Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy ddt và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Đào Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Đào Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60.42.30 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời Cảm Ơn ! Trong trình nghiên cứu vừa qua, tơi gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến hướng dẫn, bảo tận tình PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, anh chị nhóm nghiên cứu Cơng nghệ sinh học xử lý khử độc chất ô nhiễm hữu khó phân hủy, phịng Cơng nghệ Sinh học Mơi trường, đặc biệt Ths Nguyên Bá Hữu, KS Đàm Thúy Hằng, KS.Nguyễn Nguyên Quang, KS Nguyễn Quang Huy Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Khoa sau đại học, Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, tận tình dạy dỗ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học thực luận văn Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) bp Base pair DDE Dichlorodiphenyldichloroethylene DDD Dichlorodiphenyldichloroethane DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid EC Enzyme Commission EPA U.S Environmental Protection Agency HCH Hexacyclohexan Lac Laccase LB Luria - Bertani LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl PCR Polymerase Chain Reaction POP Persistent Organic Pollutant RBBR Remazol brilliant blue R RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc DDT 1.2 Tính chất lý hóa DDT ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI CỦA DDT 2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời TÌNH TRẠNG Ơ NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh 3.2 Tình trạng nhiễm DDT giới 3.3 Tình trạng nhiễm DDT Việt Nam CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT 4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý 4.1.1 Phương pháp chơn lấp, lập 4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác 4.1.3 Phương pháp phân hủy kiềm nóng 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học PHÂN HỦY SINH HỌC DDT 5.1 Khả phân hủy DDT vi sinh vật 5.1.1 Loại clo trình khử 5.1.2 Khoáng hoá DDT nấm thủy phân lignin 5.1.3 Phân hủy DDT vi khuẩn điều kiện hiếu khí 5.2 Các điều kiện mơi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT dẫn xuất DDT LACCASE 6.1 Định nghĩa 6.2 Cấu trúc phân tử laccase 6.3 Cơ chế xúc tác laccase 6.4 Tính chất hóa sinh laccase 6.5 Sự phân bố số vi sinh vật sinh laccase 6.6 Gene mã hóa laccase 6.7 Ứng dụng laccase 6.8 Lignin peroxidase Mangan peroxidase 6.8.1 Lignin peroxidase 6.8.2 Mangan peroxidase PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 7.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống 7.2 Phân loại phƣơng pháp xác định so sánh trình tự gene mã hóa 18S Rrna Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 6 6 7 11 11 13 14 16 16 16 17 17 18 20 20 21 22 23 26 27 27 28 30 32 33 34 36 37 37 38 39 39 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 7.2.1 Một số phương pháp phân loại sinh học phân tử 7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hố 18S rRNA PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU 1.1 Nguyên liệu 1.2 Hóa chất 1.3 Thiết bị 1.4 Môi trƣờng nuôi cấy PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm sợi 2.2 Sàng lọc khả sinh Lac, LiP, MnP 2.3 Nghiên cứu khả phân hủy DDT chủng FNA1 2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 2.4.1 Xác định hoạt tính laccase 2.4.2 Xác định hoạt tính LiP 2.4.3 Xác định hoạt tính MnP 2.5 Khảo sát điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả phát triển sinh laccase chủng FNA1 2.6 Xác định số tính chất hóa sinh laccase thô 2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA 2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi 2.7.2 Nhân đoạn gen kỹ thuật PCR 2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ biến nạp vào E.coli 2.7.4 Tách chiết DNA plasmid 2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số 2.6.8 Xây dựng phát sinh chủng loại 2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH BÀO TỬ CỦA CÁC CHỦNG FNA1, FNA2, FNA3 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 4.1.2 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl 4.2 Ảnh hưởng nồng độ DDT nồng độ glucose 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ DDT 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 40 42 42 42 42 42 43 45 45 45 45 46 46 47 47 48 49 50 50 51 53 53 54 55 55 55 56 56 57 59 64 64 64 65 67 68 68 69 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng 4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO4 4.3.2 Các chất ô nhiễm khác 4.4 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt 4.5 Ảnh hưởng nguồn carbon, nitơ môi trường thay 4.5.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 4.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 4.5.3 Ảnh hưởng mơi trường thay MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ 5.1 pH tối ưu độ bền pH 5.1.1 pH tối ưu 5.1.2 Độ bền pH 5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động laccase độ bền nhiệt 5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động laccase 5.2.2 Độ bền nhiệt PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA 6.1 Tách chiết DNA tổng số 6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA kỹ thuật PCR 6.3 Tách dòng gen 18S rRNA vectơ pTZ57R/T 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA chủng FNA1 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 71 72 74 76 76 78 80 81 81 81 83 84 84 85 86 86 87 88 91 94 95 96 103 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) thuốc trừ sâu tổng hợp đƣợc biết đến nhiều DDT đƣợc tổng hợp vào năm 1874, nhƣng thuộc tính thuốc trừ sâu DDT 1939 đƣợc khám phá Vào năm đầu Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT đƣợc sử dụng với lƣợng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt phát ban, bệnh côn trùng khác quân đội lẫn dân cƣ DDT trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng nơng nghiệp Chúng có mặt khắp nơi, khơng khí, đất, nƣớc lƣợng lớn đƣợc giải phóng phun cánh đồng rừng để diệt muỗi côn trùng Ngày DDT bị cấm sử dụng tính độc nhƣ có khả gây ung thƣ tiềm tàng, gây đột biến gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng Để bảo vệ môi trƣờng sức khỏe ngƣời, cần phải xử lý khử độc DDT môi trƣờng đất nhƣ mơi trƣờng khác DDT đất giảm bay hơi, xói mịn đất, hấp thu động vật, thực vật phân hủy sinh học vi sinh vật có sẵn đất nhƣng với thời gian tƣơng đối lâu Trên giới nhƣ Việt Nam, có số phƣơng pháp khử độc khác đƣợc nghiên cứu áp dụng Trong phƣơng pháp xử lý sinh học nhờ vi sinh vật hệ enzyme chúng tiết hƣớng có nhiều triển vọng Hệ enzyme sử dụng xử lý sinh học chủ yếu enzyme ngoại bào, chúng có khả phá vỡ liên kết hợp chất hữu xúc tác chuyển hóa chúng thành chất độc dạng dễ bị phân hủy Nhóm enzyme có vai trị lớn trình phân hủy DDT nhƣ chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học peroxidase (MnP) lignin peroxidase (LiP), laccase có vai trị quan trọng bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu giới Việt Nam Tại Nhóm nghiên cứu Cơng nghệ sinh học xử lý khử độc chất nhiễm hữu khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants – POPs), phịng Cơng nghệ Sinh học Môi trƣờng, Viện CNSH, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam có nghiên cứu bƣớc đầu khả phân hủy DDT, DDD, DDE sinh enzyme ngoại bào Lac, MnP, LiP [4,5,6] Để làm rõ chất sinh học khả sinh enzyme chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm DDT phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng enzyme ngoại bào vào xử lý chất ô nhiễm khó phân hủy POPs, chúng tơi thực đề tài với tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả phân hủy DDT sinh laccase chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu” Nội dung bao gồm: Phân loại định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái trình tự đoạn gene mã hố 18S rRNA Nghiên cứu khả phân hủy DDT chủng nấm sợi FNA1 Nghiên cứu khả sinh laccase chủng nấm sợi FNA1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc DDT DDT thuốc diệt côn trùng, chúng nhóm hợp chất hữu có hai vịng thơm có chứa Clo, bao gồm 14 hợp chất hữu cơ, đó: 71% p,p,- DDT, 14.9% o,p,- DDT, 0.3%p,p,- DDD, 0.1% o,p,-DDD, 4% p,p,- DDE, 0.1% o,p,-DDE, sản phẩm khác 3.5% (Hình 1.1) p-p DDT p-p DDE p-p DDD o-p DDT o-p DDE o-p DDD Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số đồng phân DDT 1.2 Tính chất lý hóa DDT Tất đồng phân DDT dạng tinh thể màu trắng, không mùi, khơng vị, có cơng thức tổng qt C14H9Cl5, khối lƣợng phân tử 354.5 Nhiệt độ nóng chảy khoảng 108.5 - 1090C, áp suất bay 2.53 x10 Pa (1.9 x10 -7mmHg) 200C DDT tan nƣớc (1g/l) nhƣng có khả giữ nƣớc, tan tốt hợp chất hữu đặc biệt mỡ động vật Khả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Geoffrey Turner, Bernhard Nüsslein, and Reinhard Fischer (2006), “Use of Laccase as a Novel, Versatile Reporter System in Filamentous Fungi”, Applied and Environmental Microbiology, 72(7), pp.5020-5026 20 Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S., (2001), “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Wat Res., 35(17), pp.4126-4136 21 Gladys Alexandr, Igor B Zhulin (2000), “Laccases are widespread in bacteria”, Trend in Biotechnology, 18(2), pp.41-42 22 Gochev, V K., A I Krastanov (2007), “Isolation of Laccase Producing Trichoderma Spp”, Bulg J Agric Sci., 13, pp.171-176 23 Guarro Josep, Josepa Gene, Alberto M Stchigel Developments in Fungal Taxonomy Unitat de Microbiologia Spain 24 Hans E Schoemaker, Klaus Piontek (1996), “On the interaction of lignin peroxidase with lignin”, Pure & Appl Chem, 68(11), pp.2089-2096 25 Harald Claus (2003), “Laccase and their occurrence in prokaryotes”, Arch Microbiol, 179, pp.145-150 26 Hestbjerg Helle, Willumsen Pia Arentsen, Christensen Mette, Andersen Ole and Jacobsen Carsten Suhr (2003), “Bioaugmentation of tarcontaminated soils under field conditions using Pleurotus ostreatus refuse from commercial mushroom production” Environmental Toxicology and Chemistry 22(4), pp.692-98 27 Hirofumi Hirai , Sawako Nakanishi, Tomoaki Nishida (2004), “Oxidative dechlorination of methoxychlor by ligninolytic enzymes from white-rot fungi”, Chemosphere, 55(4), pp.641-645 28 Hongman Hou, Jiti Zhou, Jing Wang, Cuihong Du, Bin Yan (2004), “Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye”, Process Biochemistry, 39(11), pp.1415-1419 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 29 J.M Aislabie, N.K.Richards, H.L.Boul (1997), “Microbial degradation of DDT and its residues- a review”, New Zealand Journal of Agricultural Research, pp.271- 275 30 Jan D V E., Gabriela F D., Anneke K – W., Eric S (2000), “Analysis of the dynamics of fungal communities in soil via fungal – specific PCR of soil DNA followed by denaturing gradient gel electrophoresis”, Journal of Microbiological Methods, 43, pp.133 – 151 31 Johnson B Thomas and Jack O Kennedy (1973), “Biomagnification of p, p'-DDT and Methoxychlor by Bacteria”, Appl Environ Microbiol, 26(1), pp.66-71 32 José Renato P Cavallazzi, Catarina M Kasuya, Marcos A Soares, (2005), “Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium”, Brazillan Journal of Microbiology 36, pp.383-387 33 Kizhekkedathu Narayanan Niladevi, Parukuttyama Prema (2005), “Mangrove Actinomyces as the source of Ligninolytic Enzymes” Actinomycestologica, 19, pp.40 –47 34 Klaus Piontek, Matteo Antorini, Thomas Choinowski Crystal (2002), “Structure of a Laccase from the FungusTrametes versicolor at 1.90-Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277,pp.37663-37669 35 Laura-Leena Kiiskinen (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces”, Doctor Thesis, Helneski University of Technology 36 Lucier G.W., Trischer A M., Van den Heuvel J.P., et al., (1992), “Organohalogen compounds: Extended abstracts of 12th Intern Symp On dioxins and related compounds”, Tampere: Finish Institute of occupational heath, 10, pp.3-6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 37 M Enriqueta Arias, María Arenas, Juana Rodríguez, Juan Soliveri, Andrew S Ball, and Manuel Hernández (2003), “Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335”, Applied and Environmental Microbiology, 69(4), pp.1953-1958 38 Marie-Francois Hullo, Ivan Moszer, Antoine Danchin and Isabelle Martin-verstraete (2001), “Cot A of Bacillus subtilis is a copper-depedent laccase” Journal of Bacteriology, pp.5426-5430 39 Marièlle Bar (2001), “Kinetics and physico-chemical properties ò whiterot fungal laccases”, doctor thesis 40 Mario Scherer, Reinhard Fischer (2001), “Molecular characterization of a blue-copper laccase, TILA, of Aspergillus nidulans”, FEMS Microbiology Letters, 199, pp.207-213 41 Nadeau Lloyd J, Sayler Gary S and Spain J C (1998), “Oxidation of 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) by Alcaligenes eutrophus A5”, Archives of Microbiology, 171(1), pp.44-49 42 Nadeau, L J.; Menn, F- M.; Breen, A.; Sayler, G.S., (1994) “Aerobic degradation of DDT by Alcaligenes eutrophus A5”, Applied and environmental microbiology 60: 51- 55 43 O V Morozova, G P Shumakovich, M A Gorbacheva, S V Shleev, and A I Yaropolov (2007), ““Blue” Laccases”, Biochemistry (Moscow), 72(10), pp.1136-1150 44 P Sharma, R Goel, N Capalash (2007), “Bacterial laccase”, World J Microbiol Biotechnol, 23, pp.823-832 45 Pereira W., Domagalski J., Hostettler F., et al., (1996), “Occurrence and accumulation of pesticides and organic contaminants in river sediment, water and clam tissues from the San Joaquin River and tributaries, California”, Environ Toxicol Chem, 15(2), pp.172- 180 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 101 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 46 PJ Collins, MJJ Kotterman, JA Field and ADW Dobson (1996), “Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccases from Trametes versicolor”, Appl Environ Microbiol.,62(12), pp.4563-4567 47 R V Subba-Rao and M Alexander (1985) “Bacterial and fungal cometabolism of 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) and its breakdown products”, Applied and Environmental Microbiology 49(3), pp.509-516 48 Rochkind- Dubinsky, M.L.; Sayler, G.S.; Blackburn, J.W., 1987 Microbiological decomposition of chlorinated aromatic compounds Microbiology series, vol 18, New York, Marcel Dekker: pp 153- 162 49 S Sadhasivam, S Savitha, K Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008), “Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1”, Process Biochemistry 43, pp.736–742 50 S Tagger, C Périssol, G Gil, G Vogt and J Le Petit (1998) “Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.)”, Enzyme and Microbial Technology, 23(6), pp.372-379 51 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 52 Sergio Riva (2006), “Laccases: Blue enzymes for green chemistry”, Trends in Biotechnology, 24(5), pp.219-226 53 Shah, M M.; Barr, D P.; Chung, N.; Aust S.D., (1992),“ Use of white rot fungi for the degradation of environmental cheicals”, Toxicology letters, 64/65, pp.493- 501 54 Staples C., Werner A., Hoogheem T., (1985) “Assessment of priority pollutant concentrations in the United States using STORET database”, Environ Toxicol Chem 4, pp.131- 142 55 Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca-Herrera (2009), “Lacasses in the textile industry”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 1(4), pp.115-120 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 102 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 56 Tereza Skálová et al, (2009), “The structure of small laccase from streptomyces coelicolor reveals a link between laccase and nitrite reductases”, Journal of Molecular Biotechnology, 385, pp.1165-1178 57 The Use and Effectiveness of Phytoremediation to Treat Persistent Organic Pollutants (2005), Kristi Russell Environmental Careers Organization 58 Timothy P.Ruggaber, Jeffrey W Talley (2006), “Enhancing Bioremediation with enzymatic Processes”, Practice periodical of hazardous, toxic, and radioactive waste management 59 Toxicology profile for DDT, DDE, DDD, pp 1- 231 60 Xiaohu Shao et al (2009), “Deletion and site-directed mutagnesis of laccase from Shigella dysenteriae results in enhanced enzymatic activity and thermostability”, Enzyme and Microbial Technology, 44, pp.274-280 61 Y Z Xiao, Q Chen, J Hang, Y Y Shi1, Y Z Xiao, J Wu, Y Z Hong, Y P Wang (2004), “Selective induction, purification and characterization of a laccase isozyme genes from Trametes sp AH28-2 and analyses of their differential expression”, Applied Microbiology and Biotechnology 71, pp.493-501 62 Yi Huang, Xi Zhao and Shengji Luan (2007), “Uptake and biodegradation of DDT by ectomycorrhizal fungi”, Sicence of the total enviroment 358, pp.235-241 63 Zaidi R., Baquar And Imam H S., (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocacbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, 38, pp.737- 742 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 103 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục Đặc tính lý - hóa số đồng phân DDT Đặc tính p,p,-DDT p,p,-DDE p,p,-DDD o,p,- DDT o,p,-DDE o,p-DDD 354.5 318.03 320.05 354.49 318.03 320.05 Tinh thể bé,bột trắng Tinh thể bé, bột trắng Tinh thể bé, bột trắng Tinh thể bé, bột trắng ND ND Rắn Rắn Rắn Rắn Rắn ND Phân hủy 336 0C 3500C ND ND ND 0.98-0.99 ND 1.385 0.98-0.99 ND ND Nhẹ ND ND ND ND ND 0.025mg/l (250C) ND ND 0.085mg/l (250C) 0.14mg/l (250C) 0.1mg/l (25 0C) Ít tan etanol, tan tốt etylete acetone Tan tốt chất béo dung môi hữu khác ND Tan etanol, iso octan, cacbontetraclorit Khối lƣợng phân tử Màu Trạng thái vật lý Nhiệt độ sôi Khối lƣợng riêng d(g/cm ) Mùi Độ tan nƣớc Độ tan dung môi hữu ND Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 104 ND http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Áp suất bay Luận văn Thạc sĩ Sinh học 1.6x10-7 200C,torr 6x10-6 250C,torr 1.35x106 25 0C,torr 1.1x10-7 20 0C,torr 6.2x10-6 250C,torr 1.94x106 30 0C,torr Phụ lục Các vi sinh vật sử dụng DDT Vi khuẩn Nấm Xạ khuẩn Alcaligenes eutrophus A5 Nocardia sp Streptomyces aureofaciens Phanerochaete Streptomyces chrysosporium viridochromogenes Bacillus Sp Trichoderma viridae Streptomyces annamoneus Cylindrotheca closterium Sacharomyces cerevisiae Streptomyces chromofuscus Enterobacter aerogenes Fusarium solami Enterobacter cloacae Aspergillus conicus Eschrichia coli Aspergillus niger Klebsiella pneumoneae Leccinum scabrum Klebsiella pneumoniae Gloeophyllum trabeum Pseudomonas putida Penicillium brefeldianum Arthrobacter Sp Phụ lục Vi sinh vật sinh laccase Nấm đảm Nấm sợi Phanerochaete Melanocarpus Streptomyces Bacillus chrysosporium albomyces lavendulae licheniformis Pycnoporus Fusarium Streptomyces Bacillus cinnabarinus oxysporum psammoticus halodurans Rhizotonia solani Aspergillus nidulans Streptomyces Thermus Xạ khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 105 Vi khuẩn http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Trametes villosa Luận văn Thạc sĩ Sinh học viridosporus thermophilus Trichoderma Streptomyces Escherichia coli harzianum coelicolor Trametes versicolor Aspergillus niger Pleurotus ostreatus Aspergillus terreus Lentinula edodes Pholiota spp Agaricus bisporus Peniophora spp Botrytis cinerea Mauginiella sp Bacillus subtilis Phụ lục Gene mã hóa laccase Tên chủng Bacillus subtilis Ceriporiopsis subvermispora Coprinus cinereus Cryptococcus neoformans Gaeumannomyces graminis var tritici Marasmius quercophilus Myceliophthora thermophila Neurospora crassa Tên gene Tên chủng laccase Tên gene laccase cotA Basidiomycete PM1 lac1 Ics-1 Podospora anserina lac2 lcc1 Populus euramericana lac90 CNLAC1 Rhizoctonia solani lcc4 LAC2 Trametes pubescens lap2 lac1 Trametes trogii lcc1 lcc1 Trametes versicolor lccI SalI Trametes versicolor lcc2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 106 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phlebia radiata lac1 Trametes villosa lcc1 Pleurotus ostreatus poxa1b Trametes villosa lcc2 Pleurotus ostreatus Poxc Streptomyces lavendulae Poxb Phụ lục Một số kỹ thuật phân loại đại Thành phần Bazơ (%G+C) Phạm vi phân loại Chi Biến tính DNA : DNA Lồi Các phần DNA đƣợc cắt enzym giới hạn Loài dƣới lồi Phƣơng pháp phân tích Thành phần tế bào DNA nhiễm sắc thể Đa hình chiều dài đoạn giới hạn RNA riboxom Trình tự nucleotit RNA riboxom Protein Thành tế bào Màng Loài, chi chi Lai DNA : rRNA Trình tự axit amin Lồi, chi chi So sánh phản ứng huyết Các kiểu điện di Loài chi Điện di enzym đa vị trí Các dịng lồi Cấu trúc peptidoglucan Polysaccharid Axít teichoic Axít béo Lipid phân cực Lồi chi Lồi chi Axít mycolic Isoprenoid quinones Các sản phẩm trao đổi chất Axít béo Lồi chi Tồn tế bào Sắc kí lỏng pyrolysis Pyrolsis khối phổ Lồi dƣới lồi Phụ lục Xác định hoạt tính LiP, MnP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 107 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Xác định hoạt tính enzyme LiP Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Đệm kali phosphate PPB (50 mM, pH = 7) 4-aminoantipyrine, 0,164 mM 2,4-DCP mM Dịch enzyme H2O2 mM Nƣớc khử ion Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm 500 µl 500 µl 50 µl 200 µl 200 µl µl 50 µl 50 µl 200 µl 200µl 50 µl µl Phản ứng diễn cho H2O2 vào hỗn hợp, giá trị OD đo sau phút Công thức tính: U (ODM  ODC )  V pu  106  D f VE   Trong đó: U: Hoạt độ enzym (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε510 = 21647 M-1cm-1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc mẫu đối chứng Df: Độ pha lỗng Xác định hoạt tính MnP Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Đệm kali phosphate PPB (100 mM, pH = 7) MnSO4 0,1 mM Phenol đỏ 0,1 mM Dịch enzyme H2O2 50 mM Nƣớc khử ion Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm ml ml 200 µl 300 µl ml µl 500 µl 200 µl 300 µl ml 500 µl µl Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 108 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phản ứng diễn cho H2O2 vào hỗn hợp, sau phút 30 giây dừng phản ứng cách cho 40 µl NaOH 5M vào ml mẫu, xác định giá trị OD bƣớc sóng 610 nm Cơng thức tính: Trong đó: U (ODM  ODC )  V pu  106  D f VE  1,5   U: Hoạt độ enzyme (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε610 = 4460 M-1cm-1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (5 ml) VE: Thể tích enzyme (1 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc mẫu đối chứng Df: Độ pha loãng Phụ lục Phƣơng pháp chiết dịch chiết từ đất ô nhiễm Cân khoảng 10g đất nhiễm chất độc hóa học (1,5DN5) thu nhận từ sân bay Đà Nẵng đƣợc làm khô vào bình tam giác, bổ sung 15g Na2SO4 để tiếp tục làm khơ mẫu Sau mẫu khơ hồn tồn bổ sung 45ml dung môi Methanol : Toluen = : để chất độc khuếch tán ngoài, siêu âm mẫu đất 30 phút, đậy nắp lắc hơn, sau để lắng, ly tâm tách dịch, bổ sung H2 SO4 với tỉ lệ : thể tích so với tổng thể tích dung dịch để oxy hóa Khi dung dịch tách làm hai pha dùng phễu chiết để lấy pha bảo quản lọ tối màu Phụ lục Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E coli Các bƣớc thực theo quy trình hóa chất “PCR cloning kit” hãng Fermentas Chuẩn bị tế bào khả biến môi trường nuôi cấy: Ngày trước biến nạp: Nuôi khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (bất kì chủng nào) mơi trƣờng C, lắc 37oC qua đêm Ngày biến nạp: Làm ấm môi trƣờng C tube 37oC 20 phút làm ấm đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicilin (100 µl/ml) 37oC 20 phút trƣớc gạt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 109 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Quy trình biến nạp: Bƣớc 1: Bổ sung 150 µl dịch ni qua đêm vào 1,5 ml môi trƣờng C làm ấm Lắc 37 oC 20 phút Bƣớc 2: Ly tâm 6000 vòng phút oC, loại dịch Bƣớc 3: Trộn tế bào 300 µl dung dịch T Ủ phút đá Bƣớc 4: Ly tâm 6000 vòng phút oC, loại dịch Bƣớc 5: Trộn tế bào 120 µl dung dịch T Ủ phút đá Bƣớc 6: Lấy 2,5 µl sản phẩm ligation vào ống làm lạnh đá phút Bƣớc 7: Bổ sung 50 µl tế bào chuẩn bị vào ống chứa sản phẩm ligation trên, ủ đá phút Bƣớc 8: Gạt đĩa LB-ampicillin, có bổ sung thêm X-gal IPTG Ủ 37 o C qua đêm Phụ lục Hoạt tính laccase Ảnh hƣởng nhiệt độ Nhiệt độ (oC) 28 30 37 42 Hoạt tính (U/l) 12.2 10.7 1.3 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy pH Hoạt tính (U/l) 2.6 3.2 111.1 100 3.4 1.4 3.5 Ảnh hƣởngnồng độ NaCl NaCl % 0.1 10 Hoạt tính 5.8 10.4 2.6 1.4 0.04 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 110 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học (U/l) Ảnh hƣởng nồng độ DDT 50 DDT ppm Hoạt tính (U/l) 100 6,6 200 7,1 300 6,8 Ảnh hƣởng nồng độ glucose Glucose % 0,1 0,5 Hoạt tính (U/l) 7,5 6,5 0,2 Ảnh hƣởng chất cảm ứng Chất cảm ứng guiaiacol veratyl alcohol CuSO4 Hoạt tính (U/l) 7,6 2,9 11 Ảnh hƣởng chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt Hoạt tính (U/l) Nƣớc bồ kết 0,4 0,5 3,8 3,1 Tween 80 2608,3 0,4 6,5 4,8 Động thái sinh tổng hợp laccase Ngày 10 Hoạt tính (U/l) 2608,3 0,4 2,5 6,5 194,4 4,8 2,6 7,5 6,3 2,25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 111 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Ảnh hƣởng nguồn carbon Carbon Glucose Saccharose lactose Tinh bột Khoai tây Cao malt Cellulose Hoạt tính (U/l) 8,6 22,2 1,8 4,3 3,7 1,1 3,3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ Nitơ NaNO₃+KNO₃ Cao men Cao thịt Đậu tƣơng Urê NH₄NO₃ Hoạt tính (U/l) 22,2 1,5 1,1 1,7 0,6 0,9 Môi trƣờng thay Môi trƣờng MEG YS SG PG Hoạt tính (U/l) 11,3 6,2 21,3 5,8 pH tối ƣu pH 4,5 3,5 2,5 Hoạt tính (U/l) 0,02 3,2 7,5 28,2 503,1 1,5 1552,8 2355,6 2802,8 1969,4 Nhiệt độ tối ƣu Nhiệt độ (oC) 32 40 50 60 70 80 90 Hoạt tính (U/l) 1354,2 1877,3 2532,4 2307,9 1289,3 914,4 905,1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 112 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Độ bền pH pH Hoạt tính (U/l) 650 1075 1472 2100 1825 1416,7 1386 10 1425 1472 1425 Độ bền nhiệt Nhiệt độ (oC) Hoạt tính (U/l) 50 60 80 90 10 phút 2508 2370.37 1333.333 1370.37 20 phút 2394 1958.333 1120.37 1212.963 40 phút 2453 1287.037 1263.889 1018.519 60 phút 2409 1259.259 1185.185 1074.074 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 113 http://www.lrc-tnu.edu.vn