Nghiên Ứu Khả Năng Phân Hủy Miroystin Ủa Vi Khuẩn Nướ Sphingomonas.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Th Hu NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI KHUN NƯC Sphingomonas LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC K THUẬT MÔI TRƯNG Hà Nội – Năm 201[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Th Hu NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI KHUN NƯC Sphingomonas LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC K THUẬT MÔI TRƯNG Hà Nội – Năm 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17062857888481000000 1e4d8ec BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Th Hu NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI KHUN NƯC Sphingomonas Chuyên ngành : K THUẬT MÔI TRƯNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC K THUẬT MÔI TRƯNG NGƯI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Nguyn Th Hoi H Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Đ hon thnh chương trnh cao hc v vit lun văn ny, ngoi s n lc ca bn thân, đ nhn s hướng dẫn, gip đ, đng viên v góp ý nhiệt tình ca nhiu tp th v c nhân Qua đây, xin chân thành cm ơn cc thầy cô gio Viện Khoa hc v Công nghệ Môi trưng - Đi hc Bch Khoa H Ni đ nhiệt tình ging dy truyn đt cho tơi kin thức q báu, bổ ích v gip đ tơi suốt khóa hc vừa qua to điu kiện cho tơi hồn thành lun văn tốt nghiệp Với lịng bit ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cm ơn ngưi hướng dẫn khoa hc: TS Nguyễn Thị Hoài Hà - Phòng Sinh hc To - Viện Vi sinh vt Công nghệ Sinh hc - Đi hc Quốc gia Hà Ni đ dnh nhiu thi gian tâm huyt hướng dẫn giúp tơi hồn thành lun văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cm ơn TS Đặng Minh Hằng - Viện Khoa hc v Công nghệ Môi trưng - Đi hc Bch Khoa H Ni đ quan tâm, gip đ, to điu kiện đ thc hồn thành lun văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cm ơn Th.S Phm Thị Bích Đo cn b Phng sinh hc To, nhóm tác gi đ tài mã số: 01C-09/01-2012-2 v cc cán b Viện Vi sinh vt Công nghệ Sinh hc - Đi hc Quốc gia Hà Ni đ to điu kiện, tn tình gip đ tơi suốt q trình làm lun văn vừa qua Nhân đây, tơi xin chân thnh by tỏ lịng bit ơn tới gia đnh, bn bè cng cc anh, chị, em đ đng viên, gip đ suốt q trình hc tp, đ nhiệt tnh đóng góp ý kin đ lun văn ca thêm hon thiện Mặc d tơi đ có nhiu cố gắng hon thiện lun văn tất c s nhiệt tnh v lc ca mnh, nhiên không th trnh khỏi thiu sót, mong nhn đóng góp quý bu ca quý thầy cô v cc bn Hà Ni, thng 03 năm 2014 Hc viên Lê Thị Huệ 󰈨󰈨 i 󰉼 󰈖󰈖 󰈖 MC LC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 To lam Microcystis 1.2 Đc tố mcirocystin (MC) 1.2.1 Đặc đim, cấu trc ca microcystin 1.2.2 Đc tính ca microcystin .11 1.2.2.1 Ảnh hưởng đc hi ca microcystin lên cc loi đng vt thy sinh 13 1.2.2.2 Ảnh hưởng đc hi ca microcystin lên th ngưi 14 1.3 Loi bỏ MC ha tan cc qu trnh xử lý nước 15 1.3.1 Quang phân .15 1.3.2 Qu trnh khử ozon .15 1.3.3 Khử clo 15 1.3.4 Lc carbon hot tính 17 1.3.5 Lc chm 19 1.3.6 Phân hy sinh hc MC 21 1.4 Vi khuẩn phân hy MC 21 1.4.1 Vi khuẩn dị dưng Sphingomonas 21 1.4.2 Cơ ch phân hy đc tố microcystin ca Sphingomonas 24 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.1 Đối tượng v thi gian nghiên cứu .26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trưng nuôi cấy .26 2.1.4 My móc, dụng cụ 27 2.2 Phương php nghiên cứu 27 2.2.1 Phân lp VKDD từ nước hồ nở hoa 27 2.2.2 Nghiên cứu đặc đim sinh lý, sinh ho 27 2.2.2 Nhum Gram 27 2.2.2.2 Phn ứng Catalase .28 2.2.2.3 Phn ứng Oxidase .29 2.2.3 Phân loi 16S rDNA 29 2.2.4 Phương php nghiên cứu enzyme protease .31 2.2.4.1 Nuôi VKDD đ thu nhn enzyme 31 2.2.4.2 Xc định hot đ protease theo phương php Anson ci tin 31 2.2.4.3 Điện di protease gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương php Heusen v Dowdle [27] 32 2.2.5 Nghiên cứu nh hưởng ca cc điu kiện nuôi đn s phân hy microcystin 33 2.2.5.1 Ảnh hưởng ca nhiệt đ 33 󰈨󰈨 ii  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 2.2.5.2 Ảnh hưởng ca nồng đ microcystin .33 Xc định hm lượng microcystin my quang phổ .34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 Kho st mức đ ph dưng hồ Hon Kim 35 3.2 Sng lc v tuyn chn VKDD phân hy microcystin từ nước hồ Hon Kim, H Ni 36 3.2.1 Phân lp cc chng VKDD từ nước hồ Hon Kim .36 3.2.2 Sng lc VKDD có kh phân hy đc tố microcystin 39 3.2.3 Đặc đim sinh hc v hnh dng t bo ca VKDD S1 42 3.2.3.1 Đặc đim hnh thi t bo ca VKDD S1 42 3.2.3.2 Ảnh hưởng ca điu kiện nuôi cấy đn sinh trưởng ca VKDD S1 42 3.2.4 Xc định trnh t đon gen 16S rDNA ca VKDD S1 45 3.3 Nghiên cứu enzyme phân hy đc tố microcystin ca Sphingomonas sp., S1 .48 3.3.1 Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease 48 3.3.2 Ảnh hưởng ca nhiệt đ đn hot đ protease 49 o C .51 3.3.3 Đ bn với nhiệt theo thi gian xử lý 60 3.3.4 Ảnh hưởng ca cc chất ức ch đặc hiệu đn hot tính enzyme protease .52 3.3.5 Ảnh hưởng ca ion kim loi đn hot tính enzyme protease 53 3.3.6 Phân tích thnh phần protease điện di 54 3.4 Kh phân hy MC ca VKDD Sphingomonas sp., S1 56 3.4.1 Ảnh hưởng ca nhiệt đ 56 3.4.2 Ảnh hưởng ca số lượng vi khuẩn .59 3.4.3 Ảnh hưởng ca nồng đ microcystin 60 KẾT LUẬN .63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PH LC .69 󰈨󰈨 iii  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các chữ vit tắt Tên đầy đ BOD Biochemical oxygen dermand - Nhu cầu oxy sinh hc COD Chemical oxygen demand - Nhu cầu oxy hóa hc DO Oxygen demand – Hm lượng oxy hòa tan DNA Deoxyribonucleic acid DMSO Dimethyl Sulfoxide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid Median lethal dose – Liu lượng gây cht 50% số sinh vt thí nghiệm LD50 MC Microcystin MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of microcystin MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin MC-YR Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin Ophe O –Phenanthroline PCMB p- Chloromer curibenzoate PCR Polymerase chain reaction – Phn ứng trùng hợp PMSF PP1 PP2A Phenyl methyl sulfonyl fluoride Protein Photphataza 2A RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SS SDS Suspended solids – Các chất lơ lửng Sodium Dodecyl Sulphate VKDD Vi khuẩn dị dưng WHO World Heath Organisation – Tổ chức y t th giới 󰈨󰈨 iv  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 DANH MC CÁC BẢNG Bng 1.2 Ảnh hưởng ca microcystin đn cá [28] 12 Bng 3.1 Đặc đim hình thái ca chng VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim 37 Bng 3.2 Đặc đim sinh lý, sinh hoá ca chng VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim 38 Bng 3.3 Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 48 Bng 3.4 S thay đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo nhiệt đ 50 Bng 3.5 S thay đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo thi gian xử lý 60oC 51 Bng 3.6 Nồng đ microcystin li với s phân hy ca VKDD Sphingomonas sp., S1 nhiệt đ khác 57 Bng 3.7 Nồng đ microcystin li với s phân hy ca VKDD Sphingomonas sp., S1 có số lượng vi khuẩn khác 59 Bng 3.8 Lượng microcystin li với s phân hy ca VK Sphingomonas sp., S1 nồng đ MC khác 61 󰈨󰈨 v  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 DANH MC CÁC HNH V Đ THỊ Hình 1.1 Microcystis to thành váng dày mặt nước [27] Hình 1.2 Tp đon t bào Microcystis (×40) Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc hóa hc ca microcystin [11] Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc hố hc ca đc tố MC – LR [46] 10 Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc hố hc ca đc tố MC – RR [46] 10 Hình 1.6 Mơ hình cấu trúc hoá hc ca đc tố MC – YR [46] 11 Hình 1.7 Vi khuẩn dị dưng Sphingomonas kính hin vi điện tử [45] 22 Hnh 1.8 Con đưng phân hy microcystin Sphingomonas [39] 25 Hnh 2.1 Địa đim thu mẫu hồ Hoàn Kim - Địa đim A [47] 26 Hnh 3.1 Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S1 37 Hnh 3.2 Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S2 37 Hnh 3.3 Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S3 38 Hnh 3.4 Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S4 38 Hnh 3.5 Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S5 38 Hnh 3.6 Kh phân hy MC ca VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim 41 Hnh 3.7 Hnh dng t bo VKDD S1 kính hin vi điện tử (SEM×60.000) 42 Hnh 3.8 Đng thi sinh trưởng VKDD S1 43 Hnh 3.9 Ảnh hưởng ca nhiệt đ nuôi cấy đn VKDD S1 43 Hnh 3.10 Ảnh hưởng ca pH lên VKDD S1 44 Hnh 3.11 DNA tổng số ca VKDD S1 45 Hnh 3.12 Sn phẩm PCR nhân đon gene 16S rDNA ca VKDD S1 45 Hnh 3.13.Cây ph hệ da phân tích gii trình t 16S rDNA ca VKDD S1, S2 loài có quan hệ h hàng gần(2*) 47 Hnh 3.14 Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease Sphingomonas sp.,S1 49 Hình 3.15 Ảnh hưởng ca nhiệt đ đn hot đ protease Sphingomonas sp.,S1 50 󰈨󰈨 vi  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 Hnh 3.16 S bin đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo thi gian xử lý 60oC 51 Hnh 3.17 Ảnh hưởng ca chất ức ch đặc hiệu nhóm đn hot đ protease ca Sphingomonas sp.,S1 53 Hnh 3.18 Ảnh hưởng ca ion kim loi hóa trị hai đn hot đ protease Sphingomonas sp.,S1(3*) 54 Hnh 3.19 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease ca Sphingomonas sp., S1 55 Hnh 3.20 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease ca Sphingomonas sp., S1 khôi phục ion Ca2+ 55 Hnh 3.21 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease ca Sphingomonas sp., S1 khôi phục ion Mg2+(3*) 56 Hnh 3.22 S phân hy microcystin VKDD Sphingomonas sp S1 nhiệt đ 10, 15, 20, 25, 30 35°C 58 Hnh 3.23 Tốc đ phân hy sinh hc microcystin số lượng VKDD Sphingomonas sp S1 khác 59 Hnh 3.24 Phân hy sinh hc microcystin VKDD Sphingomonas sp., S1 nồng đ MC khác (1, 10, 20 50 µg/ml) 61 PH LC Hình Bin đng pH trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 Hình Bin đng DO trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 Hnh 3.Bin đng COD trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 Hình Bin đng BOD trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 + Hình Bin đng NH trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 Hình Bin đng NO trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 2Hình Bin đng NO trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 3Hnh Bin đng PO trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 Hnh Bin đng SS trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 󰈨󰈨 vii  󰉼 󰈖   󰈖 󰈖 MỞ ĐẦU Hiện nay, th giới xử lý đc tố vi to lam thi kỳ nở hoa nước quốc gia quan tâm đặc biệt Đ có khơng cc công trnh nghiên cứu tượng nở hoa nước gim thiu tác hi ca đc tố to lam gây đc, nhiên kt qu mức đ khác Hồ Hoàn Kim_ địa danh ting ca th mt hồ nơng, kín, chất lượng nước thay đổi dẫn tới s suy gim mt số loài vi to đặc hữu, đồng thi gia tăng mt đ ca vi to lam sinh đc tố gây nên lo ngi v môi trưng cho khu hệ đng thc vt sống hồ Trong số loài vi to lam gây nở hoa nước hồ Hoàn Kim, Microcystis aeruginosa Kutzing loài bắt gặp thưng xuyên phổ bin Microcystis aeruginosa chứa đc tố thuc nhóm hepatotoxin (đc tố gan) cấu to từ peptid mch vịng có tên gi microcystin (MC) [27,43] Chng l cc heptapeptide mch vng có chứa amino acid đặc hiệu (Adda) chui bên Cho đn nay, l dng cấu trc đặc biệt gặp microcystin Microcystin có 90 đồng phân, chúng khc cc nhóm methyl (R1 v R2) v amino acid (ở vị trí X v Z) bên chui Từ dẫn đn s khc v cấu trc bc 4, tính đc cc đặc tính ưa nước kỵ nước Có loi đc tố MC-YR, MC-RR, MC-YA, MC-LR, MC-LR phổ bin v có tính đc cao Khi vo gan, microcystin ức ch hepatocyte protein photphat PP1 v PP2A, từ gây siêu phosphoryl ho cytokeratin v dẫn đn s ph v cc vi sợi, thot dịch t bo v chy mu gan đng vt S tip xc lâu di với nồng đ microcystin thấp nước uống làm nh hưởng đn cc cấu trc t bo, qu trnh nguyên phân dẫn đn kích thích gây ung thư gan ngưi Năm 1989, WHO đ triệu tp mt nhóm chuyn gia Quốc t đ có ci nhn tổng quan v lĩnh vc ny v đưa mức giới hn nồng đ đc MC-LR nước uống l 1,5g/l Song công bố gần nhất, mức giới hn MC-LR nước uống lm trn xuống mt chữ số 1,0g/l, đ đm bo sức khoẻ ngưi Microcystin thưng tích luỹ ni quan t bào dng t nước Việc loi bỏ microcystin nước có th thc nhiu phương php khc phương php sinh hc th giới quan tâm Xử lý microcystin nước vi khuẩn dị dưng (VKDD) bn địa không làm thay 󰈨󰈨