Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Gia Lâm, Hà Nội

Đồng thời, tạo được các dòng tế bào rễ tơ Đan sâm và xác định được một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ in vitro làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất c

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG, TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG TRỌT CÂY ĐAN SÂM

(SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

MÃ SỐ: 62.62.01.10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2016

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: 1 PGS TS NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

2 TS NINH THỊ PHÍP

Phản biện 1: PGS.TS ĐOÀN THỊ THANH NHÀN

Hội Sinh học

Phản biện 2: PGS.TS PHAN HỮU TÔN

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: TS TRẦN NGỌC HÙNG

Viện Nghiên cứu Rau quả

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) cây thuốc quý trong y học cổ truyền,

dùng làm thuốc được ghi đầu tiên trong sách "Bản kinh" Các nghiên cứu y học hiện đại cho thấy Đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch Nhu cầu sử dụng dược liệu Đan sâm trong hai thập kỷ gần đây gia tăng nhanh chóng Nếu như năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì nay con số đã lên tới 15.000 tấn/năm (Qin, 2006)

Mặc dù giá trị và nhu cầu Đan sâm tăng cao như vậy nhưng diện tích trồng cây Đan sâm ở Việt Nam còn rất hạn chế, không đủ cung cấp cho nhu cầu dược liệu Đan sâm trong nước Để đáp ứng về dược liệu Đan sâm, đẩy mạnh nhân nuôi là con đường tất yếu Bên cạnh phương pháp nhân giống truyền thống, ứng dụng công nghệ sinh học để nhân giống và nhân nuôi sinh khối cây dược liệu là hướng đi mới

và đúng đắn nhằm khắc phục những hạn chế trong sản xuất truyền thống Nhân

giống vô tính in vitro có nhiều ưu điểm như hệ nhân giống cao, cây giống giữ

nguyên được các đặc tính của cây mẹ, đồng đều, sạch bệnh, sức sống cao khi đưa ra trồng trên đất… nên đã và đang được ứng dụng rộng rãi vào sản xuất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây dược liệu Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc như như rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh, bền vững về mặt di truyền và tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng với cây mẹ, tạo sinh khối lớn Hơn nữa, gần đây sự phát triển hệ thống bioreactor mở ra nhiều triển vọng trong việc nuôi

cấy rễ ở quy mô công nghiệp (Guillon et al., 2006) Tại Việt Nam chưa có bất kỳ

công trình nghiên cứu nào áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất cây giống và nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp

Do vậy, đề tài này được tiến hành có ý nghĩa lớn về mặt khoa học và thực tiễn

1.2 MỤC TIÊU

1.2.1 Mục tiêu chung

Đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây Đan sâm có hệ số nhân

cao, chất lượng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật tối ưu để trồng cây Đan sâm ngoài đồng ruộng Đồng thời, tạo được các dòng tế bào rễ tơ Đan sâm và xác

định được một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ in vitro

làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất các hợp chất thứ cấp phục vụ công nghiệp dược liệu ở Việt Nam

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

(1) Xác định được các thông số kỹ thuật trong quy trình nhân giống in vitro cây

Đan sâm

(2) Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen nhờ vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm tạo được các dòng rễ tơ cây Đan sâm và

một số thông số của quá trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ Đan sâm

(3) Xác định được các biện pháp kỹ thuật (thời vụ, mật độ trồng, dinh dưỡng) thích hợp cho sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu rễ cây Đan sâm

1.3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã xác định được các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh

in vitro cây Đan sâm, từ đó xây dựng được quy trình vi nhân giống cây Đan sâm có

hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt, đáp ứng nhu cầu cây giống Đan sâm hiện nay trên thị trường Đồng thời, nghiên cứu đã thiết lập được quá trình tạo

và nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro, góp phần chủ

động tạo ra nguồn dược liệu Đan sâm sạch, chất lượng cao và làm tiền đề cho quy trình sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây Đan sâm Đề tài cũng cũng

đã xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng dược liệu Đan sâm, góp phần xây dựng quy trình trồng trọt cây Đan sâm cho hiệu quả kinh tế cao Do vậy, có thể nói, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt

Nam một cách có hệ thống và công phu về nhân giống in vitro, in vivo cây Đan

sâm, cảm ứng và nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về nghiên cứu cây Đan sâm và xây

dựng cơ sở lý luận cho việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối cây Đan sâm

bằng công nghệ sinh học và công nghệ truyền thống Từ đó, góp phần giúp cho các nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu và nghiên cứu các loại cây này trong tương lai

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐAN SÂM

2.1.1 Nguồn gốc

Cây Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc ngành Hạt

kín – Angiospermae, lớp 2 lá mầm - Dicotyledones, phân lớp Cúc - Asteridae, bộ Hoa môi – Lamiales, họ Hoa môi – Lamiaceae, chi Salvia

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn được biết đến với tên gọi là Radix

Salviae Miltiorrhizae, huyết sâm, huyết căn, xôn đ … là một loài thực vật sống lâu năm, loài bản địa của cả Trung Quốc và Nhật Bản

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

Đan sâm là cây thảo, lâu năm, cao khoảng 30 – 70 cm Thân phát triển thẳng đứng và vuông cạnh, phía trên thân cây phân nhánh Toàn thân được bao phủ bởi lớp lông mềm màu vàng và lông tuyến Lá kép lông chim lẻ mọc đối, 3-5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn Chùm hoa ô tròn, mọc ở đầu cành hoặc trên nách lá, gồm nhiều vòng chỗ dày, chỗ thưa xếp thành tầng dọc, dài 10 – 15 cm

Đan sâm có 13 – 21 rễ đ , được phát triển từ thân rễ chính Rễ Đan sâm nh dài hình trụ, dài 10 – 20 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm, ăn sâu xuống đất, cong queo,

có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nh Rễ có màu đ tươi, mặt ngoài nhăn nheo tạo thành rãnh nh song song xuôi theo chiều dài của rễ (Đỗ Tất Lợi, 2004)

2.1.3 Phân bố

Tại Trung Quốc, Đan sâm được trồng ở tỉnh Tứ Xuyên khoảng 100 năm về

trước (Wang et al., 2004) và được trồng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà

Bắc, Liêu Ninh, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Quý Châu, Quảng Đông, Sơn Tây Đan sâm được di thực vào Việt Nam khoảng những năm

1960, được trồng ở Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Văn Điển (Hà Nội), Bắc Hà (Lào Cai) và một số vườn thuốc khác Hiện nay, Đan sâm được chú ý phát triển để nhân rộng tại Trại Tam Đảo, Sapa và Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến cây thuốc Hà Nội

2.1.4 Yêu cầu điều kiện sinh thái của cây Đan sâm

Nhiệt độ thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm là 15 - 25oC, cây sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 20 - 26oC Cây ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ không khí dưới 10oC

Các đặc tính nhu cầu nước và hiệu quả sử dụng nước của cây Đan sâm trong điều kiện đất đai khác nhau đã được nghiên cứu Nước cần thiết trong toàn bộ chu

kỳ tăng trưởng của cây, nhu cầu nhiều nhất thường xảy ra từ tháng sáu đến tháng

tám và độ ẩm đất nên được duy trì mức tối đa khoảng 70% ở các giai đoạn (Gao et al., 2004)

Các nguyên tố vô cơ trong rễ Đan sâm, được thu thập từ khu vực sản xuất khác nhau, và các tính chất hóa lý của đất ở các vùng đã được phân tích Các thuộc tính chính của đất trồng Đan sâm trong khu vực sản xuất khác nhau là thịt pha cát

và sét, và độ pH của đất trong khoảng 6,0 - 8,7 Không có thành phần chính rõ ràng cho sự phát triển của Đan sâm đã được tìm thấy trong đất Do đó, Đan sâm có khả

năng thích ứng tốt trong môi trường sinh thái đất khác nhau (Zhao et al., 2004)

2.1.5 Giá trị dược liệu

Dịch chiết Đan sâm khi được chiết xuất bằng rượu đặc biệt có nhiều các sắc

tố diterpene như phenanthrenequinones (Chang et al., 1990), trong khi đó khi được

chiết xuất bằng nước thì dịch chiết thu được chứa nhiều các hợp chất phenolic (Lu and Foo, 2002)

Các thành phần hóa học chính trong rễ cây Đan sâm gồm các chất hòa tan trong lipid như tanshinone I, tanshinone II, tanshinone II, cryptotanshinone Đây là các hợp chất có hoạt tính dược học có tác dụng chống thiếu máu cục bộ, kháng

khuẩn, chống oxy hóa và các đặc tính kháng u (Gordon and Weng, 1992; Sze et

al., 2005; Wang et al., 2005)

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ DƯỢC LIỆU ĐAN SÂM

Năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì năm 2002 là 10.000 tấn trên toàn thế giới và lên tới 80.000 tấn/năm trong thời gian

gần đây (Hu et al, 2005)

Một trong các sản phẩm sử dụng phổ biến nhất có chứa dược liệu Đan sâm là Thiên Sứ Hộ Tâm Đan do các nhà khoa học Trung Quốc bào chế trên cơ sở kết hợp hai loại thảo dược là Đan sâm và tam thất để phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tăng cholesterol máu…

Có mặt trên thị trường từ năm 1993, tính đến nay có hơn 2 tỷ liều dùng được

kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị trong thời gian ngắn hoặc kéo dài tại

34 Quốc gia trên toàn thế giới như Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam Phi, Việt Nam

2.2.2 Tại Việt Nam

Đan sâm được di thực và sử dụng từ những năm 1960 ở Việt Nam và hiện nay loại dược liệu này được trồng thử nghiệm ở Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Hà Nội (Văn Điển) và một số vườn thuốc khác (Ngô Quốc Luật và cs., 2014)

2.3 CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT

2.3.1 Phương pháp nhân giống cây Đan sâm

Cây Đan sâm có thể nhân giống hữu tính bằng hạt hoặc vô tính từ rễ củ, tách

chồi và phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al., 2002;

Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các phương pháp nhân giống cây Đan sâm

Phương pháp nhân giống từ rễ

Chuyển cây ra đồng ruộng:

cuối tháng 10 hoặc khi cây đạt chiều cao 6-10 cm

Không có thông tin

Giâm củ: tháng 2-3 Chuyển cây ra đồng ruộng: khi cây đạt chiều cao 6-10 cm

2 Trồng cây

trực tiếp

Tháng 8 hoặc tháng 3 Cuối tháng

10 đến đầu tháng 11

Mật độ trồng: 33 (30-35 cm) x 23 (20)

Không có thông tin

Mật độ cây: 30-35 x 20-25 cm

Mật độ trồng: 33x23

Liu et al (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến khả năng

sinh trưởng phát triển của cây Đan sâm trồng tại tỉnh Shanxi, Trung Quốc Bảy khoảng cách trồng được khảo sát là 20 × 20 cm, 25 × 20 cm, 25 × 25 cm, 25 × 30

cm, 30 × 25cm, 35 × 25 cm và 35 × 30 cm Kết quả cho thấy tại khoảng cách trồng

20 x 20 cm, tỷ lệ cây sống thấp nhất (47%) trong khi có đến 88% cây sống ở khoảng cách trồng 25 x 20 cm

chỉ tiêu năng suất rễ, khoảng cách trồng 25 x 25 cm cho khối lượng rễ đạt cao nhất, cao hơn 20% so với khối lượng rễ thu được khi trồng cây ở khoảng cách

35 x 30 cm và 60% so với khoảng cách 35 x 25 cm

Hiện nay, ở các quy trình trồng cây Đan sâm thường sử dụng khoảng cách trồng khá lớn với khoảng cách hàng 25 hoặc 30 cm, khoảng cách cây 20 hoặc 25

cm Khoảng cách trồng này kích thích sự tổng hợp hoạt chất tanshione IIA (Wang

et al., 2003c; Jiang et al., 2004)

2.3.3 Phân bón

Bón phân quyết định năng suất và hoạt chất tích lũy trong rễ cây Đan sâm Chế độ phân bón hợp lý sẽ tạo điều kiện cho cây sinh trưởng phát triển thuận lợi, cho

năng suất cao, chất lượng dược liệu tốt

Đối với cây Đan sâm đất trồng cần chọn đất phù sa, đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều màu, cao ráo, thoát hơi nước Sau khi cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 – 25cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nước Dùng 15 – 20 tấn phân chuồng ủ với 1,4 – 2,8 tấn tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho một heta Tốt nhất, nên bón theo hốc để tiết kiệm phân và hạn chế c dại Hốc được chuẩn bị với khoảng cách 30x30 cm

2.4 KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO

2.4.1 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trong sản xuất cây dƣợc liệu

Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng cây

dược liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lượng một cách chủ động cho sản xuất

Việt Nam một số tác giả đã tiến hành nhân giống in vitro thành công trên

một số cây dược liệu quan trọng khác, sử dụng chồi đỉnh lấy từ các cây Lô hội

(Aloe vera Linne.) và tiến hành nhân giống vô tính in vitro Kết quả cho thấy, môi

trường nhân nhanh thích hợp là MS + 2,5 mg/l BAP + 0,6 mg/l α- NAA cho hệ số

nhân đạt 4,1 lần Một đối tượng khác là cây ba kích (Morinda officinalis How)

cũng được tái sinh thành công với vật liệu ban đầu là đoạn thân mang chồi nách trên môi trường thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + 1 mg/l BA với tỷ lệ chồi tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy là 96,6% Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 3,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA+ 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân là 10,13 lần (Hoàng Thị Thế và cs., 2013)

2.4.2 Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm

Nhiều công trình nhân giống vô tính cây Đan sâm với mục đích tạo ra giống

chất lượng cao đã được công bố bới một số tác giả như Feng et al (2004); Xu et

al (2008); Cai et al (1991), Zhao et al (2003

Tại Việt Nam, trước nghiên cứu này, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu

liên quan đến nhân nhanh in vitro cây Đan sâm được thực hiện bởi Tạ Như Thục

Anh và cs (2014) Tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng

đến khả năng nhân in vitro cây Đan sâm sử dụng vật liệu là chồi mầm từ củ giống

Nghiên cứu đã chỉ ra loại chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh và kích thích ra rễ cây Đan sâm trong

điều kiện in vitro

2.5 TẠO VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐAN SÂM

Hu and Alfermann (1993) tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm thông qua lây nhiễm

các cơ quan của cây in vitro với năm chủng vi khuẩn A.rhizogenes Trong quá trình

nhân nuôi rễ tơ, nhóm tác giả đã tìm ra môi trường bổ sung 3% đường và ammonium nitrate có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng sinh khối rễ tơ cũng như sự

tích lũy hoạt chất diterpenes Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 lây nhiễm với cây Đan sâm in vitro, Chen et al (1999) đã thu được các dòng rễ tơ

chuyển gen Nhóm tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền MS, MS-NH4 (môi trường MS không chứa ammonium nitrate) B5, WPM và 6,7-V đến

tốc độ tăng trưởng của rễ tơ cũng như khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp Kết quả cho thấy, tốc độ tăng trưởng rễ tơ và hoạt chất thứ cấp tích lũy ở rễ tơ khi nuôi cấy trên môi trường MS-NH4 và 6,7-V cao hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường

MS, B5 và WPM Theo kết quả nghiên cứu của Ge and Wu (2005), hàm lượng tanshinone tổng số tích lũy trong rễ tơ Đan sâm tăng 1,2 lần khi bổ sung 30 μM

Ag+ và 3,1 lần khi bổ sung 100 µg/ml YE vào môi trường nuôi cấy so với công thức đối chứng không bổ sung Ag+ và YE Yang et al (2012) đã tiến hành nghiên

cứu tác động của PEG, ABA và methyl jasmonate (MJ) đến sự tổng hợp tanshinone

ở rễ từ cây Đan sâm Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng 4 loại tanshinone trong rễ tơ cây Đan sâm tăng lên rõ rệt khi bổ sung 2% PEG và 200 µM ABA vào

môi trường nuôi cấy Cheng et al (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 3

yếu tố elicitor gồm Ag+, YE và MJ đến sự tích lũy hoạt chất tashinones Kết quả cho thấy, bổ sung kết hợp YE + Ag+, Ag+ + MJ và YE + Ag+ + MJ đã làm tăng hàm lượng tanshinones, đặc biệt bổ sung Ag+

+ MJ và YE + Ag+ + MJ làm tăng hàm lượng tanshinone lên 5 lần so với công thức đối chứng

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Hạt Đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge nhập từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung Quốc

- Chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 được cung cấp bởi Trung tâm

Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nội dung 1- Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm

- Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Đan sâm

- Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm

- Thí nghiệm 9 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây Đan sâm

in vitro trên môi trường ra rễ đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm

- Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới sự sinh trưởng và phát triển của cây Đan sâm

3.2.2 Nội dung 2-Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm

- Thí nghiệm 11 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm

- Thí nghiệm 12 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dịch khuẩn A.rhizogenes

đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm

- Thí nghiệm 13 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ

- Thí nghiệm 14 Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ

- Thí nghiệm 15 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ

- Thí nghiệm 16 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối của rễ tơ Đan sâm

- Thí nghiệm 17 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

- Thí nghiệm 18 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến

sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

- Thí nghiệm 19 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm

3.2.3 Nội dung 3-Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất nâng cao năng suất chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm

- Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

- Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

- Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số công thức phân bón đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm

3.3 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

3.3.1 Nhóm thí nghiệm trong phòng

Các thí nghiệm sử dụng môi trường nền MS hoặc B5 + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8h

tối, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C

Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm của bộ môn CNSH Thực vật, Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 30 mẫu với các thí

nghiệm trong nội dung xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm, 100

mẫu đối với thí nghiệm chuyển gen và 9 mẫu đối với thí nghiệm nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm

3.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

Các thí nghiệm sử dụng môi trường nền MS hoặc B5 theo từng thí nghiệm +

30 g/l đường + 7,0 g/l agar Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước

khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút (khối lượng agar có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm)

Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16h sáng/8h tối, cường độ ánh sáng 2000-2500 lux,

nhiệt độ 25 ± 20C (thời gian chiếu sáng có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm)

3.3.1.2 Phương chuyển gen và kiểm tra mẫu chuyển gen

a) Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Vi khuẩn A.rhizogenes chủng ATCC 15834 bảo quản ở -800C được hoạt hóa bằng cách nuôi trải trên môi trường LB đặc trong 48h ở 280C trong điều kiện tối Sau đó, một khuẩn lạc đơn được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường LB l ng, lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16h Dịch khuẩn được ly tâm thu sinh khối ở tốc độ

4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút Sinh khối vi khuẩn sau đó được hòa loãng trong môi trường MS l ng và xác định mật độ vi khuẩn dựa trên giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bước sóng 600 nm (OD600)

b) Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn

Lá, cuống lá và đoạn thân cây Đan sâm in vitro sinh trưởng phát triển tốt được cắt và tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng vào dịch khuẩn A.rhizogenes và cấy trên

môi trường đồng nuôi cấy là môi trường MS + 30 g/l sucrose trong 5 ngày trong điều kiện tối

c) Diệt khuẩn và tái sinh tạo rễ tơ

Kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy được chuyển sang môi trường diệt khuẩn và tái sinh là môi trường MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim trong điều kiện tối Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 4 tuần

d) Xác định rễ tơ chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

DNA tổng số của các mẫu rễ tơ được tách chiết theo Kit tách chiết của

Qiagen Phương pháp PCR được thực hiện để khuếch đại gen rolA và gen virD

bằng các cặp mồi đặc hiệu

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agrose 1%,

bổ sung ethidium bromide (7 µl/100ml đệm TAE), hiệu điện thế 60 V, thời gian 60 phút Gel agarose được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại

3.3.2 Nhóm thí nghiệm ngoài đồng ruộng

Các thí nghiệm được bố trí từ tháng 1/2014 -4/2015 tại khu thí thực nghiệm của Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thí nghiệm bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công thức nhắc lại 3 lần (3 ô thí nghiệm) Diện tích mỗi ô thí nghiệm 5 m2, tổng diện tích thí nghiệm của 1 công thức là 15 m2 Các ô thí nghiệm được đánh luống cao 30 cm, mỗi ô thí nghiệm cách nhau 40 cm Cây Đan sâm được trồng vào thời vụ tháng 2 năm 2014 (riêng thí nghiệm thời vụ bố trí theo các công thức đã xây dựng), với khoảng cách trồng 30 x

30 cm, tương đương 11 cây/m2 (riêng thí nghiệm mật độ trồng, bố trí theo công thức đã xây dựng), 55 cây/1 ô thí nghiệm, 165 cây/công thức, sử dụng lượng phân

bón chung cho các thí nghiệm là 2 tấn phân vi sinh sông gianh + 90 kg N + 120 kg

P2O5 + 90 kg K2O (riêng thí nghiệm phân bón, bón theo các công thức đã xây dựng) Bón lót toàn bộ phân vi sinh và phân lân Phân đạm và kali được bón thúc làm 3 đợt: Đợt 1 sau trồng 45 ngày bón 30% phân N + 30% K; Đợt 2: sau trồng 3 tháng bón 50% N + 30% K, đợt cuối cùng sau trồng 6 tháng bón nốt lượng phân N

và K còn lại Làm c và quản lý nước, kiểm tra sâu bệnh thường xuyên đảm bảo cây sinh trưởng, phát triển tốt

Cây giống được trồng trong 3 thí nghiệm này là đều là cây có nguồn gốc nuôi cấy mô Tiêu chuẩn cây con khi trồng: Cây được giâm trên giá thể cát + xơ dừa (tỷ lệ 1:1) trong thời gian 30 ngày, cây có chiều cao >4 cm, có 9 lá/cây, cây sinh trưởng kh e

3.3.2.1 Phương pháp xác định khối lượng rễ tươi

Kết thúc quá trình nuôi cấy, rễ tơ được thu nhận, rửa sạch môi trường và loại

b hoàn toàn nước bằng giấy thấm Sau đó cân rễ bằng cân phân tích để xác định khối lượng rễ tươi

3.3.2.2 Phương pháp xác định khối lượng rễ khô

Rễ tơ sau khi thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 400C đến khối lượng không

đổi để xác định khối lượng rễ khô theo phương pháp của Ge et al (2005)

3.3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất mục tiêu

Ba hoạt chất mục tiêu gồm cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA trong rễ tơ Đan sâm được xác định bằng phương pháp sắc ký l ng cao áp (HPLC) tại Phòng Thí nghiệm Trung tâm – Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 2-10 tuần tùy từng thí nghiệm Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTAT 5.0.

Mô hình thống kê sử dụng cho thí nghiệm

Yij = µij + aij + eij; Trong đó: i=1….I; j= 1……Ii

- Yij: Giá trị quan sát của chỉ tiêu theo dõi

- µij: Giá trị trung bình mẫu

- ai: Hiệu quả của công thức thí nghiệm i

- eij: Sai số ngẫu nhiên của các giá trị quan sát

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐAN SÂM

4.1.1 Tạo vật liệu khởi đầu

Tạo nguồn vật liệu khởi đầu là bước quan trọng có ý nghĩa quyết định đến sự

thành công của quy trình nhân giống in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo tỷ lệ mẫu

nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh và sinh trưởng cao

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm

sau 2 tuần nuôi cấy

GA3 (mg/l) Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi

GA3 có tác dụng làm tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt Đan sâm trên môi trường MS

Nồng độ bổ sung tối ưu nhất là 1,0 mg/l GA3, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 40,43% 4.1.2 Nhân nhanh chồi

Trong nhân giống cây trồng in vitro, để có được hệ số nhân giống cao, số lượng

cây giống lớn, đồng nhất, cây có sức sinh trưởng tốt thì việc xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp có vai trò quyết định Cytokinin là nhóm chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự tái sinh mẫu cấy theo hướng tạo chồi làm tăng hệ số nhân Tuy nhiên, với mỗi loại chất kích thích sinh trưởng khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau ở mỗi loài cây và giai đoạn nuôi cấy

Bổ sung BA làm tăng hệ số nhân chồi Đan sâm so với công thức đối chứng Trong đó, môi trường MS+0,5mg/l BA cho hệ số nhân chồi (5,05 lần) và chiều cao chồi (4,08 cm) đạt cao nhất (Bảng 4.2)

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

sau 4 tuần nuôi cấy

BA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm)

rõ rệt (Bảng 4.3)

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm

sau 4 tuần nuôi cấy

Kinetin (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm)