Nghiên ứu khả năng thủy phân protein ủa một số hủng vi khuẩn lati

Trang 1 TRẦN THỊ NGUYỆTTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- TRẦN THỊ NGUYỆTNGÀNH CÔNG NGHỆ THỰCPHẨMĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC Trang 3 BỘ GIÁ

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Khóa : 2009 - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Độc lập Tự do Hạnh phúc- -NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ tên: Trần Thị Nguyệt Lớp: Cao học thực phẩm 09 Khóa : 2009 - 2011 Khoa (Viện): Công nghệ sinh học và thực phẩm 1. Đầu đề luận văn: Nghiên cứu khả năng thủy phân protein của một số chủng vi khuẩn lactic ………

2. Các số liệu ban đầu. ………

………

………

………

3. Nội dung phần thuyết minh tính toán ………

………

………

………

………

4. Các bản vẽ (ghi rõ các loại bản vẽ, kích thước các bản vẽ)

………

………

………

………

5.Cán bộ hướng dẫn Cán bộ hướng dẫn Phần (ký, ghi rõ họ tên) ……….………

………….………

………

………….………… ………

5. Ngày giao nhiệm vụ ………

………

………

………

6 Ngày hoàn thành ………

………

………

Ngày tháng năm

Chủ nhiệm bộ môn/khoa Cán bộ hướng dẫn Công nghệ

(ký, ghi rõ họ tên) (ký, ghi rõ họ tên)

Kết quả đánh giá Học viên đã hoàn thành

LỜI CAM ĐOAN

- o0o

-Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệ , kết u

quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất cứ công trình nào

LỜI CẢM ƠN

- o0o

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm và Viện đào tạo sau đại học Trường – đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học

2009 – 2011 và đề tài nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Hồ Phú Hà, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin được cảm ơn toàn thể cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ các sản phẩm lên men – Viện công nghệ sinh học và thực phẩm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình

Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè tôi, những người luôn đứng sau giúp đỡ, chia sẻ với tôi những khó khăn và thuận lợi trong suốt thời gian qua

Xin chân trọng cảm ơn!

Hà Nội, 23/09/2011

Trần Thị Nguyệt

DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- o0o

-HA6 : Lactobacillus fermentum HA6

HA12 : Lactobacillus acidophilus HA12

Hansen : Streptococcus thermophillus HS

DANH MỤC BẢNG BIỂU

-o0o -

Bảng 1.3: thành phần hóa học phế liệu tôm 26

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của phế liệu tôm (% tính trên chất khô tổng số) Error! Bookmark not defined Bảng 1.1: Thành phần trọng lượng của tôm (%) 26

Bảng 3.1 Kết quả lượng sinh khối thu được 43

Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của các chủng 45

Bảng3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh Enzyme thủy phân Pr 47

Bảng 3.4 : Hoạt độ Pr của các chủng khi thay đổi nhiệt độ nuôi cấy 66

Bảng 3.5: Giá trị pH tại các thời điểm nuôi cấy 49

Bảng 3.6: Hoạt độ proteinaza của các chủng khi thay đổi pH 66

Bảng 3.7 : Thành phần phế liệu tôm ban đầu 51

Bảng 3.8 : Thành phần Pr còn lại sau khi loại Pr bằng phương pháp hóa học 52

Bảng 3.9 :Giá trị pH cuối quá trình lên men 67

Bảng 3.10 : Hàm lượng Protein còn lại sau khi loại protein bằng HA6 54

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

- o0o

-Hình 1.1 : Hình dạng 4 loại vi khuẩn lactic 18

Hình 1.2: Một số giáp xác chứa chitin 28

Hình 2.1: Hình ảnh của HA6 và HA12 33

Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của chủng HA6 và HA12 41

Hình 3.2: Hình ảnh nhuộn Gram của chế phẩm HS và HA6Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của 4 chủng HA6, HA12, LGG, HS 43

Bảng 3.1 Kết quả lượng sinh khối thu được 43

Hình 3.4: Tạo vòng thủy phân của chủng HA6 và HS 45

Hình 3.5: Hoạt độ Pr của các chủng nghiên cứu 46

Hình 3.6 : ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme tổng hợp Pr của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 48

Hình 3.7: ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh enzyme thủy phân Pr của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 51

Hình 3.8 : Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh nhuộm Gram HA6Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Sự thay đổi pH quá trình lên men vỏ tôm 53

TÓM TẮT NỘI DUNG

- o0o

-Từ xưa tới nay, vi khuẩn lactic luôn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là trong ngành Công nghệ thực phẩm Vi khuẩn lactic được Pasteur tìm ra từ sữa chua Ít thấy có sự hiện diện của vi khuẩn trong nước, đất mà do

nó có nhiều chất dinh dưỡng khi phát triển nên thường gặp trong sữa, sản phẩm của sữa, thực vật và xác thực vật đang bị phân giải, cả trong ruột và một vài lớp màng nhày của người và động vật Có thể dễ gặp vi khuẩn lactic trong môi trường tự nhiên như dưa chua, sữa chua, thức ăn ủ cho gia súc

Hơn thế nữa, hiện nay các ngành công nghiệp đều có những bước phát triển vượt bậc và công nghiệp chế biến tôm thì tăng lên không ngừng theo thời gian Cùng với việc tăng sản lượng tôm thì khối lượng chất thải sinh ra từ quá trình cũng tăng lên bao gồm chủ yếu là vỏ tôm và đầu tôm Bởi vậy, cần thiết phải có những nghiên cứu cấp bách để giải quyết nguồn chất thải lớn này Trong đề tài của mình tôi tiến hành nghiên cứu khả năng thủy phân protein của bốn chủng vi khuẩn lactic 4 chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn để tìm ra chủng có khả năng thủy phân protein cao nhất Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic đều được nghiên cứu như: thời gian chuẩn bị giống, tỉ lệ giống, pH ban đầu, thời gian lên men

Theo phương pháp truyền thống, để tách chitin khỏi phế liệu, dùng NaOH 4% để loại protein và HCl 4% để loại khoáng Hạn chế lớn nhất của phương pháp này

là làm ô nhiễm môi trường và làm giảm chất lượng của chitin Trong nghiên cứu này,

công đoạn khử khoáng và khử protein không dung hóa chất mà dung enzyme hoặc có thể dung hệ vi khuẩn cho cả quá trình

Sau quá trình thủy phân trên vỏ tôm, ngoài chitin thu được, chúng ta còn thủ được các sản phẩm khác như: protein, chất màu…

Trong nghiên cứu này, tôi kết hợp một số chế phẩm protease và vi khuẩn lactic

để thu hồi chitin Thành phần khoáng được loại bỏ bởi quá trình lên men lactic, 4 chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn để tìm ra chủng có khả năng thủy phân protein cao nhất Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic đều được nghiên cứu như: thời gian chuẩn bị giống, tỉ lệ giống, pH ban đầu, thời gian lên men

Kết quả thu được : xác định được chủng Lactobacillus fermentum HA6 có khả năng loại protein trong vỏ tôm cao nhất.Khi nghiên cứu trên môi trường MRS nhận thấy: môi trường thuận lợi tạo enzyme thủy phân protein là môi trường có pH = 5.5, thời gian 48h, nhiệt độ 30oC , dựa vào kết quả này để ứng dụng thử nghiệm trên vỏ tôm Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic thu được các điều kiện tốt nhất để loại protein là chuẩn bị giống trong thời gian 18h, tỉ lệ giống 10%, pH ban đầu là 5,5, thời gian lên men là 144 giờ Hiệu suất loại protein 84.5%

MỤC LỤC

MỤC LỤC 11

MỞ ĐẦU 15

-o0o - 15

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17

-o0o - 17

1.1.Tổng quan về vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic 17

1.1.1.Định nghĩa: 17

1.1.2.Phân loại vi khuẩn lactic:[6] 17

a.Theo Orla-Jensen (1919) chia làm 4 loài chính 17

b.Phân loại theo hình dạng tế bào: 18

1.1.3.Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic: 19

1.2 Giới thiệu về enzyme protease của vi khuẩn lactic 20

1.2.1 Đại cương về enzyme Protease[9] 20

1.2.2 Hệ enzyme thủy phân protein của vi khuẩn axit lactic 22

1.2.3 Ứng dụng hệ enzyme thủy phân protein của vi khuẩn lactic vào sản xuất thực phẩm 23

1.2.4 Một số đặc điểm của loài vi khuẩn Lactobacillus fermentum và L.acidophilus 23

1.3 Tổng quan tình hình chế biến xuất khẩu tôm và phế liệu tôm và các thành

phần của vỏ tôm: 25

1.3.1 Tổng quan tình hình chế biến xuất khẩu tôm và phế liệu tôm 25

1.3.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm[1]: 26

1.4 Tổng quan về chitin 27

1.4.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 27

1.4.2 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của chitin[21] 28

a Cấu trúc hóa học của chitin: 28

b Tính chất của chitin 29

1.4.3 Các phương pháp tách chitin: 30

a) Phương pháp truyền thống (phương pháp hóa học) để tách chitin: 30

b) Phương pháp sinh học để tách chitin 31

1.4.4 Ứng dụng của chitin:[22] 31

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu 33

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33

HA6 HA12 33

2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị sử dụng 33

a) Các hóa chất chính: 33

b) Các thiết bị chính: 34

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 35

2.1.4 Dung dịch để pha loãng trong đếm s ố lượng t bào 35 ế 2.1.5 Dung dịch để rửa sinh khối vi khuẩn 35

2.2 .Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 35

2.2.2 Xác định mật độ quang – OD[5] 35

2.2.3 Xác định số lượng tế bào 36

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy và thu nhận dich chiết tế bào [18] 36

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme proteaza 36

a/ Phương pháp Babakina:[19] 36

b/Phương pháp Anson cải tiến:[19] 37

2.2.7 Phương pháp giữ giống: 38

2.2.8 Xác định hàm lượng protein ( phương pháp Biuret)[20] 39

a) Chuẩn bị: 39

b) Xây dựng đường chuẩn: 39

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Lựa chọn vi khuẩn lactc từ một số thực phẩm lên men truyền thống 41

có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân proteinError! Bookmark not defined 3.1.1.Đặc điểm của bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu: 41

3.1.2 Nghiên cứu đặc tính 4 chủng vi khuẩn lactic sử dụng trong nghiên cứu: 42

a Theo dõi quá trình sinh trưởng của 4 chủng nghiên cứu: 42

b Kiểm tra lượng sinh khối tế bào nuôi cấy: 43

3.1.3.Khả năng thủy phân protein của bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu: 44

3.1.4 Kiểm tra khả năng sinh enzyme thủy phân protein: 46

3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân protein của vi khuẩn 47

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh enzyme thủy phân proteinaza 47 3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

3.2.3 Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

protein ( pH = 2,5; 3.5; 4.5; 5.5; 6.5) 49

a Giá trị pH tại các thời điểm nuôi cấy 49

b Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ Pr của các chủng thí nghiệm : 50

3.3 Ứng dụng chủng vi khuẩn đã lựa chọn để loại protein trong vỏ tôm 51

3.3 1 Thành phần nguyên liệu ban đầu của vỏ tôm 51

3.3.2 Sử dụng vi khuẩn lactic đã lựa chọn ứng dụng loại protein trong vỏ tôm 53

a Nghiên cứu đặc tính chủng HA6 : Error! Bookmark not defined b Ứng dụng HA6 thủy phân Protein trong vỏ tômError! Bookmark not defined CHƯƠNG IV 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 62

MỞ ĐẦU

- o0o

-Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzyme và ứng dụng Enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm hiện đại

Enzyme được bổ sung một cách định hướng và chọn lọc vào các thực phẩm trong quá trình chế biến nhằm tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù Ngoài ra Enzyme còn được bổ sung vào các phế phẩm của thực phẩm để xử lý và tách các chất có lợi trong các phế phẩm đó Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân cắt Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên [8]

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp….Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1,5 tỷ USD, và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp [8]

Chitin và dẫn xuất của nó đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, xử lý môi trường, nông nghiệp… Từ trước đến nay chitin chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp hóa học trong đó loại khoáng bằng axit và loại protein

bằng kiềm Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng protein, khoáng còn lại thấp và thời gian tiến hành ngắn Tuy nhiên phương pháp này làm giảm chất lượng chitin và nếu nước thải không được xử lý gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Một hướng mới

là sử dụng phương pháp sinh học để thu hồi chitin

Trong nghiên cứu này, tôi kết hợp một số chế phẩm protease và vi khuẩn lactic

để thu hồi chitin Thành phần khoáng được loại bỏ bởi quá trình lên men lactic, 4 chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn để tìm ra chủng có khả năng sinh enzyme thủy phân protein cao nhất Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic đều được nghiên cứu như: thời gian chuẩn bị giống, tỉ lệ giống, pH ban đầu, thời gian lên men

Sau quá trình thủy phân trên vỏ tôm, ngoài chitin thu được, chúng ta còn thủ được các sản phẩm khác như: protein, chất màu…

Nội dung cần nghiên cứu bao gồm:

+Lựa chọn vi khuẩn lactc từ một số thực phẩm lên men truyền thống

có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân protein

+ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân protein của vi khuẩn đã lựa chọn

+Ứng dụng thử nghiệm trên vỏ tôm

Kết quả thu được : xác định được chủng Lactobacillus platarum HA6 có khả năng sinh enzyme thủy phân protein cao nhất.Khi nghiên cứu trên môi trường MRS nhận thấy: môi trường thuận lợi tạo enzyme thủy phân protein là môi trường có pH = 5.5, thời gian 48h, nhiệt độ 30oC , dựa vào kết quả này để ứng dụng thử nghiệm trên vỏ tôm Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic thu được các điều kiện tốt nhất để loại protein trong vỏ tôm là chuẩn bị giống trong thời gian 18h, tỉ

lệ giống 10%, pH ban đầu là 5,5, thời gian lên men là 144 giờ Hiệu suất loại protein là84.5%

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trước đây vi khuẩn lactic được coi là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men và đông tụ sữa bao gồm cả vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic Sau đó đã có rất nhiều các nghiên cứu về vi khuẩn lactic, nhờ các kĩ thuật hiện đạic con người đã miêu tả đầy

đủ hơn về hình dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.1.2.Phân loại vi khuẩn lactic:[6]

Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân lọai theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm

a.Theo Orla-Jensen (1919) chia làm 4 loài chính

b.Phân loại theo hình dạng tế bào:

 Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium

 Hình cầu: các giống còn lại

 Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que)

 Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus)

Lactobacillus

Leuconostoc mensenteroides Streptococcus thermophilus

C.Phân loại theo cách thức lên men:

 Lên men đồng hình (homofermentative): Chuyển glucoza thành axit lactic

 Lên men dị hình (heterofermentative): Chuyển glucoza thành axit lactic, rượu ethylic, axit acetic, CO2

 Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus

Ngoài ra còn có thể phân loại vi khuẩn lactic theo một số đặc điểm sau:

 Nhiệt độ sinh trưởng: 10-45oC

 Khả năng chịu muối

 Khả năng sinh trưởng ở pH khác nhau

 Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic

1.1.3.Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic:

Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Mặc dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng Tất cả các đại diện đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ

thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactate) [9]

Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu

- Do đó, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí, là loại có khả năng lên men hiếu khí cũng như kỵ khí

- Chúng thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que

- Vi khuẩn lactic lên men được mono và disacarit, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật này đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào

- Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong quá trình lên men Các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài L delbrueckii là đồng hóa được tinh bột) Một số khác sử dụng được pentoza và acid xitric mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình

-Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân hủy được protein của sữa thành các peptit

và acid amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn

1.2 Giới thiệu về enzyme protease của vi khuẩn lactic

1.2.1 Đại cương về enzyme Protease

Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzyme và ứng dụng Enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm hiện đại

Enzyme được bổ sung một cách định hướng và chọn lọc vào các thực phẩm trong quá trình chế biến nhằm tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử.[9]

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm ( đông tu sữa làm phomat, làm mềm thịt, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1,5 tỉ USD,

trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%).[26]

Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả năng thủy phân các liên kết peptide của chuỗi peptide, protein thành các đoạn peptide ngắn hơn và các axit amin Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Theo phân loại quốc tế enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 nhóm:

1 Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu Nito của mạch polypeptide

2 Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu Cacbon của mạch polypeptide Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo- peptidase

3 Dipeptihydrolase: xúc tác sự thủy phân liên kết dipeptide

4 Proteinase: xúc tác sự thủy phân các liên kết peptide nội mạch

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ qan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus), đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật (gan,

dạ dày bê…)

Ở Việt Nam những nghiên cứu về protease được tiến hành từ thập kỷ 60 Về Protease động vật có những nghiên cứu tìm hiểu đặc tính protease của một số loài thường dùng trong sản xuất nước mắm Về protease thực vật có những nghiên cưú về bromelain, parapin, protease của cây sung [17] Các nghiên cứu liên quan đến protease từ vi sinh vật tập trung vào protease axit của vi khuẩn Bacillus, của nấm mốc Aspergillus và hầu hết hướng vào mục đích sử dụng cho công nghệ thực phẩm Một số thành tựu đã đạt tới các bước ứng dụng cụ thể như sau:

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một số phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc

1.2.2 Hệ enzyme thủy phân protein của vi khuẩn axit lactic

Vi khuẩn axit lactic không có khả năng tự tổng hợp một vài amino axit do đó để đảm bảo khả năng cũng như tốc độ sinh trưởng, vi khuẩn axit lactic buộc phải phát triển một hệ thống các enzyme thủy phân protein bao gồm các cacboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase, tripeptidase và endopeptidase

Trong dịch chiết enzyme thô của chủng Lactococcus lactis ESB 117 [3] được phân lập

từ pho mát Serra da Estrela có ít nhất một enzyme aminopeptidase, một dipeptidase, một prolinase và một prolidase Các enzyme thủy phân protein của L.lactis ESB 117 không những cung cấp nguồn nitơ để vi khuẩn phát triển mà còn góp phần làm chín phomat, tạo hương thơm đặc trưng của pho mát

Hệ thống enzyme thủy phân protein có trong chủng L sanfraciscensis CB1(có nhiều trong bột nhào) trực tiếp tạo ra các amino axit giúp vi khuẩn, nấm men có trong bột nhào phát triển và cũng góp phần tạo nên hương vị của bánh mỳ trong quá trình lên

men và nướng bánh Trong dịch chiết enzyme thô của L sanfraciscensis CB1 [10], người ta đã thu nhận được một protease, một dipeptidase, và một aminopeptidase Nhiệt độ va pH hoạt động tối ưu của protease là 40ºC và pH 7 trong khi đó dipeptidase

và aminopeptidase có pH tối ưu là 7.5, nhiệt độ tối ưu là từ 30-35ºC

1.2.3 Ứng dụng hệ enzyme thủy phân protein của vi khuẩn lactic vào sản xuất thực phẩm

Tùy thuộc vào sản phẩm, các chủng vi khuẩn hay gặp nhất là Lactococcus lactis (trong phomat), Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus (sữa chua) Ngoài chức năng chính là tạo ra axit lactic, sự có mặt của vi khuẩn lactic còn tạo ra mùi hương đặc trưng của sản phẩm, tạo cấu trúc cho sản phẩm

Hệ enzyme thủy phân protein của vi khuẩn lactic có trong thực phẩm đã thủy phân các protein có trong thịt, trong sữa tạo ra các peptide nhỏ và các aminoaxit tự do Sự có mặt của các hợp chất thấp phân tử này tạo nên mùi thơm đặc trưng của các sản phẩm lên men đồng thời cũng làm tăng khả năng tiêu hóa của thực phẩm do các hợp chất cao phân tử có trong thức ăn đã được phân giải thành các hợp chất thấp phân tử Đó là lý

do mà hầu như các sản phẩm lên men từ vi khuẩn lactic đều dễ tiêu hóa

1.2.4 Một số đặc điểm của loài vi khuẩn Lactobacillus fermentum L.acidophilus ; ;

L rhamnosus và Streptococcus thermophillus

Lactobacillus là vi khuẩn lactic có thể phân lập được từ các sản phẩm sữa, các sản phẩm lên men từ thực vật… Một số nghiên cứu cho thấy Lactobacillus góp phần vào quá trình tiêu hoá các hydratcacbon

Lactobacillus fermentum được đưa ra bởi Benijerinck vào năm 1901 sau một thời gian dài tranh cãi về mối liên quan giữa L cellobiosus và L fermetum[23] Đây là vi khuẩn lactic ưa ấm, là trực khuẩn hình que, được coi là nhóm vi khuẩn có đòi hỏi về dinh dưỡng cao nhất, lên men dị hình, có thể lên men fructoza, galactoza, glucoza,

lactoza, maltoza, mannoza, rafinoza Không sản sinh axit từ các mannitol, melezitoza, rhamnoza, salicin và sorbitol Một số có thể sản sinh axit từ amygdalin, arabinoza, xenloza, trehaloza và xyloza L fermentum phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 15-45oC pH thích hợp cho loài này là 6,2 6,3, bị ức chế ở pH < 2.-

Lactobacillus acidophilus là một trong tám loài chính của giống Lactobacillus Loài này có thể sống ở môi trường pH thấp từ 4 5 hoặc thấp hơn - L.acidophilus lên men lactic đồng hình, có thể phát triển trong điều kiện có hoặc không có oxy

L fermentum HA6, và L acidophilus HA12 được phân lập từ rau quả muối chua truyền thống của Việt Nam [24]

Lactobacillus rhamnosus là một trong các vi khuẩn lành tính có trong sữa [27]

tiêu Lactobacillus rhamnosus GG ( LGG ) là những vi khuẩn sống có lợi cho đườnghóa ( gọi chung là Probiotic ) [28]

Streptococcus thermophillus là chủng phân lập từ sữa chua, là vi khuẩn lên men đồng hình [28]

St thermophillus L fermentum

1.3.1 Tổng quan tình hình chế biến xuất khẩu tôm và phế liệu tôm

Theo số liệu thống kê của Tổng cục hải quan, xuất khẩu tôm đông lạnh của Việt Nam năm 2010 đạt 200 nghìn tấn, trị giá trên 1,5 tỷ USD Trong đó các sản phẩm tôm đứng đầu kim ngạch xuất khẩu, chiếm 36,4% tổng giá trị xuất khẩu So với năm 2009, tăng 10,2% về khối lượng và 3% về giá trị Nhật, Mỹ và EU vẫn là ba thị trường chính của thị trường tôm

Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thairbao gồm chủ yếu là vỏ và đầu tôm Với tốc độ khai thác và chế biến tôm như hiện nay thì ngành công nghiệp chế biến tôm thải ra hàng trăm nghìn tấn vỏ và đầu tôm mỗi năm [1]

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn phải kể đến thịt vụn do bóc toomnonx không cẩn thận và một số tôm bị hỏng Tùy theo giống loài và phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu thay đổi có thể chiếm 40% khối lượng toàn

bộ [2]

Thành phần trọng lượng của các giống tôm được thể hiện trong bảng 2.1 [3]

Bảng 1.1: Thành phần trọng lượng của tôm (%)

Loại tôm Tôm vỏ bỏ

1.3.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm[1]:

Bảng 1.3: thành phần hóa học phế liệu tôm

Phế liệu

tôm

Vỏ tôm 22.8 27.2 0.4 31.7 11.1 3.16

Như vậy, phế liệu tôm là nguồn dinh dưỡng quý giá Tỷ lệ giữa các thành phần này

là không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý, mùa vụ…

1.4 Tổng quan về chitin

1.4.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Chitin là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với số lượng lớn đứng thứ 2 sau xenllulose Chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monomer của chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp cho

sự tái tạo và gắn liền các vết ở da [21]

Hình 1.2: Một số giáp xác chứa chitin

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lượng chitin khá cao dao động từ 6 35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn – chính để sản xuất chitin [3,4]

1.4.2 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của chitin[21]

a Cấu trúc hóa học của chitin:

Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X người ta đã chứng minh được rằng chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N- acetyl – D – glucosamin) trong mạch Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm – CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3

b Tính chất của chitin

Thứ nhất: chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như: rượu, este…Chitin hòa tan được trong dung môi được đun nóng của muối Thioxianat Liti (LiSCN) và muối Thioxianat calci Ca(SCN)2 thành dung dịch keo

Thứ hai: chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như: KMnO4, NaClO, H2O2, Ca(ClO)2… lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin

Thứ ba: chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành các phức chất cần thiết Chitin bị enzyme lyozyme

– một loại enzyme chỉ có trên cơ thể người phân giải thành mono N acetyl D – – – glucosamine

Thứ tư; khi đun nóng trong dung dịch HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị phân hủy hoàn

toàn thành 88,5% D glucosamine và 11,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu - xảy ra ở mối nối glucozit, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-COCH3)

1.4.3 Các phương pháp tách chitin:

a) Phương pháp truyền thống (phương pháp hóa học) để tách chitin:

Việc sản xuất chitin và dẫn xuất của nó bằng phương pháp hóa học đã và đang là mối quan tâm lớn hiện nay Chitin thu được phụ thuộc nhiều vào quá trình xử lý với axit để khử khoáng và với kiềm nóng để khử protein Quá trình này tiêu tốn năng lượng, thải ra một lượng lớn nước thải chứa nhiều axit và kiềm gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đồng thời khó tách các sản phẩm có giá trị như: chất màu, protein Nhưng điều quan trọng hơn là ảnh hưởng đến chất lượng chitin, ảnh hưởng tới trọng lượng phân tử

và mức độ acetyl hóa [2]

• Về phương diện môi trường: quá trình hóa học có những nhược điểm như sau:

- Cần sử dụng một lượng lớn axit và kiềm, nước rửa

- Nước thải là chất rắn ăn mòn và chứa những chất gây ô nhiễm môi trường

• Về kinh tế: quá trình hóa học có những nhược điểm

- Chi phí cho xử lý môi trường

- Chi phí năng lượng

- Tốn lượng nước rửa lớn

- Không thu hồi được các sản phẩm giá trị khác

• Về chất lượng sản phẩm: chất lượng chitin giảm vì các lí do

- Việc sử dụng axit và kiềm dẫn đến việc cắt mạch chitin làm cho sản phẩm thay đổi trọng lượng phân tử và độ nhớt

- Việc đề acetyl hóa một cách ngẫu nhiên bằng axit và kiềm nóng đã làm biến đổi sản phẩm

b) Phương pháp sinh học để tách chitin

Trong phương pháp sinh học, công đoạn khử khoáng và khử protein không sử dụng hóa chất mà dùng ezyme để loại protein, axit hữu cơ để loại khoáng hoặc có thể sử dụng hệ vi khuẩn cho cả quá trình Sản phẩm thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất Protein của quá trình thủy phân bằng enzyme có thể thu hồi làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid hay sắc tố cũng được thu hồi Quá trình loại khoáng được đề xuất bằng lên men lactic [11,12]

Hiệu quả của quá trình lên men lactic phụ thuộc nhiều vào yếu tố như: lượng giống, chủng, lượng glucoza, pH ban đầu, pH trong quá trình lên men, thời gian lên men [12,13]

Trong quá trình lên men, axit lactic được tạo ra làm giảm pH, ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại Axit lactic tác dụng với các thành phần cacbonat có trong phế liệu tôm Trong quá trình lên men, protein cũng bị thủy phân bởi các enzyme proteolytic được tạo ra do chủng Lactobacillus

Trong phương pháp sinh học, quá trình loại khoáng và protein không triệt để bằng phương pháp hóa học Để đạt hiệu quả hơn nữa, cần có những bước xử lý tiếp theo, có như vậy mới loại bỏ được phần khoáng và protein trong chitin thô [14]

1.4.4 Ứng dụng của chitin:[22]

Chitin và các dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: Công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học, y học, môi trường và một số ngành công nghiệp khác

a) Trong nông nghiệp:

Với tính chất của chitin chitosan và các dẫn xuất của nó, người ta lợi dụng khả – năng của chitosan để làm thành một màng mỏng bao quanh hạt giống, giúp cho việc bảo quản được lâu hơn.

b) Trong y học:

Trong lĩnh vực y tế những ứng dụng tiềm năng của chitin, chitosa, glucosamin

và các dẫn xuất của nó rất nhiều, ngày nay với sự phát triển của y học thì chúng càng được ứng dụng rộng rãi Một số đã được đưa vào ứng dụng như: chỉ khâu

tự thiêu, da nhân tạo, thấu kính tiếp xúc, thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng, bào chế dược phẩm, khả năng miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, chống nhiễm khuẩn và cầm máu…

c) Trong công nghiệp thực phẩm

Chitin được chuyển thành chitosan nhờ dung dịch kiềm đặc Chitosan không hòa tan trong nước, kiềm, xeton nhưng tan trong dung dịch axit loãng, chitosan tạo trạng thái keo Dung dịch kẹo này khi bao phủ bề mặt sản phẩm sẽ tạo thành một lớp màng bảo vệ bán thấm Các phương pháp dùng chitosan bảo quản quả tươi dựa trên tính chất này, lớp màng bảo vệ này có thể hạn chế sự bay hơi nước của hoa quả, giảm bớt cường độ hô hấp, kháng khuẩn Sử dụng vỏ bọc chitosan

để bảo quản thủy sản tươi và khô, bao gói xúc xích…

d) Trong sinh học

Chitin, chitosan được sử dụng khá rộng rãi làm vật liệu cố định enzyme và tế bào thông qua cầu nối glutaraldehyt hoặc được nhốt trong gel Trong công nghệ sản xuất rượu, làm sạch nước, sản xuất đường nghịch đảo… mang lại hiệu quả kinh tế cao