính (2)

- Vật kính (3): thấu kính có độ phóng đại 10, 20, 40

hoặc 100 lần

- Các ốc chuyển (sơ cấp, thứ cấp) (4,5)

- Khay kính đặt tiêu bản (6)

- Đèn, gương (7), kính tụ quang (8): tạo ánh sáng và hội

tụ, tăng cường độ sáng tập trung vào mẫu vật

- Vi chỉnh (9): dịch chuyển mẫu vật (trước sau hoặc

trái-phải)

1.1.2 Sử dụng kính hiển vi

Điều chỉnh nguồn sáng

Lắp tiêu bản lên khay kính, sử dụng vật kính có độ phóng đại 10 trước, dùng ốc chuyển (sơ cấp và thứ cấp) để điều chỉnh, sau khi quan sát thấy vi sinh vật mới chuyển sang vật kính có độ phóng đại cao hơn (40)

Sau khi quan sát xong nâng ống kính lên cao, lấy tiêu bản ra

(Lưu ý: khi sử dụng ốc chuyển sơ cấp luôn vừa chỉnh, vừa nhìn khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản, tránh trường hợp vật kính va chạm, tiếp xúc mạnh gây vỡ lam kính và hỏng vật kính)

Bảo quản: Dùng bông sạch, tẩm cồn lau vật kính, đặt khăn khô mềm lên khay kính, hạ cho vật kính tiếp xúc với khăn Đặt kính hiển vi trong hộp để tránh bụi và hạn chế ẩm

2.2 Làm tiêu bản và nhuộm màu vi sinh vật

Để quan sát hình dạng, cấu trúc, sự di động và tính chất nhuộm màu của vi sinh vật (vi khuẩn) trên kính hiển vi cần tiến hành làm tiêu bản vi sinh vật

2.2.1 Tiêu bản sống:

Để quan sát hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo bào tử và sinh sản của VSV

- Tiêu bản giọt ép:

Lấy 1 lượng nhỏ canh trường lên phiến kính(sử dụng pipet hoặc que cấy), rồi dàn mỏng Đặt lá kính nghiêng 60o sao cho cạnh của lá kính tiếp xúc với giọt canh trường, rồi từ từ hạ xuống để toàn bộ giọt canh trường tiếp xúc với lá kính (tránh bọt khí) Chờ ổn định 1-2’ rồi đem quan sát dưới kính hiển vi

- Tiêu bản giọt treo:

Dùng phiến kính có lỗ lõm, lấy canh trường lên lá kính, lật ngược rồi đặt lên phiến kính sao cho giọt canh trường lơ lửng trong lỗ

2.22 Nhuộm màu VSV:

Nguyên tắc: dựa trên khả năng hấp phụ thuốc nhuộm dạng aniline kiềm hoặc trung tính

của VSV

Mục đích: quan sát hình dạng, khả năng tạo bào tử, nha bào, tính chất nhuộm màu của

VK, …

- Tiêu bản VSV sống nhuộm màu: thường dùng các thuốc nhuộm có nồng độ 1%-1o/oo Thuốc nhuộm thường dùng fuchsin kiềm Sau khi nhuộm sẽ quan sát được tế bào VSV có màu đậm hơn so với màu của kính trường

Cách nhuộm (tiêu bản trần): lấy 1 giọt nhỏ thuốc nhuộm lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy canh trường VSV rồi dàn đều lên giọt thuốc nhuộm, sau đó đem quan sát

- Tiêu bản VSV chết nhuộm màu: để nhận biết một số bào quan của VSV như nha bào, bào tử,…

Cách nhuộm: lấy 1 lượng canh trường thích hợp, dàn mỏng lên phiến kính, sau đó để khô

tự nhiên (cố định tiêu bản), rồi nhuộm màu bằng cách nhỏ thuốc nhuộm lên trên

Tùy theo mục đích nghiên cứu, có thể sử dụng 1 trong 2 cách:

+ Nhuộm đơn giản: sử dụng 1 loại thuốc nhuộm (fucsine hoặc xanh metylen), ứng dụng trong quan sát hình dạng, nha bào

+ Nhuộm phức tạp: nhuộm 2 hoặc nhiều loại thuốc nhuộm, ứng dụng trong nhuộm gram

2.3 Thực hành:

Quan sát hình thái vi khuẩn (sử dụng tiêu bản trần)

Vẽ hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn, chuỗi,…)

Đánh giá chất lượng canh trường: thuần khiết hay không thuần khiết

BÀI 2 QUAN SÁT NẤM MỐC VÀ TẢO

2.1 Nấm mốc

Vi nấm là tên chung chỉ các loại nấm hiển vi có cấu tạo dạng sợi

 Cấu trúc:

Cấu tạo dạng sợi, đơn bào hoặc đa bào phân nhánh mạnh

Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty:

- Khuẩn ty cơ chất: đâm sâu vào môi trường, giúp hệ sợi bám chặt vào môi trường

và lấy chất dinh dưỡng

- Khuẩn ty khí sinh: phát triển trên bề mặt môi trường, nhận oxi từ không khí, mang

cơ quan sinh sản (bào tử)

- Ở nấm đơn bào (Mucor, Rhizopus) khuẩn ty không có vách ngăn

- Ở nấm đa bào (Penicillium, Aspergillus) khuẩn ty có vách ngăn

 Đặc tính sinh lý:

Nấm mốc dinh dưỡng cacbon theo kiểu dị dưỡng (sử dụng cacbon dạng tinh bột, xenlulo)

Hô hấp hiếu khí nhờ khuẩn ty khí sinh

Phương thức sinh sản:

+ sinh sản hữu tính

+ sinh sản dinh dưỡng bằng 1 đoạn sợi nấm

+ sinh sản vô tính bằng bào tử (chủ yếu)

Nấm mốc đơn bào: bào tử nang

Nấm mốc đa bào: bào tử đính

 Các nhóm nấm mốc điển hình

Nấm mốc đa bào

Sợi nấm đa bào, phân nhánh mạnh, sinh sản vô tính bằng bào tử đính Các chủng khác nhau thường có màu sắc bào tử đính khác nhau

+ Nấm Aspergillus: Đầu sợi nấm phình to, mang các tế bào nhỏ thể bình Từ các tế bào thể bình hình thành bào tử nhỏ đính vào nhau tạo thành chuỗi.Cuống bào tử đính không có vách ngăn Các chủng khác nhau có màu bào tử đính khác nhau:

A Oryza: vàng hoa cau

A Niger: màu đen

A Uzami màu nâu đen

A Flavus màu vàng chanh

+ Nấm penicillium: cuống bào tử đính phân nhánh phân đốt dạng chổi

Màu bào tử đính:

P nigricans vàng lục

P notatum màu xanh lục

P Pasteuricenus màu lục xẫm

Nấm mốc đơn bào :

Sợi đơn bào, phân nhánh, sinh sản bằng bào tử nội sinh

Sợi nấm màu trắng, bào tử màu đen khi già 2 giống điển hình là Mucor và Rhizopus Nấm Mucor : cuống bào tử nang phân nhánh và mọc lên ở bất kỳ vị trí nào của sợi nấm Nấm Rhizopus : cuống bào tử nang hình thành nơi sợi nấm ăn sâu vào môi trường, cuống mọc thành cụm Chân cuống mọc nhiều sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường gọi là rễ giả

2.2 Tảo

1 Hình dạng và kích thước :

Tảo đơn bào : có kích thước nhỏ, 5-10 µm (hình tròn, quả lê,…)

Tảo đơn bào : có 1, 2, 4 tiên mao

Có loại không có tiên mao (Chlorella)

Tảo đa bào :

- Dang xoắn (tế bào tảo xếp chuỗi) : spirulina

- Dạng sợi : sợi đơn giản, đồng nhất, ít phân nhánh, phân đốt (zignema)

- Dạng dị sợi : không đồng nhất về kích thước và chiều dài, phân nhánh mạnh hơn, không phân đốt (stigeolenium)

2 Cấu tạo :

- Có sắc tố

- Điểm mắt

- Không bào khí

3 Đặc điểm sinh lý :

- Tự dưỡng quang năng

- Sinh sản : sinh sản dinh dưỡng (bằng gãy khúc hoặc phân đôi) ; vô tính bằng bào

tử ; hữu tính bằng hợp tử

2.3 Thực hành :

- Quan sát nấm mốc (màu sắc, hình dạng):

+ Đơn bào

+ Đa bào

- Quan sát tảo: tảo đơn bào, đa bào (vẽ hình)

BÀI 3 PHÂN TÍCH COLIFORM VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI TRONG

NƯỚC THẢI

Coliform là tên gọi chung chỉ nhóm trực khuẩn ngắn, không tạo bào tử, nhuộm gram âm,

hô hấp tùy tiện, có khả năng lên men lactoza sinh khí trong 48g ở 35oC hoặc 37oC

Coliform được phân thành 2 loại:

 Fecal – coli (E.coli) : có nguồn gốc từ phân (người, động vật máu nóng) Vì vậy sự

có mặt của chúng trong nước là dấu hiệu chứng tỏ nước bị nhiễm phân hay nhiễm

nước thải sinh hoạt E coli phát triển hiếu khí trên môi trường Endo (ở 37oC) cho khuẩn lạc màu đỏ, ánh kim

 Non Fecal-coli: có nguồn gốc khác (từ đất, cây cỏ)

Trong môi trường lỏng chứa lauryl sulfat (có thành phần lactoza và N hữu cơ) Coliform

hô hấp yếm khí, sinh hơi (là các khí H2S, NH3, indole, skatole, )

Các khái niệm biểu thị:

Tổng Coliform: MPN/100ml

Chỉ số Coli: số tế bào Coli/1 lit nước

Chuẩn độ Coli: số ml nước ít nhất trong đó có 1 tế bào Coli

3.1 Phân tích coliform bằng phương pháp nhiều ống

C-37oC Kết quả được tính dựa trên bảng thống kê MPN

Lấy mẫu: Dùng bình thủy tinh hoặc túi lấy mẫu chuyên dụng vô trùng, lấy mẫu trung

bình của nguồn cần kiểm tra Mẫu lấy xong cần phân tích ngay Nếu chưa phân tích ngay, phải giữ mẫu ở nhiệt độ 2-3oC nhưng không quá 1 ngày

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường Kesler:

Pepton 5g Na2SO3 0,5 g

Lactoza: 7,5 g H2O 1000ml

KH2PO4 : 1,5 g pH 7,5

Có thể sử dụng môi trường tổng hợp Lauryl sulfat: (pha theo hướng dẫn trên hộp)

Nước muối sinh lý 0.85%: pha 8.5 g NaCl trong 1 lit nước Dùng pipet hút vào mỗi ống

nghiệm 9 ml nước muối sinh lý, nút ống nghiệm bằng bông không thấm nước rồi thang trùng ở 110oC trong 30’ Sau thang trùng, lấy ống ra để nguội trước khi pha loãng mẫu

Thực hành:

Chuẩn bị 3 dãy ống (mỗi dãy 5 ống)

Phân phối mỗi ống nghiệm 5 ml môi trường đã pha lauryl sulfat, cho vào mỗi ống 1 ống durham úp ngược, rồi đậy bằng nút bông không thấm nước

Khử trùng môi trường trong 30’ ở nhiệt độ 110oC Sau đó lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng

- Tiến hành phân tích:

Pha loãng mẫu:

Tùy theo độ ô nhiễm của mẫu: Nước ngầm, nước ao hồ, sông suối, nước thải trước xử

lý hay sau xử lý,… mà quyết định độ pha loãng cần thiết sao cho đảm bảo độ chính xác khi phân tích Mẫu được pha loãng bằng nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp (10-1 – 10-5) Cấy mẫu đã pha loãng vào môi trường lauryl sulfat

Chuẩn bị 3 dãy (mỗi dãy 5 ống), mỗi dãy ứng với 1 mức pha loãng Lấy 1 ml mẫu đã pha loãng cấy vào mỗi ống Ví dụ:

Dãy A: 5 ống x 1ml (nồng độ 100 - không pha loãng)

Dãy B: 5 ống x 1ml (nồng độ 10-1 - pha loãng 10 lần)

Dãy C: 5 ống x 1ml (nồng độ 10-2 - pha loãng 100 lần)

hoặc:

Dãy A: 5 ống x 1ml (nồng độ 10-1 - pha loãng 10 lần)

Dãy B: 5 ống x 1ml (nồng độ 10-2 - pha loãng 100 lần)

Dãy C: 5 ống x 1ml (nồng độ 10-3 - pha loãng 1000 lần)

Đặt các ống nghiệm đã cấy mẫu vào tủ ấm, nuôi ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ

Những ống có lên men sinh khí trong ống Durham (ống Durham nổi lên hoặc chứa khí) được xác định là dương tính, kết quả tính từ nồng độ pha loãng cao nhất ngược lại, rồi tra bảng chỉ số MPN ứng với dãy pha loãng đã chọn để có giá trị Coliform tổng

và chuẩn độ Coli

2.2 Định lượng E.coli

Môi trường Endo:

Lactoza: 10 g Na 2 SO 3 (10%): 25 ml

Pepton: 10 g Agar: 18-20 g

K 2 HPO 4 : 3,5 g Fuchsin kiềm (bão hòa trong cồn 96 o ): 3 ml

Nước 1000ml

Có thể sử dụng môi trường Endo bán sẵn trên thị trường và pha theo hướng dẫn, sau khi

pha xong khử trùng ở 110oC trong 15’ Sau đó lấy ra phân phối vào các hộp petri vô trùng (độ dày lớp Endo trong hộp khoảng 1.5mm) Đậy nắp hộp lại và để nguội đến nhiệt

độ môi trường

Thực hành định lượng E.coli: pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp bằng nước muối

sinh lý

Cấy trên môi trường Endo: lấy 0.1 ml mẫu đã pha loãng cấy lên mỗi hộp môi trường Endo (làm 3 hộp song song), trang đều, rồi nuôi ở 37oC trong 24 giờ Nếu có E.coli môi

trường sẽ chuyển màu tím hồng và khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim (khuẩn lạc có màu vàng

là Salmonella)

II.3 Đánh giá kết quả

1 Tra bảng xác định chỉ số MPN, chuẩn độ Coli

2 Định lượng khuẩn lạc E.coli, tính chỉ số và chuẩn độ Coli:

+ Chỉ số: c = a x f/3 (tế bào/lít) + Chuẩn độ Coli: b = 1000/c, (ml) Trong đó:

a: tổng số khuẩn lạc có trong 3 hộp petri thí nghiệm f: hệ số pha loãng

b: chuẩn độ Coli, ml c: chỉ số Coli, tế bào/lit

3 So sánh với Qui chuẩn hiện hành tương ứng về thông số Coliform (ví dụ: nước thải sinh hoạt QCVN 14:2008/BTNMT)

4 Nhận xét

BÀI 4 XÁC ĐỊNH NHU CẦU OXY SINH HÓA BOD

4.1 Định nghĩa

Nhu cầu oxy sinh hóa BOD là lượng oxy cần thiết để vi sinh vật oxy hóa các chất hữu cơ có khả năng phân huỷ sinh học

4.2 Lấy mẫu và bảo quản

Trong khoảng thời gian từ lúc mẫu được lấy đến khi phân tích, mẫu nước có thể phân huỷ đáng kể dẫn đến giá trị BOD của mẫu giảm dần.Vì vậy tốt nhất là phân tích mẫu ngay sau khi lấy Trong trường hợp không phân tích được ngay cần giữ lạnh mẫu ở nhiệt độ đóng băng nhưng cũng chỉ trong vòng 24 giờ Đưa mẫu về

200C trước khi phân tích

4.3 Bộ đo BOD bằng Oxitop

* Cấu tạo:

- Thiết bị khuấy từ làm việc ở điện áp 230V/50Hz hoặc 120V/60Hz

- Chai ủ màu tối có thể tích 510ml

- Các con từ

- Sensor BOD

- Ống cao su chứa viên NaOH tinh thể để hấp thụ CO2

- Các bình định mức thể tích mẫu

* Nguyên tắc hoạt động:

Quá trình ủ mẫu được tiến hành trong hệ kín.Vi sinh vật sử dụng O2 trong quá trình phân huỷ làm lượng O2 giảm dần, đồng thời khí CO2 tạo thành trong quá trình phân huỷ được các hạt kiềm hấp thụ làm áp suất trong chai giảm dần Sự giảm áp suất được chuyển qua một bộ vi xử lý trong sensor và chuyển thành giá trị BOD tương ứng

4.3.1 Xử lý mẫu

- Trung hòa mẫu: dùng dung dịch NaOH 1N (hoặc đặc hơn) hoặc H2SO4 1N (hoặc

đặc hơn) điều chỉnh pH của mẫu về khoảng 6,5 – 7,5 Thể tích axit hoặc bazơ

cho vào không nên vượt quá 0,5% thể tích mẫu Cần thiết có thể dùng dung dịch

đặc hơn

- Nước thải sinh hoạt thông thường không chứa các chất độc đồng thời có đủ các chất dinh dưỡng và vi sinh vật thích hợp nên có thể lấy phân tích ngay mà không cần bổ sung vi sinh vật và chất dinh dưỡng

4.3.2Cách tiến hành

- Chọn thể tích mẫu: Thể tích mẫu lấy phụ thuộc vào khoảng giá trị BOD của mẫu (xem bảng) Giá trị BOD của mẫu được ước đoán qua giá trị COD

- Thông thường BOD = 50-80%COD Dựa vào giá trị này lấy thể tích mẫu tương ứng bằng các bình định mức sẵn có

- Đổ mẫu nước vào chai ủ mẫu

- Cho con khuấy từ vào

- Đặt ống cao su lên miệng chai

- Cho vào ống cao su 2 viên NaOH Chú ý không được để NaOH rơi vào mẫu

- Vặn chặt sensor vào chai

- Cài đặt thời gian trên sensor

- Giữ chai trên thiết bị khuấy từ trong tủ 20oC trong 5 ngày

Trong quá trình xác định có thể đọc kết quả BOD sau khoảng thời gian khác nhau: ví

dụ BOD3, BOD5, BOD7,…

1 Kết quả

BOD5 (mg/l) = D  hệ số D: số hiện trên sensor BOD sau 5 ngày

2 Đánh giá kết quả