Nghiên cứu khả năng phân hủy đầu Diesel của chủng vi khuẩn BTLD5 phân lập từ nước thải công nghiệp

Bài viết trình bày phân lập chủng BTLD5 từ nước khu công nghiệp Từ Liêm, Hà Nội; hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng BTLD5; nghiên cứu khả năng phân hủy dầu DO của chủng BTLD5; phân loại vi khuẩn dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRNA...

33(4): 86-91 12-2011 Tạp chí Sinh học NGHIÊN CứU KHả NĂNG PHÂN HủY DầU DIESEL CủA CHủNG VI KHUẩN BTLD5 PHÂN LậP Từ NƯớC THảI KHU CÔNG NGHIệP CUNG THị NGọC MAI, NGUYễN THùY LINH, NGUYễN VĂN BắC, Vũ THị THANH, NGHI£M NGäC MINH ViƯn C«ng nghƯ sinh häc Sau than đá, dầu mỏ nguyên liệu hóa thạch thứ hai đợc ngời biết đến đa vào khai thác, sử dụng Kể từ phát đến nay, dầu mỏ đợc coi nh nguồn lợng thiếu nh cha thể thay Chính có vị trí quan trọng loài ngời mà ngành công nghiệp dầu mỏ ngày phát triển mạnh mẽ đ trở thành mạnh kinh tế nớc có tiềm dầu mỏ Tuy nhiên, bên cạnh nguồn lợi kinh tế ngành công nghiệp đem lại hiểm họa ô nhiễm môi trờng có nguyên nhân từ cố khai thác, vận chuyển dầu mỏ biển gây Ngoài cố tràn dầu, phải kể đến số lợng không nhỏ cặn thải xăng dầu tồn đọng kho chứa, nh hàm lợng dầu đợc sử dụng cho động cơ, loại dây chuyền sản xuất công nghiệp làm lợng dầu ô nhiễm có nớc thải công nghiệp sinh hoạt ngày gia tăng Vấn đề ô nhiễm dầu ngày trở thành nỗi xúc toàn cầu Đứng trớc hiểm họa ô nhiễm dầu mỏ sản phẩm nó, để giải cách triệt để, đòi hỏi phải có kết hợp nghiên cứu nhiều nhà khoa học, công nghệ nhà quản lí môi trờng nh hợp tác đơn vị vận chuyển, kinh doanh sử dụng dầu mỏ Hiện nay, công nghệ phân hủy sinh học (Bioremediation) đ đợc áp dụng rộng r i xử lý ô nhiễm dầu chất độc hóa học, nh chất ô nhiễm khác có hiệu cao, chi phí thấp an toàn với môi trờng Bản chất công nghệ phân hủy sinh học kích thích phân hủy, phát triển vi sinh vật địa có khả phân hủy dầu chất gây ô nhiễm khác có sẵn tự nhiên, 86 cách thay đổi yếu tố môi trờng nh độ thông khí, chất dinh dỡng nh nguồn nitơ photpho, chất vi lợng, chất hoạt động bề mặt sinh học có nghĩa tạo điều kiện tối u để vi sinh vật sử dụng thành phần dầu mỏ phát triển hoạt động phân huỷ Vì vậy, để góp phần xử lý ô nhiễm dầu diesel (dầu DO) nớc thải công nghiệp, chủng vi khuẩn BTLD5 đ đợc phân lập từ nớc thải khu công nghiệp (KCN) Từ Liêm đánh giá khả sử dụng dầu DO I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Nguyên liệu Chủng vi khuẩn BTLD5 đợc phân lập từ nớc thải bể chứa tập trung KCN Từ Liêm Hà Nội vị trí khác Phơng pháp a Phân lập Phơng pháp làm giàu lần đợc dùng để phân lập chủng vi khn BTLD5 Hót ml mÉu n−íc th¶i sau trộn vào bình tam giác 250 ml chứa 45 ml môi trờng khoáng có bổ sung 5% dầu DO, nuôi lắc - ngày 30oC với tốc độ 200 vòng/phút Sau - ngày, chuyển 10% giống lần làm giàu thứ sang bình làm giàu lần hai lần ba Sau lần làm giàu thứ ba, hút 0,5 ml dịch nuôi cấy, pha lo ng cấy gạt môi trờng hiếu khí tổng số, mẫu đợc nuôi tĩnh 30oC Sau ngày, khuẩn lạc mọc riêng rẽ đợc tách riêng nuôi 20 ml môi trờng khoáng dịch thể b Quan sát hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BTLD5 đợc quan sát môi trờng hiếu khí tổng số thạch Hình thái tế bào chủng vi khuẩn đợc quan sát dới kính hiển vi điện tử quét JSMLV5410 víi sù phèi hỵp cđa ViƯn 69, Bé T− Lệnh Lăng c Nghiên cứu khả phân hủy dầu DO chủng BTLD5 Chủng vi khuẩn BTLD5 đợc nuôi lắc 200 vòng/phút môi trờng muối khoáng có bổ sung 5% dầu DO 30oC Khả phân hủy dầu chủng BTLD5 đợc thực theo phơng pháp phân tích khối lợng TCVN 4582-88 Quá trình phân tích dầu đợc thực với phối hợp Viện Hóa học công nghiệp d Phân loại vi khuẩn dựa việc so sánh trình tự gen 16S rRNA DNA tổng số chủng BTLD5 đợc tách chiết theo h−íng dÉn cđa bé kÝt (h ng Bioneer), sau ®ã DNA tổng số đợc nhân lên với cặp mồi 27f 1492r với chu trình phản ứng là: 94oC phút; lặp lại 32 chu kỳ: 94oC phót, 55oC 30 gi©y, 72oC phút 30 giây; 72oC phút; 4oC để giữ Lần Tiếp sản phẩm PCR (kích thớc khoảng 1500 bp) đợc gắn vào vector tách dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5 Dòng plasmit chứa đoạn gen mong muốn đợc tách chiết, tinh xác định trình tự máy xác định trình tù gen tù ®éng (ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer) Việc so sánh trình tự nucletit xây dựng phát sinh chủng loại chủng BTLD5 với chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X Treeview II KếT QUả Và THảO LUậN Phân lập chủng BTLD5 từ nớc thải KCN Từ Liêm, Hà Nội Sau lần làm giàu, nhận thấy màu sắc độ đục môi trờng thay đổi rõ rệt so với mẫu nớc thải ban đầu So sánh kết lần làm giàu thứ nhất, lần làm giàu thứ thứ quan sát thấy sau 24 giờ, màu môi trờng thay đổi rõ rệt sinh khối ngày tăng lên, điều cho thấy phát triển nhanh chóng vi sinh vật mẫu nớc thải (hình 1) Lần Lần Hình Mẫu làm giàu lần 1, lần 2, lần môi trờng khoáng có bổ sung 5% dầu DO A B Hình Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào chủng BTLD5 với độ phóng đại 7500 lần (B) 87 Sau pha lo ng lần làm giàu thứ cấy gạt môi trờng hiếu khí tổng số thạch, cấy chuyển sang môi trờng khoáng dịch chứa 5% dầu DO, nhận thấy chủng BTLD5 chủng vi khuẩn phát triển nhanh nhất, sau 24h lợng sinh khối bám thành bình lợng dầu bề mặt dịch biến nhanh Vì vậy, sử dụng chủng vi khuẩn để dùng cho nghiên cứu Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng BTLD5 Trên môi trờng hiếu khí tổng số thạch, khuẩn lạc chủng vi khuẩn BTLD5 có màu trắng đục, nhớt, lồi, đờng kính khoảng mm tiết môi trờng sắc tố xanh lục (hình 2A) Dới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 7500 lần, tế bào chủng BTLD5 có dạng hình que ngắn, kích thớc từ 0,73 - 0,91 àm ì - 1,8 àm K (hình 2B) Nghiên cứu khả phân hủy dầu DO chủng BTLD5 Chủng BTLD5 đợc nuôi lắc môi trờng khoáng dịch có bổ sung 5% dầu DO Sau ngày nuôi lắc 30oC, so với mẫu đối chứng vi sinh vật (mẫu K), môi trờng nuôi cấy chủng BTLD5 đ có đổi màu rõ rệt lợng sinh khối bám vào thành bình lớn (hình 3) Vì vậy, phần khẳng định đợc khả phân hủy dầu chủng vi khuẩn Tuy nhiên, để đánh giá xác khả phân hủy dầu DO, đ gửi phân tích Viện Hóa công nghiệp Bằng phơng pháp phân tích khối lợng, sau ngày nuôi lắc hàm lợng dầu lại g/l giảm 25 g/l so víi mÉu ®èi chøng (28 g/l) Tõ ®ã, tính toán đợc lợng dầu BTLD5 sử dụng 89,3% BTLD5 Hình Khả sinh trởng chủng BTLD5 môi trờng chứa 5% dầu DO M C 1 1500 bp Hình Sản phẩm nhân đoạn gene m hóa 16S rRNA chủng BTLD5 Hình Sản phẩm điện di DNA plasmid dòng sè trªn gel agarose 1% M Thang DNA chuÈn kÝch th−íc kb; S¶n phÈm PCR cđa chđng BTLD5 C DNA plasmid dòng khuẩn lạc màu xanh (đối chứng); DNA plasmid dòng khuẩn lạc số Phân loại vi khuẩn dựa trình tự đoạn gen 16S rRNA DNA tổng số BTLD5 đợc 88 tách chiết, nhân đoạn gen 16S rRNA với cặp mồi 27f 1492r với chu trình nhiệt phản ứng nêu phần phơng pháp Điện di đồ sản phẩm PCR thu đợc băng rõ nét, đặc hiệu, có kích thớc khoảng 1500 bp, hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết (hình 4) Sản phẩm PCR đợc tinh sạch, gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5 Một dòng khuẩn lạc trắng đợc tách chiết DNA plasmit (hình 5) DNA plasmid dòng khuẩn lạc đợc kiểm tra cách PCR lần với cặp mồi 27f 1492r với DNA plasmid dòng khuẩn lạc số làm khuôn (thành phần phản ứng chu 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 tcctggattc aacgtccgga ggacctcacg ccaaggcgac ggtccagact ccagccatgc aagggcagta cttcgtgcca taaagcgcgc ctgcatccaa gtgaaatgcg tgacactgag ccgtaaacga ataagtcgac gcccgcacaa ccttgacatg tgctgcatgg caacccttgt aaaccggagg cacgtgctac aaaccgatcg taatcgtgaa ccaccatggg agcggcggac aacgggcgct ctatcagatg gatccgtaac cctacgggag cgcgtgtgtg agttaatacc gcagccgcgg gtaggtggtt aactactgag tagatatagg gtgcgaaagc tgtcgactag cgcctgggga gcggtggagc ctgagaactt ctgtcgtcag ccttagttac aaggtgggga aatggtcggt tagtccggat tcagaatgtc atcgttgctc gggtgagtaa aataccgcat agcctaggtc tggtctgaga gcagcagtgg aagaaggtct ttgctgtttt taatacgaag cagcaagttg ctagagtacg aaggaacacc gtgggggagc ccgttgggat gtacggccgc atgtggttta tccagagatg ctcgtgtcgt cagcacctcg tgacgtcaag acaaagggtt cgcagtctgc acggtgaata cagaagtatc trình nhiệt nh lần PCR thứ nhất), kết cho thấy dòng khuẩn lạc trắng chứa đoạn gen cần thiết (1500 bp) Do đó, DNA plasmid dòng khuẩn lạc đợc tách chiết, tinh xác định trình tự gene Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng BTLD5 đ đợc xác định máy ®äc tr×nh tù tù ®éng ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu, trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn đợc trình bày hình tgcctaggaa acgtcctgag ggattagcta ggatgatcag ggaatattgg tcggattgta gacgttacca ggtgcaagcg gatgtgaaat gtagagggtg agtggcgaag aaacaggatt ccttgagatc aaggttaaaa attcgaagca gattggtgcc gagatgttgg ggtgggcact tcatcatggc gccaagccgc aactcgactg cgttcccggg tag tctgcctggt ggagaaagtg gttggtgggg tcacactgga acaatgggcg aagcacttta acagaataag ttaatcggaa ccccgggctc gtggaatttc gcgaccacct agataccctg ttagtggcgc ctcagatgaa acgcgaagaa ttcgggaact gttaagtccc ctaaggagac ccttacggcc gaggtggagc cgtgaagtcg ccttgtacac agtgggggat ggggatcttc taaaggccta actgagacac aaagcctgat agttgggagg caccggctaa ttactgggcg aacctgggaa ctgtgtagcg ggactgatac gtagtccacg agctaacgcg ttgactgggg ccttacctgg cagacacagg gtaacgagcg tgccggtgac agggctacta taatcccata gaatcgctag accgcccgtc Hình Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn BTLD5 Dựa vào việc so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn BTLD5 với trình tự chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn khác LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature), đ thống kê mức độ tơng đồng chủng so sánh (bảng 1) xây dựng phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn (hình 7) Bảng STT Mức độ tơng đồng BTLD5 so víi mét sè chđng vi khn M· sè trªn Số nucleotit Mức độ Tên chủng vi khuẩn NCBI so sánh tơng đồng X06684 1329/1355 98% Pseudomonas aeruginosa Z76652 1294/1371 94% Pseudomonas agarici AB02147 1147/1354 85% Pseudomonas acidovorans AJ011504 1297/1369 95% Pseudomonas abietaniphila AB030583 1311/1363 96% Pseudomonas alcalophila AJ011759 806/956 84% Aminobacter aminovorans Z76654 1276/1359 94% Pseudomonas amygdale X67037 1160/1372 85% Pseudomonas andropogonis X99540 1300/1349 96% Pseudomonas anguilliseptica 89 Pseudomonas amygdale (Z76654) Pseudomonas alcalophila (AB030583) Pseudomonas anguilliseptica (X99540) ( BTLD5 (JF750922) Pseudomonas aeruginosa (X06684) Aminobacter aminovorans (AJ011759) ( Pseudomonas acidovorans (AB02147) Pseudomonas andropogonis (X67037) Pseudomonas amygdale (Z76654) Pseudomonas abietaniphila (AJ011504) Hình Cây phát sinh chủng loại chủng BTLD5 so với loài có họ hàng gần gũi Quan sát bảng hình nhận thấy, chủng BTLD5 có quan hệ gần gũi với chủng thuộc chi Pseudomonas, dựa việc so sánh nucleotit chủng vi khuẩn có độ tơng đồng cao với chủng Pseudomonas aeruginosa (98%) Do đó, tạm đặt tên chủng vi khuẩn Pseudomonas sp BTLD5 Chủng vi khuẩn đ đợc đăng ký ngân hµng Genbank (NCBI) víi m sè lµ JF750922 Mét sè tác giả giới đ công bố khả phân hủy dầu DO chi Pseudomonas Nghiên cứu nhóm tác giả Kaczorek nnk (2011) nghiên cứu khả phân hủy sinh học hợp chất hydrocarbon đ phân lập đợc chủng vi khuẩn Pseudomonas alcaligenes S22 có khả phân hủy 92% dầu DO sau 21 ngày nuôi cấy có bổ sung thêm Triton X-100 [3] Năm 2009, tác giả Adeline nnk., đ phân lập đợc chủng Pseudomonas lundensis UTAR FPE2 từ lò nhiên liệu nhà máy có khả phân hủy 69% dầu diesel ngày [1] Năm 2006, nhóm tác giả Ueno A nnk., đ phân lập đợc chủng Pseudomonas aeruginosa WatG đất ô nhiễm dầu có khả phân hủy 51% tổng lợng hydrocarbon mạch thẳng có dầu DO [5] Năm 2004, nhóm tác giả Hong nnk đ phân lập đợc chủng vi khuẩn 90 Pseudomonas aeruginosa IU5 có khả phân hủy 60% dầu DO (8500 mg/kg) sau 13 ngày nuôi cấy [2] Việt Nam đ có công bố số nhóm tác giả chủng vi khuẩn có khả sử dụng dầu DO Năm 2010, nhóm tác giả Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học đ nghiên cứu khả tạo chất hoạt động bề mặt từ chủng vi khuẩn Pseudomonas pseudomalei H24 giúp tăng cờng khả phân hủy dầu DO vi sinh vật từ mẫu cát biển có khả phân hủy 67% 37% với nồng độ dầu ban đầu 39,2 g/l [4] Nh vậy, so sánh với chủng vi khuẩn có khả phân hủy dầu DO giới Việt Nam, chủng BTLD5 có khả phân hủy dầu lớn Chủng vi khuẩn đ chứng minh u xử lý dầu nớc thải công nghiệp Do đó, bổ sung chủng vào tập đoàn giống tạo bùn hoạt tính để nâng cao hiệu xử lý nớc thải công nghiệp III KếT LUậN Chủng vi khuẩn BTLD5 có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, nhớt, lồi, đờng kính khoảng mm tiết môi trờng sắc tố xanh lục Dới kính hiển vi điện tử quét, tế bào chủng BTLD5 có dạng hình que ngắn, kích thớc từ 0,73 - 0,91 àm ì - 1,8 àm Chủng vi khuẩn BTLD5 có khả phân hủy 89,3% dầu DO với hàm lợng ban đầu 28 g/l sau ngày nuôi cấy Kết phân loại thông qua việc xác định trình tự nucleotide đoạn gen m hóa 16S rRNA cho thÊy, chđng BTLD5 cã mèi quan hƯ gÇn gũi với loài thuộc chi Pseudomonas Trình tự nucleotide đoạn gen m hóa 16S rRNA chủng có độ tơng đồng 98% so với loài Pseudomonas aeruginosa (X06684) Vì vậy, chủng BTLD5 đợc đặt tên Pseudomonas sp BTLD5 Trình tự nucleotit đoạn gen m hóa 16S rRNA chủng đ đợc đăng ký Ngân hàng gen quốc tế NCBI với m số JF750922 Lời cảm ơn: Bài báo đợc hoàn thành nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài: ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nớc thải có chứa hợp chất hữu hydrocacbon thơm đa vòng, m số 01C-09/02-2009-2, Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội tài trợ TàI LIệU THAM KHảO Adeline S Y Ting, Carol H C Tan and Aw C S., 2009: Hydrocarbon-degradation by isolate Pseudomonas lundensis UTAR FPE2 Malaysian Journal of Microbiology, 5(2): 104-108 Hong J H., Kim J., Choi O K., Cho K S and Ryu H W., 2005: Characterization of a diesel-degrading bacterium, Pseudomonas aeruginosa IU5, isolated from oilcontaminated soil in Korea World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21: 381-384 Kaczorek E., Moszynska S., Olszanowski A., 2011: Modification of cell surface properties of Pseudomonas alcaligenes S22 during hydrocarbon biodegradation Biodegradation, 22(2): 359-366 L¹i Thóy Hiền, Nguyễn Thị Thu Huyền, Đỗ Thu Phơng, Phạm Thị Hằng, Vơng Thị Nga, Lê Thị Nhi Công, Nguyễn Thị Yên, Nguyễn Bá Tú, Hoàng Văn Thắng, 2010: Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vi sinh vật nhằm ứng dụng ngành công nghiệp xử lý môi trờng: 199-209 Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ ViÖt Nam Ueno A., Yukiya I., Isao Y., Hidetoshi O., 2007: Isolation and characterization of bacteria from soil contaminated with diesel oil and the possible use of these in autochthonous biogaugmentation World Journal of Microbiology & Technology, 23(12): 1739-1745 STUDYING DIESEL OIL BIODEGRADATION OF THE BACTERIAL STRAIN BTLD5 ISOLATED FROM INDUSTRIAL WASTEWATER CUNG THI NGOC MAI, NGUYEN THUY LINH, NGUYEN VAN BAC, VU THI THANH, NGHIEM NGOC MINH SUMMARY The bacterial strain BTLD5 was isolated from wastewater of Tu Liem industrial zone This strain had round and smooth colony with mm diameter The cell morphology of the strain BTLD5 was observed under the Scaning Electron Microcopy showed that it was a short rod with 0.73 - 0.91 µm in wide and - 1.8 µm in length The strain BTLD5 is able to utilize diesel oil as sole energy and carbon sources After days in shake cultivation, 89.3% adding oil was removed The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene had been used for taxonomy of the strain BTLD5 The result of the amplification of the nucleotide sequence with the primer 27f/1492r indicated that the strain BTLD5 had high homology with the species of the genus Pseudomonas and was close to the Pseudomonas aeruginosa strain (X06684) Based on the morphology and the 16S rRNA gene nucleotide sequence, this strain belong to genus Pseudomonas and named Pseudomonas sp BTLD5 The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene was deposited in the NCBI genbank database with assession number JF750922 Ngµy nhËn bµi: 26-4-2011 91 ... biển có khả phân hủy 67% 37% với nồng độ dầu ban đầu 39,2 g/l [4] Nh vậy, so sánh với chủng vi khuẩn có khả phân hủy dầu DO giới Vi t Nam, chủng BTLD5 có khả phân hủy dầu lớn Chủng vi khuẩn đ... Nghiên cứu khả phân hủy dầu DO chủng BTLD5 Chủng vi khuẩn BTLD5 đợc nuôi lắc 200 vòng/phút môi trờng muối khoáng có bổ sung 5% dầu DO 30oC Khả phân hủy dầu chủng BTLD5 đợc thực theo phơng pháp phân. .. Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ, Vi n Công nghệ sinh học đ nghiên cứu khả tạo chất hoạt động bề mặt từ chủng vi khuẩn Pseudomonas pseudomalei H24 giúp tăng cờng khả phân hủy dầu DO vi sinh vật từ mẫu