Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột sống của một số chủng nấm sợi phân lập từ đất trồng sắn

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cám ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trưởng phịng Các chất chức sinh học, Viện Cơng Nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện vật tư, hóa chất thiết bị cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cám ơn tập thể cán phòng Các chất chức sinh học giúp đỡ tơi suốt thời gian làm khóa luận Tơi xin chân thành cám ơn Thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp 1101-Công Nghệ Sinh Học- K18 tất bạn bè động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh Viên Nguyễn Thị Thơ MỤC LỤC Giới thiệu chung Phần 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………3 1.1: Tổng quan Enzyme, α-Amylase, glucoamylase 1.1.1: Enzyme 1.1.2: α-Amylase 1.1.3: γ-Amylase (glucoamylase)……………………………………………………10 1.2: Sơ lược nấm sợi 11 1.2.1: Hình thái cấu trúc nấm sợi 11 1.2.2: Phân loại nấm sợi…………………………………………………………….14 Phần 2: PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU………………………………………16 2.1: Phương pháp .16 2.1.1: Phương pháp vi sinh……………………………………………………….….16 2.1.1.1: Phương pháp phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu (F Uyenco, 1988)……………………………………………………………………………16 2.1.1.2: Phương pháp lên men lỏng………………………………………………… 17 2.1.1.3: Phương pháp lên men xốp……………………………………………….… 17 2.1.2: Phương pháp hóa sinh …………………………………….………………….18 2.1.2.1: Phương pháp tách triết dịch enzyme thô từ môi trường lên men xốp……….18 2.1.2.2: Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào: khuếch tán môi trường thạch (William, 1983) ………………………………………………… 19 2.1.2.3: Phương pháp tách triết dịch amylase thô từ môi trường lên men xốp……….20 2.1.2.4: Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Miller, 1959)……………….21 2.2: Thiết bị - vật liệu…………………………………….……………………………24 2.2.1: Vật liệu…………………………………….……………………………………24 2.2.2: Hóa chất…………………………………….………………………….……….24 2.2.3: Dụng cụ ………………….………………….…………………………………25 2.2.4: Thiết bị ………………….………………….……………………………….…25 Phần 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ………………….………………………… 26 3.1: Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh amylase từ đất trồng sắn ………………….………………….………………………………………….26 3.1.1: Phân lập chủng nấm sợi từ đất trồng sắn ……………………………………26 3.1.2: Phân lập chủng nấm sợi có khả sinh Amylase ……………………… 30 3.2: Xác định môi trường lên men xốp ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 ………………….………………………………31 3.2.1: Ảnh hưởng độ ẩm………………….………………….………………………31 3.2.2: Ảnh hưởng tuổi giống ………………….………………….……………… 33 3.2.3: Ảnh hưởng thời gian lên men xốp ………………….……………………… 35 3.2.4: Ảnh hưởng tỷ lệ giống bổ sung ………………….………………………… 36 Phần KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ………………….………………….……….38 4.1: Kết luận ………………….………………….………………….………………… 38 4.2: Kiến nghị………………….………………….………………….……………… …38 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………….39 PHỤ LỤC……………………………………………………………………………… 41 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNS 3,5 – dinitrosalicylic acid VSV Vi sinh vật PDA Potatoes dextrose Agar OD Optical density (mật độ quang) NXB Nhà xuất DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc khơng gian α-Amylase Hình 1.2 Sự phát triển sợi nấm Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng aspergillus Hình 1.4 Một số hình ảnh bào tử nấm sợi chủng Aspergillus Hình 3.1: Hình ảnh chủng nấm sợi phân lập làm Hình 3.2: Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột chủng nấm sợi phân lập từ đất trồng sắn xác định phương pháp khuếch tán mơi trường thạch Hình 3.3: Lên men lỏng tạo giống sau ngày khác ni 28oC Hình 3.4: Đặc điểm hình dạng bào tử, sợi nấm chủng P0 môi trường lên men lỏng quan sát kính hiển vi quang học Hình 3.5: Lên men xốp sinh tổng hợp enzyme chủng P0, 28oC, sau ngày Hình 6.1: Sự tương quan giá trị ∆OD 540nm nồng độ glucose (µg/ml) Hình 6.2: Sự tương quan giá trị ∆OD 540nm nồng độ maltose (µg/ml) DANH MỤC BẢNG – ĐỒ THỊ Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose Bảng 2.2 : Xây dựng đường chuẩn Maltose Bảng 2.3: Xác định hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột Bảng 2.4: Danh mục thiết bị sử dụng thí nghiệm Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng nấm sợi phân lập Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột đĩa môi trường thạch Bảng 6.1: Đường chuẩn glucose 0.1% Bảng 6.2: Đường chuẩn maltose 0.1% Bảng 6.3: Độ ẩm chất 15% Bảng 6.4: Độ ẩm chất 20% Bảng 6.5: Độ ẩm chất 25% Bảng 6.6: Tuổi giống ngày Bảng 6.7: Tuổi giống ngày Bảng 6.8: Tuổi giống ngày Bảng 6.9: Sau ngày lên men xốp Bảng 6.10: Sau ngày lên men xốp Bảng 6.11: Sau ngày lên men xốp Bảng 6.12: Sau ngày lên men xốp Bảng 6.13: Bổ sung 10% giống Bảng 6.14: Bổ sung 15% giống Bảng 6.15: Bổ sung 20% giống Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng độ ẩm chất đến khả sinh enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng tuổi giống đến khả sinh enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng thời gian lên men xốp đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung giống vào môi trường lên men xốp đến khả sinh tổng hợp sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 GIỚI THIỆU CHUNG Tinh bột, với protein chất béo thành phần quan trọng bậc chế độ dinh dưỡng loài người nhiều loài động vật khác Người La Mã gọi amilum, từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon) Trong q trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose chất tạo nên nguồn lượng thực phẩm Ngồi tinh bột cịn giữ vai trị quan trọng cơng nghiệp thực phẩm tính chất hóa lý chúng Tinh bột thường dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho thực phẩm dạng lỏng, tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, yếu tố kết dính làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm Bên cạnh đó, tinh bột cịn dùng ngành cơng nghiệp khác sản xuất giấy, rượu, Nhiều nước giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngơ (sắn), cịn riêng nước ta sử dụng gạo khoai mì nguồn tinh bột chủ yếu Trong chế biến tinh bột đường, công đoạn quan trọng thuỷ phân tinh bột đường đơn giản Sau đó, chủ yếu sở đường đơn nhờ lên men, người ta nhận nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước người ta hay dùng acid H2SO4 để thủy phân tinh bột Nhưng kết cho thấy, thuỷ phân acid khó kiểm sốt thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm giá thành lại cao Cho nên để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Amylase thu nhận từ thực vật loại vi sinh vật [1, 2] Ngoài ra, Amylase cịn có nhiều ưu điểm sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho q trình tinh dịch đường Nguồn Amylase lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch (malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong Amylase thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng sản xuất bia Nguyên liệu cho sản xuất enzyme thường gạo, bắp, khoai mì,… nguồn nguyên liệu rẻ tiền tìm thấy dễ dàng nước ta Cho nên lợi hướng phát triển mạnh làm sở cho nhiều ngành khác phát triển [1] Việt Nam nước có nguồn tinh bột phụ phẩm nơng nghiệp chứa hàm lượng tinh bột dồi điều kiện thuận lợi cho công nghiệp amylase phát triển Tuy nhiên, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chế phẩm amylase từ vi sinh vật nấm sợi Việc sản xuất amylase từ nấm sợi có nhiều ưu việt rút ngắn trình sản xuất, tận dụng nguồn ngun liệu, phế phẩm nơng nghiệp góp phần giảm nhiễm mơi trường, enzyme có hoạt tính cao giảm giá thành sản phẩm… so với enzyme có nguồn gốc từ ithực vật động vật [3] Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận α-amylase, α-glucoamylase từ nấm sợi, mong muốn thu nhận enzyme hoạt tính cao thủy phân tinh bột sống bao gồm enzyme quan trọng α-amylase α-glucoamylase, tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả thủy phân tinh bột sống số chủng nấm sợi phân lập từ đất trồng sắn ” PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME, α-AMYLASE, α-GLUCO-AMYLASE 1.1.1: Enzyme: a) Enzyme: Trong thể sống (các tế bào) luôn xảy trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng cịn tồn Q trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học phức tạp khác Các phản ứng có liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống[4] Enzyme có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme cịn gọi chất xúc tác sinh học nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học[4] Chúng chất xúc tác sinh học khơng có vai trị quan trọng q trình sinh trưởng, phát triển sinh vật mà cịn giữ vai trị quan trọng công nghệ chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, cơng nghệ gen bảo vệ mội trường[5] b) Amylase Amylase tên gọi nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trongpolysaccharide (tinh bột) dextrin cuối Cơ chất tác dụng amylase tinh bột glycogen Sản phẩm tạo thành trình thủy phân glucose, maltose dextrin [6, 7] Amylase loại enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm c) Lịch sử phát 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ từ 400C – 600C Năm 1833, Payen Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu kết tủa có khả phân giải tinh bột thành đường, đặt tên Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa phân giải, Amylase) Sau theo đề nghị Duclo, Enzyme phân giải tinh bột gọi Amylase Năm 1851: Leuchs phát nước bọt có khả phân giải tinh bột thành đường Sau đó, Amylase nước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn bắt đầu quan tâm nghiên cứu Năm 1862, Danilevxki tách Amylase tuyến tụy phương pháp hấp thụ chọn lọc Năm 1949, Schwimmer xác định số chu chuyển α-Amylase 19000 Năm 1950, Englard Singer cho biết số chu chuyển β-Amylase 250000 Đến năm 1952, người ta thu 72 enzyme trạng thái kết tinh có α-Amylase Năm 1971, Uxtinilov cộng phương pháp điện di gel poliacrylamid xác định có mặt lượng lớn α-Amylase glucoamylase canh trường nấm mốc lượng nhỏ phân đoạn có hoạt lực dextrinase transglucosilase Hiện nước giới sản xuất hàng trăm chế phẩm enzyme, Nhật nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển, đặc biệt hãng Novo Đan Mạch hãng sản xuất enzyme tiếng giới Bên cạnh năm gần nước Đơng Âu Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu sản xuất enzyme.[8] Nếu Tây Âu mạch nha từ lúa mạch nguồn enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, Viễn Đơng Amylase thường sản xuất từ nấm mốc môi trường ni cấy loại ngũ cốc có chứa tinh bột Như hãng Novo có nhiều chế phẩm Amylase sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy…[8] a b c Hình 3.2 Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột chủng nấm sợi phân lập từ đất trồng sắn xác định phương pháp khuếch tán môi trường thạch a Chủng D1, D5, D7, D10, D13, P0 b Chủng D2, D3, D4, D6 c Chủng D9, D11, D8, P0, D12, A13 (Đối chứng) Kết cho thấy, số lượng chủng nấm sợi đất trồng sắn Bắc Ninh - Bắc Giang với khả sinh enzyme amylase không đồng Do điều kiện thời gian hạn hẹp, số lượng mẫu đất nghiên cứu cịn ít, số lượng chủng nấm phân lập từ đất trồng sắn Bắc Ninh Bắc Giang có khả sinh enzyme thủy phân tinh bột chưa nhiều Chúng tiếp tục công việc thời gian sau 3.2: XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN XỐP ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHỦNG P0 3.2.1 Ảnh hưởng độ ẩm: Độ ẩm yếu tố có ảnh hưởng quan trọng lên men xốp sinh tổng hợp enzyme thủy phân carbon-hydrate từ nấm sợi [1] Nếu môi trường nuôi cấy khô kìm hãm sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme nấm sợi Ngược lại, độ ẩm cao gây ức chế sinh trưởng nấm sợi làm giảm độ thống khí, giảm lưu thơng oxi mơi trường dẫn đến giảm khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột 30 Thí nghiệm nhằm mục đích xác định độ ẩm tốt để lên men xốp Chúng tiến hành khảo sát độ ẩm chất khác (15, 20 25%) Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng độ ẩm chất đến khả sinh enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Từ số liệu nghiên cứu cho thấy, độ ẩm chất 20% nấm sợi phát triển tốt so với độ ẩm chất 15% 25% Khi độ ẩm chất 15%, hạt chất cịn khơ chưa hút đủ nước, hàm lượng nước hoạt động thấp, làm kìm hãm phát triển thể sợi, làm giảm sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột nấm sợi Ở độ ẩm 25% làm cho chất dính hạt chất bết dính lại với q nhiều nước, hàm lượng nước hoạt động (activity water: Aw) nhiều, độ xốp giảm giảm lưu thông O2 từ bên ngồi vào mơi trường lên men, sinh trưởng phát triển nấm bị chậm lại, làm giảm khả sinh enzyme thủy phân tinh bột Môi trường chất 20%, hạt chất hút ẩm vừa đủ tạo diện tích bề mặt tối đa, tạo độ tơi xốp hợp lí, điều kiện cho nấm sợi tiếp xúc với chất lấy dinh dưỡng dễ dàng để phát triển, oxi lưu thông chất dễ hơn[11] Như vậy, để chủng P0 sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột cao độ ẩm 20% mơi trường lên men xốp hợp lí Độ ẩm loại chất có 31 khác nhau, khả sinh enzyme thủy phân tinh bột phụ thuộc vào độ ẩm chất chủng nấm [15] 3.2.2 Ảnh hưởng tuổi giống: Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian lên men lỏng để thu nhận giống tốt trình nuôi cấy giống thực môi trường lên men xốp Chúng tiến hành khảo sát tuổi giống thời điểm nuôi lắc, ngày, ngày, ngày, nuôi lắc 200 vồng/phút 28oC a b c d Hình 3.3 Lên men lỏng tạo giống sau ngày khác nuôi 28oC a Tuổi giống ngày c Tuổi giống ngày b Tuổi giống ngày d Tuổi giống ngày a b c Hình 3.4 Đặc điểm hình dạng bào tử, sợi nấm chủng P0 môi trường lên men lỏng quan sát kính hiển vi quang học a Tuổi giống ngày b Tuổi giống ngày 32 c Tuổi giống ngày Môi trường xốp sản xuất enzyme cấy giống nấm (với tuổi giống khác nhau) với tỷ lệ 10% giống/cơ chất cấp ẩm, lên men tĩnh 26-28oC a b c d Hình 3.5 Lên men xốp sinh tổng hợp enzyme chủng P0, 28oC, sau ngày a Tuổi giống ngày c Tuổi giống ngày b Tuổi giống ngày d Tuổi giống ngày 33 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng tuổi giống đến khả sinh enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Từ kết nghiên cứu cho thấy, với tuổi giống ngày, sau lên men xốp, nấm sinh trưởng phát triển tốt Ở giai đợn tuổi giống ngày, lượng bào tử nấm sinh lớn nhất, cho khả phát triển vs sinh tổng hợp enzyme nấm sợi tốt Giai đoạn tuổi giống 1-2 ngày, cấy vào môi trường xốp, cho sinh trưởng phát triển kém, hoạt tính enzyme thấp Với tuổi giống ngày, nấm mọc môi trường xốp nhiều tuổi giống ngày ngày so với tuổi giống ngày Do tuổi giống ngày, nấm chuyển sang hệ sợi, bào tử dần 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian lên men xốp: Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian ni cấy để thu nhận enzyme thủy phân tinh bột có hoạt độ cao Hoạt tính enzyme phụ thuộc lớn vào phát triển tế bào nấm sợi nên thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme nhân tố quan trọng định hoạt tính enzyme cao hay thấp Đánh giá ảnh hưởng thời gian lên men xốp đến khả sinh tổng hợp hai loại amylase chủng P0 với độ ẩm tối ưu 20% tuổi giống tối ưu ngày, 28-300C Thu enzyme thô sau 4, 5, 6, ngày lên men để tiến hành xác định hoạt tính thời gian lên men xốp tốt 34 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng thời gian lên men xốp đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Kết cho thấy, chủng P0 có hoạt độ α-amylase tăng dần từ 4-5 ngày, sau đạt cực đại ngày giảm dần từ 6-7 ngày Khi thời gian ủ dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng, nấm phát triển kém, hoạt tính enzyme giảm Kết phù hợp với nghiên [26, 27] Aspergillus niger, trình sinh tổng hợp enzyme nhiều thường kết thúc nấm bắt đầu sinh đính bào tử 3.2.4 Ảnh hưởng tỷ lên giống bổ sung vào môi trường lên men xốp Nhằm mục đích xác định tỷ lệ bổ sung giống vào mơi trường lên men xốp để thu nhận enzyme thủy phân tinh bột có hoạt độ cao Để xác định, tiến hành khảo sát bổ sung giống vịa mơi trường xốp thep tỷ lệ 10%, 15%, 20% Kết thu thể qua biểu đồ 3.4 35 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung giống vào môi trường lên men xốp đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột chủng P0 Qua biểu đồ nhận thấy, bổ sung giống với tỷ lệ 15% so với lượng chất môi trường, chủng nấm P0 cho khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao với hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột cao Với tỷ lệ giống bổ xung vào lớn hay nhỏ 15% hoạt độ enzyme giảm Như vậy, để chủng nấm P0 sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột có hoạt tính tốt lượng giống bổ sung vào 15% 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1: KẾT LUẬN Từ mẫu đất tỉnh Bắc Giang Bắc Ninh, phân lập đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột 14 chủng nấm sợi (kí hiệu là: D1, D2, D3, D4, D5, d6, D7, D8, D9, D10, D11, D12, D13, P0) Đã chọn chủng nấm P0 có khả sinh α –amylase (hoạt độ 1075514 U/g) α –glucoamylase (hoạt độ 193115 U/g) cao chủng lại Đã xác định số điều kiện lên men xốp phù hợp chủng nấm P0 để khả sinh tổng hợp enzyme tốt với α -amylase (hoạt độ 5925.38 KU/g) α - glucoamylase (hoạt độ 5139.78 KU/g) , điều kiện lên men như: Độ ẩm chất 20% (w/w), tuổi giống nấm ngày, tỷ lệ bổ sung giống 15%, thời gian lên men xốp ngày, nhiệt độ lên men 26280C 4.2:KIẾN NGHỊ Chúng cho chủng P0 chủng nấm sợi có phẩm chất đặc biết hẳn hầu hết chủng nấm sợi tuyển chọn khảo sát Chủng cần bảo quản tiếp tục sâu nghiên Nghiên cứu hỗ trợ phần kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu hồn thiện qui trình sản xuất chế phẩm sinh học chứa đa enzyme probiotic để ứng dụng chế biến thức ăn chăn nuôi từ bã thải chế biến tinh bột” Mã số: 01C-06/012015-2, Cấp Sở KH CN Hà Nội, 2015-2016, TS Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ái, B., Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm NXB Khoa học kỹ thuật Tp.HCM, 2003 Lượng, N.Đ., Công nghệ vi sinh - tập 2: Vi sinh vật Công nghiệp NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 2008 Nguyễn Thị Lan Hương, “Tuyển chọn khảo sát khả sinh amylase số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần Tp Hồ Chí Minh” Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Tp Hồ Chí Minh, 2009 trang: 8-39, 40-45 Hai, Đ.Q., Giáo trình cơng nghệ ứng dụng enzyme Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzym, NXB Đại học Quốc gia TpHCM, 2006,: p 288308,410-414 Đoàn Văn Thược, Tuyển chọn nghiên cứu số chủng vi sinh vật có khả sinh amylaza bã sắn phế thải để sản xuất enzim cho chăn nuôi gia súc Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 2005 FuJi M., K.Y., Action of α - amylase and glucoamylase on hydrolysis of starch.Biotechnol Bioeng.,, 1985, 27 http://vietsciences.free.fr/ http://www.biotopics.co.uk/ 10 http://www.google.com.vn/ 11 http://www.Enzymessentials.com 12 Phạm Thị Trân Châu, P.T.N., Công nghệ sinh học, tập ba, enzyme ứng dụng , NXB Giáo dục., (2007), 13 www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf 14 Phẩm, L.Đ., Nấm men công nghiệp NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2006 15 giả, N.Đ.L.v.m.s.t., Công nghệ enzym NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004 16 Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2004 17 Thu, Đ.T.T., Sinh hóa ứng dụng NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 2003: p 210-218 18 Phạm Thị Trân Châu, P.T.N., Công nghệ sinh học, tập ba, enzyme ứng dụng NXB Giáo dục, 2007 19 Nguyễn Thành Đạt, M.T.H., Sinh học vi sinh vật NXB Giáo dục Hà Nội, 2000 38 20 Bùi Xuân Đồng, Những vấn đề sinh học Tập 2: Một số vấn đề nấm học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội., 1977, 21 Khưu Phương Yến Anh, Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ ngập mặn Cần Giờ Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm TpHCM, 2007, 22 giả, N.L.D.v.c.t., Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 1979(Tập 2, 3) 23 Đồng, B.X., Những vấn đề sinh học Tập 2: Một số vấn đề nấm học NXB Khoa học kỹ thuật Tp.HCM, 1977 24 UNDP/UNESCO, Regional Mangroves Project RAS/86/1998 New Delhi, June 1988, 25 Vân, P.H., PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học chi nhánh Tp HCM, 2009 26 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2004 trang: 228-308, 410-414 27 Trần Thanh Trúc, "Phân lập tuyển chọn số dòng Aspergillus Niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao" Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, 2013 39 PHỤ LỤC Đồ thị đường chuẩn glucose để xác định hoạt độ α-amylase theo phương pháp so màu với thuốc DNS (Miller, 1959) Thứ tự Nồng độ glucose (µM) 1111.1 2222.2 3333.3 4444.4 5555.6 OD o.258 0.33 0.467 0.55 0.638 0.79 Delta OD 0.072 0.209 0.292 0.38 0.532 Bảng 6.1 đường chuẩn glucose 0.1% Hình 6.1: Sự tương quan giá trị ∆OD 540nm nồng độ glucose (µg/ml) Đồ thị đường chuẩn Maltose để xác định hoạt độ glucoamylase theo phương pháp so màu với thuốc DNS (Miller, 1959) Thứ tự Nồng độ maltose (µM) 584.80 1169.59 1754.39 2339.18 2923.98 OD 0.2253 0.277 0.324 0.358 0.402 Delta OD 0.018 0.042 0.089 0.123 0.167 Bảng 6.2 Đường chuẩn Maltose 0.1% 40 Hình 6.2: tương quan giá trị ∆OD 540nm nồng độ maltose (µg/ml) Ảnh hưởng độ ẩm chất đến hoạt độ enzyme chủng nấm P0 Bảng 6.3: Độ ẩm chất 15%: Độ pha Test ∆OD loãng (lần) 10 0.533 0.799 100 0.3773 0.601 500 0.313 0.537 1000 0.235 0.461 2000 0.234 0.493 Trung bình Bảng 6.4: Độ ẩm chất 20% Test Độ pha ∆OD loãng (lần) 10 0.707 1.102 100 0.697 0.953 500 0.664 0.914 1000 0.486 0.736 2000 0.485 0.735 Trung bình Blank α-amylase (KU/g) glucoamylase (KU/g) 0.266 0.223 0.224 0.226 0.259 152.05 1088.05 4547.22 216927.77 13800 5303.02 134.95 700.83 2164.58 1079.16 2075 1230.91 Balnk α-amylase (KU/g) 200.38 1976.11 9422.22 13900 27744.44 10648.63 glucoamylase (KU/g) 207.45 2032.91 9477.08 11537.50 22991.67 9249.32 0.395 0.256 0.25 0.25 0.25 41 Bảng 6.5: Độ ẩm chất 25% Độ pha Test ∆OD loãng (lần) 10 0.676 0.975 100 0.586 0.812 500 0.516 0.744 1000 0.400 0.631 2000 0.249 0.479 Trung bình Blank α-amylase (KU/g) glucoamylase (KU/g) 0.281 0.226 0.228 0.231 0.230 191.77 1667.77 7366.66 11511.11 14633.33 7074.13 194.54 1570.41 6393.75 7954.16 3325 3887.57 Ảnh hưởng tuổi giống đến hoạt độ chủng nấm P0 Bảng 6.6: Tuổi giống ngày Độ pha Test Blank α-amylase ∆OD loãng (lần) (KU/g) 10 1.11 100 0.985 500 0.476 Trung bình Bảng 6.7: Tuổi giống ngày Độ pha Test ∆OD loãng (lần) 10 0.918 100 0.732 500 0.604 Trung bình Blank α-amylase (KU/g) 0.275 259 0.21 2073.33 0.23 8588.88 2730.30 1.193 0.942 0.834 Bảng 6.8: Tuổi giống ngày Độ pha Test ∆OD loãng (lần) 10 0.558 100 0.597 500 0.47 Trung bình 0.258 312.33 0.251 2776.11 0.267 6811.11 2474.88 1.368 1.236 0.743 Blank 0.953 0.853 0.72 42 α-amylase (KU/g) 0.395 159 0.256 1698.33 0.25 6727.77 2146.27 glucoamylase (KU/g) 375.37 3232.91 5560.41 2292.17 glucoamylase (KU/g) 295.37 2178.75 8227.08 2675.30 glucoamylase (KU/g) 145.37 1616.25 5435.41 17999.20 Ảnh hưởng thời gian lên men xốp đến hoạt độ chủng nấm P0 Bảng 6.9: Sau ngày lên men xốp Độ pha Test Blank α-amylase glucoamylase ∆OD loãng (lần) (KU/g) (KU/g) 10 0.667 0.942 0.275 189.27 190.79 100 0.497 0.707 0.21 1420.55 1199.58 500 0.468 0.698 0.23 6700 5393.75 1000 0.363 0.593 0.23 10483.33 6412.5 Trung bình 4698.29 3299.15 Bảng 6.10: Sau ngày lên men xốp Test Độ pha ∆OD loãng (lần) α-amylase (KU/g) glucoamylase (KU/g) 200.38 1976.11 9422.22 13344.44 6235.79 207.45 2032.91 9477.08 10704.16 5605.40 Bảng 6.11: Sau ngày lên men xốp Độ pha Test Blank ∆OD loãng (lần) 10 0.953 1.193 0.24 100 0.703 0.168 0.871 500 0.628 0.834 0.206 1000 0.582 0.75 0.168 Trung bình α-amylase (KU/g) 268.22 1992.77 8922.22 16566.66 6937.59 glucoamylase (KU/g) 309.95 2057.91 8727.08 15537.50 6658.11 Bảng 6.12: Sau ngày lên men xốp Độ pha Test ∆OD loãng (lần) α-amylase (KU/g) glucoamylase (KU/g) 125.11 1012.22 4852.77 8900 3722.52 94.54 587.08 2622.91 4037.50 1835.51 10 100 500 1000 Trung bình 10 100 500 1000 Trung bình 0.707 0.697 0.664 0.466 0.436 0.350 0.335 0.306 Blank 1.102 0.953 0.914 0.716 0.395 0.256 0.25 0.25 Blank 0.66 0.562 0.546 0.517 43 0.224 0.212 0.211 0.211 Ảnh hưởng tỷ lệ giống bổ sung vào môi trường đến hoạt độ chủng nấm P0 Bảng 6.13: Bổ sung 10% giống Độ pha Test Blank α-amylase glucoamylase ∆OD loãng (lần) (KU/g) (KU/g) 10 0.758 0.948 100 0.654 0.844 500 0.476 0.681 1000 0.383 0.603 Trung bình Bảng 6.14: Bổ sung 15% giống Test Độ pha ∆OD loãng (lần) 10 1.127 1.327 100 0.743 0.963 500 0.583 0.769 1000 0.453 0.639 Trung bình Bảng 6.15: Bổ sung 20% giống Độ pha Test ∆OD loãng (lần) 10 100 500 1000 Trung bình 0.655 0.501 0.457 0.264 0.19 0.19 0.205 0.22 Blank 0.2 0.22 0.186 0.186 Blank 0.835 0.707 0.628 0.446 44 0.18 0.206 0.171 0.182 214.55 1856.66 6811.11 11038.88 4980.30 228.70 1853.75 5560.41 7245.83 3722.17 α-amylase (KU/g) 317.05 2103.88 8297.22 12983.33 5925.37 glucoamylase (KU/g) 382.45 2224.58 7789.58 10162.50 5139.78 α-amylase (KU/g) glucoamylase (KU/g) 185.94 1431.66 6547.22 7733.33 3974.54 185.79 1216.25 5164.58 2287.50 2213.53