Đề cương ôn tập Điện di và các phương pháp sắc ký

+ Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detector VR = tR.FCL = u.tR L= u.tM Với: FC là tốc độ thể tích dòng th

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP ĐIỆN DI VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Lớp D4 Học kỳ II Năm học 2017 – 2018

-* -

Câu 1: Các thông số sắc ký, các bài tập liên quan?

- Thời gian lưu (t R ): là thời gian từ lúc chất tan được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm

mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại

+ Có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

+ Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detector

V R = t R F C

L = u.t R (L= u.t M )

Với: FC là tốc độ thể tích dòng (thể tích pha động trên một đơn vị thời gian)

u là tốc độ tuyến tính trung bình của pha động/ chất tan + Thể tích lưu hiệu chỉnh hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh được cho bởi:

V’ R = V R – V M hoặc t’ R = t R - t M

+ Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

 Bản chất của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp của hạt nhồi

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

 pH của pha động, nồng độ chất tạo phức

- Hệ số phân bố (K): đặc trung cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha

tĩnh

K= 𝑪𝑺

𝑪𝑴

Với: CS, CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng

+ K càng lớn, sự di chuyển chất tan qua pha tĩnh càng chậm

+ Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách chất diễn ra càng dễ dàng hơn

- Hệ số dung lượng (k’): là đại lượng cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan phân

bố vào pha tĩnh và pha động

tR, tM là thời gian lưu của chất cần phân tích và chất không lưu giữ

Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1 ≤ 𝑘′ ≤ 5

- Hệ số chọn lọc (): đặc trưng cho tốc độ di chuyển của hai chất

 = 𝑡′𝑅𝐵

𝑡′𝑅𝐴 = 𝑘′𝐵

𝑘′𝐴 = 𝐾𝐵

𝐾𝐴

Theo quy ước, B là chất lưu giữ mạnh hơn A nên  luôn lớn hơn 1

Như vậy để tách riêng hai chất A và b thì  phải >1 (1,05- 2)

Câu 2: Lý thuyết đĩa và lý thuyết động học trong phân tách sắc ký

- Lý thuyết đĩa

o Mặc dù quá trình xảy ra trong cột là một quá trình xảy ra liên tục nhưng theo mô hình của Craig, ông cho rằng đó là những bước nối tiếp riêng biệt Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý thuyêt

o Có thể giả định cột sắc ký được chia thành N phần mỏng/ N lớp/ N đĩa tách Ở mỗi đĩa có sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng mới

o Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm chiều cao một đĩa lý thuyết Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cốt tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau

o Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và khoảng cách x mà nó di chuyển Tên gọi này là từ lý thuyết đĩa trong đó sự tách được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách

u là tốc độ dòng tuyến tính của pha động

A mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy do các dòng chảy không đều của pha động qua pha tĩnh, kích thước hạt pha tĩnh to và không đều thì A lớn dẫn đến sự doãng pic lớn

B/u mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc theo cột của chất tan trong pha động, B phụ thuộc vào kỹ thuật nhồi cột

C.u mô tả sự chuyển khối ( do ảnh hưởng của sự di chuyển không đều của chất tan trong lòng pha động, ở vùng tiếp giáp 2 pha và trong lòng pha tĩnh

* Khuếch tán xoáy: Hệ số khuếch tán xoáy A = 2.λ.dp

- Hệ số A độc lập với tốc độ dòng pha động khi đi qua pha tĩnh, nhưng đường kính của hạt nhồi dp và sự không đồng đều về kích cỡ có thể tạo ra dòng pha động có

những hướng khác nhau khi đi qua Đây là nguyên nhân gây ra sự doãng pic và ảnh hưởng đến sự phân bố giữa hai pha

- λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột

- Ảnh hưởng này thường xảy ra trong LC và không có trong GC với cột WCOT

* Khuếch tán dọc: Hệ số khuếch tán dọc theo cột B=2γ.D

- Hệ số khuếch tán dọc theo cột B mô tả sự khuếch tán dọc theo cột và song song với đường đi pha động

- Hệ số này ảnh hưởng lớn trong GC do chất tan khuếch tán mạnh trong pha khí

- B phụ thuộc vào γ biểu thị cho hệ số trở kháng của chất nhồi đến khuếch tán dọc và

D biểu thị sự khuếch tán chất tan trong pha động

- Thường γ có giá trị là 1 trong GC và 0.7 trong LC

- Sự truyền khối trong pha tĩnh:

o Nếu pha tĩnh là chất lỏng thị hệ số phụ thuộc vào bề dày lớp hấp phụ

o Nếu pha tĩnh là chất rắn thì nó phụ thuộc vào khả năng hấp phụ và giải hấp phụ chất tan xảy ra trên bề mặt

- Hệ số truyền khối trong pha động CM:

o Tỷ lệ nghịch với hệ số khuếch tán chất tan trong pha động DM

o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính hạt nhồi

o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính cột và tốc độ chảy của pha động

Câu 3: Ứng dụng của phương pháp sắc ký

- Phân tích định tính

o Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (sắc ký rửa giải) hoặc vị trí trên pha tĩnh (sắc ký khai triển) của chất phân tích cùng với điều kiện sắc ký là những thông tinh định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu

o Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp nhiều khó khăn Cho nên sắc ký thường dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ Mặc khác, định tính bằng sắc ký không cho kết quả dương tính chắc chắn Vì hai lý do trên, để định tính các chất trong hỗn hợp người ta kết hợp sắc ký – phổ IR hoặc sắc ký – khối phổ

o Sắc ký khẳng định đúng kết quả âm tính nên thường được dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu

- Phân tích định lượng

o Phương pháp chuẩn ngoại:

 Cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện

 So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

 Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm:

 Chuẩn hỏa một điểm Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử CX = CS.𝑆𝑋

𝑆𝑆

Với : CX, CS là nồng độ mẫu thử, chuẩn

SX (HX), SS (HS) là diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử, chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm

- Chuẩn bị một dãy chất chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định : Y = a + b.CX

Với Y là diện tích pic

a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b là độ dốc của đường chuẩn

CX là nồng độ của chất thử

o Phương pháp chuẩn nội:

 Chất chuẩn nội là chất được thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Tỷ

số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

 Yêu cầu của chất chuẩn nội:

 Chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

 Có cấu trúc hóa học tương tự như mẫu thử

 Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

 Phải có hệ số tinh khiết cao và dễ kiếm

Hệ số đáp ứng FX: mối tương quan giữa tỷ số khối lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số diện tích của hai pic:

Fx = 𝑚𝐶.𝑆𝐼𝑆

𝑀𝐼𝑆.𝑆𝐶 =𝐶𝐶.𝑆𝐼𝑆

𝐶𝐼𝑆.𝑆𝐶

Các sai số sẽ được cực tiểu hóa nếu hệ số FX xấp xỉ 1

- Phương pháp chuẩn một điểm:

o Chuẩn nội được thêm vào cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký

o Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:

mT = 𝑆𝑇

𝑆𝐼𝑆mIS.FX

CT = 𝑆𝑇

𝑆𝐼𝑆CIS.FX

- Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm:

Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một nồng độ chuẩn nội Sau khi sắc ký và thu được dữ kiện diện tích, tiến hành

vẽ đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic của chuẩn trên chuẩn nội (SS/SIS) với tỷ số nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (CS/CIS)

Câu 4: Các bước phân tích thực nghiệm và ứng dụng của HPTLC?

a) Các bước phân tích thực nghiệm:

 Lưu chọn bản mỏng: tùy thuộc chất phân tích

- Trên thị trường có các bản mỏng tráng sẵn với các chất hấp phụ đa dạng, phổ biến nhất là bản mỏng Silica gel 60F, Alumina, Cellulose…

- 80% các phép phân tích sử dụng bản mỏng Silicagel, có 2 loại:

+ Loại G: silica gel có thêm thạch cao CaSO4.1,5H2O

+ Loại F: có chỉ thị huỳnh quang

- Cellulose: phân tích amino acid, dipeptide, đường và các alkaloid

- Bản mỏng pha đảo RP2, RP8 và RP18: các chất không phân cực như các acid béo, carotenoid, cholesterol

- Bản mỏng kết hợp RPW F254s: phân tích các chất bảo quản, các barbiturat, thuốc giảm đau, phenothiazine

 Pre – washing bản mỏng:

- Để tránh ảnh hưởng của các tạp chất và hơi nước có thể có trong không khí sau khi

mở hộp và cất giữ trong thời gian dài, người ta khuyến cáo bản mỏng nên được làm sạch trước khi sử dụng Quá trình này gọi là pre- washing

- Pre-washing được thực hiện với các kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lên, nhúng, liên tục…

- Dung môi sử dụng thường là:

+ Chloroform: Methanol (1:1)

+ Methylene chloride: Methanol (1:1)

+ 1% amonia hoặc 1% acid acetic

Chuẩn bị mẫu phân tích

Đưa mẫu lên bảng mỏng

Khai triển sắc ký

Hoạt hóa bảng mỏng Phát hiện

Pre-washing Lựa chọn bảng mỏng

Quét và xử lý, lưu trữ

 Hoạt hóa bản mỏng:

- Bản mỏng trong hộp mới mở không cần hoạt hóa

- Bản mỏng đặt trong môi trường ẩm cao hoặc được cầm trên tay trong thời gian dài cần được hoạt hóa

- Đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 110-120℃ trong 30 phút

 Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử: nồng độ mẫu 0,1 – 1ug/ul

- Tránh ảnh hưởng của tạp chất và hơi nước

- Tỷ lệ S/N được cải thiện, đường nền càng thẳng thì LOD càng cao

- Thường dùng dung môi pha mẫu:

+ Methanol

+ Chloroform: Methanol (1:1)

+ Ethyl acetat: Methanol (1:1)

+ Methylene chloride: Methanol (1:1)

+ Chloroform: Methanol: Amoniac (90:10:1)

+ 1% amonia hoặc 1% acid acetic

 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:

- Chọn mẫu và thiết bị đưa mẫu lên bản mỏng phụ thuộc vào:

+ Thể tích mẫu

+ Số lượng mẫu( số vết chấm)

- Thể tích mẫu: 0.5-5µl (1 điểm) hoặc 10µl (theo dải)

- Chấm theo dải( áp dụng khi lượng mẫu lớn) cho kết quả phân tách tốt hơn, đáp ứng tốt khi phân tích cường độ

- Mẫu thường được đưa lên bằng thiết bị tự động/bán tự động qua các mao quản:

+ Thiết bị đưa mẫu bằng tay NANOMAT: dùng mao quản chính xác để đưa mẫu + Thiết bị đưa mẫu bán tự động LINOMAT:

 Thích hợp trong phân tích các mẫu thường quy

 Việc thay đổi mẫu cần có thao tác của con người

 Mẫu được phun lên bản mỏng dưới dạng băng hẹp (dạng dải) dưới tác dụng của khí N2

 Dung môi của mẫu bốc hơi gần như hoàn toàn, tập trung mẫu thành một dải hẹp dài

+ Thiết bị đưa mẫu tự động ATS4:

 Mẫu được đưa lên tự động dưới dạng chấm hoặc dải băng hẹp hoặc dạng chữ nhật bằng kỹ thuật phun dưới dòng khí N2

 Mẫu đưa lên dưới dạng hình chữ nhật cho phép đưa một thể tích mẫu lớn lên bản mỏng mà vẫn đảm bảo độ phân tách

 Lựa chọn pha động:

- Nguyên tắc: Thử- Lỗi- Thử

- SK pha thuận:

+ Pha động không phân cực, pha tĩnh phân cực

+ Chất không phân cực di chuyển nhanh hơn

- SK pha đảo:

+ Pha động phân cực, pha tĩnh không phân cực

+ Chất phân cực di chuyển nhanh hơn

- Tránh sử dụng hệ pha động chứa nhiều dung môi (3-4)

- Pha động đã sử dụng một lần nên tránh sử dụng lại

 Khai triển sắc ký:

- Bão hòa dung môi:

+ Buồng sắc ký không được bão hòa dung môi làm cho giá trị Rf cao hơn

+ Sử dụng giấy kéo dung môi lên phân bố hơi dung môi trong buồng

+ giảm giá trị Rf

- Khai triển sắc ký bằng thiết bị tự động:

+ Quá trình bão hòa dung môi, theo dõi quá trình khai triển và sấy khô bản mỏng được cài đặt và tiến hành hoàn toàn tự động

+ Khai triển đẳng dòng (ADC), khai triển gradient (AMD)

 Phát hiện vết:

- Phát hiện dưới đèn UV: 254nm hoặc 366nm, quan sát được các chất không bắt huỳnh quang và bên dưới UV (sử dụng silicagel GF)

- Bình phun sắc ký, buồng phun và thiết bị phun sấy bản mỏng

 Định lượng và lưu dữ liệu:

- Bản mỏng được quét trên dải bước sóng UV được chọn và tín hiệu các vết được chuyển thành dưới dạng pic

- Thiết bị chuyển thông tin các dải băng về dạng pic, các thông số diện tích/ chiều cao pic tỷ lệ với nồng độ

- Thiết bị video scan hoạt động theo 2 kiểu: đo độ truyền qua hoặc đo độ tán xạ

- Ứng dung trên lâm sàng: nghiên cứu chuyển hóa, sàng lọc thuốc, ngộ độc,…

- Kiểm soát thuốc giả…

- Phân tích dữ liệu: kiểm soát chất lượng dược liệu, phân lập chất trong dược liệu, fingerprint, xác định thành phần trong chế phẩm đông dược:

+ Xác định dấu vân tay dược liệu:

 Vấn đề: dữ liệu thu hái từ nhiều địa phương, thời vụ, nhầm lẫn loài, chi, dữ liệu giả

 Kỹ thuật dấu vân tay: ghi các thông tin hóa học của dược liệu và chế phẩm với các sắc ký đồ, phổ và đồ thị khác bằng các kỹ thuật phân tích hóa học

 Có nhiều phương pháp ghi nhận dấu vân tay: sắc ký, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ…

+ Đánh giá chất lượng dược liệu

+ Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu thuốc:

 Tầm quan trọng: độ ổn định, độc tính

 HPTLC là một trong những PP giúp đánh giá tạp chất trong nguyên liệu

Câu 5: So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao với sắc khí lớp mỏng và sắc khí lỏng hiệu năng cao?

So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao và sắc khí lỏng hiệu năng cao

Tạo dẫn xuất sau phân

Yêu cầu độ sạch của mẫu Không quá khắt khe Rất quan trọng

So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao và sắc khí lớp mỏng

Thời gian phân tách Giảm quảng đường di

chuyển nên giảm thời gian phân tích

Thể tích mẫu lớn Chấm dạng băng dài Gây hiệ tượng quá tải

Số vết chấm tối đa trên

một bản mỏng

Chế độ quét UV – Vis/huỳnh quang Không

định lượng

Định tính

CÂU 6: CẤU TẠO, NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA HPLC:

Cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC:

- Hệ thống cung cấp pha động ( dung môi pha động)

 Bình chứa dung môi:

- Bình chứa dung môi là bình thủy tinh không màu, trung tính, có thể tích từ 100 – 2000 ml, kín ( tránh bay hơi dung môi)

 Dung môi pha động:

- Yêu cầu của dung môi pha động:

+ Tinh khiết + Trơ về mặt hóa học + Giá thành thấp

+ Tương thích với detector + Hòa tan mẫu phân tích

- Dung môi bơm vào phải không được chứa các bụi bẩn hoặc những vật lạ, bởi vì điều này có thể làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của bơm và làm kẹt cột tách

 Vì vậy, cần phải lọc dung môi qua màng lọc 0,45 hoặc 0,22 𝝁m Các loại màng lọc như: + Nước: màng lọc cellulose nitrat, cellulose acetat

+ Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon

+ Hỗn hợp DMHC và nước: màng lọc RC, polyamid hay nylon

- Cần phải loại bỏ hoặc đuổi khí hòa tan hay các bọt khí trong dung môi vì khí hòa tan

có thể làm biến dạng pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền Ta có thể loại khí ngay

trong bình chứa dung môi ( siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm

+ Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung môi

+ Sục khí trơ ( helium): đuổi khí hòa tan khỏi dung môi

+ Khử ngay trên dòng ( online membrane degassing)

- pH của dung môi pha động:

+ Trong phân tích dược, nhiều trường hợp cần điều chỉnh pH pha động bằng đệm pH + Thường sử dụng: đệm phosphat, perchlorate, sulfat, Một số acid mạnh như: TCA ( trichloroacetate acid), TFA ( trifloroacetate acid)

+ Ảnh hưởng đến độ phân tách và độ chọn lọc của peak

 Phương pháp rửa giải:

- Có 2 cách rửa giải:

+ Đẳng dòng: Không thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải

+ Gradient: Tỷ lệ thành phần pha động thay đổi trong quá trình rửa giải

- Ưu điểm của rửa giải gradient:

+ Rút ngắn thời gian phân tích

+ Giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện hình dạng pic

+ Tăng độ nhạy phân tích

2 HỆ THỐNG BƠM:

 Chức năng:

- Chức năng của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định

 Bơm cần đáp ứng một số yêu cầu khá cao về tính năng như sau:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

- Bền với dung môi pha động

- Tốc độ dòng có một khoảng rộng để chọn lựa và dễ thay đổi tốc độ dòng

- Dễ thay đổi từ việc sử dụng dung môi này đến loại dung môi khác

- Dễ bảo dưỡng và sửa chữa

 Một số loại bơm thông dụng:

- Lưu lượng không đổi

- Áp suất hằng định

- Thể tích không giới hạn

- Cột luôn có áp suất

không đổi

- Hai bơm nối đầu

- Chung đường pha động

và đường đến cột

- Lấy đồng thời 4 dung môi từ 4 kênh riêng

- Rửa giải gradient

- Tiết kiệm dung môi

3 BỘ PHẬN TIÊM MẪU:

 Sử dụng vòng tiêm mẫu:

- Vòng tiêm mẫu hay được sử dụng và có thể tự động hóa

- Cho phép đưa mẫu vào cột bằng van bơm với thể tích xác định

- Van bơm có thể hoạt động dưới áp suất cao

- Vòng chứa mẫu có thể tích nhất định nên thể tích mẫu đưa vào cột lúc nào cũng hằng định

- Lượng mẫu bơm vào vòng tiêm mẫu thường nhiều hơn thể tích của vòng tiêm mẫu ( 10 –

4 CỘT SẮC KÝ, PHA TĨNH:

 Đặc điểm của cột sắc ký:

- Cột HPLC thường làm bằng thép không gỷ hay thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo

- Chiều dài: 10 – 25 cm

- Đường kính trong: 4 – 10 mm

- Cỡ hạt pha tĩnh: 3 – 10 mcm

- Số đĩa lý thuyết: N = 40,000 – 60,000 đĩa/m

Gần đây, người ta có loại Cột nhỏ - microcolumn: chiều dài 3 – 7,5 cm, đường kính trong 1 – 2 mm, cỡ hạt 1,5 – 5 mcm, N = 100,000 đĩa/m Ưu điểm nổi bật của chúng là tiết kiệm dung môi và rút ngắn thời gian sắc ký

 Chất nhồi cột sắc ký:

- Silica ( sillic dioxide) kết tụ thành silicagel

- Silicagel được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt

- Ngoài ra còn có các chất nhồi khác: Nhôm oxyd, hạt polyme xốp, hạt nhựa trao đổi ion

- Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột

- Được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy không làm doãng pic

- Cột bảo vệ được nhổi đầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong cột phân tích

 Hạt pha tĩnh trong pha liên kết:

- Pha tĩnh được chế tạo từ silica ( silic dioxyde) Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫn chất clorosilane tạo ra dẫn chất siloxan Liên kết siloxan bền ở pH 2-7

- Gốc R trong dẫn xuất siloxan quyết định tính phân cực của pha tĩnh và loại hình sắc ký là

pha đảo hay pha thuận:

 Sắc ký pha đảo:

+ Pha tĩnh không phân cực: R = C8, C18, phenyl

+ Pha động tương đối phân cực: Nước, MeOH, MeCN

+ Sắc ký pha đảo được sử dụng rộng rãi vì cho kết quả phân tách tốt với nhiều đối tượng ( 75% khối lượng sắc ký)

+ Trong sắc ký pha đảo, chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu tăng lên

 Sắc ký pha thuận:

+ Pha tĩnh phân cực: R = cyano, amino, diol

+ Pha động ít phân cực: Ethyl ether, cloroform, n-hexan

+ Trong sắc ký pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần

5 DETECTOR:

 Chức năng:

- Chức năng của detector là phát hiện pha động đi ra từ cột phân tích Tín hiệu ra của detector

là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu

 Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC:

 Detector đo ở bước sóng cố định:

- Nguồn sáng là đèn thủy ngân và đèn Vonfram cùng với kính lọc để chọn một số bước sóng như 254 nm, 280 nm, 334 nm và 436nm

- Nhược điểm của detetor này là kém linh hoạt nhưng rẻ tiền

 Detector đo ở bước sóng thay đổi:

- Có thể đo ở bất kỳ bước sóng nào trong vùng UV – VIS, cho phép lựa chọn bước sóng có đáp ứng tối ưu của detector đối với chất phân tích

- Hệ thống tạo bước sóng đơn sắc bao gồm nguồn sáng đèn D2 và đèn Vonfram cùng thiết

bị đơn sắc hóa để chọn bước sóng

 Detector mảng diod ( DAD hay PDA):

- Cấu tạo: Có một hoặc hai mảng diod để nhận ra bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch

bằng laser

- Nguyên tắc: Chùm sáng đa sắc được cho đi qua mẫu, sau đó hội tụ vào khe của bộ phận

đơn sắc hóa để tách chùm tia đơn sắc cần đo hướng vào bộ dò tìm Để đo mật độ quang tại những bước sóng khác nhau, bước sóng được thay đổi nhờ quay chậm lăng kính hoặc bộ cách tử trong bộ đơn sắc hóa

- Ưu điểm:

+ Cung cấp phổ UV – VIS của chất phân tích trong bước sóng đã chọn

+ Kiểm tra tính tinh khiết của sản phẩm và định danh sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước + Phát hiện đồng thời được chất phân tích ở nhiều bước sóng khác nhau, giúp cho việc xác định được bước song hấp thụ cực đại của một chất, cũng như phát hiện các tạp chất và các chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn, không đặc trưng

+ Cung cấp sắc ký đồ 3 chiều giúp cho việc chọn điều kiện thích hợp để định lượng cũng như định danh các mẫu phân tích

+ Thích hợp cho việc định lượng đồng thời nhiều thành phần

- Nhược điểm:

+ Độ nhạy kém hơn detector UV – VIS đo ở bước sóng thay đổi

5.2 Detector huỳnh quang:

- Ưu điểm:

+ Chọn lọc hơn và nhạy hơn detector UV

+ Đáp ứng với các chất phát huỳnh quang

+ Có thể tạo dẫn chất phát huỳnh quang với những chất không phát huỳnh quang ( trước hoặc sau cột)

+ Tương thích với rửa giải gradient

- Nhược điểm:

+ Không phát hiện được chất không phát huỳnh quang

+ Bị ảnh hưởng lớn của môi trường: dung môi, pH, nhiệt độ, độ nhớt, lực ion, khí hòa tan

5.3 Detector chỉ số khúc xạ ( RID):

- Nguyên tắc: Hoạt động của detector theo nguyên lí đo vi sai Tín hiệu đo là sự khác

nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và của pha động hòa tan chất phân tích

- Ưu nhược điểm:

+ Đây là detector vạn năng đáp ứng với hầu hết các chất phân tích nhưng độ nhạy kém hơn detector hấp thụ UV có thể đến 1000 lần

+ Detector khúc xạ rất nhạy với nhiệt độ và khó sử dụng cho rửa giải gradient vì khó so sánh trị số khúc xạ của mẫu và pha động khi thành phần pha động thay đổi

+ Detector kém nhạy, có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử dụng bị hạn chế

5.4 Detector tán xạ bay hơi ( ELSD):

- Nguyên tắc: Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu detector được trộn với khí nito ở trong

bộ phận phun sương Hỗn hợp đi qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích thước đều nhau Ở đây dung môi được bay hơi khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm laser Chùm tia laser bị tán xạ bởi các hạt rắn được phát hiện nhờ ống nhân quang

- Đáp ứng của detector liên quan đến khối lượng của chất phân tích, nghĩa là diện tích pic sắc ký tỷ lệ thuận với khối lượng

- Ưu, nhược điểm:

+ Đây là detector vạn năng đáp ứng với bất kì chất phân tích nào kém bay hơi hơn so với pha động của sắc ký lỏng

+ Khác so với detector khúc xạ: thích hợp với chế độ rửa giải gradient Khác với detector UV: độc lập với độ hấp thụ UV và nhóm chức

5.5 Detector điện hóa:

2 Huỳnh quang 10^-9 Đặc biệt rất nhạy, chọn lọc Dùng được

3 Chỉ số khúc xạ 5.10^-4 Vạn năng, độ nhạy vừa phải

Thay đổi nhiều theo nhiệt độ

Không dùng được

4 Tán xạ bay hơi 2.10^-4 Vạn năng, độ nhạy vừa phải

Đáp ứng với khối lượng

- Có thay đổi theo nhiệt độ

và tốc độ dòng Chỉ thích hợp với chất tan ion

- Rất nhạy, chọn lọc, điện cực dễ bị nhiễm bẩn

Không dùng được

6 Phổ khối Cực nhỏ Vạn năng, rất nhạy, đắt tiền Dùng được

6 BỘ PHẬN XỬ LÝ VÀ GHI TÍN HIỆU:

- Chính xác và đa năng

- Tự động hóa trong việc phát hiện pic, đo diện tích pic và điều chỉnh đường nền

- Có khả năng phân tích định tính thành phần của hỗn hợp

- Xác định được nồng độ của mẫu

- Có khả năng giữ lại các dữ kiện trong bộ nhớ để có thể lặp lại việc tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu thử qua hệ thống sắc ký nhiều lần

- Hiện nay các hệ thống SK được kết nối với hệ thống máy tính, các máy tính được cài đặt các phần mềm tiện dụng trong việc tính toán các phép tính từ đơn giản đến phức tạo một cách nhanh chóng, chính xác

CÂU 7: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC:

1 Nguyên tắc chung:

Dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic trong mẫu thử với một hay nhiều mẫu chuẩn

- Pic hẹp và đối xứng: đo chiều cao hoặc diện tích pic

- Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic

2 Phương pháp định lượng:

1 Định lượng so sánh với chuẩn Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp)

Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn) Chuẩn nội

Thêm chuẩn

2 Định lượng không có chuẩn Chuẩn hóa diện tích pic ( quy về 100% diện tích

pic)

2.1 Định lượng so sánh với chuẩn

2.1.1 Phương pháp chuẩn ngoại:

a Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp):

- Phân tích bằng chiều cao pic:

𝑪𝟎 và 𝑪𝒙 càng gần nhau, kết quả càng chính xác

b Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn):

- Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau

- Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn

- Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ

- Tiến hành sắc ký mẫu thử Dựa vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ mẫu thử

2.2.2 Phương pháp chuẩn nội:

 Yêu cầu của chất chuẩn nội:

- Chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích

- Có cấu trúc hóa học tương tự chất phân tích

- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất phân tích

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

 Độ nhạy phát hiện của chất chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau

 Xác định yếu tố hiệu chính Fs của chất chuẩn nội và chất phân tích:

 Nồng độ của mẫu thử có diện tích pic 𝑺𝒙:

𝐂𝐱 = 𝐒𝐱

𝐒𝐢 × 𝐂𝐢 × 𝐅𝐬

2.2.3 Phương pháp thêm chuẩn:

- Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử

- Nồng độ 𝑪𝒙 của mẫu thử có diện tích pic là 𝑺𝒙

 Áp dụng của phương pháp chuẩn hóa diện tích: xác định độ tnh khiết sắc ký

- Yêu cầu: tất cả các chất trong mẫu thử đều phải được tách và phát hiện

- Giả định: mỗi chất trong hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho 1 pic duy nhất

- Khối lượng của chất trong mỗi pic được tìm thấy:

𝑺𝟏

𝑺𝟏+ 𝑺𝟐+ ⋯ + 𝑺𝟑 × 𝑴 M: Tổng khối lượng chất tan trong mẫu tiêm

- Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần

- Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các hợp chất tự nhiên có độ tinh khiết cao

+ Pic dung môi và pic chính tương ứng với chất phân tích

+ Tỷ lệ % của diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối của chất

+ Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử

Câu 8: Các xu hướng phát triển của sác ký lỏng hiệu năng cao?

-Phương trình Van Deemter: H = A + B/u + Cu

+ Khắc phục A:

 Hạt pha tĩnh nhỏ

 Cột mao quản được bao pha tĩnh ở bề mặt bên trong

+Khắc phục B:Sử dụng Sắc ký có đường kính nhỏ (cột mao quản)

+Khắc phục C:

 Tăng nhiệt độ cột giảm độ nhớt pha động, giảm quá trình chuyển khối

 Cột mao quản bao 1 lớp pha tĩnh mỏng và đều

 Chất bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều

-Sắc ký lỏng siêu hiệu năng(UPLC)

+Kích thước hạt pha tĩnh:1,5-1,8µm

+Áp suất đầu vào có thể lên đến 1800psi

+Thể tích hệ thống giảm tối thiểu: dùng cột nhỏ hơn, thể tích pha động ít hơn

+Lượng mẫu tiêm ít: chỉ 1-2 µl

+Thời gian sắc ký ngắn: 1-2 phút

 Các kỹ thuật phân tách trong SK lỏng: HPLC-UHPLC-UPLC

Áp suất vận hành <6000psi 6000-15000psi 9000-15000psi

 Gia tăng tính linh hoạt và phù hợp với các mẫu có đặc tính khác nhau

-Sự khác nhau giữa 3 kỹ thuật phân tách:

+Tăng độ phân giải

+Giảm thời gian sắc ký

+Tăng độ nhạy

-Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hiệu năng giữa 3 kỹ thuật phân tách:

+Sự phân tán: sự mở rộng dải (tăng chiều rộng pic đáy) của chất phân tích là doảnh hưởng

của cột sắc ký (động học khuếch tán và chuyển khối phụ thuộc vào tốc độ pha tĩnh và tốc

độ dòng) và ảnh hưởng của hệ thống (đường kính trong và chiều dài ống mao quản, bộ phận kết nối thiết bị, thể tích tế bào dòng của đầu dò)

+Hiệu năng phân tách thật sự bị ảnh hưởng bởi sự phân tán hệ thống cùng với 1 khoảng tốc

độ dòng để mang lại hiệu năng cao nhất có thể với một cột SK nhất định

-Chi phí cho 1 lần phân tích sẽ giảm từ HPLC-UHPLC-UPLC do thời gian phân tách ngắn

hơn và tốc độ dòng thấp hơn

-Ứng dụng các kỹ thuật SK lỏng hiện đại tại phòng thí nghiệm phân tích thường quy:

+Các kỹ thuật SK lỏng mới được ứng dụng đầu tiên trong giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới (khám phá thuốc mới, phát triển công thức bào chế thuốc ở giai đoạn đầu)

+Việc ứng dụng các kỹ thuật SK lỏng này trong phòng thí nghiệm phân tích thường quy chỉ xảy ra sau khi có sự chấp nhận các quy trình phân tích trong giai đoạn đầu tiên của vòng đời sản phẩm

+Các kỹ thuật này phải cho kết quả lắp lại, ổn định và tin cậy

+Việc áp dụng kỹ thuật này phải duy trì được sự tuân thủ khi triểm khai các quy trình phân tích đã được xây dựng và thẩm định

+Các kỹ thuật này cũng phải duy trì sự tương hợp các điều kiện phân tích đang được sử dụng

-Cải tiến về cột SK: Giảm đường kính cột

+Giảm thể tích hệ thống

+Giảm thời gian phân tích

+Tăng độ nhạy SK

Giảm chiều cao đĩa lý thuyết cho kết qủa phân tách tốt hơn

Câu 9: Ứng dụng của SK lỏng hiệu năng cao trong phân tích dược phẩm

 HPLC là kỹ thuật chính để phân tích dược phẩm từ giai đoạn nghiên cứu , phát

triển và kiểm soát chất lượng thuốc với các chức năng sau:

+ Phát minh thuốc: tìm kiếm các cấu trúc hóa học làm ứng viên để phát triển thuốc +Phát triển cấu trúc hóa học: tìm kiếm các con đường tổng hợp khả thi và quy trình + phát triển thuốc: phát triển dạng bào chế và hồ sợ độ ổn định của thuốc để chuản bị cho các nghiên cứu lâm sàng

+Kiểm soát chất lượng(QC): đánh giá chất lượng của các sản phẩm và công bố các tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm

 Giai đoạn phát minh thuốc mới:

+Từ hàng trăm tới hàng ngàn hợp chất được tại gia, quy trình sàng lọc thông lượng cao(HTS) LC-MS đã trở thành một trong những công cụ linh hoạt nhất cho HTS trong quá trình phát triển thuốc, đặc biệt là sự hỗ trợ của tổng hợp hữu cơ và thử nghiệm sinh học

 Vai trò hỗ trợ tổng hợp hữu cơ HPLC bao gồm xác nhận sự ttoongr hợp các hợp chất mục tiêu, cũng như xác định độ tinh khiết và tinh chế chúng

 Sự hỗ trợ cho phân tích sinh học bao gồm định lượng của chất phân tích mục tiêu trong nền sinh học nhằm hỗ trợ tối ưu hóa hướng đến nghiên cứu tiền lâm sàng, bao gồm các quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ thuốc +Phương pháp HPLC sử dụng detecer huỳnh quang hoặc điện hóa để phát hiện chất sau khi

xử lý mẫu đã dần được thay thế bằng HPLC-MS/MS hoặc phương pháp UPLC-MS/MS

+Việc làm sạch mẫu ngày càng đơn giản và tự động hơn, thường áp dụng các phương pháp liên quan đến sự kết tủa protein và kỹ thuật chiết pha rắn

+Với kỹ thuật HPLC-MS/MS, thời gian phân tích mẫu sinh học bằng phương pháp sắc ký thường khá nhanh chóng, bằng cách sử dụng chế độ rửa giải gradient hoặc isocratic, sử dụng kích thước cột nhỏ Tín hiệu thu được khi sử dụng detecter khối phổ thường ổn định, độ nhạy cao hơn, chọ lọc hơn

 Giai đoạn sản xuất thuốc:

+Định tính: Xác định hiện diện dược chất trong nguyên liệu hay thành phẩm

Trong hầu hết các trường hợp, việc định tính tiến hành trong 2 thử no độc lập để cho kqua chắc chắn, bao gồm tín hiệu tR trên sắc ký đồ HPLC và 1 thử no quang phổ, chẳng hạn quang phổ tử ngoại kết hợp quang phổ hồng ngoại, thường được so vs chất chuẩn tham chiếu

+Định lượng

Phương pháp HPLC với detecter UV, so sánh chuẩn ngoại

Chuẩn bị mẫu Hòa tan và pha loãng

nguyên liệu trong bình định mức về nồng độ 0,01-1mg/ml

Thực hiện các bước thông thường: Nghiền-hòa tan-pha loãng-lọc trên 20 đvị

Giới hạn cho phép Tinh khiết 98-102%

tính trên dạng khan

90-110% so vs hàm lượng ghi nhãn

Điều kiện thẩm định

chấp nhận được

Độ đúng: thực hiện 3 lần lặp lại (70,100,130% nồng độ

đlượng), yêu cầu ≤±2% giá trị thực

Độ chính xác: Đánh giá trên 6 mẫu ở nồng độ 100%, yêu

N là số đơn vị thử, A là hàm lượng ghi nhẵn,

Mc là lượng cân chuẩn, V là thể tích dd chuẩn gốc, P là độ tinh khiết chuẩn, CF là hệ

số chuyển đổi khối lượng (trong trường hợp hoạt chất ở dang muối khác với dạng tồn tại của chuẩn)

+ Độ đồng đều hàm lượng: trong nhiều trường hợp việc đánh giá độ đồng đều khối lượng

chỉ có thể thực hiện bằng phương pháp HPLC