Nghiên Ứu Khả Năng Phân Hủy Miroystin Ủa Vi Khuẩn Nướ Sphingomonas.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Th Hu NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI KHUN NƯC Sphingomonas LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC K THUẬT MÔI TRƯNG Hà Nội – Năm 201[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Lê Th Hu

NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI

KHUN NƯC Sphingomonas

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC K THUẬT MÔI TRƯNG

Hà Nội – Năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Đ ho n th nh chương tr nh cao h c v vi t lu n văn n y, ngo i s n l c c a

b n thân, tôi đ nh n ợđư c s hướng dẫn, gi p đ , đ ng viên v góp ý nhiệt tình c a nhi u t p th v c nhân

Qua đây, tôi xin chân thành c m ơn c c thầy cô gi o Viện Khoa h c v Công nghệ Môi trư ng Đ i h c B ch Khoa H N i đ nhiệ- t tình gi ng d y và truy n đ t cho tôi những ki n thức quý báu, b ổ ích v gi p đ tôi trong suốt khóa h c vừa qua cũng như t o đi u kiện cho tôi hoàn thành lu n văn tốt nghiệp này

Với lòng bi t ơn sâu sắc, tôi xin chân thành c m ơn ngư i hướng dẫn khoa h c:

TS Nguyễn Thị Hoài Hà - Phòng Sinh h c T o - Viện Vi sinh v t và Công nghệ Sinh

h c - Đ i h c Quốc gia Hà N i đ d nh rất nhi u th i gian và tâm huy t hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành lu n văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành c m ơn TS Đặng Minh Hằng Viện Khoa h c v Công

-nghệ Môi trư ng - Đ i h c B ch Khoa H N i đ quan tâm, gi p đ , t o đi u kiện đ tôi th c hiện và hoàn thành lu n văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành c m ơn Th.S Ph m Thị Bích Đ o c n b Ph ng sinh h c

T o, nhóm tác gi đ tài mã số: 01C-09/01-2012-2 v c c cán b Viện Vi sinh v t và Công nghệ Sinh h c Đ- i h c Quốc gia Hà N i đ t o đi u kiện, t n tình gi p đ tôi trong su t quá trình làm luố n văn vừa qua

Nhân đây, tôi xin chân th nh b y tỏ lòng bi t ơn tới gia đ nh, b n bè c ng c c anh, chị, em đ đ ng viên, gi p đ tôi trong su t quá trình hố c t p, đ nhiệt t nh đóng góp ý ki n đ lu n văn c a tôi thêm ho n thiện

Mặc d tôi đ có nhi u cố gắng ho n thiện lu n văn bằng tất c s nhiệt t nh v năng l c c a m nh, tuy nhiên không th tr nh khỏi những thi u sót, rất mong nh n được những đóng góp quý b u c a quý thầy cô v c c b n

Hà N i, th ng 03 năm 2014

H c viên

Lê Thị Huệ

M C L C

MỞ ĐẦU 2

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 T o lam Microcystis 5

1.2 Đ c tố mcirocystin (MC) 8

1.2.1 Đặc đi m, cấu tr c c a microcystin 8

1.2.2 Đ c tính c a microcystin 11

1.2.2.1 Ảnh hưởng đ c h i c a microcystin lên c c lo i đ ng v t th y sinh 13

1.2.2.2 Ảnh hưởng đ c h i c a microcystin lên cơ th ngư i 14

1.3 Lo i bỏ MC h a tan trong c c qu tr nh xử lý nước 15

1.3.1 Quang phân 15

1.3.2 Qu tr nh khử bằng ozon 15

1.3.3 Khử bằng clo 15

1.3.4 L c bằng carbon ho t tính 17

1.3.5 L c ch m 19

1.3.6 Phân h y sinh h c MC 21

1.4 Vi khuẩn phân h y MC 21

1.4.1 Vi khuẩn dị dư ng Sphingomonas 21

1.4.2 Cơ ch phân h y đ c tố microcystin c a Sphingomonas 24

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng v th i gian nghiên cứu 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Môi trư ng nuôi cấy 26

2.1.4 M y móc, dụng cụ 27

2.2 Phương ph p nghiên cứu 27

2.2.1 Phân l p VKDD từ nước hồ nở hoa 27

2.2.2 Nghiên cứu đặc đi m sinh lý, sinh ho 27

2.2.2 1 Nhu m Gram 27

2.2.2.2 Ph n ứng Catalase 28

2.2.2.3 Ph n ứng Oxidase 29

2.2.3 Phân lo i 16S rDNA 29

2.2.4 Phương ph p nghiên cứu enzyme protease 31

2.2.4.1 Nuôi VKDD đ thu nh n enzyme 31

2.2.4.2 X c định ho t đ protease theo phương ph p Anson c i ti n 31

2.2.4.3 Điện di protease trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương ph p Heusen v Dowdle [27] 32

2.2.5 Nghiên cứu nh hưởng c a c c đi u kiện nuôi đ n s phân h y microcystin 33

2.2.5.2 Ảnh hưởng c a nồng đ microcystin 33

X c định h m lượng microcystin trên m y quang phổ 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kh o s t mức đ ph dư ng trong hồ Ho n Ki m 35

3.2 S ng l c v tuy n ch n VKDD phân h y microcystin từ nước hồ Ho n Ki m, H N i 36

3.2.1 Phân l p c c ch ng VKDD từ nước hồ Ho n Ki m 36

3.2.2 S ng l c VKDD có kh năng phân h y đ c tố microcystin 39

3.2.3 Đặc đi m sinh h c v h nh d ng t b o c a VKDD S1 42

3.2.3.1 Đặc đi m h nh th i t b o c a VKDD S1 42

3.2.3.2 Ảnh hưởng c a đi u kiện nuôi cấy đ n sinh trưởng c a VKDD S1 42

3.2.4 X c định tr nh t đo n gen 16S rDNA c a VKDD S1 45

3.3 Nghiên cứu enzyme phân h y đ c tố microcystin c a Sphingomonas sp., S1 48

3.3.1 Ảnh hưởng c a pH đ n ho t đ protease 48

3.3.2 Ảnh hưởng c a nhiệt đ đ n ho t đ protease 49

3.3.3 Đ b n với nhiệt theo th i gian xử lý ở 60oC 51

3.3.4 Ảnh hưởng c a c c chất ức ch đặc hiệu đ n ho t tính enzyme protease 52

3.3.5 Ảnh hưởng c a ion kim lo i đ n ho t tính enzyme protease 53

3.3.6 Phân tích th nh phần protease bằng điện di 54

3.4 Kh năng phân h y MC c a VKDD Sphingomonas sp., S1 56

3.4.1 Ảnh hưởng c a nhiệt đ 56

3.4.2 Ảnh hưởng c a số lượng vi khuẩn 59

3.4.3 Ảnh hưởng c a nồng đ microcystin 60

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PH L C 1 69

DANH M C CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ vi t tắt Tên đầy đ

BOD Biochemical oxygen dermand - Nhu cầu oxy sinh h c COD Chemical oxygen demand - Nhu cầu oxy hóa h c

DO Oxygen demand – H m lượng oxy hòa tan

DNA Deoxyribonucleic acid

DMSO Dimethyl Sulfoxide

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid

LD50 Median lethal dose – Li u lượng gây ch t 50% số sinh v t

thí nghi m ệ

MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of microcystin

MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin

MC-YR Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin

Ophe O –Phenanthroline

PCMB p- Chloromer curibenzoate

PCR Polymerase chain reaction – Ph n ứng trùng hợp

PMSF Phenyl methyl sulfonyl fluoride

PP1 và PP2A Protein Photphataza 1 và 2A

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SS Suspended solids Các ch– ất lơ lửng

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

VKDD Vi khuẩn d ịdư ng

WHO World Heath Organisation – Tổ chức y t th giới

DANH M C CÁC BẢNG

B ng 1.2 Ảnh hưởng c a microcystin đ n cá [28] 12

B ng 3.1 Đặc đi m hình thái c a 5 ch ng VKDD phân l p t hừ ồ Hoàn Ki m 37

B ng 3.2 Đặc đi m sinh lý, sinh hoá c a 5 ch ng VKDD phân l p t hừ ồ Hoàn Ki m 38

B ng 3.3 Ảnh hưởng c a pH đ n ho t đ protease c a Sphingomonas sp., S1 48

B ng 3.4 S thay đổi ho t đ protease c a Sphingomonas sp., S1 theo nhiệt đ 50

B ng 3.5 S thay đổi ho t đ protease c a Sphingomonas sp., S1 theo th i gian xử lý

ở 60oC 51

B ng 3.6 Nồng đ microcystin còn l i với s phân h y c a VKDD Sphingomonas sp.,

S1 các nhiở ệt đ khác nhau 57

B ng 3.7 Nồng đ microcystin còn l i với s phân h y c a VKDD Sphingomonas sp.,

S1 có số lượng vi khu n khác nhau ẩ 59

B ng 3.8 Lượng microcystin còn l i với s phân h y c a VK Sphingomonas sp., S1 ở

các nồng đ MC khác nhau 61

DANH M C CÁC H NH V Đ THỊ Hình 1.1 Microcystis t o thành váng dày nổi trên mặt nư c [27] 5 ớ

Hình 1.2 T p đo n t bào Microcystis (×40) 5

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hóa h c c a microcystin [11] 9

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hoá h c c a đ c tố MC – LR [46] 10

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hoá h c c a đ c tố MC – RR [46] 10

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc hoá h c c a đ c tố MC – YR [46] 11

Hình 1.7 Vi khuẩn ị dư ng Sphingomonas d dưới kính hi n vi điện tử [45] 22

H nh 1.8 Con đư ng phân h y microcystin bằng Sphingomonas [39] 25

H nh 2.1 Địa đi m thu mẫu hồ Hoàn Ki m Địa đi m A [47] 26 -

H nh 3.1 H nh th i khuẩn l c ch ng VKDD S1 37

H nh 3.2 H nh th i khuẩn l c ch ng VKDD S2 37

H nh 3.3 H nh th i khuẩn l c ch ng VKDD S3 38

H nh 3.4 H nh th i khuẩn l c ch ng VKDD S4 38

H nh 3.5 H nh th i khuẩn l c ch ng VKDD S5 38

H nh 3.6 Kh năng phân h y MC c a 7 VKDD phân l p từ hồ Hoàn Ki m 41

H nh 3.7 H nh d ng t b o VKDD S1 dưới kính hi n vi điện tử (SEM×60.000) 42

H nh 3.8 Đ ng th i sinh trưởng VKDD S1 43

H nh 3.9 Ảnh hưởng c a nhiệt đ nuôi cấy đ n VKDD S1 43

H nh 3.10 Ảnh hưởng c a pH lên VKDD S1 44

H nh 3.11 DNA tổng số c a VKDD S1 45

H nh 3.12 S n phẩm PCR nhân đo n gene 16S rDNA c a VKDD S1 45

H nh 3.13.Cây ph hệ d a trên phân tích gi i trình t 16S rDNA c a

VKDD S1, S2 và các loài có quan hệ h hàng gần (2*) 47

H nh 3.14 Ảnh hưởng c a pH đ n ho t đ protease ở Sphingomonas sp.,S1 49

Hình 3.15 Ảnh hưởng c a nhiệt đ đ n ho t đ protease ở Sphingomonas sp.,S1 50

H nh 3.16 S bi n đổi ho t đ protease c a Sphingomonas sp., S1 theo th i gian xử lý

H nh 3.20 Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease

c a Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Ca2+ 55

H nh 3.21 Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease

c a Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Mg2+(3*) 56

H nh 3.22 S phân h y microcystin bởi VKDD Sphingomonas sp S1 ở

H nh 8 Bi n đ ng PO43- trung bình c a mẫu nước hồ Hoàn Ki m tháng 3, 4, 5/2012 8

H nh 9 Bi n đ ng SS trung bình c a mẫu nước hồ Hoàn Ki m tháng 3, 4, 5/2012 8

MỞ ĐẦU Hiện nay, trên th giớ ử lý đ c tố vi t o lam trong th i kỳ ở hoa nước đang i x n được các quốc gia quan tâm đặc biệ Đ có không ít c c công tr nh nghiên cứt u hiện tượng nở hoa nước và gi m thi u tác h i c a đ c tố t o lam gây đ c, tuy nhiên k t qu vẫn còn các mở ức đ khác nhau Hồ Hoàn Ki m_ địa danh nổi ti ng c a th đô là m t

hồ nông, kín, chất lượng nước thay đổi d n tẫ ới s suy gi m m t s loài vi t o đặc h u, ố ữđồng th i gia tăng m t đ c a vi t o lam sin đh c tố và gây nên nh ng lo ng i v môi ữtrư ng cho khu hệ đ ng th c v t s ng trong hố ồ

Trong số các loài vi t o lam gây n ở hoa nước hồ Hoàn Ki m, Microcystis

aeruginosa Kutzing là loài bắt gặp thư ng xuyên và phổ bi n nhất Microcystis

aeruginosa chứa đ c tố thu c nhóm hepatotoxin (đ c tố gan) cấu t o từ các peptid

m ch vòng có tên g i là microcystin (MC) [27,43 ] Ch ng l c c heptapeptide m ch

v ng có chứa 1 amino acid đặc hiệu (Adda) chu i bên Cho đ n nay, đây l những

d ng cấu tr c đặc biệt chỉ gặp ở microcystin Microcystin có hơn 90 đồng phân, chúng

kh c nhau ở c c nhóm methyl (R1 v R2) v 2 amino acid (ở vị trí X v Z) bên trong chu i Từ đó dẫn đ n s kh c nhau v cấu tr c b c 4, tính đ c cũng như c c đặc tính ưa nước hoặc kỵ nước Có 4 lo i đ c tố MC-YR, MC-RR, MC-YA, MC-LR, trong đó

MC-LR phổ bi n v có tính đ c cao nhất Khi v o gan, microcystin sẽ ức ch hepatocyte protein photphat PP1 v PP2A, từ đó gây ra siêu phosphoryl ho

cytokeratin v dẫn đ n s ph v c c vi sợi, tho t dịch t b o v ch y m u gan đ ng

v t S ti p x c lâu d i với nồng đ microcystin thấp trong nước uống làm nh hưởng

đ n c c cấu tr c t b o, qu tr nh nguyên phân dẫn đ n kích thích gây ung thư gan ở ngư i Năm 1989, WHO đ triệu t p m t nhóm chuy n gia Quốc t đ có c i nh n tổng quan nhất v lĩnh v c n y v đưa ra mức giới h n nồng đ đ c MC LR trong nước -uống l 1,5g/l Song công bố gần đây nhất, mức giới h n MC-LR trong nước uống

được l m tr n xuống m t chữ số là 1,0g/l, đ đ m b o sức khoẻ con ngư i

Microcystin thư ng tích luỹ trong n i quan t bào hoặc dưới d ng t trong donước Việc lo i bỏ microcystin trong nước có th th c hiện bằng nhi u phương ph p

kh c nhau trong đó phương ph p sinh h c đang được th giới quan tâm Xử lý

đổi thành phần lo i qua đó gi p gi m thi u nguy cơ suy gi m đa d ng sinh h c Ngoài

ra, việc tìm VKDD bra n địa có kh năng phân h y microcystin cao s mẽ ở ra tri n

v ng xử lý microcystin t i ngu n, gi m thiồ u s lưu h nh c a đ c tố này, gi m nguy cơ đối với sức khỏe con ngư i và hệ sinh thái Từ những y u tố trên cho th y, x ấ ử lý microcystin bằng biện pháp sinh h c mang tính b n vững cao

Với mong mu n góp thêm mố t công c trong xụ ử lý đ c t tố o lam h Hoàn ở ồ

Ki m, tôi th c hiện đ tài: “Nghiên cứ kh năng phân hy microcystin ca vi u

cấp Thành phố Hà N i “Nghiên c u xây d ng quy tr nh phân h y đ c t m crocystin i

c a t o lam Microcystis aeruginosa b ng vi khu n d dư ng nh m b o v nư c hồ Hoàn Kiếm, Hà N i” mã số đ tài: 01C-09/01-2012-2, ch nhiệm đ tài TS Nguy n ễThị Hoài Hà

Lu n văn gồ ầ ở đầ ị v 03 chương n i dung:

Tổng quan, phương ph p nghiên cứu, k t qu và th o lu n K t qu được trình bày trong chương 3 trong đó, :

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trình bày các phương pháp đượ ác c t gi sử d ng trong quá ụ trình nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N Ậ

3.1 Kh o s t v đ nh gi mức đ ph dư ng c a ồh Hoàn Ki m (B ng 1 ph l c 2) ụ ụtác gi k thừa k t qu c a nhóm tác gi đ tài 01C-09/01-2012-2;

3.2 Sàng l c và tuy n ch n VKDD phân h y microcystin t ừ nước h Hoàn Ki m, Hà ồ

N i: t ác gi ph ân l p tuy n ch n được 5 ch ng VKDD ừ nước hồ t HOàn Ki m có khnăng ân hph y MC Định danh được 2 VKDD thu c chi Sphingomonas

- Mục 3.2.4 X c định trình t đo n gen 16S rDNA v định danh VKDD S1, S2 tác gi tham gia cùng Th.S Ph m Thị Bích Đ o, TS Nguy n Th Hoài Hà ễ ị

3.3 Nghiên c u enzyme phân hứ y đ c tố microcystin c a Sphingomonas sp., S1: Nghiên c u tính ứ chất, ho đ protease c a enzyme VKDD Sphingomonas sp., S1

- Mục 3.3.5 Ảnh hưởng c a ion kim lo i đ n ho t tính enzyme protease c a Sphingomonas sp., S1

- M c 3.3.6 Phân tích thành ph n protease bụ ầ ằng điện di tác gi tham gia cùng

Th.S Ph m Th ịBích Đ o, TS Nguy n Th Hoài Hà ễ ị

3.4 Kh năng phân h y MC c a VKDD Sphingomonas sp., S1

Các k t qu tác gi trình bày trong lu n văn đ được s đồng ý cho phép c a

ch nhi m và nhóm tác gi ệ đ tài mã s ố 01C-09/01-2012- 2

Trong quá làm lu n v t ăn ác gi ti n hành th í nghi m cùng nhóm ệ đ t ài 01C09/01 2012- -2 và nh n được s giúp đ c a TS Nguy n ễ Thị Hoài Hà, Th.S Ph m Thị

-Bích Đào cùng c ác thành ên trong nhóm vi đ t ài 01C-09/01-2012-2

Lu n văn đ s ng l c, tuy n ch n được ch ng vi khuẩn dị dư ng có kh 5 năng phân h y microcystin từ nước hồ Ho n Ki m, trong đó có 2 ch ng thu c chi Sphingomonas; Nghiên cứu tính ch t, ho t đ protease c a enzyme ấ VKDD Sphingomonas sp., S1 và kh năng phân h y đ c tố microcystin c a VKDD Sphingomonas sp., S1 được phân l p từ nước hồ Ho n Ki m

T k t qu ừ thu được, lu n văn góp phần t o ti n đ cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn đ x ử lý đ c t microcystin trong h Hoàn Ki m nói riêng và các th y vố ồ c

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tảo lam Microcystis

Trong các loài t o lam sinh ra microcystin thì Microcystis là lo i thư ng gặp nhất trong các th y v c Chi Microcystis khác v i các chi khác c a tớ o lam ở đặc đi m

cơ th là m t t p đo n gồm nhi u t bào dính, gi ng nhau, n m trong mố ằ t b c nhày, mắt thư ng có th nhìn th y tấ p đo n như những h t trứng cá lơ lửng trong nước Đó l những t p đo n có kích thước từ 40 – 250μm, gồm nhi u t bào hình cầu hợp l i [43]

gi n và có th thay đổi trong suốt c c giai đo n sinh trưởng kh c nhau C c đặc đi m siêu cấu tr c dư ng như kh tương đồng cho t t cấ các lo i hình thái [27] Thành t bào được chia thành 3 ph n, tầ o thành 3 d ng t ng peptidoglycầ an Đó l c c tầng có tác dụng b o vệ phía ngoài, sàng l c phân tử, b y các ion và phân tẫ ử, th c đẩy quá trình bám dính c a t b o Nó cũng l lớp vỏ vững chắc, l c c khung đ đị nh d ng và duy trì hình d ng t bào [27]

Các h t trong n i bào hầu như chứa toàn b các v t ch t dấ trữ c a t bào Micorocystis Các không bào khí là m t đi m đặc trưng c a chi Microcystis, chức năng chính c a không bào là làm cho t bào nổi lên, thích nghi với s thay đổi c a c c đi u

kiện môi trư ng trong c t nước Không bào được phát tri n từ các cấu trúc có hình nón đôi nhỏ, nh ng cấu tr c n y được t o thành từ quá trình mã hóa protein phức t p bởi ữcác gen trong nhân Bở mặt các không bào cho phép các khí ngo i bào th m qua t ấ

do cho đ n khi thành phần các khí n i bào và ngo i bào cân b ng nhau Không bào khí ằ

là những c u trúc rấ ắn chắc, chi m th tích l n trong tớ bào, có th gi m đi khi áp suất thấp, còn khi áp suất cao hơn th ch ng bị v ra v khi đó t bào mất đi kh năng nổi lên Microcystis sinh s n theo hình thức phân đôi t bào S sinh s n c a Microcystis chỉ được nh n th y khi có s phân rã c a các tấ b o ban đầu, trong các t p đo n t o nh ỏ

và c trong các t b o đơn

C c đi u ki n thuệ n l i cho s ợ sinh trưởng phát tri n c a t o lam dẫn đ n s n ởhoa c a Microcystis trong nước là s k t hợp c a các y u tố: đi u kiện chi u s ng đầy

đ , nhiệt đ nước phù hợp (kho ng 15 – 30ºC), pH c a nước có giá trị ừ t trung tính đ n

ki m (pH = 6 – 9), nước trong các th y v c bị t đ ng, th y v c trong tình tr ng nước thi u oxy, h m lượng chất dinh dư ng cao, h m lượng N và P lớn, trong đi u kiện gió

nh hoẹ ặc không có gió dẫn đ n s phân tầng nước trong th y v c Nước chứa các loài Microcystis gây đ c thư ng có mùi tanh, sinh khối c a Microcystis sau khi sấy khô có mùi tanh h ắc

Các hợp ch t trong tấ o lam là các chất giàu ho t tính sinh h c, nó có th là các chất gây c n trở s phân bào, chống ung thư, ức ch enzyme, kháng sinh, chống virus

và chống nấm Vi t o lam được bi t đ n nhi u nhất trong vai trò là chất t o ra đ c t ốgây ra các nh hưởng có h i đối với con ngư i C c đ c chất t o lam có th được phân

lo i thành 3 nhóm l n theo c u trúc hóa hớ ấ c như sau: c c peptid v ng, c c alkaloid và các lipopolysaccharide Tuy nhiên, c c đ c chất cũng có th được phân lo i thành 5 nhóm lớn d a v o c c đặc tính sinh lý, c c cơ quan, b ph n, các t bào chịu t c đ ng ban đầu, bao gồm: các chất đ c thần kinh, các chất đ c gan, các chất đ c t bào, các chất đ c da, các chất kích thích và các chất đ c đư ng tiêu hóa [8,10,43 ]

Phân tích mẫu nước c a hồ H a Ki m H N i x c định được 35 taxon loài thu c 26 chi trong đó:T o lam (Cyanophyta): 10 chi, 12 loài T o l; ục (Chlorophyta):

12 chi, 19 loài T o silic (Diatomae): 2 chi, 2 loài; T o m; ắt (Euglenophyta): 2 chi, 2

loài [3] Trong đó, các vi t o lam thu c chi Microcystis là nh ng bữ ch th ô nhiễ v ỉ ị m

l vi t o gây nở hoa nước ở hồ Ho n Ki m

Loại bỏ tế bào tảo lam trong các quá trình xử lý nước

M t c ch đơn gi n đ gi m thi u tối đa microcystin trong th y v c là lo i b ỏcác t bào t o lam trong ph m vi x ử lý nước lớn bằng cách s dử ụng các v t c n h n ch

s di chuy n c a các váng hoặc các dụng c vụ ớt đ thu gom lượng l n t bào Có ớnhững phương ph p kh c đ lo i b các t bào tỏ o lam, được thi t k đ gi m s phá

v t bào và gi i phóng đ c chất Quá trình xử lý nước sử d ng sụ k t tụ (s đ ng tụ/s

k t t a bông) và l c là có hiệu qu trong lo i bỏ các t bào t o lam, nhưng c c MC h a tan được gi i phóng từ các t b o, không được lo i bỏ m t cách hi u quệ bởi nh ng ữphương ph p n y [16] Các chất hóa h c t t nhố ất cho s k t tụ là những chất ngăn ngừa

s phá v t bào và gi i phóng đ c chất v o nước S k t tụ liên quan đ n vi c làm mệ ất tính ổn định c a các thành phần, như l c c t bào t o lam, b ng cách trung hòa sằ trao đổi b mặt c a chúng, t o ra s k t tụ trong m t lượng lớn các t bào Các chất hóa h c như c c hợp ch t cấ a bazơ – Fe v bazơ – Al được sử dụng [12] Chow đ chứng minh rằng s k t t a bông sử dụng FeCl3 không gây phá v các t bào t o lam, hoặc l m tăng

h m lượng MC h a tan đối với Microcystis aeruginosa và Anabaena circinalis[16]

Hơn nữa, h m lượng tối ưu c a nh ng h p chữ ợ ất hóa h c này trong vi c loệ i bỏ các t bào t o lam mà không làm v t b o, v gia tăng h m lượng đ c chất ngo i bào [19]

L c là m t bước quan tr ng trong lo i b các t bào t o lam và các thành ph n ỏ ầ

v t chất t o lam Hầu h t thi t bị l c thư ng sử dụng các th nh phần như l c t thô, than antracid nghi n nhỏ, hoặc granit Phương ph p l c c t nhanh được sử dụng sau khi

th c hiện quá trình đông tụ, lưu giữ kho ng 14% các t bào t o lam được lo i bỏ, l c

ch m có th lo i b tỏ ới hơn 85% c c t bào t o lam cũng như là m t lượng đ ng k các chất đ c c a ch ng, như MC-LR, MC-RR và MC-YR (tốc đ lo i bỏ ừ t 43 đ n 99%) [14] Tuy nhiên, trong m t v i trư ng hợp ửx lý nướ có nhi uc th c v t có th l c m không k t hợp c ng keo tụ, và các t bào t o lam, n u có mặt với h m lượng cao, có

th gây tắc hệ ố th ng l c [12] Đầu l c không đ thô đ ch ng l i s t c nghố ắ ẽn m t cách nhanh chóng, sẽ không giữ l i hi u qu các tệ bào t o lam, trong khi đó đầu l c tốt đ

đ giữ l i các t bào sẽ gây tắc ngh n nhanh chóng trong thẽ i gian ngắn s dử ụng Do

đó, phương ph p ỉch l c thôi th không được khuy n nghị sử dụng trong vi c loệ i b ỏcác t bào t o lam [12]

Tuy n n i, là mổ t phương ph p xử lý nước thay th đ làm lắng đ ng, là phương ph p hiệu qu đố i với việc lo i b các vỏ t ch t k t t a, keo t mấ ụ ở t đ thấp, bao gồm c các t bào t o lam Tuy n nổi không khí hòa tan (DAF) là m t trong những phương ph p thư ng được s dử ụng đ lo i bỏ -80% t40 bào t o lam [12]

S lo i bỏ được th c hiện b ng cách sằ ục khí áp suở ất khí quy n trong m t b tuy n nổi t o ra m t dòng bong bóng nhỏ, tham gia vào làm huy n phù các v t chất hoặc các t bào, t o ra s trôi nổi ho c tặ o thành các váng n i trên bổ mặt trên các th y

v c, t i nơi m ch ng có th sau đó được lo i b bỏ ằng các thi t bị vớt [16]

1.2 Độc tố mcirocystin (MC)

1.2.1 Đặc điểm, cấu trúc c a microcystin

Microcystin (MC) là các peptid vòng, có chứa 7 amino acid, c u trúc hóa hấ c (hình 1.3) là vòng (-D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7) Trong đó, X v

Z là các L-amino acid (như Leucine (L), Arginine (R), Tyrosine (T), Alanine (A), hoặc Methionine (M)), D-MeAsp là acid D-erytho-β-methylaspartic và Mdha là N-methyldehydroalanin, Adda bi u thị 3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid [8,11]

S thay đổi trong c u trúc là sấ thay đổi vị trí c a tất c 7 amino acid, nhưng sthay đổi lớn nhất là s thay th c a L-amino acid tương ứng vở ị trí 2 và 4, và s tách methyl c a D-MeAsp v Mdha tương ứng ở vị trí 3 và 7 [8,35] Các vị trí được thay th

ở trên o ra các chất đ c khác nhau trong h MC Có hơn 90 bi n th c a MC, bao tgồm các bi n th chứa các amino acid và các nhóm thay th Tr ng lượng phân tử c a

MC trong kho ng từ 900 đ n 1100 Daltons (tr ng lượng phân tử)

Hình 1.3 Mô h nh cấu tr c hóa h c c a microcystin [11]

Bốn lo i MC được xem xét chính có nhóm amino acid khác nhau vở ị trí X và

Z MC được đặt tên theo chữ cái vi t t t c a các amino acid X và Z vắ ở ị trí thay th tương ứng C c đ c tố MC phổ bi n nhất là MC LR, MC RR và MC YR Tron– – – g

đó, MC – LR là chất được nghiên cứu nhi u nhất v có tính đ c m nh

B ng 1.1 Các amino acid xuất hiện trong cấu trúc c a microcystin [11]

Các lo i đ c t ố Amino acidvị trí X Amino acid vị trí Z Tr ng lượng phân tử Microcystin LA Leucine (L) Alanine (A) 910 06,

Microcystin YR Tyrosine (Y) Arginine (R) 1045 19,

Microcystin LR Leucine (L) Arginine (R) 995 17,

Hầu h t đ c tố MC là những lo i có chứa L-amino acid kỵ nước S thay th các L-amino acid k ỵ nước trong các v trí X b i các L-amino acid kị ở ỵ nước khác (alanine, phenylanine hoặc tryptophan) duy tr tính đ c, nhưng s thay th bởi các amino acid ưa nước (như arginine) sẽ làm gi m đ ng k đ c tính Các MC có các ph n ầphân c c (ưa nước) trong các vị trí c a các amino acid thay th , như MC-RR (arginine-

arginine) và MC-M(O)R (methionine sulfoxyde, arginine), có đ c tính thấp nh t S ấthay đổi trong những phần còn l i có th hoặc không nh hưởng đ n tính đ c [8,35,43 ].

H nh 1.4 Mô h nh cấu tr c ho h c c a đ c tố MC – LR [46]

H nh 1.5 Mô h nh cấu tr c ho h c c a đ c tố MC – RR [46]

MC r t b n và không b ấ ị t c đ ng b i các phở n ng hóa h c thông thư ng như: ứ

ph n ứng th y phân, ph n ứng oxy hóa – khử, dưới c c đi u kiện được tìm th y trong ấhầu h t các th y v c t nhiên Những chất đ c này bị phân h y ch m ở nhiệt đ cao

ph n ứng th y phân chỉ x y ra nhanh khi trong đi u ki n phòng thí nghi m khi thêm ệ ệHCl 6M và nhiệt đ cao [43]

H nh 1.6 Mô h nh cấu tr c ho h c c a đ c tố MC – YR [46]

1.2.2 Độc tính c a microcystin

MC thu c nhóm đ c tố gan (hepatotoxin), gây xuất huy t gan Hầu h t các nh n

bi t v đ c tính c a MC là d a trên những nghiên cứu trên chu t nh t và chu t cắ ống, thí nghiệm được ti n hành b ng cách tiêm MC ằ – LR qua màng bụng chu t, hoặc tiêm

tr c ti p vào khoang b ng chuụ t Trong các nghiên cứu này, MC gây ch t đ ng v t thí nghiệm chỉ trong vài gi Tổn thương gan v s phá h y t b o được quan sát b ng ằkính hi n vi sau 20 ph t khi tiêm v o đ ng v t thí nghiệm m t li u MC gây ch t Trong vòng 1 gi , t bào ị phá v , mất đi c c liên k t và cấu tr c b nh thư ng c a gan [28] bCác nghiên c u dứ ịch tễ đ chỉ ra rằng, ti p xúc với MC trong th i gian dài có

th gây ra ung thư gan Trong số các MC, MC-LR là chất đ c m nh, vì v y t ổ chức Y

t Th giới (WHO) đ đưa ra mức nồng đ tối đa đối với MC – LR trong nước uống là 1μg/L Gi trị LD50 _li u lượng gây ch t 50% sinh v t thí nghi m cệ a MC –LRđối với chu t nh t thí nghiắ ệm được x c định trong kho ng 25 đ n 150 µg/kg tr ng lượng cơ

th (ti p xúc tiêm qua màng bụng) Giá trị LD50 đối với chu t nhắt trong thí nghiệm

ti p x c qua đư ng tiêu hóa (uống nước) là 5000 µg/kg tr ng lượng cơ th , đối với m t

ch ng chu t nhắt khác thì giá trị LD50 được x c định là 10900 µg/kg tr ng lượng cơ

th , và giá trị cao hơn đối với chu t cống [22]

Chưa nh n th y MC bấ ị th y phân trong d dày bởi men peptidaza, nhưng m t lượng lớn đ ng k MC – LR đ vượt qua s ngăn c n c a các men trong h ệ tiêu hóa đ được hấp th vào LDụ 50 c a m t số lo i MC kh c như MC-LA, -YR, -YM tương t như c a MC-LR, nhưng LD50 c a MC-RR cao hơn MC-LR kho ng 10 lần [22]

M t số nghiên cứu đ khuy n nghị ằ r ng MC có kh năng th c đẩy quá trình t o khối u, m t số tác nhân có th không gây ra ung thư nhưng kích thích s phát tri n c a

m t số khối u Th ng 6/2006, Cơ quan nghiên cứu Ung thư (IARC) đ x c định r ng ằ

“MC – LR có th gây ung thư trên ngư i”, nhưng “c c chi t xuất c a Microcystis không được phân lo i là chất gây ung thư đối với con ngư i” Tuy nhiên, c c MC có

kh năng kích thích s tăng trưởng c a các t b o ung thư [28]

B ng 1.2 Ảnh hưởng c a microcystin đ n cá [28]

Lo i cá Li u lượng (µg/kg)

Số lượng

li u

Th i gian

ti p xúc (ngày)

Tổng li u lượng (µg/kg)

S nh hưởng

Cá chép

(lớn) 50 28 28 1400 Tổn thương gan nặng

Cá chép

(chưa lớn) 400 1 1 400 Tổn thương gan và th n nặng

Cá hồi 550 8 4 4400 Tổn thương gan nặng

Cá rô 1150 8 4 9200 Tổn thương gan nặng

Cá rô phi 1200 21 21 25200 Dấu hiệu ức ch oxy hóa trong gan

MC gây đ c theo cơ ch như sau:

MC ức ch protein nhân chuẩn serine/threonine photphotaza I và 2A (thành phần quan tr ng đ duy trì cân bằng n i môi trong t b o) qua tương t c với các nhóm xúc tác nhỏ c a các enzyme Quá trình phosphoryl và dephosphoryl protein là m t quá trình liên tục thay đổi v l con đư ng quan tr ng trong đi u ch nh hoỉ t đ ng c a

không ki m soát được s ức ch các enzyme này có th t c đ ng đ ng k đ n cân b ng ằ

n i môi c a t bào MC có ái l c m nh đối với PP1 v PP2A Cơ ch tương t c giữa

MC và PP1 và PP2A gồm 2 bước, đầu tiên chất đ c liên k t đ làm mất ho t đ c a enzyme, sau đó h nh th nh c c liên k t c ng hóa trị trong su t thố i gian dài ph n ứng[4]

1.2.2.1 Ảnh hưởng độc hại c a microcystin lên các loài động vật th y sinh

Tác h i đầu tiên khi t o lam n hoa làm gi m ở oxy ho tan trong nước gây hiện tượng đ ng v t nổi đầu và ch t Khi n a và chở ho t, ch ng sinh đ c t ố gây đ c cho

đ ng v t th y sinh.Các chất đ c nh hưởng t i h ớ ệthần kinh, có th gây ch t ho c gây ặ

ra m t số nh hưởng khác S tồn dư c c đ c chất n y trong cơ th chúng gây ng đ c cho con ngư i khi sử d ng nhụ ững đ ng v t th y sinh làm th c phẩm Đặc biệt các

đ ng v t hai m nh là những đối tượng hấp thu và tồn trữ các chất đ c này nhi u nhất

MC thông qua c c lưới thức ăn th y sinh, đi v o c c lo i c , tôm, cua, s , h n cũng như những ngư i tiêu thụ c c lo i n y MC không có trong mô c a c c đ ng v t

có vỏ khi th i gian ti p x c l m t v i tuần C c lo i v t nuôi, đ ng v t hoang d ti p

x c với MC thông qua nước uống có chứa t o lam đ c hoặc ăn ph i c c th m t o lam

MC ở trong nước gây đ c cho cá ở nồng đ kho ng v i μg/l, th m chí mức nồng đ dưới 1μg/l cũng có th gây đ c các vùng biỞ n khi x y ra s nở hoa, n ng ồ

đ MC trong nước đo được lên đ n 25000μg/l C thư ng ăn tr c ti p t o lam đ c hoặc

ăn gi n ti p c c lo i đ bị nhiễm đ c t o lam Ở m t mức đ thấp hơn, c c lo i c có

th hấp thụ tr c ti p MC từ trong nước Ngo i ra, MC cũng có th truy n từ c mẹ sang trứng Gan c l cơ quan chịu t c đ ng chính khi bị nhiễm đ c, MC cũng gây ức ch

ho t đ ng c a protein photphataza, m protein n y có vai tr quan tr ng trong qu trình

ph t tri n c a phôi c Do kh năng gi i đ c c a c đối với MC kém nên ch ng dễ bị

ch t khi nồng đ MC tăng lên

Trong t nhiên, cá có th b ịch t sau khi đ ti p xúc với MC qua vài ngày hoặc vài tuần M t số nghiên cứu đ nh n th y sấ tổn thương gan nghiêm tr ng trong cá sau khi uống MC có chứa trong các t bào t o lam d ng đông khô.C c lo i trai v đ ng v t phù du thu th p từ những khu v c t o lam nở hoa có chứa nồng đ MC kho ng từ 2500

- 2900 v 13700μg MC/kg tr ng lượng cơ th [23] Những trư ng hợp tử vong mở t

số lo i chim liên quan đ n s nở hoa c a t o lam đ c được nh n thấ ởy Mỹ và Canada

v o đầu những năm 1990 Ở California, c c lo i chim tr đông t i vùng bi n Salton bị nhiễm đ c MC có tỷ ệ l ch t cao Mức nồng đ MC tìm thấy trong nhi u xác chim tương đồng với m c nồng đ ứ chất này gây ch t chu t thí nghiệm Ng đ c MC cũng gây tử vong và bệnh t t c a các loài cò xanh vở ịnh Chesapeake [21]

1.2.2.2 Ảnh hưởng độc hại c a microcystin lên cơ thể người

Con đư ng xâm nh p phổ bi n nh t cấ a MC v o trong cơ th con ngư i l qua

đư ng tiêu hóa, do tr c ti p sử d ng các loụ i nước và th c phẩm bị nhi m b n (các sễ ẩ n phẩm nông nghiệp, c , tôm v c c đ ng v t thân m m), hoặc gián ti p tiêu thụ thông qua c c đ ng v t kh c đ ăn ph i v tích lũy c c lo i t o lam đ c Ngoài ra, MC có th

đi v o cơ th con ngư i qua con đư ng hô hấp khi trong không khí có c c h t nước chứa đ c chất khi tham gia c c ho t đ ng liên quan đ n nước [21] Quy tr nh xử lý nước không th lo i bỏ h t được MC có mặt trong nguồn cung cấp nước uống được lưu trữ trong hồ chứa

Các triệu chứng khi nhiễm đ c cấp tính MC: khó thở, đau bụng, gây ra các ph n

ứng trên da, và nặng hơn l tổn thương gan T o lam hoặc MC có th gây ra các mụn nước, m đay hay nổi ban ngoài da Khi nu t phố i các nước nhiễm đ c, có th gây ra các b nh vệ tiêu hóa như: đau bụng, tiêu ch y, buồn nôn, cũng có th đau đầu và d n ẫtới sốt nặng Khi hít thở ph i những h t nước hoặc hơi có chứa MC trong không khí có

th bị ch y nước mắt, nước mũi, ho, đau h ng, và m t s iố tr ệu tr ng giứ ống như bệnh hen suyễn hoặc dị ứ ng.Ti p xúc vớilượng lớn MC có th gây ra tổn thương gan

MC đ từng gây ra nhi u v ngụ đ c c p tính, vấ ụ nhiễm đ c MC gây tử vong nổi ti ng nh t xấ y ra ở Brazil v o năm 1996, 116 trong số 131 bệnh nhân ở Caruaru, Brazil đ bị rối lo n thị gi c, buồn nôn, nôn mửa, y u cơ sau khi l c m u M t trăm ngư i bị nh hưởng sau đó đ bị suy gan cấp tính v 52 ngư i cuối c ng đ ch t v c c triệu chứng c a căn bệnh, bây gi được g i l "H i chứng Caruaru" [5]

1.3 Loại bỏ MC hòa tan trong các quá trình xử lý nước

Quá trình x ử lý nước chung như đông tụ, keo tụ, lắng đ ng và l c không hoàn toàn lo i bỏ các MC hòa tan [19] Ch ỉnhững quá trình x ử lý nước như quang phân, kh ửozon, l c b ng carbon hoằ t tính và khử bằng clo có th lo i b hoàn toàn các MC hòa ỏtan từ nước

1.3.1 Quang phân

MC tương đối b n vững khi b ịchi u b ng ánh sáng mằ ặt tr i nhưng l i b b gãy ị ẻnhanh chóng bằng tia c c tím (UV) với s hấp thụ c c đ i ở bước sóng 238-254 nm MC-LR, MC-YR và MC-YA được lo i bỏ bằng tác nhân ánh sáng như xúc tác oxy nguyên t , bử ức x UV và các chất xúc tác bán dẫn titan dioxyd (TiO2) Các ch ất đ c này được phân h y nhanh chóng với th i gian bán h y ít hơn 5 ph t[33] Tốc đ ph n ứng phụ thu c m nh vào s có mặt c a lượng xúc tác TiO2 -5g/l) (0 Đ nh gi xử lý trong nước hồ v nước cất cho thấy hiệu qu tốt khi sử dụng nước hồ Quá trình có tính

kh thi trong nước t nhiên, mặc dù s gia tăng mức đ x c t c (lên đ n 5 g/l) M t s ốcác nghiên cứu đ sử ụ d ng thành công quá trình xúc tác quang h c đ lo i bỏ các MC trong nước [26]

1.3.2 Quá trình khử bằng ozon

Ozon b n vững với 3 nguyên tử (O3), là m t trong những chất oxy hóa m nh nhất v được s dử ụng r ng rãi trong lo i bỏ các chất bẩn hữu cơ v vô cơ trong xử lý nước (như: c c kim lo i n ng, phenol và thuặ ốc trừ sâu) và trong kh ử ho t tính c a các

vi sinh v t (như vi khuẩn và virut) [13] Do đó, qu tr nh khử trung gian bằng ozon với nồng đ 0,5 g/l là c n thiầ t đ lo i bỏ các hợp chất đ c bao gồm c c MC trong nước [19] Tuy nhiên, khi li u lượng ozon không đ s tẽ o ra các s n phẩm ụ như bromat, ph

từ ph n ứng c a ozon với các muối c a brom trong t nhiên sẽ gây ra nh hưởng bất lợi với sức khỏe (như t o khối u trong c c lo i đ ng v t) [16]

1.3.3 Khử bằng clo

Khử trùng bằng clo là m t trong những bước ch y u trong quá trình xử lý nước [6] Khử trùng bằng clo, có hi u quệ v kinh t , thư ng được s dụng đ ử khử trùng nước uống, nước tiêu dùng Clo ph n ứng với phân nửa chất tương t , giống như ozon

(liên k t đôi, hệ thống các than ho t tính, v c c amin trung tính) nhưng tốc đ ph n ứng thấp hơn so với ozon [30]

Nhóm nghiên cứu Himberg đ chứng minh rằng khử trùng b ng clo không có ằhiệu qu trong việc lo i bỏ các MC ra khỏi nước [15] Đi u này có th là do các quá trình xuất hiện ở m t mức pH, mở ức m h m lượng clo t do tương đối thấp [25] Keijola v Himberg đ không ghi nh n các mức pH, nhưng Hoffman đ th c hiện những đi u tra mở ức pH 8,5 Ảnh hưởng c a pH đối với s kh các MC bằng clo đ ửđược đi u tra xâu chu i bởi Nicholson v nhóm đồng nghiên cứu v o năm 1994

Nicholson, Rositano và Burch đ chỉ ra rằng s phân h y MC-LR phụ thu c

v o pH pH dưới 8, clo lỏng xu t hiấ ện trong s t o thành acid hypocloro với h m lượng

15 mg/l, và có th phân h y MC-LR khi mà s lo i b ỏ chất đ c đ gi m đ ng k với mức pH lớn hơn 8 S suy gi m đ c chất cùng với tăng pH là do gi m h m lượng acid hypoclorơ (79% ở pH 7, 55%-pH 7,5; 28%-pH 8; 0.4%-pH 10, và 20ºC), là tác nhân oxy hóa m nh hơn nhi u so với ion hypoclorit M t chú ý quan tr ng, mức cho phép sau 30 phút trong quá trình khử trùng theo th tứ c c bước phân h y đ c tố là lượng clo

dư t i mức thấp nhất 0,5 mg/l là [29]

Ảnh hưởng c a clo lên s phân h y MC-LR và MC-RR, c c đ c tố d dàng ễđược phân h y bởi s k t hợp c a clo với mu i natri hypoclorit, số phân h y phụ thu c vào li u lượng clo t do và pH Trong suốt quá trình kh b ng clo, nhi u phử ằ n ứng t ừcác s n ph m phẩ ụ đ được t o thành, m t trong những ph n ứng đó l ph n ng t o ứthành microcystin chứa 2 nhóm OH thông qua ion c a muối clo tở i vị trí liên hợp c a Adda, bằng ph n ứng th y phân Các s n phẩm khác có th l đồng phân l p th c a nó hoặc c c đồng phân v vị trí Không có s n phẩm đ c n o được phát hiện t quá trình ừkhử MC-LR b ng clo M c dù nhằ ặ ững k t qu này cho rằng khử trùng b ng clo ằ ở li u lượng clo thích h p rợ ất có hiệu qu đối với việc lo i bỏ các MC, nhưng s oxy hóa c a chính các t bào bởi clo ph i được phòng tránh, bởi v nó thư ng gây ra s gi i phóng

c c đ c t tố ừ t o lam và s t o ra các hợp chất halogen hữu cơ (như chloroform, c c trihalomethan kh c (THMs), c c acid haloacetic (HAAs)…) trong suốt quá trình xử lý nước [34]

phân t trong các l nhử ỏ nhất t o ra c c đơn vị ấ h p th , làm cho các phân t lụ ử ớn và nh ỏ

c a các chất nhi m bễ ẩn h a tan được cô đặc v được lắng xuống t dung dừ ịch đi v o trong các l chứa các phân tử [6]

Hai d ng khác nhau c a carbon ho t tính: carbon ho t tính d ng b t (PAC) và carbon ho t tính d ng h t (GAC) được s dử ụng trong xử lý nước cũng như là lo i b ỏcác MC [41] GAC được sử d ng rụ ng rãi trong các dòng thông qua các c t ph n ứng,

trong khi PAC có th được thêm tr c ti p v o nước trước đ t o s ông tđ ụ hoặc l c [25] Tuy nhiên, GAC có các lợi hơn PAC như v ng đ i c a nó dài, kh năng hấp phụ

cao hơn, dễ dàng ki m soát quá trình, th hiện các tính chất c a carbon hiệu qu hơn,

và có th tái sử dụng carbon [17]

Carbon ho t tính cũng như khử trùng bằng ozon là các công c x ụ ử lý nướ ốt c t

nhất trong vi c loệ i b ỏ c c MC trong nước [30] Vi ệ ức ng dụng carbon ho t tính trong

lo i bỏ c c đ c tố t o lam, bao gồm c c MC được t o ra b i tở o lam M.aeruginosa, đ được th c hi n bệ ởi Hoffmann Quá trình x ử lý nướ như đông tụ, keo tục , l c và kh ử

trùng b ng clo không còn hiằ ệu qu khi d ng đ lo i b ỏ c c đ c tố, khi đ sử dụng quá trình xử lý nước với than ho t tính nhưng s lo i bỏ phụ thu c vào các mức li u lượng

c a than ho t tính MC được lo i b bởi c c bước xử lý đông tụ thông thưỏ ng và th m chí vi c thêm vào mệ t lượng nhỏ PAC cùng v i các hóa chớ ất đông tụ không l m tăng

đ ng k hi u qu ệ lo i bỏ các MC S lo i b mỏ t c ch đ ng k c c đ c tố đ được gi ữ

l i b i GAC và kh trùng bở ử ằng ozon trong phòng thí nghiệm và các thí nghiệm ngoài

th c địa 20mg/l PAC có th giữ l i kho ng 90% các MC x lý, kử t hợp với xử lý đông

tụ và trầm tích hóa thông thư ng và kh trùng bử ằng ozon bước đầu và lo i b thành ỏ

công MC được sinh ra bởi loài M.aeruginosa Xử lý các hợp chất gây mùi từ s n hoa ở

t o lam bằng cách sử dụng GAC dưới c c đi u kiện sử dụng th c v t thí nghiệm Đông

tụ - trầm tích hóa thông thư ng, thi t bị l c gấp đôi v c c qu tr nh xử lý bằng kh ửtrùng clo k t hợp với than ho t tính (GAC v PAC) đ lo i bỏ hơn 80% MC-LR t ừnước thô ban đầu, nhưng h m lượng MC-LR còn l i là 0,1-0,5μg/l quan s t được tương ứng với kh năng xử lý c a GAC và PAC

S thay đổi các nguồn carbon ho t tính có kh năng hấp phụ MC-LR khác nhau S n ph m gẩ là các ch t hấ ấp phụ MC-LR hiệu qu nhấ ởi vì chúng có kích t bthước ao qu n m trung b nh ớn Quá trình x lý MC-LR v l ử ớ ồng đi n 25 mg/l sử dụng PAC từ g với th i gian ti p xúc là 30 phút, có th gi m h m lượng MC-LR t 50 ừxuống 1 g/l Carbon t μ ừ g là chất hấp phụ MC-LR hiệu qu nhất, ti p sau là các PAC

từ than, trong khi đó carbon từ ừ d a và rêu than bùn là các ch t h p phấ ấ ụ MC-LR kém

nhất S mở r ng ph m vi h p phấ ụ i vđố ới m i PAC liên quan tới kích thước các mao

qu n (đư ng kính gi a 2,0 và 50nm), ữ kích thước c a mao qu n ụph thu c vào các v t chất khởi đầu S c nh tranh h p phấ ụ c a PAC với các v t chất hữu cơ t nhiên (NOM)

từ nước t nhiên (sông Murray, Autralia) làm gi m m t c ch đ ng k tốc đ hấp th ụMC-LR ban đầu

Theo Lawton và Robertson, kh năng lo i b MC bởi PAC l tương đối cao ỏ ởtrong nước tinh khi t và thấp trong nước thô Hiệu qu lo i b MC ỏ gi m xuống bởi vì

s c nh tranh c a các vị trí liên k t trong carbon [25] Không chỉ có s c nh tranh h p ấthụ m c c đặc đi m c a nước v c c đặc tính c a carbon cũng nh hưởng đ ng k đ n

s lo i bỏ MC bằng carbon ho t tính Huang và Cheng cũng cho r ng carbon hoằ t tính

vớ ỷi t lệ th tích mao qu n trung b nh và mao qu n ớ l n càng cao thì kh năng hấp ph ụMC-LR lớ , trong khi đó mao qu nn trong carbon có diện tích b mặt trong nhỏ đối với

s hấp ph [20] Kh năng hấụ p ph cụ a các lo i carbon ho t tính khác nhau là giống nhau t i đi m pH bằng không (pHzpc) Các lo i carbon ho t tính với giá trị pHzpc th

hiện s không rõ ràng ho c là các vặ t mang hi u quệ kém dưới c c đi u kiện pH, tăng

kh năng hấp thụ MC-LR trên b mặt c a carbon Nh ng ữ nh hưởng c nh tranh c a các v t chất hữu cơ t nhiên lên carbon ho t tính làm gi m kh năng hấp phụ c a

Các h t carbon ho t tính được s dử ụng như m t gi th cho vi khuẩn (d ng màng sinh h c) đ phân h y sinh h c các s n phẩm ữu cơ được t o ra t sh ừ ozon hóa (bao gồm ceton, alhydrid v c c acid), cũng như c c hợp chất không mong muốn khác, bao gồm c c MC Cơ ch h p ph và phân h y sinh hấ ụ c được bi t đ n là các y u t ốchi m ưu th góp phần lo i bỏ MC trong suốt quá trình l c GAC [17]

Do đó, m t nghiên c u c a Wang ứ đ phân biệt v đ nh gi giữa c c cơ ch quan

tr ng là h p ph và phân h y sinh h c trong suấ ụ ốt quá trình lo i b ỏMC-LR bởi GAC Những k t qu đ chỉ rra ng s phân h y sinh h c là m t cơ ch ằ lo i b ỏ hiệu qu Tuy nhiên, h cũng đ ph t hiện ra r ng màng sinh h c ho t tính, có mằ ặt trên b mặt GAC thông thư ng, cũng c n trở s h p phấ ụ MC-LR Hơn 70% MC LR đượ- c lo i b sau 6 ỏtháng ho t đ ng c a c t GAC vô trùng, cho th y sấ h p phấ ụ vẫn đóng vai tr quan

m t h ệ thống phân h y ho t đ ng chuy n hóa đối với các hợp chấ ữu cơ Như vt h y,

m t vài quá trình sinh h c cũng mở r ng chi u sâu trong đệm cát, ti p sau s hấp thu, chuy n hóa các xenobiotic và các chất đ c t nhiên bởi vi khuẩn và nấm [5,12 ]

L c cát sinh h c đ trở nên phổ bi n hơn trong việc lo i b các hợp chất không ỏmong muốn, bao gồm c các MC, do chi phí c a nó trong quá trình xử lý nướ đc t hi u ệ

qu , cùng với công nghệ, s duy trì và các thi t b không quá cao [7,18] Phương ph p ị

n y cũng mang l i hi u qu trong quá trình lo i b các chệ ỏ ất nhi m bễ ẩn mà không s ửdụng các chất hóa h c kh c đ gây ra các s n ph m phẩ ụ không mong muốn [18] M t

số nghiên cứu đ nêu b t lên s lo i bỏ các MC bằng h ệ thống l c cát ,14,18] [7 Như Lahti và Hiisvirta, l c ch m có kh năng lo i b các MC t ỏ ừ nước và s phân h y sinh

h c c c MC đ x y ra trong l c ch m Do v y, những nghiên cứu này không chỉ ra: s

lo i bỏ các MC thông qua các quá trình sinh h c (bao gồm phân h y sinh h c) hơn l các quá trình v t lý (hấp phụ) [44]

Tuy nhiên, lần đầu tiên chứng minh thành công s lo i bỏ các MC, với thi t b ị

l c cát ho t tính sinh h c, bởi các quá trình sinh h c H đ ki m tra s l c cát sinh h c trong các c t cát trong phòng thí nghi m (bệ ằng th y tinh với chi u dài 30cm, đư ng kính trong 2,5 cm, và chi u cao c t c t 15cm) đối với 2 lo i MC khác nhau MC-LR và MC-LA Trong c hai lo i, h m lượng cuối cùng là 20μg/l, đ được lo i b hoàn toàn ỏtrong 4 ngày (3 ngày trong pha log) Nh kỹ thu t PCR, từ màng sinh h c được tách ra

ở thi t bị l c cát có hiệu qu trong lo i bỏ c c MC, đ thu được vi khuẩn mang gen mlrA mã hóa ho t đ ng c a m t enzyme trong bước đầu tiên c a quá trình phân h y sinh h c MC-LR S phát hiện gen n y đ cung cấp thêm bằng chứng v s phân h y sinh h c MC l bước lo i bỏ ban đầu M t nghiên cứu xa hơn nữa, đ phân l p được Sphingopyxix LH21 từ thi t bị l c cát sinh h c [18] LH21 có chứa 4 gen tương đồng mlrA, mlrB, mlrC, mlrD, liên quan t i sớ phân h y sinh h c MC-LR bởi Sphingomonas sp., ACM-3962 LH21 có hi u quệ trong phân h y MC-LR và MC-LA, trong các thi t bị l c cát theo mẻ dưới c c đi u kiện môi trư ng liên quan, với s lo i

bỏ ho n to n được nh n thấy trong 4 ng y (h m lượng ban đầu c a đ c chất là 20 g/l) μBourne đ đ nh gi ho t tính sinh h c c a l c ch m trong việc lo i b các MC ỏ

sử dụng vi khuẩn Sphingomonas MJ-PV phân h y MC (ACM-3962) MC-LR được hòa tan nở ồng đ 50μg/l đ đượ thêm v o c t d ng đc lấp đầy c t ống dẫn PVC (đư ng kính 100mm, chi u dài 1m và chi u cao c t cát là 0,5m) S lo i b hoàn toàn ỏchất đ c được quan sát thấy trong vòng 6 ngày, và m u có thẫ i gian lớn hơn 15 ngày không phát hi n thệ ấy s phân h y chất đ c nhi u hơn nữa Dùng PCR khuy ch đ i chu i 16SrDNA c a MJ-PV và gen mrlA, đ ki m soát s có mặt c a vi khu n trong ẩcác thí nghi m thệ ử Tuy nhiên, ph m vi thí nghiệm thi t bị l c ch m có ho t tính sinh

h c đ chứng minh được s phân h y MC-LR mà không c n tầ ới vi khuẩn MJ-PV được thêm vào Không có các s n phẩm được khuy ch đ i, ch ỉthị đặc trưng c a loài MJ-PV,

đ được quan sát thấy ở trong các quá trình x ử lý không được thêm vào chỉ thị cho các

ch ng vi khuẩn kh c, hơn l MJ PV đóng vai tr trong qu tr nh phân h- y MC-LR Nghiên cứu c a Bourne đ chứng minh r ng hi u quằ ệ c a h ệ thống xử lý nước áp dụng công nghệ không cao như l c ch m với ho t tính sinh h c trong lo i bỏ các MC từ các

đi m cung cấp nước [7]

1.3.6 Phân h y sinh học MC

Trong nước ng t, cơ ch phân h y MC là quá trình phân h y sinh h c Lớp vi

t o lam mỏng và l p thớ c v t nổi trên b mặt làm gi m kh năng xuyên qua c a ánh sáng, giới h n nh hưởng c a s quang phân MC được hấp th nhanh chóng trên trụ ầm tích hồ nhưng với lượng ít hơn 20% c c chất đ c có th được h p thụ Do đó, s phân ấ

h y sinh h c có th có ý nghĩa lớn trong vi c loệ i bỏ MC trong nước t nhiên

Phân h y sinh h c MC liên quan tới các thành phần phức t p (enzyme, ) c a loài vi khuẩn trong th y v c S phân h y sinh h c làm gi m c c đ c chất n i bào ởtrong các t bào t o lam đ c v c c đ c tố ngo i b o trong nước [43] S thay đổi trong tốc đ phân h y đ c chất gi a các thữ y v c nước t nhiên khác nhau có th liên quan

đ n lịch sử nở hoa c a hồ và các y u t môi trư ng, như nhiệt đ và pH là những y u ố

tố nh hưởng đ n tốc đ chuy n hóa c a vi khuẩn phân h y Các hồ có th i kỳ ị l ch s ử

v n hoa c a t o lam có th chứa vi khu n có khở ẩ năng sử dụng các t bào t o lam đ c

v MC như nguồn thức ăn v có th phân h y nhanh chóng c c đ c ch t[9] ấ

1.4 Vi khuẩn phân h y MC

1.4.1 Vi khuẩn dị dưỡng Sphingomonas

Sphingomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que (0,3-0,8 × 1,0-2,7μm), hi u khí bắt bu c, có doi đơn c c, khu n lẩ c sinh s c tắ ố vàng M t vài loài Sphingomonas không có kh năng di đ ng v lên men nhưng tất c đ u ch a mứ t thành phần đặc trưng bất thư ng: có 18-21 chu i carbon m ch thẳng dihydrosphingosine bão hòa, dihydrosphingosine không b o h a đơn, v cyclopropane chứa dihydrosphingosines trong m t glycolipid ch a axit uronic và axit béo ceramide liên k t amit 2-hydroxy ứchu i thẳng bão hòa Ngoài ra, chúng có ch a mứ t chu i dài benzoquinone hô h p vấ ới

m t chu i bên l 10 đơn vị isoprenoid (ubiquinone Q-10) [42]

Theo Yabuuchi,chi Sphingomonas thu c h Sphingomonadaceae D a vào phân tích phát sinh loài, ki u h nh polyamine v c c đặc đi m acid béo, Sphingomonas được chia nhỏ thành b n chi riêng biố ệt là: Sphingomonas sensustricto và ba chi mới Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [42] Hơn 30 lo i trong chi

Sphingomonas đ được công b vố ới các tên hợp lệ, ch ng đ được phân l p từ nhi u môi trư ng khác nhau, bao gồm c nước khoáng, th c v t v đất [39]

Thành t bào có m t lớp màng chứa protein, quinone với các phospholipid, m t lớp màng ngoài có chứa các phần carbonhydrate hướng ra ngoài và glycoshingolipids (GSLs) [25] GSLs chi m v ịtrí tương t như c a LPS trong các vi khuẩn Gram âm

kh c v tương đồng ở nhi u chức năng, như l m t rào c n đối với các chất diệt khu n ẩNgoài ra, vì phần carbonhydrate c a GSLs ngắn hơn so với LPS nên b mặt t bào c a Sphingomonas kỵ nước hơn so với các vi khuẩn Gram âm kh c Đây có th là lý do cho kh năng phân huỷ hydrocarbon thơm đa v ng kỵ nước và tính nh y với kháng sinh kỵ nước c a vi khuẩn [44]

Hình 1.7 Vi khuẩn dị dư ng Sphingomonas dưới kính hi n vi điện tử [45]

Chi Sphingomonas là m t nhóm đồng nhất các sinh v t thu c phân lớp α-4 c a Proteobacteria M t nhóm sinh v t liên quan chặt chẽ ớ v i nhau v phát sinh loài, có cùng các thành phần lipid bất thư ng, đ được phân l p từ ễ r cây v được x p vào m t chi riêng biệt Rhizomonas Những sinh v t n y có c c đặc đi m ki u hình gi ng hố ệt nhau [38] Nhóm thứ hai với mối quan hệ phát sinh loài gần gũi v cấu tr c lipid tương

t được x c định là Zymomonas, có kh năng s n xuất ethanol thương m i quan tr ng [36]

Trong lịch sử, s hình thành c a 3 ketolactose từ lactose là m t đặc đi m h u ữ

c a Proteobacteria, tuy nhiên những nghiên c u gứ ần đây đ chỉ ra r ng Sphingomonas ằcũng có đặc đi m này Nghiên c u phân loứ i được th c hiện d a trên s l a ch n các

ch ng 3 ketolactose dương tính bao gồm Agrobacterium rhizogenes, Chromobacterium lividum và Prunuspersica, chúng có liên quan ch t ch vặ ẽ ới các loài thu c chi Sphingomonas Những loài này có các ki u lipid và trình t 16S rRNA đặc trưng c a chi, nhưng d a trên s khác nhau v c c đặc đi m sinh lý, đ xuất 4 loài mới [37] Các

vi khuẩn quang h p hiợ u khí Erythrobacter longus chứa bacteriochlorophylla, cũng chứa nhóm các lipid bất thư ng và ti t ra 3 ketolactose [32]

Sphingomonas được tìm thấy trong c c môi trư ng khác nhau, bao gồm nước (c nư c ng t v nước bi n), trên mặt đất, hệ ớ thống rễ cây, các mẫu bệnh phẩm và những ngu n khác Nó có khồ năng sử dụng m t lo t các h p chợ ất hữu cơ cho s phát tri n và có th t n tồ i dưới đi u ki n thiệ u dinh dư ng Nhi u ch ng Sphingomonas được phân l p từ môi trư ng tương đối s ch, ph n lầ ớn trong số ch ng cũng đ được phát hiện t i c c địa đi m b ô nhi m chị ễ ứa các hợp chất đ c h i như creosote, pentachlorophenol, thuốc diệt cỏ Trong nghiên c u c a Nishiyama và c ng sứ , loài Sphingomonas paucimobilis đ l m gi m lượng hexachlorocylohexane, sống sót và phát tri n trong đấ ịt b ô nhi m Ngoài ra, mễ t đ các vi khuẩn cao hơn khi có s hi n ệdiện c a các chất gây ô nhi m Nhễ ững phát hiện này ch ng minh rứ ằng Sphingomonas

có th s d ng chất gây ô nhiễm như m t nguồn năng lượng cho quá trình sinh ử ụtrưởng.[32]

Sphingomonas đượ ức ng dụng r ng r i trong lĩnh v c công nghệ sinh h c, y sinh, bao g m x lý các ch t gây ô nhiồ ử ấ ễm môi trư ng đ n s n xuất polyme sinh h c như sphingans (ví dụ gellan, welan v rhamsan) v đặc biệt là phân h y chất ô nhiễm chịu nhi t ệ

Sphingomonas sp., SS3 phân l p từ đất ô nhiễm ở Đức có kh năng sử dụng diphenyl ether 4-flo, 4-chloro và các dẫn xuất 4-bromo ( các mở ức đ kh c nhau) như

m t nguồn carbon v năng lượng duy nhất [22] Sphingomonas sp., RW1 phân l p t ừnước sông Elbe s dử ụng diaryl ete dibenzo-p-dioxyn và dibenzofuran như nguồn năng lượng duy nhất Phân tích trình t 16s rRN đ x c định loài này là m t loài mới có A quan hệ h hàng gần với loài Sphingomonas sp., khác [42] Sphingomonas sp.,HH69,

phân l p từ đấ t phân h y các h p chợ ất v ng thơm: acetoxydibenzofuran và hydroxydibenzofura [42]

2,3,4-M t số loài thu c chi Sphingomonas phân l p t i đ sâu 180-410m sông ởSavannah (Aiken, South Carolina, đồng b ng ven biằ n Đông Nam Hoa Kỳ) có th phân h y toluene, naphthalene, o- xylen, m-xylen, p-xylen, p-cresol, salicylat và benzoat [22] H u h t chúng có thầ t o ra những vùng s ch quanh các khu n l c phát ẩtri n trên đĩa th ch có phun floren, biphenyl và dibenzothiophene Kh năng chuy n hóa c toluen và naphthalene là hi m trong s ố các VKDD hi u khí Gram âm và quan

tr ng trong xử lý ô nhiễm dầu khí bằng phương ph p sinh h c

1.4.2 Cơ chế phân h y độc tố microcystin c a Sphingomonas

Sphingomonas đ được David G Bourne chứng minh là ch ng VKDD có chứa các enzyme tham gia v o con đư ng phân h y đ c tố microcystin S phân h y đ c t ố

n y được xúc tác bởi enzyme ngo i bào [7]

Con đư ng phân h y MC - LR bởi Sphingomonas được gi i thích như Hình 1.8 Việc s d ng các chử ụ ất ức ch protease kinh đi n cho phép: (1) phân lo i các enzyme này thành các h protease cơ b n v (2) tích lũy tức th i trong đi u kiện invitro các s n phẩm trung gian từ s phân h y MC - LR Vị trí phân cắt ban đầu trên phân t ử

MC - LR bởi enzyme được x c định là liên k t peptides 3 - amino - 9 - methoxy - 2,6,8

- trimethyl - deca - 4,6 dienoic acid (Adda) - Arg

Hai s n phẩm phân h y trung gian được tìm thấy là MC - LR m ch thẳng: NH2 - Adda – Glu(iso) -methyldehydroalanine - Ala Leu ß - - - methylaspartate - Arg - OH (chất A) và s n phẩm còn l i là tetrapeptide: NH2 - Adda Glu (iso) - –methyldehydroalanine - Ala -OH (chất B) là k t qu làm gi m MC - LR nh hai enzyme trung gian

Hình 1.8 Con đư ng phân h y microcystin bằng Sphingomonas [39]

Chính hiện tượng mở v ng đ c tố MC - LR nh enzyme microcystinase c a vi khuẩn khi n chất này trở nên không đ c do đó gi m đ ng k tương t c với các protein phosphatase

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu

Vi khuẩn dị dư ng Sphingomonas từ hồ Ho n Ki m, H N i

H nh 2.1 Địa đi m thu mẫu hồ Ho n Ki m Địa đi m A - [47]

Địa đi m thu mẫu: Hồ Hoàn Ki m, Hà N i

Vị trí thu mẫu: Đi m thu mẫu đối di n Tràng Tiệ n Plaza, trên đư ng Hàng Khay T a đ N 21o01’33’’, E 105o51’11’’

Th i gian nghiên cứu t : ừ 11/2012 đ n 03/2014

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất d ng cho nghiên cứu đ t i gồm c c hóa chất có đ tinh khi t cao xuất

xứ Sigma, Merk, Trung Quốc…

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trư ng nuôi cấy VKDD: môi trư ng NA, LB, PBS v nước hồ nhân t o (Phụ lục 1) Được bổ sung MC LR với nồng đ 10µg/ – l

2.1.4 Máy móc, dụng cụ

Sử dụng m y móc, dụng cụ có t i ph ng Sinh h c T o v c c ph ng thí nghiệm thu c Viện Vi sinh v t v Công nghệ Sinh h c, Đ i h c Quốc Gia, H N i

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập VKDD từ nước hồ nở hoa

Các mẫu nướ ừc t hồ Hoàn Ki m được l c qua lưới 20 micromet phin lvà c, nhằm lo i b ỏ phần lớn đ ng v t nguyên sinh v đ ng v t nổi nhưng vẫn c n lượng VKDD v ít đ ng v t nguyên sinh trong nước đ l c Lấy 1 ml nước sau l c pha loãng

ở các nồng đ pha loãng thích h p Nhợ ỏ 1ml d ch pha loị ng trên môi trư ng dịch th PBS có bổ sung 10 g/l microcystin Sau 24 gi  nhỏ 100µl d ch cị ấy trang đ u trên mặt

th ch quan sát thấy các khuẩn l c, tách và c y ria nhóm khuấ ẩn l c cho tách nhau riêng

rẽ Tách và c y mấ t khuẩn l c trên môi trư ng tương ứng Quá trình lặp l i nhi u l n ầcho đ n khi thu được các ch ng thuần khi t

Nuôi giữ ch ng VKDD n y trên môi trư ng th ch nghiêng, b o qu n ở nhiệt đ 4°C d ng cho c c nghiên cứu ti p theo

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá

2.2.2 1 Nhuộm Gram

Nguyên t cắ : Nhu m Gram (ph n ứng Gram) có vai tr đặc bi t trong vi c phân ệ ệ

lo i vi khuẩn Trong quá trình nhu m Gram, t b o bước đầu được x lý vử ới tím k t tinh và iot nên có s t o thành phức chất tím k t tinh iot bên trong t– bào Khi vi khuẩn Gram âm b tị ẩy cồn, lipit c a l p màng ngoài bớ ị ho tan l m tăng tính thấm c a màng dẫn đ n s rửa trôi phức ch t tím ấ – iot và làm cho vi khuẩn mất màu Khi nhu m

bổ sung chúng sẽ b t màu v i thuắ ớ ốc n y (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin)

ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các l trong peptidoglycan co l i do đó phức chất tim – iot bị ữ gi l i bên trong t bào

Cách tiến hành: D ng que cấy vô tr ng lấy dịch huy n ph t b o vi khuẩn đặt lên phi n kính Cố định tiêu b n bằng ng n lửa rồi nhu n thuốc đầu bằng dung dịch tím

k t tinh (crystal violet) trong kho ng 1 ph t Rửa bằng nước Nhu m ti p bằng dung

dịch iốt (dung dịch Lugol) trong 1 ph t Rửa bằng nước Ph lên v t bôi dung dịch ethano 95%:axeton (1:1) trong kho ng 1 ph t L i rửa bằng nước Sau đó nhu m ti p bằng thuốc nhu m m u đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) Rửa qua nước, đ khô, soi kính Vi khuẩn Gram (-) m u đỏ v m u tím cho Gram (+)

2.2.2.2 Phả ứn ng Catalase

Nguyên tắc:

- Các vi sinh v t hi u khí và kỵ khí tùy tiện chứa chu i truy n điện tử có cytochrome đ u có enzyme catalase, có kh năng bi n dư ng năng lượng theo phương thức hô h p vấ ới oxy t o ra H2O2

- Catalase th y phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn c n s tích tụ phân tử có đ c tính cao này trong t bào

- S th y phân H2O2 sẽ gi i phóng O2 được ghi nh n qua hiện tượng s i b t khí Cách ti n hành: ế

Hóa chất sử dụng:

- Dung dịch H2O2 30% được giữ trong t l nh với chai màu nâu tránh ánh sáng

- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0

Có th th c hiện thử nghiệm catalase bằng m t trong những phương ph p sau:

- Thử trên phi n kính (lamen): dùng que c y l y mấ ấ t ít sinh khối t khuừ ẩn l c thuần đặt trên m t phi n kính s ch Nh mỏ t gi t H2O2 30% lên sinh kh i vi sinh vố t trên phi n kính Ghi nh n s s i b t n u có Ho c có thặ bằng cách chuy n m t ít sinh khối c a khuẩn l c lên phi n kính, nhỏ m t gi t H2O2 0,5% rồi đ y l i bằng m t lá kính (lamelle) Ghi nh n n u có s xuất hiện c a b t khí b ịgiữ l i gi a phiữ n kính và lá kính

- Thử trong ống th ch nghiêng: nh ỏ tr c ti p 1ml H2O2 30% lên sinh kh i chố ng thuần trên b mặt th ch nghiêng Ghi nh n n u có s s i b t quanh sinh khối

- Thử ằng ng mao d n: dùng b ố ẫ ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau

đó chấm đầ ốu ng mao d n này vào tâm khuẫ ẩn l c cần thử trên môi trư ng Ghi nh n

n u có s s i b t khí trong ng mao dố ẫn Phương ph p n y có ưu đi m là thử được trên từng khuẩn l c nên có th th c hi n trên các khu n lệ ẩ c c a ch ng chưa l m thuần

K t qu

- Dương tính (+) : khi có hiện tượng s i b t khí do khí O2 được t o ra

- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng s i b t khí

2.2.2.3 Phản ngứ Oxidase

L m ướt thanh giấy l c đ được sấy vô khu n tẩ ừ trước b i thu c thở ố ử oxidase (1% tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride), l y que cấ ấy nh a (1µl) gặt 1 khuẩn

l c nghi ng và qu t lên thanh giệ ấy đ tẩm thu c thố ử oxidase, n u vùng giấy được quệt

vi khuẩn chuy n m u tím tía được đ c l dương tính (vi khuẩn có cytochrome oxidase -

là m t thành phần trong chu i hô h p cấ a vi khuẩn)

2.2.3 Phân loại 16S rDNA

 Tách chi t DNA [31] ế

Nguyên tắc:Th nh t b o c a vi sinh v t được ph v bởi lyzozyme v c c

chất tẩy m nh nh SDS - Tris - HCl gi p DNA được gi i phóng Protein v RNA được t ch ra khỏi DNA nh c c enzyme x c t c RNaza A, proteaza K và các dung môi chloroform: isoamyl alcohol (24:1) Cuối c ng DNA được t a bằng etanol (l nh -22oC) tuyệt đối v x c định nồng đ DNA trong dịch mẫu

20 – 24 gi Sinh kh i mố ẫu được chuy n vào eppendorf, rửa b ng EDTA và thu bằ ằng

ly tâm 8000 v ng trong 15 ph t Sau đó, sinh khối được làm huy n phù trở l i trong

200 µl đệm 10× TE (tỷ l mệ ẫu:đệm là 1:2), ti p đó bổ sung 10 µl lyzozyme, lắc nhẹ, giữ ở 37˚C trong nồi cách th y trong 15 phút Sau khi lần m t, h n hợp mẫu được lắc bằng tay trong 15 phút và lần hai ở 37˚C trong 15 ph t Bổ sung 250 µl Tris-SDSvào

mẫ ắu l c tay trong kho ng 15 20 phút.– Ủ mẫ ở 60˚C trong 20 ph t, trong nồu i cách

th y Dịch tan t b osau đó được làm l nh trong đ trong 10 ph t Mẫu được bổ sung 150µl cloroforms-isoamyl alcohol với th tích bằng 1/3 th tích mẫu, lắc b ng tay trong ằkho ng 20 phút Ly tâm 10 000 vòng trong 15 phút ở 4˚C đ phân lớp Sau đó chuy n phần dịch nhớ ởt phía trên sang eppendorf mới.ADN thô được tách ra bằng cách b ổ

sung ethanol 95% với th tích gấp đôi th tích mẫu Bổ sung 2µl Na acetat 3M, lắc nhẹ

v đ trong 30 ph t đ t a ADN.Ly tâm dịch mẫu ở 10000 vòng trong 15 phút ở 4˚C

Lo i bỏ phần dịch, ph n ADN tách chiầ t được giữ l i trong phần đ y ống eppendorf

Bổ sung 100 µl ethanol 70%, v nh ẹ đ rửa t bào và ngâm trong 30 phút Ly tâm 10

000 vòng trong 10 phút ở 4˚C, lo i dịch Sợi ADN được làm khô ở nhiệt đ phòng và được làm tan trở l i trong 20 µl đệm 1× TE và gi lữ nh qua đêm

 Nhân đoạn gen b ng ph n ng PCR [41]

Tr nh t mồi:

Mồi xuôi 27F 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ’ 8-27

Mồi ngược 1525R 5 -AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ 1543-1525 ’

H n hợp ph n ứng PCR:

dNTP (2,5mM) 2µl Mồi 0,5µl (10pmol cho m i lo i mồi)

10×Taq buffer 2,5µl Nước cất 12µl

Mẫu (50-90ng) 2µl Taq polymeraza 0,3µl (Taq 5U/ml)

 Xác đ nh tr nh t gen b ng máy t đ ng (ABI Prism 3100 Avant)

 Xây d ng cây phát sinh loài: c a lo i nghiên cứu với c c lo i tương ứng được công bố trong ngân h ng genbank NCBI, bằng chương tr nh ClustalW

và Mega 5.10

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu enzyme protease

2.2.4.1 Nuôi VKDD để thu nhận enzyme

Cấy m t nửa vòng que cấy VKDD thuần khi t v o môi trư ng NA lỏng Nuôi cấy được th c hiện trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút ở28 30- °C, lắc qua đêm Sau

đó, 2ml dịch nuôi cấy(106 t b o/ml) được chuy n v o 100ml môi trư ng NA như trên

và lắc ở 28 30- °C trong 48 gi

Dịch nuôi cấy sau 48 gi được ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút 4°C, ởthu lấy dịch trong L c qua màng 0.22 µm và sử dụng cho nghiên cứu

2.2.4.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp A on cải tiếnns

H n hợp ph n ứng bao gồm 0.5ml dung dịch enzyme, 1ml cơ chất cazein giữ ở 35,5oC trong 20 ph t Dừng ph n ứng bằng 2 5ml dung dịch TCA 5% Mẫu ki m tra ,cho TCA v o dung dịch enzyme trước khi cho cơ chất Đ 30 ph t ở nhiệt đ ph ng,

l c lấy dịch trong S n phẩm ph n ứng được x c định bằng ph n ứng m u với thuốc thử Folin (tỷ lệ dịch trong:Na2CO3 6%:Folin × 5 l 1:4:1) So m u trên m y quang phổ

ở bước sóng 660nm

Ti n h nh d ng đư ng chuẩn L-tyrozine (Merk) với kho ng nồng đ 10-100 g/ml

2.2.4.3 Điện di protease trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo

phương pháp Heusen và Dowdle [27]

Nguyên tắc: Điện di l qu tr nh t ch c c phân tử tích điện do s di chuy n kh c

nhau trong điện trư ng C c phân tử trong m t điện trư ng di chuy n với m t tốc đ

n o l phụ thu c v o s tích điện, ngo i h nh v kích thước c a ch ng nên phương

ph p điện di được d ng r ng r i trong qu tr nh nghiên cứu c c phân tử riêng rẽ trong

m t h n hợp

Cách tiến hành:Chuẩn bị dụng cụ đổ gel, pha hóa chất cho gel polyacrylamid

12,5% Đổ lớp gel t ch, bổ sung 0,1% cơ chất gelatin Nhỏ lên b mặt b n gel m t lớp mỏng methanol đ có b mặt gel phẳng Gel t ch được giữ trong 30-40 ph t ở 37oC đ acrylamit tr ng hợp ho n to n Đổ lớp gel cô

Th nh phần c a gel polyacrylamit 12.5% điện di

Th nh phần Gel tách (running gel), ml Gel cô

(Stacking gel), ml Monomer (acrylamit+bis gốc) 30% 4.15 0.44

Amontri persulphat (APS) 10% 50l 16.7l

TEMED (chỉ cho v o sau khi đ cho

c c th nh phần trên v o h n hợp gel) 3.35l 1.7l

L m đầy buồng điện di bằng dung dịch đệm ch y (Tris-glycin 0,025M, SDS 10%, pH 8,3) Chuẩn bị mẫu ch y điện di: tr n đ u mẫu enzyme với đệm lên mẫu (Simple buffer)

Tra mẫu điện di v o từng gi ng Lắp b nguồn v ti n h nh ch y điện di ở hiệu điện th ban đầu l 100V Sau khi mẫu (chất m u) đ di chuy n qua phần gel cô v o gel t ch th tăng hiệu điện th lên 120V v ch y cho đ n cuối b n gel Sau khi ch y