Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam. tt

1. Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án + Mục đích: Tuyển chọn được một số chủng VKTQH vừa có khả năng tạo tạo màng sinh học (MSH) vừa có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao. Đánh giá hiệu suất phân hủy các hợp chất hydrocarbon dầu mỏ bởi MSH đơn chủng và đa chủng VKTQH trên các loại giá thể, từ đó đưa ra giải pháp xử lý ô nhiễm dầu ở điều kiện mô hình. + Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn tía quang hợp, mẫu đất và nước thải nhiễm dầu, hợp chất hydrocarbon có trong dầu mỏ. 2. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật Phân lập các chủng VKTQH; Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH; Xác định mật độ tế bào VKTQH trên MSH; Đánh giá khả năng tạo MSH của các chủng đã lựa chọn; Xác định phổ hấp thụ Bacteriochlorophyll ở trong tế bào nguyên được xác định theo phương pháp quang phổ ở vùng 400 – 900 nm trên máy quang phổ; Xác định Gram của vi khuẩn; Đánh giá tính đối kháng của các chủng VKTQH; Đánh giá khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ bởi MSH của VKTQH bằng phương pháp sắc kí khối phổ (GCMS), sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 2.2. Các phương pháp sinh học phân tử Tách chiết DNA tổng số, PCR, điện di DNA trên gel agarose. 2.3. Nhóm phương pháp phân tích hóa học Các thành phần hydrocarbon thơm có trong dịch nuôi cấy vi khuẩn được đem đi phân tích hóa học bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC); Hàm lượng dầu diesel được xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 4582-88:100 ml. 3. Các kết quả chính và kết luận Từ 32 chủng, chúng tôi đã tuyển chọn được 3 chủng VKTQH là DQ41, DD4 và FO2 vừa có khả năng tạo MSH tốt vừa phân hủy thành phần hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao. Các chủng này đã được định tên là Rhodopseudomonas sp. DD4 (LC318127.1), Rhodopseudomonas sp. DQ41 (LC318128.1) và Rhodopseudomonas sp. FO2 (LC318129.1). Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối, chúng tôi thấy ba chủng VKTQH DQ41, DD4 và FO2 có khả năng sinh trưởng và tạo MSH tốt trong dải nhiệt độ 30-37oC, pH 5-9 và nồng độ NaCl 1 - 2%. Nhờ vậy, các chủng VKTQH đã được lựa chọn dễ dàng thích ứng với môi trường thực tế ngoài hiện trường. Sau 14 ngày nuôi cấy: MSH của ba chủng VKTQH đã lựa chọn có khả năng phân hủy 100% toluene (nồng độ ban đầu là 250 ppm), hiệu suất phân hủy naphthalene là 97,71; 97,23; 96,53% tương ứng với DQ41, DD4 và FO2 (nồng độ ban đầu 300 ppm) và hiệu suất phân hủy pyrene cũng rất tốt đều đạt trên 99% (nồng độ ban đầu là 300 ppm); MSH đa chủng VKTQH gắn trên xơ dừa cho hiệu suất phân hủy cao nhất các thành phần hydrocarbon trong dầu mỏ, cụ thể: hiệu suất phân hủy dầu diesel: 95% (nồng độ ban đầu là 17,2 g/l), n-alkane (C8-C16) trong dầu diesel: 80 - 94%, PAH: 91 - 96% (nồng độ ban đầu là 600ppm), dầu thô: 92% tổng số dầu thô (nồng độ ban đầu là 20g/l). Đây là những công bố đầu tiên về đánh giá hiệu suất phân hủy dầu thô, dầu diesel bởi MSH đơn chủng và đa chủng VKTQH trên giá thể (sỏi nhẹ, xơ dừa, mút xốp).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2022 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI: HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ CƠNG NGHỆ; VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM Viện Cơng nghệ sinh học HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ; VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC, VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: Người hướng dẫn khoa học 1: TS Lê Thị Nhi Công PGS TS Đồng Văn Quyền, Viện Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học TS Lê Thị Nhi Công, Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đồng Văn Quyền - Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 1: …………………………………… Phản biện 3: Phản biện 2: …………………………………… Phản biện 3: …………………………………… Luậnán ánsẽsẽđược đượcbảo bảovệvệtrước trướcHội Hộiđồng đồngđánh đánhgiá giáluận luậnánántiến tiếnsĩ sĩ cấp Luận cấp Họcviện, viện,họp họptại tạiHọc Họcviện việnKhoa Khoahọc họcvàvàCông Côngnghệ nghệ- Viện - ViệnHàn Hànlâm lâm Học Khoa học học vàCông Côngnghệ nghệViệt Việt Nam ngày Nam vàovào hồi hồi … … giờgiờ ….’,…’, ngày … … tháng … năm 202… tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Cơng nghệ Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học- viện vàsinh Công nghệ ViệnKhoa Cônghọc nghệ học - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Dầu mỏ sử dụng từ thời cổ đại ngày trở nên quan trọng xã hội, đặc biệt kinh tế, trị cơng nghệ Bên cạnh lợi ích kinh tế, dầu mỏ sản phẩm dầu nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng; chúng thải từ trình khai thác, sử dụng chế biến dầu Dầu mỏ có chứa nhiều hợp chất độc hại khó phân hủy tự nhiên, gây độc gây hệ lụy nghiêm trọng cho mơi trường sinh thái Đặc biệt, hợp chất thơm như: benzene, toluene, naphthalene, pyrene, phenol có độ hịa tan nước cao, độc hại nhiều loài sinh vật Xử lý nhiễm dầu mỏ tiến hành theo phương pháp học (vật lý), hóa học sinh học Trong đó, phương pháp vật lý hóa học thường sử dụng để xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ nồng độ cao, có chi phí lớn Biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật (VSV) phân hủy hydrocarbon dầu mỏ biện pháp hiệu xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ nồng độ thấp, nằm khả xử lý học/hoá học Ứng dụng VSV có khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ đồng thời tạo màng sinh học tăng hiệu xử lý sinh học Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) vi khuẩn quang hợp kỵ khí, cơng bố có khả trao đổi chất linh hoạt, sử dụng nhiều loại chất, có hydrocarbon Một số VKTQH có khả tạo màng sinh học đóng vai trị quan trọng việc phân hủy chuyển hóa hợp chất hydrocarbon dầu mỏ VKTQH phân bố rộng rãi tự nhiên, có tiềm ứng dụng cao xử lý nhiễm hydrocarbon dầu mỏ chỗ (in situ) bên (ex situ) Xuất phát từ sở thực tiễn nêu trên, đề xuất thực đề tài: “Nghiên cứu khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Tuyển chọn số chủng VKTQH từ vùng biển ô nhiễm dầu Việt Nam, vừa có khả tạo tạo màng sinh học vừa có khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao - Đánh giá hiệu suất phân hủy hợp chất hydrocarbon dầu mỏ màng sinh học đơn chủng đa chủng VKTQH loại giá thể, từ đưa giải pháp xử lý nhiễm dầu điều kiện mơ hình Các nội dung nghiên cứu luận án [1] Tuyển chọn số chủng VKTQH có khả tạo màng sinh học phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ tốt; nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh chủng lựa chọn [2] Nghiên cứu số điều kiện lý hóa pH, nhiệt độ, nồng độ muối ảnh hưởng tới khả tạo màng sinh học chủng lựa chọn [3] Đánh giá hiệu suất phân hủy số thành phần hydrocarbon dầu mỏ màng sinh học đơn chủng/ đa chủng gắn giá thể (xơ dừa, mút xốp, sỏi nhẹ) không gắn giả thể Giới thiệu luận án: Luận án gồm 98 trang (3 chương): Mở đầu trang, chương (Tổng quan tài liệu) 27 trang, chương (Vật liệu phương pháp nghiên cứu) 14 trang, chương (Kết nghiên cứu thảo luận) 56 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục công trình nghiên cứu tác giả trang, tài liệu tham khảo 18 trang, phụ lục trang, luận án có 34 hình, bảng, 178 tài liệu tham khảo CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn tía quang hợp VKTQH thuộc nhóm vi khuẩn (VK) thủy sinh có khả sinh trưởng điều kiện kỵ khí cách quang hợp khơng thải oxy chúng khơng nhận điện tử từ q trình quang phân ly nước mà từ số chất như: hydro, acid hữu đơn giản, lưu huỳnh, hydro sulfide, đường đơn giản rượu VKTQH thường có màu hồng đến đỏ tía, sắc tố quang hợp chứa bacteriochlorophyll (Bchl) carotenoid Nhóm VK có kiểu trao đổi chất linh hoạt tùy thuộc vào điều kiện môi trường sống nên chúng phân bố rộng rãi tự nhiên Theo khoá phân loại Bergey, VKTQH chia thành nhóm: (i)VKTQH lưu huỳnh (PSB): có khả tích luỹ giọt lưu huỳnh bên tế bào; (ii)VKTQH khơng lưu huỳnh (PNSB): khơng có khả tích luỹ giọt lưu huỳnh bên tế bào 1.2 Ứng dụng VKTQH để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ Những liệu ô nhiễm môi trường dầu mỏ cho thấy việc nghiên cứu, lựa chọn biện pháp xử lý nhiễm dầu an tồn hiệu vấn đề mang tính cấp thiết Các phương pháp vật lý hóa học mang lại hiệu nhanh chóng, rõ rệt phát huy tác dụng làm dầu Tuy nhiên, chúng thường tốn kém, tạo nhiễm thứ cấp Ngược lại, phương pháp tự nhiên đặc biệt phân hủy sinh học coi công nghệ xanh, đem lại hiệu cao thân thiện với môi trường Hạn chế phương pháp thời gian diễn chậm Chính vậy, việc kết hợp khoa học phương pháp việc tăng tốc độ phân hủy sinh học tập trung nghiên cứu thời gian gần Phân lập lựa chọn vi sinh vật phân hủy hydrocarbon bước quan trọng phương pháp xử lý sinh học Các hợp chất thơm nhóm khó phân hủy tự nhiên liên kết bền vững vịng benzen Một số PNSB có khả sử dụng hợp chất thơm có nguồn gốc từ thực vật bao gồm nhiều loại monome lignin số hợp chất nhân tạo chlorobenzoates toluene để làm nguồn carbon Rps palustris có khả sử dụng benzoate nguồn carbon cho trình quang hợp kỵ khí Khả chuyển hóa benzoate Rps palustris; Rps fulvum; Rcy purpureus đặc tính đặc trưng để phân biệt chúng với loài khác chi Khả quang chuyển hóa hợp chất thơm phát số loài khác như: Rps Acidophila, Rhodomicrobium (Rmi.) vannieli, Blastochloris (Blc.) sulfoviridis, Rubrivivax (Rvi.) benzoatilyticus Một số nghiên cứu khảo sát sinh trưởng Rps palustris nhiều hợp chất thơm khác cho thấy tuỳ chủng Rps palustris ngồi benzoate cịn sử dụng số hợp chất thơm khác 4-hydroxybenzoate, 4-hydroxycinnamate, cinnamate, chorobenzoates, phenylaxetat, phenol, hợp chất metoxyl hóa, như aldehyde rượu thơm nguồn carbon nitơ cho sinh trưởng Khả phân hủy dẫn xuất lignin chứa nhóm 3-methoxyl- 3-hydroxyl- tính đặc trưng riêng Rps palustris Mặc dù hợp chất chlorobenzoate thường chất độc VSV số chủng thuộc lồi Rps palustris có khả sử dụng hợp chất nguồn carbon Ở Việt Nam, tác giả Đinh Thị Thu Hằng cộng năm 2007 có nghiên cứu phân hủy sinh học hợp chất hydrocacbon mạch vịng số vi khuẩn quang hợp tía Nghiên cứu phát chủng vi khuẩn quang hợp tía có khả phân hủy mạnh 3-chlorobenzoate với đồng chất benzoate 4-hydroxybenzoate, 3-chlorobenzoate sử dụng nguồn carbon Gen badA mã hóa cho enzyme benzoateCoA ligase đường phân hủy benzoate chủng VKTQH MI1 tương đồng 93,3% so với gen tương ứng loài R palustris chủng DCP3 công bố Ngân hàng Gen Quốc tế Gần đây, Sampaio cộng (2017) phân lập số chủng thuộc chi Rhodovolum chi Rhodomicrobium có khả phân hủy kỵ khí hydrocarbon dầu mỏ Venkidusamy Megharaj (2021) phân lập chủng Rps palustris RP2 phân huỷ thành phần n-alkane hydrocarbon dầu mỏ 1.3 Vi sinh vật có khả phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ tạo màng sinh học (MSH) Sự ô nhiễm môi trường hydrocarbon dầu mỏ, bao gồm hydrocarbon no hydrocarbon thơm tồn lâu tự nhiên có xu hướng lan rộng vào nước bề mặt nước ngầm Hiệu phân hủy PAH VK phụ thuộc vào khả tồn mơi trường khắc nghiệt Điều đáng ý, khu hệ VSV MSH có khả chống chịu điều kiện khắc nghiệt môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hạn chế cạnh tranh VSV khác qua cho thấy tiềm chống chọi với môi trường khắc nghiệt tăng cường khả phân hủy chất ô nhiễm Kokoky cộng (2017) phân lập số chủng VK từ đất ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ, có chủng Acinetobacter sp PDB4 lựa chọn để đánh giá khả tạo MSH, phân hủy PAH thúc đẩy phát triển trồng Shao cộng (2015) công bố chủng Acinetobacter sp phân lập từ khu vực khai thác than sử dụng fluorene, phenanthrene pyrene làm nguồn carbon Nghiên cứu Zhang cộng (2015) cho thấy MSH hình thành chủng Micrococcus sp PHE9 Mycobacterium sp NJS-P có khả phân hủy phenanthrene pyrene, tốc độ phân hủy MSH cao nhiều so với vi khuẩn polysaccharide ngoại bào (EPS) Wimpenny cộng (2000) báo cáo nghiên cứu xử lý sinh học qua trung gian MSH cách tiếp cận thành thạo lựa chọn an tồn tế bào MSH có hội sống sót khả thích ứng tốt hơn, đặc biệt điều kiện khắc nghiệt MSH hỗ trợ phát triển Pseudomonas sp tăng cường phân hủy dầu thô cách dễ dàng rộng rãi MSH hình thành có dầu thơ tích lũy sinh khối cao so với MSH tạo có glucose nguồn carbon Nghiên cứu Tribelli cộng (2012) cho thấy chủng Pseudomonas extremaustralis phân lập từ Nam Cực có khả tạo MSH Trong MSH, tế bào VK tăng trưởng, sản xuất chất hoạt hóa bề mặt phân hủy dầu diesel đạt hiệu suất cao so với ni cấy bình lắc MSH chủng phân hủy alkane mạch dài mạch nhánh, nhiên ni cấy bình lắc chủng phân hủy ankane mạch trung bình Để khám phá tiềm xử lý nước nhiễm dầu thô đậm đặc Pseudomonas aeruginosa NY3, chủng NY3 cố định bề mặt mút xốp để đánh giá khả tạo MSH khả khôi phục MSH sử dụng nghiên cứu Kết cho thấy trình hình thành MSH chủng NY3 diễn nhanh chóng dễ dàng Trong điều kiện tối ưu, sinh khối cố định bề mặt mút xốp đạt 488,32 mg tế bào khơ / g mút xốp khô Kết chứng minh tỷ lệ loại bỏ dầu trung bình g dầu thô / L nước bị ô nhiễm khoảng 90% 40 ngày Trong đó, MSH thu hồi để tái sử dụng Khả thu hồi tốc độ loại bỏ dầu cao, ổn định tạo điều kiện thuận lợi cho việc áp dụng MSH để loại bỏ dầu cô đặc khỏi nước thải Mới đây, Omarova cộng (2019) nghiên cứu khả phân hủy hydrocarbon chủng Alcanivorax borkumensis thấy MSH chủng có khả loại bỏ 40-50% vệt dầu loang sau ngày nuôi cấy phân hủy đến 90% hexadecan sau ngày ni cấy (trong chất phân tán thương mại Corexit 9500A làm giảm 25% hexadecan) Trong vài năm gần tác giả Lê Thị Nhi Công cộng đánh giá khả tạo MSH số chủng VK nấm men phân huỷ dầu, phân lập từ mẫu nước biển bị ô nhiễm dầu Thanh Hoá Vũng Tàu Kết cho thấy, xác định chủng thuộc chi Candida, Acinetobacter, Bacillus, Rhodococcus chủng vừa tạo MSH vừa có khả phân huỷ chuyển hoá thành phần dầu mỏ tốt Hơn nữa, sau 24 nuôi cấy, dạng tạo MSH chúng cịn có khả phân huỷ dầu tốt dạng tế bào tự Điều cho thấy tiềm phong phú chủng loại VSV vừa tạo MSH vừa phân huỷ chuyển hoá hydrocarbon mẫu đất nước bị ô nhiễm dầu Việt Nam Nghiên cứu Cung Thị Ngọc Mai (2019) tuyển chọn chủng vi khuẩn chủng nấm men bao gồm Rhodococcus sp BQN11, Paracoccus sp DG25, Ochrobactrum sp DGP2, Pseudomonas sp DGP4, Pseudomonas sp DGP8, Acinetobactersp QND10, Rhodococcus sp.VTPG5, C viswanathii TH1 Candida sp TH4 từ vị trí nhiễm dầu Các chủng VSV có khả tạo MSH tốt pH 5, 30oC có khả phân hủy lên đến 99.8% phenol, 76.07% pyrene, 65.4% anthracene 35.7% iso-pentybenzene điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm với nồng độ ban đầu từ 100-200 ppm Sử dụng giá thể cho VSV tạo màng sinh học có nhiều ưu điểm tăng mật độ VSV tham gia xử lý, đem lại hiệu xử lý ổn định Vật liệu sử dụng làm giá thể dùng xử lý ô nhiễm nước đa dạng xơ dừa, sỏi nhẹ, xốp, bèo tây khô… Hiện nhiều công nghệ xử lý nước thải sử dụng giá thể cho hệ vi sinh phát triển bể phản ứng sinh học kết hợp màng (MBR), bẻ phản ứng màng sinh học chuyển động ngang (MBBBR) … đem lại hiệu cao trình xử lý Năm 2016, Lê Thị Nhi Công cộng nghiên cứu MSH hỗn hợp chủng VK nấm men gắn xơ dừa, vừa chất hấp phụ, vừa giá thể Hiệu phân hủy thành phần hydrocarbon khó phân hủy có nước thải nhiễm dầu nhờ hệ thống MSH từ VSV gắn xơ dừa đạt > 99% sau ngày thử nghiệm, đạt tiêu chuẩn nước thải loại B Việt Nam Năm 2017, Đỗ Văn Tuân cộng thiết kế hệ thống xử lý sinh học nước thải nhiễm dầu quy mơ 20.000 lít/mẻ kho xăng dầu Đỗ Xá, Thường Tín, Hà Nội sử dụng MSH gắn xơ dừa Sau ngày xử lý, 99.9% thành phần hydrocarbon nước thải nhiễm dầu, 99,9% phenol 94,8% thành phần hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) loại bỏ Việc sử dụng chủng VK kị khí vi hiếu khí, nấm men có khả tạo MSH phân hủy hydrocarbon dầu mỏ giải pháp khắc phục ô nhiễm dầu mỏ Đặc biệt, VKTQH cơng bố có khả trao đổi chất linh hoạt, sử dụng nhiều loại chất có hydrocarbon dầu mỏ… nhóm VK ứng dụng 11 - Khả tạo MSH chủng lựa chọn tiến hành nhuộm với tím tinh thể theo phương pháp O’Toole Kolter (1998), Morikawa (2006) - Phổ hấp thụ Bacteriochlorophyll tế bào nguyên xác định theo phương pháp quang phổ vùng 400 – 900 nm máy quang phổ Novaspec II máy quang phổ UV – 1650PC - Xác định Gram vi khuẩn theo phương pháp Smith Hussey (2005) - Tính đối kháng chủng VKTQH thực theo mô tả Nguyễn Lân Dũng cộng (1981) - Đánh giá khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ MSH VKTQH phương pháp sắc kí khối phổ (GCMS), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử - Các bước tách chiết DNA tổng số tiến hành theo mô tả nghiên cứu Ramana et al (2006) - Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn 16S rRNA theo phương pháp Hillmer Gest (1977) - Trình tự nucleotide sản phẩm PCR xác định hệ thống đọc trình tự DNA tự động ABI (Mỹ) phân tích phần mềm tin sinh Bioedit, Clustal X Mega4 - Điện di DNA gel agarose tiến hành theo phương pháp Sambrook Russel (2001) 2.2.3 Nhóm phương pháp phân tích hóa học - Các thành phần hydrocarbon thơm có dịch ni cấy vi khuẩn đem phân tích hóa học sắc ký lỏng cao áp (HPLC) - Hàm lượng dầu diesel xác định phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 4582-88:100 ml 12 2.2.4 Xử lý thống kê Các kết quả, số liệu nghiên cứu xử lý phương pháp thống kê sinh học Dựa vào phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn vẽ đồ thị Mỗi thí nghiệm lặp lại lần để tính trung bình mẫu Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê đề nghị p1) Song song với thí nghiệm xác định khả sinh trưởng 32 chủng VKTQH chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả tạo 13 MSH Kết tạo MSH 32 chủng VKTQH so sánh với chủng P23 đối chứng dương cho thấy 10 chủng FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 tạo MSH tốt so với chủng P23 đối chứng dương có giá trị OD590 đạt 17,6 (Hình 3.3 3.4 trang 50 tồn văn) Trong đó, bốn chủng DQ41, DQ51, DD4 DQ82 có khả hình thành MSH mạnh mẽ, giá trị OD590 từ 20,6 đến 22,4 tiếp tục tăng sau ngày nuôi cấy Do đó, chúng tơi lựa chọn 10 chủng để thực nghiên cứu 3.1.2.2 Khả sử dụng hydrocarbon dầu mỏ chủng VKTQH Kết thí nghiệm đánh giá khả sử dụng dầu diesel, naphthalene, phenol, pyrene toluene 10 chủng VKTQH tổng hợp Bảng 3.3 Bảng 3.3 Khả sinh trưởng nguồn chất VKTQH Nguồn chất Nồng độ Toluene 200 ppm 250 ppm 150 ppm 300 ppm 200 ppm 250 ppm 200 ppm 250 ppm 4-8% Phenol Naphthalene Pyrene Dầu diesel Chủng VSV có khả sinh trưởng tốt DQ41, DD4, DQ52 FO2 DQ41, DD4 FO2 DQ41, FO1, FO2, DD3 DD4 DQ41, FO2 DD4 DQ41, DQ52, DQ81 DD4 DQ52, DQ81 DD4 DQ41, DQ51, FO2, DD3 DD4 DQ41, FO2 DD4 DQ41, DD4, FO2 Ba chủng DQ41, DD4, FO2 lựa chọn chủng VKTQH đồng thời sở hữu hai đặc tính tạo MSH khả sử dụng hydrocarbon dầu mỏ Như vậy, ba chủng tiếp tục 14 lựa chọn để phân tích cách chi tiết đặc điểm sinh học định danh loài 3.2 Các đặc điểm sinh học định danh ba chủng DQ41, DD4 FO2 3.2.1 Các đặc điểm hình thái Kết nhuộm Gram cho thấy ba chủng VKTQH VK Gram (-) Các khuẩn lạc chủng DD4 có hình trịn, nhỏ li ti, có màu đỏ nhạt; tế bào chúng có dạng hình que, xoắn, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 700 x 2210 nm Các khuẩn lạc chủng DQ41 có hình trịn, lồi, bóng, khơng nhân, có rìa trong, màu đỏ đậm, đường kính - 1.5 mm; tế bào chúng có dạng hình que, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 540 x 1320 nm Các khuẩn lạc chủng FO2 có hình tròn, nhẵn, nhỏ màu đỏ nhạt bao phủ viền mờ đục, đường kính nhỏ 0.5 mm; tế bào chúng có dạng hình que, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 515 x 1160 nm Quan sát kính hiển vi điện tử cho thấy tất chủng có dng hỡnh gy, vi kớch thc 500 ì1100 ữ 700 ×2200 nm Đáng ý, chủng FO2 có phương thức sinh sản nảy chồi Như vậy, ba chủng mà chúng tơi lựa chọn có đặc điểm hình thái tương tự với loài thuộc chi Rhodopseudomonas 3.2.2 Trình tự 16S rRNA và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2 Cả ba chủng VKTQH DD4, DQ41và FO2 có trình tự gen mã hóa 16S rRNA có mức độ tương đồng cao R palustris (>99%) mức độ tương đồng thấp so với R faecalis (>98%) Dựa đặc điểm hình thái trình tự gene mã hóa 16S rRNA, ba chủng chọn phân loại có trình tự tương 15 đồng cao đặt tên Rhodopseudomonas sp DD4, Rhodopseudomonas sp DQ41 Rhodopseudomonas sp FO2 Trình tự gene 16S rRNA chủng FO2, DQ41, DD4 đăng ký ngân hàng gene quốc tế với mã số tương ứng LC318127, LC318128 LC318129 Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại chủng DD4, DQ41, FO2 Cả ba chủng VKTQH DD4, DQ41và FO2 có trình tự gen mã hóa 16S rRNA có mức độ tương đồng cao R palustris (>99%) mức độ tương đồng thấp so với R faecalis (>98%) 16 Dựa đặc điểm hình thái trình tự gene mã hóa 16S rRNA, ba chủng chọn phân loại có trình tự tương đồng cao đặt tên Rhodopseudomonas sp DD4, Rhodopseudomonas sp DQ41 Rhodopseudomonas sp FO2 Trình tự gene 16S rRNA chủng FO2, DQ41, DD4 đăng ký ngân hàng gene quốc tế với mã số tương ứng LC318127, LC318128 LC318129 3.2.3 Các đặc điểm sinh học 3.2.3.1 Đặc điểm sắc tố quang hợp Cả chủng có điểm cực đại vùng 800 - 890 nm đặc trưng cho bacteriochlorophyll a mô tả nghiên cứu trước Carotenoid VKTQH đa dạng, đặc trưng cho loài khác hẳn với nhóm sắc tố tảo thực vật bậc cao cấu trúc Chủng DD4 có cực đại 591nm, chủng DQ41 có cực đại 406, 445, 464, 492, 591nm, chủng FO2 có cực đại 460, 491, 591 nm Các cực đại hấp thụ phù hợp với phổ hấp thụ họ spirilloxanthin Theo nghiên cứu Plennig Trueper (1992), khả tổng hợp sắc tố tế bào VKTQH phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh trưởng Các loài chi Rhodopseudomonas có khả tổng hợp sắc tố sinh trưởng điều kiện hiếu khí, tối Để xác định khả tổng hợp sắc tố chủng lựa chọn, nuôi cấy chúng đĩa petri chứa mơi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch ni điều kiện kỵ khí, sáng hiếu khí, tối Kết xác định ảnh hưởng oxy ánh sáng đến khả tổng hợp sắc tố chủng lựa chọn cho thấy chúng sinh trưởng điều kiện hiếu khí, tối khả tổng hợp sắc tố bị ức chế phần, màu sắc khuẩn lạc trở nên hồng nhạt màu (Hình 3.18 trang 61 tồn văn) Kết thu khẳng định ba chủng lựa chọn tổng hợp sắc tố quang hợp chiếu 17 sáng Mặc dù chúng sinh trưởng điều kiện hiếu khí, tối khả tổng hợp sắc tố chúng bị ức chế Đây đặc điểm đặc trưng chi Rhodopseudomonas 3.2.3.2 Khả sử dụng số nguồn carbon thay ba chủng DQ41, DD4 FO2 So sánh khả sử dụng số nguồn carbon ba chủng DQ41, DD4 FO2 với đại diện loài Rhodopseudomonas, kết Bảng 3.4 trang 62 toàn văn cho thấy, ba chủng DQ41, DD4 FO2 có khả sinh trưởng mơi trường chứa formate, acetate, succinate, citrate, benzoate, glycerol malate Chúng khả sinh trưởng mơi trường chứa methanol tartate Khả sử dụng nguồn carbon acetate, succinate, malate glycerol chủng VK nghiên cứu tương tự loài thuộc chi Rhodopseudomonas Trong số lồi thuộc chi này, có hai lồi R palustris R rhenobacensis số chủng thuộc lồi R acidophila có khả sử dụng formate nguồn carbon cho sinh trưởng Tuy nhiên, loài R acidophila sinh trưởng tốt môi trường axit R rhenobacensis lại có khả sử dụng tartate nguồn carbon Đặc biệt, chủng VKTQH DD4, FO2 DQ41 có khả sinh trưởng mạnh môi trường chứa nguồn carbon glycerol Theo số nghiên cứu cơng bố, số lồi thuộc chi Rhodopseudomonas có lồi R palustris có khả sử dụng benzoate nguồn carbon cho sinh trưởng kỵ khí ngồi sáng Như vậy, theo đặc điểm dinh dưỡng carbon ba chủng VKTQH nghiên cứu gần với loài R palustris Nhiều đặc điểm hình thái, sinh lý dinh dưỡng carbon chủng tương tự loài R palustris 18 3.3 Ảnh hưởng số điều kiện mơi trường đến hình thành MSH chủng VKTQH B chủng DQ41, DD4 FO2 tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến hình thành MSH chúng ngưỡng 15, 30, 37, 40, 45oC; dải pH từ – 9; nồng độ muối từ - 4% Kết cho thấy chủng DQ41, DD4 FO2 có khả sinh trưởng tốt ngưỡng nhiệt độ thử nghiệm, đạt tối ưu khoảng 30 - 37oC; pH = (đáng ý, chủng VKTQH có khả sinh trưởng tạo MSH tốt dải pH từ – 9); tất chủng VKTQH tạo MSH nồng độ muối NaCl khác nhau, ba chủng hai chủng DD4 FO2 tạo MSH tốt nồng độ NaCl 1,5 đến 2% chủng DQ41 tạo MSH tốt nồng độ NaCl 1% Tuy nhiên, để tìm điều kiện chung cho chủng VKTQH nồng độ – % sử dụng cho nghiên cứu Kết mở hướng ứng dụng chủng VKTQH môi trường nước ngọt, nước lợ nước mặn 3.4 Hiệu suất phân hủy số hydrocarbon dầu mỏ MSH từ chủng VKTQH 3.4.1 Hiệu suất phân hủy số hydrocarbon thơm MSH đơn chủng không gắn giá thể chủng VKTQH lựa chọn Kết từ Bảng 3.5 (trang 67 toàn văn) cho thấy, khả phân hủy hợp chất toluene, naphthalene, pyrene MSH chủng VK tạo thành tốt Đặc biệt, kết phân tích toluene cho thấy chủng lựa chọn có khả phân hủy hoàn toàn toluene nồng độ ban đầu 250 ppm Hiệu suất phân hủy pyrene chủng tốt đạt 99% Chủng FO2 có khả phân hủy pyrene cao với hiệu suất lên tới 99,37% tương ứng với nồng độ ban đầu 300 ppm 19 Hiệu suất phân hủy naphthalene 97,71; 97,23; 96,53% tương ứng với chủng DQ41, DD4 FO2 (nồng độ chất ban đầu 300 ppm) Hiệu suất phân hủy phenol nồng độ 300 ppm chủng VKTQH DQ41, DD4, FO2 76,48, 78,35, 86,53% 3.4.2 Hiệu suất phân hủy số hydrocarbon dầu mỏ MSH đơn chủng/đa chủng không giá thể/trên giá thể chủng VKTQH lựa chọn 3.4.2.1 Kiểm tra tính đối kháng chủng VSV lựa chọn Mục tiêu nghiên cứu đánh giá hiệu suất phân hủy hydrocarbon dầu mỏ màng sinh học từ hỗn hợp chủng VKTQH lựa chọn, so sánh với màng sinh học đơn chủng Bên cạnh đó, hiệu màng sinh học tạo điều kiện có khơng có giá thể so sánh Trước tiên, tính đối kháng ba chủng đánh giá theo phương pháp cấy vạch Kết quả, cho thấy ba chủng VKTQH khơng đối kháng lẫn (Hình 3.22, toàn văn trang 70) 3.4.2.2 Đánh giá hiệu tạo MSH loại giá thể Quan sát kính SEM màng sinh học cho thấy độ xốp tất giá thể phù hợp cho hấp phụ tế bào VK vào giá thể (Hình 3.24, tồn văn trang 72) Trong đó, sỏi nhẹ có nhiều cấu trúc mút xốp, nơi VK xâm chiếm; xơ dừa có cấu trúc sợi hình thành sợi song song; mút xốp không xốp giá thể khác theo Alessandrello cộng (2017), mút xốp vật liệu tiềm để gắn VK áp dụng phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ Các đặc tính lý tưởng giá thể khơng độc, rẻ tiền có độ xốp cao có cấu trúc dạng sợi để gắn kết tế bào phát triển 20 VKTQH quan sát thấy có hình dạng que với kích thước khoảng x 0,3 (nm), tạo cấu trúc MSH bền vững Độ dày MSH tạo thành giá thể sỏi nhẹ, xơ dừa mút xốp cao xác định tương ứng 13, 20 12 nm Theo công bố Levison cộng (1994), chất oxy dễ dàng khuếch tán cho hoạt động trao đổi chất MSH có độ dày từ 10–20 mm Hơn nữa, số lượng VKTQH gắn xơ dừa cao so với sỏi nhẹ mút xốp (Hình 3.23, tồn văn trang 71) Như kết luận xơ dừa giá thể phù hợp cho VKTQH bám dính 3.4.2.3 Hiệu suất phân hủy dầu diesel MSH Kết phân tích (Hình 3.25, trang 74 tồn văn) cho thấy MSH tạo chủng DD4, DQ41 FO2 phân hủy dầu diesel với hiệu suất 56, 60 58% Hiệu suất phân hủy dầu diesel MSH đa chủng không gắn giá thể đạt 78% Hình3.25a 3.25b cho thấy gia tăng số lượng tế bào VKTQH thấy rõ sau ngày nuôi cấy, chứng tỏ sau ngày nuôi cấy hiệu suất phân hủy dầu diesel tăng nhanh Sau ngày, số lượng tế bào có xu hướng giảm chủng VKTQH pha suy vong, dinh dưỡng môi trường cạn kiệt Từ kết thu được, suy để sản xuất sinh khối, tế bào đòi hỏi phải khai thác dầu diesel làm nguồn carbon lượng Hình 3.26 (trang 75 toàn văn) chứng minh khả hấp phụ dầu diesel ba loại giá thể sỏi nhẹ, mút xốp xơ dừa khơng có VKTQH 16, 12 15%, đó, MSH đa chủng hình thành giá thể sỏi nhẹ, mút xốp xơ dừa phân hủy dầu diesel tối đa 90, 91 95% Kết (Hình 3.25 Hình 3.26) màng sinh học tạo thành VKTQH giá thể có hiệu suất phân hủy dầu diesel > 21 90%, đặc biệt màng sinh học xơ dừa 95% (p