Sau khi ph©n tÝch vµ xö lý sè liÖu, tr×nh tù ®o¹n gen 16S rRNA cña chñng vi khuÈn nµy ®−îc tr×nh bµy trªn h×nh 6.. 1 tcctggattc agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt a[r]
(1)33(4): 86-91 T¹p chÝ Sinh häc 12-2011
NGHIÊN CứU KHả NĂNG PHÂN HủY DầU DIESEL CủA CHủNG VI KHUẩN BTLD5 PHÂN LậP Từ NƯớC THảI KHU CÔNG NGHIệP
CUNG THị NGọC MAI, NGUYễN THùY LINH, NGUYễN VĂN BắC, Vũ THị THANH,
NGHIÊM NGọC MINH Viện Công nghệ sinh học Sau than đá, dầu mỏ nguyên liệu hóa
thạch thứ hai đ−ợc ng−ời biết đến đ−a vào khai thác, sử dụng Kể từ phát đến nay, dầu mỏ đ−ợc coi nh− nguồn l−ợng thiếu nh− ch−a thể thay Chính có vị trí quan trọng lồi ng−ời mà ngành cơng nghiệp dầu mỏ ngày phát triển mạnh mẽ đG trở thành mạnh kinh tế n−ớc có tiềm dầu mỏ
Tuy nhiên, bên cạnh nguồn lợi kinh tế ngành công nghiệp đem lại hiểm họa nhiễm mơi tr−ờng có nguyên nhân từ cố khai thác, vận chuyển dầu mỏ biển gây Ngoài cố tràn dầu, phải kể đến số l−ợng không nhỏ cặn thải xăng dầu tồn đọng kho chứa, nh− hàm l−ợng dầu đ−ợc sử dụng cho động cơ, loại dây chuyền sản xuất công nghiệp làm l−ợng dầu nhiễm có n−ớc thải công nghiệp sinh hoạt ngày gia tăng Vấn đề ô nhiễm dầu ngày trở thành nỗi xúc tồn cầu Đứng tr−ớc hiểm họa nhiễm dầu mỏ sản phẩm nó, để giải cách triệt để, địi hỏi phải có kết hợp nghiên cứu nhiều nhà khoa học, cơng nghệ nhà quản lí mơi tr−ờng nh− hợp tác đơn vị vận chuyển, kinh doanh sử dụng dầu mỏ
Hiện nay, công nghệ phân hủy sinh học (Bioremediation) đG đ−ợc áp dụng rộng rGi xử lý ô nhiễm dầu chất độc hóa học, nh− chất nhiễm khác có hiệu cao, chi phí thấp an tồn với mơi tr−ờng Bản chất cơng nghệ phân hủy sinh học kích thích phân hủy, phát triển vi sinh vật địa có khả phân hủy dầu chất gây nhiễm khác có sẵn tự nhiên,
cách thay đổi yếu tố môi tr−ờng nh− độ thơng khí, chất dinh d−ỡng nh− nguồn nitơ photpho, chất vi l−ợng, chất hoạt động bề mặt sinh học có nghĩa tạo điều kiện tối −u để vi sinh vật sử dụng thành phần dầu mỏ phát triển hoạt động phân huỷ Vì vậy, để góp phần xử lý ô nhiễm dầu diesel (dầu DO) n−ớc thải công nghiệp, chủng vi khuẩn BTLD5 đG đ−ợc phân lập từ n−ớc thải khu công nghiệp (KCN) Từ Liêm đánh giá khả sử dụng dầu DO
I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn BTLD5 đợc phân lập từ nớc thải bể chứa tập trung KCN Từ Liêm Hà Nội vị trí khác
2. Phơng pháp a. Phân lập
Ph−ơng pháp làm giàu lần đ−ợc dùng để phân lập chủng vi khuẩn BTLD5 Hút ml mẫu n−ớc thải sau trộn vào bình tam giác 250 ml chứa 45 ml mơi tr−ờng khống có bổ sung 5% dầu DO, nuôi lắc - ngày 30oC với
tốc độ 200 vòng/phút Sau - ngày, chuyển 10% giống lần làm giàu thứ sang bình làm giàu lần hai lần ba Sau lần làm giàu thứ ba, hút 0,5 ml dịch nuôi cấy, pha loGng cấy gạt môi tr−ờng hiếu khí tổng số, mẫu đ−ợc ni tĩnh 30oC Sau ngày, khuẩn lạc mọc
riêng rẽ đợc tách riêng nuôi 20 ml môi trờng khoáng dịch thể
b. Quan sát hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào
(2)BTLD5 đợc quan sát môi trờng hiếu khí tổng số thạch
Hình thái tế bào chủng vi khuẩn đợc quan sát dới kÝnh hiĨn vi ®iƯn tư qt JSMLV5410 víi sù phèi hợp Viện 69, Bộ T Lệnh Lăng
c. Nghiên cứu khả phân hủy dầu DO chủng BTLD5
Chủng vi khuẩn BTLD5 đợc nuôi lắc 200 vòng/phút môi trờng muối khoáng có bổ sung 5% dầu DO 30o
C Khả phân hủy dầu chủng BTLD5 đợc thực theo phơng pháp phân tích khối lợng TCVN 4582-88 Quá trình phân tích dầu đợc thực với phối hợp Viện Hóa học công nghiệp d. Phân loại vi khuẩn dựa việc so sánh
trình tù gen 16S rRNA
DNA tổng số chủng BTLD5 đ−ợc tách chiết theo h−ớng dẫn kít (hGng Bioneer), sau DNA tổng số đ−ợc nhân lên với cặp mồi 27f 1492r với chu trình phản ứng là: 94oC
trong phót; lỈp l¹i 32 chu kú: 94oC
phót, 55oC 30 gi©y, 72oC
phút 30 giây; 72oC phút; 4oC để giữ.
Tiếp sản phẩm PCR (kích th−ớc khoảng 1500 bp) đ−ợc gắn vào vector tách dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Dòng plasmit chứa đoạn gen mong muốn đ−ợc tách chiết, tinh xác định trình tự máy xác định trình tự gen tự động (ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer) Việc so sánh trình tự nucletit xây dựng phát sinh chủng loại chủng BTLD5 với chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X v Treeview
II KếT QUả Và THảO LUậN
1. Phân lập chủng BTLD5 từ nớc thải KCN Từ Liêm, Hà Nội
Sau lần làm giàu, nhận thấy màu sắc độ đục môi tr−ờng thay đổi rõ rệt so với mẫu n−ớc thải ban đầu So sánh kết lần làm giàu thứ nhất, lần làm giàu thứ thứ quan sát thấy sau 24 giờ, màu môi tr−ờng thay đổi rõ rệt sinh khối ngày tăng lên, điều cho thấy phát triển nhanh chóng vi sinh vật mẫu n−ớc thải (hình 1)
H×nh 1 Mẫu làm giàu lần 1, lần 2, lần môi trờng khoáng có bổ sung 5% dầu DO
Hình 2 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào chủng BTLD5 với độ phóng đại 7500 lần (B) Lần Lần Lần
(3)Sau pha loGng lần làm giàu thứ cấy gạt mơi tr−ờng hiếu khí tổng số thạch, cấy chuyển sang mơi tr−ờng khống dịch chứa 5% dầu DO, nhận thấy chủng BTLD5 chủng vi khuẩn phát triển nhanh nhất, sau 24h l−ợng sinh khối bám thành bình l−ợng dầu bề mặt dịch biến nhanh Vì vậy, chúng tơi sử dụng chủng vi khuẩn để dùng cho nghiên cu tip theo
2. Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng BTLD5
Trờn mơi tr−ờng hiếu khí tổng số thạch, khuẩn lạc chủng vi khuẩn BTLD5 có màu trắng đục, nhớt, lồi, đ−ờng kính khoảng mm tiết mơi tr−ờng sắc tố xanh lục (hình 2A) D−ới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 7500 lần, tế bào chủng BTLD5 có dạng hình que ngắn, kích th−ớc từ 0,73 - 0,91 àm ì - 1,8 àm
(hình 2B)
3. Nghiên cứu khả phân hủy dÇu DO cđa chđng BTLD5
Chủng BTLD5 đ−ợc ni lắc mơi tr−ờng khống dịch có bổ sung 5% dầu DO Sau ngày nuôi lắc 30oC, so với mẫu đối chứng khơng có
vi sinh vật (mẫu K), môi tr−ờng nuôi cấy chủng BTLD5 đG có đổi màu rõ rệt l−ợng sinh khối bám vào thành bình lớn (hình 3) Vì vậy, phần khẳng định đ−ợc khả phân hủy dầu chủng vi khuẩn Tuy nhiên, để đánh giá xác khả phân hủy dầu DO, chúng tơi đG gửi phân tích Viện Hóa cơng nghiệp Bằng ph−ơng pháp phân tích khối l−ợng, sau ngày ni lắc hàm l−ợng dầu cịn lại g/l giảm 25 g/l so với mẫu đối chứng (28 g/l) Từ đó, chúng tơi tính tốn đ−ợc l−ợng dầu BTLD5 sử dụng 89,3%
H×nh 3. Khả sinh trởng chủng BTLD5 môi trờng chứa 5% dầu DO
Hình 4 Sản phẩm nhân đoạn gene mG hóa 16S rRNA chủng BTLD5
M.Thang DNA chn kÝch th−íc kb; S¶n phẩm PCR chủng BTLD5
Hình 5 Sản phẩm điện di DNA plasmid dòng số gel agarose 1%
C DNA plasmid dòng khuẩn lạc màu xanh (đối chứng); DNA plasmid dòng khuẩn lạc số 4. Phân loại vi khuẩn dựa trình tự đoạn
gen 16S rRNA
DNA tæng số BTLD5 đợc
tỏch chit, nhõn đoạn gen 16S rRNA với cặp mồi 27f 1492r với chu trình nhiệt phản ứng nêu phần ph−ơng pháp Điện di đồ sản phẩm K BTLD5
M
1500 bp
(4)PCR thu đ−ợc băng rõ nét, đặc hiệu, có kích th−ớc khoảng 1500 bp, hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết (hình 4) Sản phẩm PCR đ−ợc tinh sạch, gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Một dòng khuẩn lạc trắng đ−ợc tách chiết DNA plasmit (hình 5) DNA plasmid dịng khuẩn lạc đ−ợc kiểm tra cách PCR lần với cặp mồi 27f 1492r với DNA plasmid dòng khuẩn lạc số làm khuôn (thành phần phản ứng chu
trình nhiệt nh− lần PCR thứ nhất), kết cho thấy dịng khuẩn lạc trắng chứa đoạn gen cần thiết (1500 bp) Do đó, DNA plasmid dịng khuẩn lạc đ−ợc tách chiết, tinh xác định trình tự gene
Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng BTLD5 đG đ−ợc xác định máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu, trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn đ−ợc trình bày hình
1 tcctggattc agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat
61 aacgtccgga aacgggcgct aataccgcat acgtcctgag ggagaaagtg ggggatcttc
121 ggacctcacg ctatcagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taaaggccta 181 ccaaggcgac gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac 241 ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat 301 ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg 361 aagggcagta agttaatacc ttgctgtttt gacgttacca acagaataag caccggctaa 421 cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg 481 taaagcgcgc gtaggtggtt cagcaagttg gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa 541 ctgcatccaa aactactgag ctagagtacg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg 601 gtgaaatgcg tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac 661 tgacactgag gtgcgaaagc gtgggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 721 ccgtaaacga tgtcgactag ccgttgggat ccttgagatc ttagtggcgc agctaacgcg 781 ataagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcagatgaa ttgactgggg 841 gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttacctgg 901 ccttgacatg ctgagaactt tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact cagacacagg 961 tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg 1021 caacccttgt ccttagttac cagcacctcg ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac 1081 aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc agggctacta 1141 cacgtgctac aatggtcggt acaaagggtt gccaagccgc gaggtggagc taatcccata 1201 aaaccgatcg tagtccggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagtcg gaatcgctag 1261 taatcgtgaa tcagaatgtc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1321 ccaccatggg atcgttgctc cagaagtatc tag
Hình 6 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn BTLD5 Dựa vào việc so sánh trình tự ®o¹n gen 16S
rRNA cđa chđng vi khn BTLD5 với trình tự chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn khác LPSN (List of Prokaryotic names with
Standing in Nomenclature), đG thống kê mức độ t−ơng đồng chủng so sánh (bảng 1) xây dựng phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn (hình 7)
Bảng Mức độ t−ơng đồng BTLD5 so với số chủng vi khuẩn
STT Tªn chđng vi khn M· sè trªn NCBI
Sè nucleotit so sánh
(5)Hình 7 Cây phát sinh chủng loại chủng BTLD5 so với loài có họ hàng gần gũi
Quan sỏt trờn bng hình chúng tơi nhận thấy, chủng BTLD5 có quan hệ gần gũi với chủng thuộc chi Pseudomonas, dựa việc so sánh nucleotit chủng vi khuẩn có độ t−ơng đồng cao với chủng Pseudomonas aeruginosa (98%) Do đó, chúng tơi tạm đặt tên chủng vi khuẩn Pseudomonas sp BTLD5 Chủng vi khuẩn đG đ−ợc đăng ký ngân hàng Genbank (NCBI) với mG số JF750922
Một số tác giả giới đG công bố khả phân hủy dầu DO chi Pseudomonas Nghiên cứu nhóm tác giả Kaczorek nnk (2011) nghiên cứu khả phân hủy sinh học hợp chất hydrocarbon đG phân lập đ−ợc chủng vi khuẩn Pseudomonas alcaligenes S22 có khả phân hủy 92% dầu DO sau 21 ngày nuôi cấy có bổ sung thêm Triton X-100 [3] Năm 2009, tác giả Adeline nnk., đG phân lập đ−ợc chủng Pseudomonas lundensis UTAR FPE2 từ lò nhiên liệu nhà máy có khả phân hủy 69% dầu diesel ngày [1] Năm 2006, nhóm tác giả Ueno A nnk., đG phân lập đ−ợc chủng Pseudomonas aeruginosa WatG đất nhiễm dầu có khả phân hủy 51% tổng l−ợng hydrocarbon mạch thẳng có dầu DO [5] Năm 2004, nhóm tác giả Hong nnk đG phân lập đ−ợc chủng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa IU5 có khả phân hủy 60% dầu DO (8500 mg/kg) sau 13 ngày nuôi cấy [2]
ở Việt Nam đG có cơng bố số nhóm tác giả chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu DO Năm 2010, nhóm tác giả Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học đG nghiên cứu khả tạo chất hoạt động bề mặt từ chủng vi khuẩn Pseudomonas pseudomalei H24 giúp tăng c−ờng khả phân hủy dầu DO vi sinh vật từ mẫu cát biển có khả phân hủy 67% 37% với nồng độ dầu ban đầu 39,2 g/l [4]
Nh− vậy, so sánh với chủng vi khuẩn có khả phân hủy dầu DO giới Việt Nam, chủng BTLD5 chúng tơi có khả phân hủy dầu lớn Chủng vi khuẩn đG chứng minh −u xử lý dầu n−ớc thải cơng nghiệp Do đó, bổ sung chủng vào tập đồn giống tạo bùn hoạt tính để nâng cao hiệu xử lý n−ớc thải công nghiệp
III KÕT LUËN
Chủng vi khuẩn BTLD5 có khuẩn lạc trịn, màu trắng đục, nhớt, lồi, đ−ờng kính khoảng mm tiết mơi tr−ờng sắc tố xanh lục D−ới kính hiển vi điện tử quét, tế bào chủng BTLD5 có dạng hình que ngắn, kích thc t 0,73 - 0,91
àm ì - 1,8 µm
Pseudomonas amygdale (Z76654)
Pseudomonas alcalophila (AB030583) Pseudomonas anguilliseptica (X99540) (
BTLD5 (JF750922)
Pseudomonas aeruginosa (X06684) Aminobacter aminovorans (AJ011759) (
Pseudomonas acidovorans (AB02147) Pseudomonas andropogonis (X67037)
(6)Chñng vi khuÈn BTLD5 có khả phân hủy 89,3% dầu DO với hàm lợng ban đầu 28 g/l sau ngày nuôi cÊy
Kết phân loại thông qua việc xác định trình tự nucleotide đoạn gen mG hóa 16S rRNA cho thấy, chủng BTLD5 có mối quan hệ gần gũi với lồi thuộc chi Pseudomonas Trình tự nucleotide đoạn gen mG hóa 16S rRNA chủng có độ t−ơng đồng 98% so với lồi Pseudomonas aeruginosa (X06684) Vì vậy, chủng BTLD5 đ−ợc đặt tên Pseudomonas sp BTLD5 Trình tự nucleotit đoạn gen mG hóa 16S rRNA chủng đG đ−ợc đăng ký Ngân hàng gen quốc tế NCBI với mG s l JF750922
Lời cảm ơn: Bài báo đợc hoàn thành nhờ
s h tr kinh phí từ đề tài: “ứng dụng cơng nghệ vi sinh để xử lý n−ớc thải có chứa hợp chất hữu hydrocacbon thơm đa vòng”, mG số 01C-09/02-2009-2, Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội tài trợ
TàI LIệU THAM KHảO
1 Adeline S Y Ting, Carol H C Tan and Aw C S., 2009: Hydrocarbon-degradation by isolate Pseudomonas lundensis UTAR FPE2 Malaysian Journal of Microbiology, 5(2): 104-108
2 Hong J H., Kim J., Choi O K., Cho K S. and Ryu H W., 2005: Characterization of a diesel-degrading bacterium, Pseudomonas aeruginosa IU5, isolated from oil-contaminated soil in Korea World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21: 381-384
3 Kaczorek E., Moszynska S., Olszanowski A., 2011: Modification of cell surface properties of Pseudomonas alcaligenes S22 during hydrocarbon biodegradation Biodegradation, 22(2): 359-366
4 Lại Thúy Hiền, Nguyễn Thị Thu Huyền, Đỗ Thu Phơng, Phạm Thị Hằng, Vơng Thị Nga, Lê Thị Nhi Công, Nguyễn Thị Yên, Nguyễn Bá Tú, Hoàng Văn Thắng, 2010: Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vi sinh vật nhằm ứng dụng ngành công nghiệp xử lý môi trờng: 199-209 Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Ueno A., Yukiya I., Isao Y., Hidetoshi O.,
2007: Isolation and characterization of bacteria from soil contaminated with diesel oil and the possible use of these in autochthonous biogaugmentation World Journal of Microbiology & Technology, 23(12): 1739-1745
STUDYING DIESEL OIL BIODEGRADATION OF THE BACTERIAL STRAIN BTLD5 ISOLATED FROM INDUSTRIAL WASTEWATER
CUNG THI NGOC MAI, NGUYEN THUY LINH, NGUYEN VAN BAC, VU THI THANH, NGHIEM NGOC MINH
SUMMARY
The bacterial strain BTLD5 was isolated from wastewater of Tu Liem industrial zone This strain had round and smooth colony with mm diameter The cell morphology of the strain BTLD5 was observed under the Scaning Electron Microcopy showed that it was a short rod with 0.73 - 0.91 µm in wide and - 1.8 µm in length
The strain BTLD5 is able to utilize diesel oil as sole energy and carbon sources After days in shake cultivation, 89.3% adding oil was removed The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene had been used for taxonomy of the strain BTLD5 The result of the amplification of the nucleotide sequence with the primer 27f/1492r indicated that the strain BTLD5 had high homology with the species of the genus Pseudomonas and was close to the Pseudomonasaeruginosa strain (X06684) Based on the morphology and the 16S rRNA gene nucleotide sequence, this strain belong to genus Pseudomonas and named Pseudomonas sp BTLD5 The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene was deposited in the NCBI genbank database with assession number JF750922