Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập tại cây xăng việt hoàng huyện phú lương tỉnh thái nguyên

a ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHUÔNG TRƢỜNG GIANG t NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DẦU DIESEL CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TẠI CÂY XĂNG VIỆT HOÀNG HUYỆN PHÚ LƢƠNG TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS: NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên, Năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Tác giả Khng Trƣờng Giang Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trƣởng phịng Cơng nghệ Sinh học Môi Trƣờng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập thực đề tài nghiên cứu Trong trình làm luận văn, nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình anh chị Phịng Cơng nghệ Sinh học Môi Trƣờng Đặc biệt TS Lê Thị Nhi Công, Th.S Cung Thị Ngọc Mai, CN Vũ Thị Thanh … Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa sau Đại học - Đại học Thái Nguyên dạy dỗ bảo suốt trình học tập trƣờng Lời cuối xin cảm ơn ngƣời thân gia đình, anh em bạn bè động viên giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần để tơi hồn thành khóa học thực tốt luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày Số hóa trung tâm học liệu tháng năm 2013 http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung dầu mỏ 2.1.1 Cấu trúc hóa học đặc điểm dầu mỏ: 2.1.2 Các sản phẩm từ dầu mỏ: 2.2 Tình trạng nhiễm dầu ảnh hƣởng nó: 2.1 Tình hình nhiễm dầu giới: 2.2.3 Hậu tác động nước ô nhiễm dầu 10 2.3 Các phƣơng pháp xử lý ô nhiễm dầu 12 2.3.1 Phương pháp học: 12 2.3.2 Phương pháp hóa học: 12 2.4 Vai trò vi sinh vật phân hủy dầu: 13 2.5 Cơ chế phân hủy dầu DO vi sinh vật: 15 2.5.1 Phân hủy hydrocacbon no: 16 2.5.2 Phân hủy hydrocacbon thơm: 19 2.6 Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật: 19 2.6.1 Phương pháp phân loại truyền thống: 20 2.6.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử: 20 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Nguyên liệu, hoá chất thiết bị sử dụng: 22 3.1.1 Nguyên liệu: 22 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv 3.1.2 Hố chất, môi trƣờng nuôi cấy: 22 3.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 23 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: 24 3.2.1 Thu thập mẫu: 24 3.2.2 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu diesel 25 3.2.3 Khảo sát khả sử dụng dầu diesel chủng vi khuẩn 25 3.2.4 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn: 26 3.2.5 Đánh giá ảnh hƣởng số điều kiện hóa lý tới khả phân hủy dầu diesel: 27 3.2.7 Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa vào xác định trình tự đoạn mã hóa 16S rRNA xây dựng phát sinh chủng loại: 27 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết lấy mẫu đất nƣớc thải 31 4.3 Đặc điểm sinh học chủng G10 41 4.4 Phân loại định tên xây dựng phát sinh chủng loại dựa trình tự đoạn gen mã hố 16S rRNA chủng vi khuẩn G10 42 4.5 Ảnh hƣởng pH, nồng độ muối NaCl đến khả sinh trƣởng mơi trƣờng có dầu diesel chủng G10: 45 4.6 Khả phân huỷ dầu diesel chủng G10: 48 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị: 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Atm : Standard atmosphere Bp : Base pair ( cặp bazơ ) CFU : Colony forming unit DNA : Deoxyribonucleic acid KDa : Kilo Dalton ( 1.66 x 10-27 kg ) LB : Luria - Broth MPA : Meat - Peptone - Agar OD : Opitical Density ( mật độ quang học ) PCR : Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hơp) Ppm : Parts per million ( Đơn vị phần triệu, mg/1) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid vsv : Vi sinh vật X-gal : – bromo – – crlomo – indolyl - - D – galactopy : ranoside Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Máy móc thiết bị dùng đề tài ………………… ……… 24 Bảng 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập đƣợc … 34 Bảng 4.2 Khả sinh trƣởng môi trƣờng có dầu diesel 1% 10 chủng vi kkhuẩn …… 35 Bảng 4.3 Khả sinh trƣởng môi trƣờng có dầu diesel 2% chủng vi khuẩn …….… ………………………………………………………… 37 Bảng 4.4 Khả sinh trƣởng mơi trƣờng có dầu diesel 5% chủng vi khuẩn … … ………………………………………………………… 39 Bảng 4.5 Khả sinh trƣởng mơi truờng có dầu diesel 10% chủng vi khuẩn … … … 40 Bảng 4.6 Một số chủng có trình tự 16S rRNA tƣơng đồng với chủng G10…… 43 Bảng 4.7 Khả sinh trƣởng phát triển chủng G10 với nồng độ DO 10% giải pH khác … … … ………………………… 46 Bảng 4.8 Khả sinh trƣởng phát triển chủng G10 với nồng độ DO 10% nồng độ muối NACl khác … … … … ……… 47 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1 Mẫu đất nƣớc xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, Phú Lƣơng, Thái Nguyên … … … … … … … … … ………… 31 Hình 4.2a Làm giàu lần mơi trƣờng khống có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … …… 32 Hình 4.2b Làm giàu lần mơi trƣờng khống có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … …… 32 Hình 4.2c Làm giàu lần mơi trƣờng khống có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … …… 32 Hình 4.3 Tập đồn vi sinh vật mơi trƣờng muối khống Gost thạch .… … … … … … … … ………… …………………… 33 Hình 4.4 Đặc điểm dịch ni chủng mơi trƣờng muối khống có bổ sung 1% dầu diesel sau ngày nuôi cấy … … … …………………… 35 Hình 4.5 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn nồng độ 1% dầu diesel 36 Hình 4.6 Khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng có 2% dầu diesel… ……………………………………………………………………… 37 Hình 4.7 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn nồng độ 2% dầu diesel………………………………………………………… 37 Hình 4.8 Khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng có 5% dầu diesel………………………………………………………………………… 38 Hình 4.9 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn nồng độ 5% dầu diesel………………………………………………………… 39 Hình 4.10 Khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng có 10% dầu diesel………………………………………………………… … 40 Hình 4.11 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ viii nồng độ 10% dầu diesel……………………………………………………… 41 Hình 4.12 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng G10……… 41 Hình 4.13 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn G10… 42 Hình 4.14 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn G10 ……… 44 Hình 4.15 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn G10 giá trị pH khác …………………… ……………… …… 46 Hình 16 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn G10 giá trị NaCl khác ………………………………….…… Số hóa trung tâm học liệu 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn/ CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp chế biến dầu mỏ nƣớc giới có Việt Nam phát triển không ngừng Tuy nhiên với phát triển ngành tình trạng nhiễm mơi trƣờng ảnh hƣởng chất thải có nhiễm dầu Các tƣợng tràn dầu, rị rỉ dầu gây nhiễm nghiêm trọng cho môi trƣờng, làm hủy hoại hệ sinh thái động thực vật ảnh hƣởng trực tiếp đến đời sống ngƣời, nhiễm mơi trƣờng nƣớc dầu gây đƣợc xem vấn đề đáng lo ngại tốc độ lan truyền, quy mô ảnh hƣởng rộng thời gian tác động lâu dài Ngồi cố kể vấn đề bảo quản xăng dầu kho chứa nhƣ xăng có số lƣợng xăng dầu không nhỏ gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng xung quanh kho chứa xăng Đứng trƣớc hiểm họa ô nhiễm dầu mỏ sản phẩm nó, để giải cách triệt để địi hỏi phải có kết hợp nghiên cứu nhiều nhà khoa học, công nghệ nhà quản lý môi trƣờng nhƣ hợp tác đơn vị vận chuyển, kinh doanh sử dụng sản phẩm từ dầu mỏ Với mục tiêu góp phần bảo vệ mơi trƣờng, ngồi việc tránh tƣợng rị rỉ dầu bên ngồi việc xử lý nƣớc thải có nhiễm dầu đƣợc đặc biệt quan tâm ý Hiện nay, phân hủy sinh học (biodegradation)đã đƣợc áp dụng rộng rãi xử lý nhiễm dầu chất độc hóa học nhƣ chất ô nhiễm khác Bản chất cơng nghệ phân hủy sinh học kích thích phát triển vi sinh vật địa có khả phân hủy dầu chất gây ô nhiễm khác có sẵn tự nhiên, cách thay đổi yếu tố mơi trƣờng nhƣ độ thơng khí, chất dinh dƣỡng, nguồn nitơ, phốt pho, chất vi lƣợng, chất hoạt động bề mặt sinh học …v.v Các yếu tố có ý nghĩa tạo điều kiện tối ƣu để vi sinh vật sử dụng thành phần dầu mỏ phát triển Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 42 4.4 Phân loại định tên xây dựng phát sinh chủng loại dựa trình tự đoạn gen mã hố 16S rRNA chủng vi khuẩn G10 Chủng G10 đƣợc phân loại định tên phƣơng pháp phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA Trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng G10 đƣợc xác định máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu,trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng vi khuẩn đƣợc thể hình 4.13 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 agcttgctct gagggggata gggaccttcg aacggctcac ctgagacacg aagcctgatg gcggggagga accggctaac tactgggcgt acctgggaac ggtgtagcgg gacaaagact agtccacgcc ctaacgcgtt gacgggggcc tacctggtct agacaggtgc acgagcgcaa cagtgataaa gctacacacg ctcataaagt cgctagtaat cccgtcacac cttaccactt cgggtgacga actactggaa ggcctcatgc ctaggcgacg gtccagactc cagccatgcc aggcgttgag tccgtgccag aaagcgcacg tgcattcgaa tgaaatgcgt gacgctcagg gtaaacgatg aaatcgaccg cgcacaagcg tgacatccac tgcatggctg cccttatcct ctggaggaag tgctacaatg atgtcgtagt cgtagatcag catgggagtg tg gcggcggacg acggtagcta catcagatgt atccctagct ctacgggagg gcgtgtgtga gttaataacc cagccgcggt caggcggtct actggcaggc agagatctgg tgcgaaagcg tcgatttgga cctggggagt gtggagcatg agaactttcc tcgtcagctc ttgttgccag gtggggatga gcatatacaa ccggattgga aatgctacgg ggttgcaaaa ggtgagtaat ataccgcata gcccagatgg ggtctgagag cagcagtggg agaaggcctt tcgtcgattg aatacggagg gtcaagtcgg tagagtcttg aggaataccg tggggagcaa ggttgtgccc acggccgcaa tggtttaatt agagatggat gtgttgtgaa cggttaggcc cgtcaagtca agagaagcga gtctgcaact tgaatacgtt gaagtaggta gtctgggaaa acgtcgcaag gattagctag gatgaccagc gaatattgca cgggttgtaa acgttacccg gtgcaagcgt atgtgaaatc tagagggggg gtggcgaagg acaggattag ttgaggcgtg ggttaaaact cgatgcaacg tggtgccttc atgttgggtt gggaactcaa tcatggccct cctcgcgaga cgactccatg cccgggcctt gcttaacctt ctgcctgatg accaaagtgg taggtggggt cacactggaa caatgggcgc agcactttca cagaagaagc taatcggaat cccgggctca tagaattcca cggccccctg ataccctggt gcttccggag caaatgaatt cgaagaacct gggaactgtg aagtcccgca aggagactgc tacgaccagg gcaagcggac aagtcggaat gtacacaccg cgggagggcg Hình 4.13 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn G10 Kết so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng G10 với chủng vi khuẩn LPSN cho thấy,chủng G10 có độ tƣơng đồng cao với chủng thuộc chi Klebsiella đặc biệt tƣơng đồng đến 99% so với loài Klebsiella pneumoniae [Bảng 4.6], chủng G10 đƣợc đặt tên Klebsiella sp G10 đƣợc đăng ký ngân hàng Genbank với mã số JX983098 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 43 Bảng 4.6 Một số chủng có trình tự 16S rRNA tƣơng đồng với chủng G10 TT Tên vi sinh vật Mã số Mức độ tƣơng đồng Enterobacter aerogenes AB004750 1367/1391 (98%) Klebsiella ornithinolytica U78182 1359/1391 (98%) Klebsiella oxytoca AF129440 1335/1372 (97%) Klebsiella pneumoniae subsp Ozaenae AF130982 1358/1372 (99%) Klebsiella planticola ATCC 33531T AF129443 1340/1372 (98%) Klebsiella pneumoniae X87276 1390/1393 (99%) Klebsiella pneumoniae ATCC13884T Y17657 1385/1392 (99%) Klebsiella singaporensis LX3 AF250285 1264/1282 (99%) Dựa vào bảng 4.6 xây dựng đƣợc phát sinh chủng loại chủng G10 ( Hình 4.14) Chúng nhận thấy,mức độ tƣơng đồng chủng thuộc chi Klebsiella với chủng vi khuẩn G10 ( Klebsiella sp G10 (JX983098))theo thứ tự gần gũi là: Klebsiella pneumoniae (X87276)> Klebsiella singaporensis LX3`(AF250285)> Klebsiella pneumoniae ATCC13884T (Y17657) > Klebsiella pneumoniae subsp Ozaenae (AF130982) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 44 Hình 4.14 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn G10 Hiện nay, chƣa có nhiều cơng bố khả phân hủy dầu diesel chủng vi khuẩn thuộc chi Klebsiella Tuy nhiên, số tác giả giới công bố khả phân huỷ dầu DO chi Pseudomonas Nghiên cứu nhóm tác giả Kaczorek cộng năm 2011 nghiên cứu khả phân huỷ sinh học hợp chất hydrocorbon phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Pseudomonas alcaligenes S22 có khả phân huỷ 92% dầu DO sau 21 ngày ni cấy có bổ sung thêm Trion X-100 [28] Năm 2009 tác giả Yieng cs phân lập đƣợc chủng Pseudomonas lundensis UTAR FPE2 từ lị nhiên liệu nhà máy có khả phân huỷ 69% dầu diesel ngày [45] Năm 2006 nhóm tác giả Ueno A cộng phân lập đƣợc chủng Psedomonas aeruginosa WatG đất nhiễm dầu có khả phân huỷ 51% tổng lƣợng hydrocarbon mạch thẳng có dầu DO [42] Năm 2005, nhóm tác giả Hong cộng phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa IU5 có khả phân huỷ 60% dầu DO (8500 mg/kg) sau 13 ngày ni cấy [24] Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 45 Ở Việt Nam có cơng bố số nhóm tác giả chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu DO Năm 2010, nhóm tác giả Phịng Vi Sinh vật Dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học nghiên cứu khả tạo chất hoạt động bề mặt từ chủng vi khuẩn Psedomonas pseudomalei H24 giúp tăng cƣờng khả phân huỷ dầu DO vi sinh vật từ mẫu cát biển có khả phân huỷ 67% 37% với nồng độ dầu ban đầu 39,2 g/l [3] Nhƣ vậy, so sánh với chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu DO giới Việt Nam, chủng Klebsiella sp G10 nhận đƣợc nghiên cứu có khả phân huỷ dầu lớn Chủng vi khuẩn chứng minh ƣu xử lý dầu nƣớc thải cơng nghiệp Do bổ sung chủng G10 vào tập đồn giống tạo bùn hoạt tính để nâng cao hiệu xử lý nƣớc thải công nghiệp nhiễm diesel 4.5 Ảnh hƣởng pH, nồng độ muối NaCl đến khả sinh trƣởng mơi trƣờng có dầu diesel chủng G10: Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện hóa lý đến khả sử dụng dầu diesel vi sinh vật nhằm mục đích xác định điều kiện tối ƣu để vi sinh vật dễ phát triển Từ đó, kiểm sốt đƣợc q trình phân hủy nguồn ô nhiễm vi sinh vật theo mong muốn đạt hiệu cao nhất, yếu tốt pH, nồng độ muối NaCl đƣợc xem có ảnh hƣởng lớn nhất, trực tiếp đến phát triển nhƣ khả sử dụng dầu diesel vi sinh vật, đồng thời yếu tố dễ kiểm sốt Chủng vi khuẩn G10 đƣợc ni đánh giá khả sử dụng dầu diesel môi trƣờng muối khống Gost có giá trị pH từ – 9, với giá trị OD600 đầu vào chủng nhƣ 0,3 thời gian ngày Tuy nhiên thử nghiệm với giá trị pH 8,5 khả sử dụng dầu diesel giảm rõ rệt Điều lý giải chủng vi khuẩn G10 đƣợc phân lập từ mẫu lấy kho xăng Việt Hoàng nên pH mẫu có giá trị trung tính Kết đƣợc thể bảng 4.7 hình 4.15 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 46 Bảng 4.7 Khả sinh trưởng phát triển chủng G10 với nồng độ DO 10% dải pH khác Dải Ph 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Ngày 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Giá trị OD bƣớc sóng 600 nm Ngày Ngày Ngày 0,92 1,86 1,98 1,16 2,03 2,23 1,8 2,72 3,48 1,98 3,24 3,84 1,96 3,76 4,06 Ngày 1,57 1,98 2,76 3,08 3,78 Từ bảng 4.7 nhận thấy tốc độ tăng trƣởng phát triển chủng G10 tăng dần theo thời gian nuôi cấy Đặc biệt tốc độ sinh trƣởng chủng G10 mạnh thể qua giá trị OD ngày thứ tƣơng ứng giải pH = Kết bảng 4.7 đƣợc thiết lập đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng chủng G10 giá trị pH khác Kết thể hình 4.15 pH Hình 4.15 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng chủng vi khuẩn G10 giá trị pH khác Kết hình 4.15 cho thấy, giá trị pH khả sử dụng dầu diesel chủng G10 mạnh đạt giá trị OD600 = 4,06 sau ngày nuôi cấy Điều phù hợp với nghiên cứu Sharma Pant (2001) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 47 [39] Nhƣ chủng G10 có khả sinh trƣởng phát triển mạnh pH pH đƣợc lựa chọn để đánh giá tiếp ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl Chúng tiến hành nuôi cấy chủng G10 dung dịch nuôi cấy Gost nồng độ DO 10%, nồng độ muối khác nhau,kết thể bảng 4.8 Bảng 4.8 Khả sinh trưởng phát triển chủng G10 với nồng độ DO 10% nồng độ muối NaCl khác Nồng độ NaCl 0,0% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% Giá trị OD bƣớc sóng 600 nm Ngày 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Ngày 1,09 1,36 2,24 2,38 2,76 Ngày 2,16 1,65 3,05 3,48 4,14 Ngày 1,57 2,37 3,49 4,06 4,45 Ngày 1,26 1,56 3,08 3,21 4,03 Qua bảng 4.8 nhận thấy qua thời gian thử nghiệm với giá trị OD bƣớc sóng 600nm tốc độ sinh trƣởng phát triển G10 tăng qua ngày,đặc biệt tốc độ sinh trƣởng phát triển chủng G10 cao ngày thứ thời gian nuôi cấy Để thấy rõ tốc độ sinh trƣởng phát triển chủng G10 nồng độ DO 10% môi trƣờng NaCl từ 0.5% đến 2%, tiến hành nuôi cấy thiết lập đồ thị biểu thị tốc độ sinh trƣởng chủng vi khuẩn G10 nồng độ NaCl khác Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 48 Nồng độ muối NaCl (%) Hình 4.16 Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng chủng vi khuẩn G10 nồng độ NaCl khác Nồng độ muối liên quan đến áp suất tế bào, ảnh hƣởng đến trình trao đổi chất chuyển hóa chất nhiễm Vì vậy,việc nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả phân hủy dầu diesel chủng vi khuẩn quan trọng cho việc ứng dụng sau Nồng độ muối đƣợc sử dụng thí nghiệm nằm dải từ ÷ Tuy nhiên nồng độ muối có 2,5%;3% khả sinh trƣởng phân hủy dầu diesel chủng vi khuẩn G10 giảm rõ rệt ( Kết không minh họa) Nhƣ pH 8, nồng độ muối NaCl 2% điều kiện tối ƣu cho khả phân hủy dầu diesel chủng vi khuẩn G10 (Hình 4.16) 4.6 Khả phân huỷ dầu diesel chủng G10: Sau ngày nuôi cấy với điều kiện pH 8,nồng độ muối NaCl 2%, 37oC,tốc độ lắc 200 vòng/phút, mẫu đƣợc gửi phân tích Viện Hố Cơng nghiệp - Bộ Cơng thƣơng Kết phân tích cho thấy,so với mẫu đối chứng (49720 mg/l) mẫu chứa chủng G10 hàm lƣợng dầu cịn lại 23140mg/l từ tính tốn đƣợc hiệu suất phân hủy dầu DO 53,46% Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 49 Những nghiên cứu sử dụng tập đoàn vi khuẩn phân huỷ dầu DO đất cho kết nghiên cứu tìm đƣợc bốn loại vi khuẩn thuộc tập đoàn vi khuẩn lấy từ Viện Dầu khí Mexico đựoc định tên Pseudomona, Serratia, Acinetobacter Flavobacterium có khả giảm nồng độ dầu DO đất nhỏ 15% so với nồng độ ban đầu thời gian tuần Khi áp dụng thí điểm thực tế diện tích đất 5m2 nồng độ dầu DO giảm 85%, bổ sung thêm NH4NO3 kết đạt tới 90% [31], [32] Nghiên cứu Kaczorek cộng năm 2011 nghiên cứu khả phân huỷ sinh học hợp chất hydrocarbon phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Pseudomonas alcaligenes S22 có khả phân huỷ 92% dầu DO sau 21 ngày ni cấy có bổ sung thêm chất hoạt động bề mặt Triton X-100 [28] Ở Việt Nam có cơng bố số nhóm tác giả chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu DO Năm 2011,nhóm tác giả phịng Vi sinh Vật Dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học phân lập đƣợc chủng vi khuẩn TN1 TN2 mẫu cát biển Đồ Sơn có khả phân huỷ 67% 37% hàm lƣợng dầu DO tổng số thu đƣợc bổ sung chất hoạt động bề mặt Trần Thị Nga (2005)đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn SG =7 có khả phân huỷ 80% dầu DO với nồng độ DO 17 – 18% sau ngày nuôi cấy [6] Nhƣ vậy, so sánh với chủng vi khuẩn có khả phân huỷ dầu DO giới Việt Nam, chủng G10 mà phân lập đƣợc có khả phân huỷ dầu tốt Chủng vi khuẩn đƣợc lƣu giữ để phục vụ cho nghiên cứu có liên quan Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 50 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.Phân lập đƣợc 10 chủng vi sinh vật ([G1]; [G2]; [G3]; [G4]; [G5]; [G6]; [G7]; [G8] ;[G9] ;[G10] ) có khả sinh trƣởng phát triển tốt dầu diesel Trong chủng G10 có khả sinh trƣởng phát triển tốt mơi trƣờng có chứa 10% dầu DO Chủng G10 có khuẩn lạc trịn,lồi,bóng,ƣớt,màu trắng đục,đƣờng kính 1,8 – 2,2 mm,tế bào chủng G10 có dạng hình que ngn,kớch thc 0,6 ữ 0,8 àm x 1,6 ữ 2,3µm Chủng G10 đƣợc đặt tên Klebsiella sp G10 Trình tự nucleotide đoạn gen mã hố 16S rRNA chủng Klebsiella sp G10 đƣợc đăng ký ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số JX983098 Hiệu suất phân hủy dầu DO chủng G10 nồng độ 10% pH 8, nồng độ muối NaCl 2% 53,46% sau ngày nuôi cấy với hàm lƣợng ban đầu 49720 mg/l Kiến nghị: Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hƣởng đến phát triển khả phân huỷ dầu DO chủng G10 từ tối ƣu hố điều kiện để có khả tạo chế phẩm sử dụng xử lý nguồn nƣớc đất nhiễm dầu xăng Việt Hồng nguồn nhiễm dầu DO tƣơng tự Kết viết thành báo khoa học “Khả phân huỷ dầu diesel chủng G10 phân lập từ kho xăng Việt Hoàng, tỉnh Thái Nguyên” nhóm tác giả: Lê Thị Nhi Công, Khuông Trường Giang, Đỗ Thị Dịu, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (Viện CNSH) Đăng tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên Tr-103, Tập 101,số 01,năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Trần Nhƣ Hoa, Cù Việt Nga, Nguyễn quang Huy, Đàm Tiến (1999), "Điều tra số nhóm vi sinh vật mẫu đất Cửa Lục, vịnh Hạ Long", Kỷ yếu viện Công nghệ sinh học1998, Tr 302 -311, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đinh Thúy Hằng, Lê Gia Hy, Lƣu Thị Bích Thảo (l998), "Vi sinh vật phân hủy hyđrocarbon dầu mỏ" , Tạp chí khoa học cơng nghệ, XXXVI (3) Lại Thúy Hiền, Nguyễn Thị Thu Huyền, Đỗ Thu Phƣơng, Phạm Thị Hằng, Vƣơng Thị Nga, Lê Thị Nhi Cơng, Nguyễn Thị n, Nguyễn Bá Tú, Hồng Văn Thắng (2010), Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vi sinh vật nhằm ứng dụng ngành công nghiệp xử lý môi trƣờng, Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 199-209 Nguyễn Bá Hữu, Trần Thị Tƣờng Vi, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007) Phân hủy sinh học dầu diesel hydrocarbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải nhiễm dầu kho cảng B12, Quảng Ninh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên 2(42): 59 – 66 Cung Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thùy Linh, Nguyễn Văn Bắc, Vũ Thị Thanh, Nghiêm Ngọc Minh (2011), Nghiên cứu khả phân hủy diesel chủng vi khuẩn BTL5 phân lập từ nƣớc thải cơng nghiệp, Tạp chí Sinh học, 33(4), 86-91 Trần Thị Nga (2005), “Khả sử dụng vi khuẩn phân hủy dầu đồng thời tạo chất hoạt động bề mặt xử lý ô nhiễm dầu” Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trƣơng Hữu Trì (2008), “ Sản phẩm dầu mỏ thƣơng phẩm”, Đại học Bách khoa Đà Nẵng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 52 Đỗ Công Thung, Trần Đức Thành, Nguyễn Thị Minh Huyền (2008), "Đánh giá tác động ô nhiễm dầu hệ sinh thái biển Việt Nam" Hà Thế Tiến (2010), Vịnh Hạ Long ô nhiễm dầu mạnh nƣớc Báo điện tử kiến thức – Khoa học Công nghệ - Ngày 9/8/2010 Tiếng Anh: 10 Amann RI, Ludwig WW, Schleifer KH (1995), "Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ", Micobiological Reviews, 59, pp 143-169 11 Amellal N, Portal JM, Volgel T, Berthelin J (2001), "Distribution and location of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and PAH- degrading bacteria within son aggregates", Biodegradation, 12, pp 49 - 57 12 American public health association (1969), "Standard methods for the examination of water and wastewtaer including bottom sediments and sludge'', pp 604-609 13 Atlas RM (1981), "Microbial Degradation of Petroleum ydrocarbon an Environment Perspective" Microbiological Reviews, 145.1, pp 180-209 14 Beam HW and Perry JJ (1974), "Microbial Degradation of Cycloparaffmic Hydrocarbons via Co-metabolism and Commensalism" Journal of General Nicrobiology, 82, pp 163 -169 15 Bidleman TF, Wralla MD, Roura R, Can E and Schmidt S (l993), “Organochlorine pesticides inthe atmosphere of the Southem Ocean and Antarctica, January - March, 1990", Marine Pollution Bulletin, 26, pp 258-262 16 Bitton LN (1984), "Microbial degradation of aliphatic hydrocarbons", In Microbia degl adation of organic compounds David T Gibson (ed) 17 Cappello S., Santisi S., Calogero R., Hassanshahian M and Yakimov M M (2012), Characterisation of oil - degrading bacteria isolated from bilge water Water, Air and Soil Pollution 3: 1-8 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 53 18 Chen Q, Jansen DB, and witholt B (1995), "Pseudomonas oleovorans due to the induction of alk B and synthesis of octanol", Journal of Bacteriology, 177, pp 6894- 6901 19 Coates JD( Anderson RT and Lovlev D (1996), "Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons under sulfate-reducing conditions", Applied and Environment Microbiology, 62, pp 1099 - 11 20 Dorobantu LS, Yeung AKC, Foght JM and Gray MR (2004), "Stabilization of Oil-Water Emulsions by hydrophobic Bacteria", Applied and Enronment Microbiology, pp.6333 - 6336 21 Fingas M and Edited by Charles J (2000), Effects of oil spills on the environment – The bagic of oil ceanup Lewis Publishers: United States of American International Standard Book Number – 56670 – 537 - 22 Fernandez - Lineares GML, Acquaviva M and Bertrand JC (1997), “Influence of glycine betaine on degradation of eicosane by Marmobacter hydrocarbonoclasticus at high salinity", System Applied Microbiology, 20, pp 150 - 153 23 Gawdzik B and Gawdzik J (2011), Impact of pollution with oil derivatives on the natural enviroment and methods of their removal Ecological Chemistry and Engineering S 18(3): 346 – 357 24 Hong JI, Kim J, Choi OK, Cho KS and Ryu HW (2005) “Characterrization of a diesel-degrading bacterium, Pseudomonas aeruginosa IU5, isolated from oil – contaminated soil in Korea”, World Journal of Microbiology ang Biotechnology 21: 381 - 384 25 Leahy G J and Colwell R R (1990), Microbial degradation of hydrocarbons in the environment Microbiological Reviews 54(3): 305-315 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 54 26 Jesus GM, Silvia GA, Ana IA and Francisco RV (l999), "Use of 16S-23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity", Journal Microbiol Methods, vol 36, pp 55-64 27 Jun IM , Sakai Y, Tani Y and Kato N (1996), "Isolation and characterization of a novel oxygenase that catalyzes the first step of nalkane oxidation in Acinetobacter sp Strain M-l" Journal of Bacterioiogy, 182 – pp 2059 -2067 28 Kaczorek E, Moszynska S and Olszanowski A (2011), "Modiflcation of cell properties of Pseudomonas alcaligenes S22 during hydrocarbon biodegradation" Biodegradation, 22(2), pp 359-366 29 Kanaly RA and Harayama S (2000), "Biodegradation of high-molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria" Journal of Bacteriology 182, pp 2059-2067 30 Mariano AP, Tomasella RC, Martino CD, Morais EB, Fitho RM, Seleghim MH R Contiero J, Tomisielo SMT and Angelis DF (2010), "Aerobic bidegradation of butanol and diesel oil blends", African Journal of Biotechnology, 9(42), pp 7094-7101 31 Marquez-Rocha FJ, Hemandez-Rodriguez V and Lamela MT (2001), “Biodegration of diesel oil in soil by a microbial consortium", Water, air and soil pollutionlution, 128, pp 3-32 32 Marquez-Rocha FJ, Olmos-soto J, Rosano-Hemandez MC and MurielGarcysa M (2005), "Detẹrnination of the hydrocarbon-degrading metabolic capabilities of tropical bacterial isolates" International Biodeterioration & Biođegradation, 55 , pp 7- 23 33 Mergesin R and Schinner F (2001), "Biodegradation of hydrocarbons in exeme environment ", Applied Microbiology and Biotechnology 56, pp 650-663 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 55 34 Mullis K B., Saiki R K., Scharf S., Faloona F., Horn G T., Erlich H A and Arnheim N (1985), “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia ” Science 230(4732):1350- 35 Nguyen BH, Denner EBM, Dang TCH, WTanner G, and Stan - Lotter H (1999), "Marinobacter aquaeolei sp nov., halophilic bacterium isolated from environments samples and their assembly into functional genes", Gene, 212 , pp 221 -228 36 Pirnik MP, Atlas RM, and Bartha R (l974), "Hydrocarbon Metabolism by Brevibacterium erythrogenes: Normnal and Branched Alkanes", The Journal of Bacteriol 119 (3): 868-878 37 Radvan SS and Al - Hasan RE (2000), "Oil pollution and cyanobacteria", The ecology of cyanobacteria Whitton BA and Potts M (eds.), pp 307 319 , Kluwer Academic Publishers, Public in the Netherland 38 Rontani JF and Giusti G (1986), “Study of the biodegradation of polybranched alkanes by a marine bacterial community”, Marine Chemistry, 20(2), pp.197 – 205 39 Sharma S L and Pant A (2001), Crude oil degradation by a actinomycete Rhodococcus sp Indian Journal of Marine Science 30: 146-150 40 Smith C A and Hussey A M (2005), Gram Stain Protocols American society for microbiology Conference for Undergraduate Educators – American 41 Trugill P W (l 989), "The degradation of alicyclic hydrocarbons by a microbial consortium", International Biodeterioration and biodegradation, 25(l-3), pp 197-206 42 Ueno A, Ito Y, Yumoto I and Okuyama H (2007), "Isolation and haracterization of bacteria from soil contaminated with diesel oil and the possible use of these in autochthonous bioaugmentation", World Journal of Microbiology & Technology, 23 (l 2), pp 1739- 1745 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 56 43 Yamaga F., Washio K and Morikawa M (2010), Sustainable Biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoacetius P23 isolated from the rhizosphere of Duckweed Lenma aoukikusa Environmental Science and Technology 44: 6470-6474 44 Zhou J., Bruns M A and Tiedje J M (1996), DNA Recovery from soils of diverse composition Applied and Environmental Microbiology 62(2): 316-322 45 Yieng ATS ( 2009 ), “ Hydrocarbon – degradation by isolate Pseudomonas lundensis UTAR FPD2” Malaysian Journal of Microbiology, 5(2), pp 104 - 108 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/