Bài viết nghiên cứu Chitinaza ở Việt Nam nhằm mục tiêu tạo được chế phẩm trừ nấm bệnh giúp sử dụng an toàn nông phẩm và làm giảm sự ô nhiễm môi trường, hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững.
28(2): 82-85 6-2006 Tạp chí Sinh học khả sinh tỉng hỵp chitinaZA cđa chđng vi khn Bacillus Q3 cã hoạt tính kháng nấm Cao Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Lân Dũng Trung tâm Công nghệ sinh học, ĐHQG HN Nấm nhóm vi sinh vật vô đa dạng, có tới 250000 loài đợc xác định Chúng khu trú bề mặt hầu hết vật thể, kể thể sống nh thực vật, ®éng vËt vµ ng−êi Chitinaza lµ mét enzim cã triển vọng việc phòng chống nấm bệnh [5] có khả phân giải thành tế bào nấm ức chế sinh trởng nấm Trên giới, ngày có nhiều công trình nghiên cứu chitinaza để sử dụng bảo vệ thực vật y tế Trong bối cảnh nông nghiệp Việt Nam phải đối mặt với vấn đề nh ô nhiễm môi trờng đất, môi trờng nớc; tàn phá mùa màng sâu bệnh sử dụng tràn lan phân bón thuốc bảo vệ thực vật hóa häc ViƯc nghiªn cøu chitinaza ë ViƯt Nam nh»m mơc tiêu tạo đợc chế phẩm trừ nấm bệnh, giúp sử dụng an toàn nông phẩm làm giảm ô nhiễm môi trờng, hớng tới nông nghiệp bền vững I Phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Sử dụng 22 chủng vi khuẩn đợc phân lập từ đất vùng Hà Nội, Thái Bình Hòa Bình có hoạt tính chitinaza Các chủng nấm đợc lấy từ Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam, Trung tâm Công nghệ sinh học, ĐHQGHN Sử dụng chitin đợc tách chiết từ vỏ tôm, vỏ cua chitin tinh khiết (Sigma) Phơng pháp Xác định sơ hoạt tính chitinaza hoạt tính kháng nấm chủng vi khuẩn lựa chọn đợc phơng pháp khuếch tán đĩa thạch II Kết thảo luận Chọn lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính chitinaza cao Các chủng vi khuẩn phân lập đợc từ mẫu đất thu thập địa bàn vùng Hà Nội, Thái Bình Hòa Bình đợc nuôi cấy lắc ổn nhiệt môi trờng MS [2] chứa 0,1% chitin 24 nhiệt độ 37C Sau đó, mẫu đợc pha loãng tới nồng độ thích hợp (từ 10-3-10-6), nhỏ môi trờng thạch chitin Dựa vào vòng suốt quanh khuẩn lạc, tuyển chọn đợc 22 chủng vi khuẩn có khả sinh chitinaza Từ 22 chủng vi khuẩn, lựa chọn đợc chủng Q3 có hoạt tính chitinaza cao để nghiên cứu tiếp Căn vào đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, xác định chủng Q3 thc chi Bacillus TÝnh kh¸ng nÊm cđa chđng vi khuẩn Bacillus Q3 Kết trình bày bảng dới cho thấy chủng Q3 sản sinh chitinaza nên ức chế mạnh mẽ phát triển nhiều chủng nấm bệnh khác Bảng Khả kháng nấm chủng Bacillus Q3 có hoạt tính chitinaza Các chủng nấm Hoạt tính kháng nấm (D-d, mm) Aspergilus VN04-460 22 Trichoderma VN04-412 15 Eurotium amstelodami Eurotium chevalieri 20 Fusarium oxysporum 20 82 Hình Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn Bacillus Q3 Xác định điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus Q3 cho việc sinh tổng hợp chitinaza 220 rpm, môi trờng MS có chứa 0,1% chitin, nhận thấy thời điểm 48 h sinh khối vi khuẩn hoạt tính chitinaza đạt đến giá trị cực đại Kết cho thấy khả sinh trởng chủng Q3 tăng theo pha logarit, thời gian hệ ngắn, lợng enzim sinh nhiều vào cuối pha sinh trởng đầu pha cân Sau thời gian đó, mật độ tế bào hoạt tính chitinaza dịch nuôi giảm a Động thái sinh trởng ảnh hởng thời gian nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp chitinaza (hình 2) Khi nuôi cấy máy lắc nhiệt độ 27oC, Hoạt độ enzim (D-d, mm) 35 2,5 Sinh tr−ëng (OD, 620 nm) 32 1,929 1,827 1,8 22 1,563 30 1,797 25 20 20 1,282 17 15 OD 620 nm 1,5 1,074 12 10 chitinaza (D-d, mm) 0,5 5 0 24 48 72 96 120 144 Thêi gian (giê) Hình Hoạt độ tơng ứng chitinaza thời điểm nuôi cấy khác b ảnh hởng nhiệt độ thích hợp đến khả sinh tổng hợp chitinaza Nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn Q3 nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 45, 50C 48 giờ, ly tâm lạnh để lấy dịch enzim nhỏ vào lỗ thạch Kết đợc biểu thị hình Kết thu đợc cho thấy chủng vi khuẩn Q3 sinh trởng sinh tổng hợp chitinaza mạnh mẽ 37oC nhiệt độ thấp 25C hay cao 55oC, chitinaza đợc tiết vào dịch nuôi nhng với hoạt tính thấp c ảnh hởng pH thích hợp đến khả sinh tổng hợp chitinaza Môi trờng ban đầu đợc điều chỉnh với giá trị pH 5,0; 6,0; 6,8; 7,0; 8,0; 9,0 Sau đó, cấy lợng giống vi khuẩn nh nuôi cấy lắc 48 37C Kết thí nghiệm đợc trình bày hình Chủng vi khuẩn Q3 cho hoạt tính chitinaza cao môi trờng nuôi cấy với giá trị pH ban đầu 7,0 83 Hoạt độ enzim (D-d, mm) 35 30 chitinaza (D-d, mm) 25 20 15 10 25 30 35 37 45 55 Nhiệt độ ban đầu (oC) Hình ảnh hởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinaza Hoạt độ enzim (D-d,mm) 30 chitinaza (D-d, mm) 25 20 15 10 5 6,8 6.8 pH ban đầu Hình ảnh hởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinaza Hoạt độ enzim (D-d, mm) d ảnh hởng nồng độ nguồn chất chitin thích hợp đến khả sinh tổng hợp chitinaza 30 Chúng nhận thấy nồng độ 0,2% chitin thích hợp cho khả sinh tổng hợp chitinaza chủng vi khuÈn Bacillus Q3 25 20 chitinaza (D-d, mm) 15 10 Nồng độ chất ban đầu (%) 0,1 0,2 0,5 0,7 1,5 H×nh ảnh hởng nồng độ chitin ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinaza 84 III Kết luận Tài liệu tham khảo Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập đợc có hoạt tính chitinaza, lựa chọn chủng có hoạt tính chitinaza cao để nghiên cứu tiếp Đó chủng vi khuẩn Bacillus Q3 Chủng Bacillus Q3 có khả sử dụng chitinaza để ức chế mạnh mẽ nhiều chủng nấm gây bệnh thực vật (Aspergilus VN04-460; Trichoderma VN04-412; Eurotium amstelodami; Eurotium chevalieri; Fusarium oxysporum) C¸c điều kiện thích hợp để sản sinh chitinaza chủng Bacillus Q3 nuôi cấy môi trờng MS có pH ban đầu 7,0; nồng độ chất ban đầu thích hợp 0,2% nhiệt độ 37C, thời gian 48 Nguyễn Thị Tuyết Nhung cs., 2003: T¹p chÝ Sinh-Y häc, 1: 125-128 Selitrennikoff C P., 2001: Applied & Environ-mental Microbiology, 67: 28832894 Naoto Mabuchi, Ichiro Hashizume and Yoshio Araki, 2000: Can J Microbiol., 46: 370-375 Shimahara K and Takiguchi Y., 1988: Methods Enzymol., 161: 417-423 Henrissat B., Davies G J., 2000: Advances in chitin science Jacques Andre Publisher, Lyon, France the chitinase BIO-production ABILITY OF THE Bacillus strain Q3 Having the high antagonism toward fungi Nguyen Thi Thu Trang, Nguyen Lan Dung Summary In a trial study for the isolation of chitin-degrading bacteria from soil samples of agricultural fields from Hanoi city and Thaibinh, Hoabinh provinces, we have isolated 22 bacterial strains Among these 22 strains, there was the Bacillus strain Q3 having the highest antagonism toward Fungi (Aspergilus VN04-460; Trichoderma VN04-412; Eurotium amstelodami; Eurotium chevalieri; Fusarium oxysporum) and the highest chitin hydrolyzis On the MS medium with 0,2% colloidal chitin, the chitinase activity of the Bacillus strain Q3 culture reached the highest value after 48 hours, at 37°C and with pH 7.0 Ngµy nhËn bµi: 18-7-2005 85 ... chitin ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinaza 84 III Kết luận Tài liệu tham khảo Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập đợc có hoạt tính chitinaza, lựa chọn chủng có hoạt tính chitinaza cao để nghiên cứu... nguồn chất chitin thích hợp đến khả sinh tổng hợp chitinaza 30 Chúng nhận thấy nồng độ 0,2% chitin thích hợp cho khả sinh tổng hợp chitinaza chủng vi khuẩn Bacillus Q3 25 20 chitinaza (D-d, mm) 15...Hình Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn Bacillus Q3 Xác định điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus Q3 cho vi c sinh tổng hợp chitinaza 220 rpm, m«i tr−êng