Đề cương ôn tập Điện di và các phương pháp sắc ký

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP ĐIỆN DI VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Lớp D4 Học kỳ II Năm học 2017 – 2018 -* Câu 1: Các thông số sắc ký, tập liên quan? Thời gian lưu (tR): thời gian từ lúc chất tan nạp vào cột tách phận tiêm mẫu lúc chất khỏi cột thời điểm có nồng độ cực đại + Có thể dùng thời gian lưu để phát định tính chất + Thể tích lưu VR thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan từ thời điểm đưa mẫu vào, qua cột đến detector VR = tR.FC L = u.tR (L= u.tM) Với: FC tốc độ thể tích dịng (thể tích pha động đơn vị thời gian) u tốc độ tuyến tính trung bình pha động/ chất tan + Thể tích lưu hiệu chỉnh thời gian lưu hiệu chỉnh cho bởi: V’R = VR – VM t’R = tR - tM + Thời gian lưu phụ thuộc vào yếu tố:  Bản chất pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp hạt nhồi  Bản chất, thành phần, tốc độ pha động  Cấu tạo chất phân tử chất tan, nhóm  pH pha động, nồng độ chất tạo phức - Hệ số phân bố (K): đặc trung cho phân bố chất tan pha động pha tĩnh 𝑪𝑺 K= 𝑪𝑴 Với: CS, CM nồng độ chất tan pha tĩnh pha động tương ứng + K lớn, di chuyển chất tan qua pha tĩnh chậm + Nếu chất hỗn hợp có số K khác nhiều khả tách chất diễn dễ dàng - Hệ số dung lượng (k’): đại lượng cho ta biết tỷ số khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh pha động 𝑽𝑺.𝑪𝑺 𝑽𝑺 𝒕′𝑹 𝒕𝑹−𝒕𝑴 𝑽𝑹−𝑽𝑴 k’= = K = = = 𝑽𝑴.𝑪𝑴 𝑽𝑴 𝒕𝑴 𝒕𝑴 𝑽𝑴 Với: K hệ số phân bố VS, VM thể tích pha tĩnh pha động tR, tM thời gian lưu chất cần phân tích chất khơng lưu giữ Cần chọn điều kiện sắc ký cho k’ nằm khoảng ≤ 𝑘 ′ ≤ - Hệ số chọn lọc (): đặc trưng cho tốc độ di chuyển hai chất 𝑡′𝑅𝐵 𝑘′𝐵 𝐾𝐵 = = = 𝑡′𝑅𝐴 𝑘′𝐴 𝐾𝐴 Theo quy ước, B chất lưu giữ mạnh A nên  lớn Như để tách riêng hai chất A b  phải >1 (1,05- 2) Câu 2: Lý thuyết đĩa lý thuyết động học phân tách sắc ký - Lý thuyết đĩa o Mặc dù trình xảy cột trình xảy liên tục theo mơ hình Craig, ơng cho bước nối tiếp riêng biệt Các bước tái lập lại tuần hoàn theo di chuyển cấu tử cột Mỗi bước tương ứng với trạng thái cân gọi đĩa lý thuyêt o Có thể giả định cột sắc ký chia thành N phần mỏng/ N lớp/ N đĩa tách Ở đĩa có phân bố chất tan vào hai pha đạt đến trạng thái cân o Khả tách cấu tử hỗn hợp cột cải thiện giảm chiều cao đĩa lý thuyết Các chất tan dịch chuyển qua cốt tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác chúng có hệ số khuếch tán khác o Chiều cao đĩa lý thuyết H số phương sai σ2 dải chất tan khoảng cách x mà di chuyển Tên gọi từ lý thuyết đĩa tách thực giai đoạn rời rạc gọi đĩa tách H= σ2 𝐿 Chiều cao đĩa lý thuyết khoảng 0.1 đến 1mm sắc ký khí khoảng 10µm sắc ký lỏng hiệu cao nhỏ 1µm sắc ký điện di mao quản - Lý thuyết động học o Lý thuyết đĩa chưa xem xét đến yếu tố cột ảnh hưởng đến pic sắc ký, làm giãn pic o Sự doãng pic phụ thuộc nhiều vào trình độc học nhiệt động học xảy cột: chất tan khuếch tán ngang dọc theo pha động, tốc độ thiết lập cân phân bố chất tan vào hai pha, khuếch tán chất tan pha tĩnh, không đồng dòng chảy… o Ảnh hưởng dòng chảy thông số động học khác mô tả phương trình Van Deemter có dạng sau: H=A+ 𝐵 𝑢 + C.u H chiều cao đĩa lý thuyết u tốc độ dịng tuyến tính pha động A mơ tả ảnh hưởng khuếch tán xốy dịng chảy khơng pha động qua pha tĩnh, kích thước hạt pha tĩnh to khơng A lớn dẫn đến dỗng pic lớn B/u mô tả ảnh hưởng khuếch tán dọc theo cột chất tan pha động, B phụ thuộc vào kỹ thuật nhồi cột C.u mô tả chuyển khối ( ảnh hưởng di chuyển khơng chất tan lịng pha động, vùng tiếp giáp pha lòng pha tĩnh * Khuếch tán xoáy: Hệ số khuếch tán xoáy A = 2.λ.dp - Hệ số A độc lập với tốc độ dòng pha động qua pha tĩnh, đường kính hạt nhồi dp khơng đồng kích cỡ tạo dịng pha động có Với hướng khác qua Đây nguyên nhân gây doãng pic ảnh hưởng đến phân bố hai pha - λ hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể chất nhồi, dạng hình học kích thước cột - Ảnh hưởng thường xảy LC khơng có GC với cột WCOT * Khuếch tán dọc: Hệ số khuếch tán dọc theo cột B=2γ.D - Hệ số khuếch tán dọc theo cột B mô tả khuếch tán dọc theo cột song song với đường pha động - Hệ số ảnh hưởng lớn GC chất tan khuếch tán mạnh pha khí - B phụ thuộc vào γ biểu thị cho hệ số trở kháng chất nhồi đến khuếch tán dọc D biểu thị khuếch tán chất tan pha động - Thường γ có giá trị GC 0.7 LC * Sự truyền khối: - Hệ số truyền khối C tổng hệ số truyền khối (chất tan) pha động pha tính - Với CS hệ số truyền khối pha tĩnh CM hệ số truyền khối pha động, ta có: C = CS + CM - Sự truyền khối pha tĩnh: o Nếu pha tĩnh chất lỏng thị hệ số phụ thuộc vào bề dày lớp hấp phụ o Nếu pha tĩnh chất rắn phụ thuộc vào khả hấp phụ giải hấp phụ chất tan xảy bề mặt - Hệ số truyền khối pha động CM: o Tỷ lệ nghịch với hệ số khuếch tán chất tan pha động DM o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính hạt nhồi o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính cột tốc độ chảy pha động Câu 3: Ứng dụng phương pháp sắc ký - Phân tích định tính o Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (sắc ký rửa giải) vị trí pha tĩnh (sắc ký khai triển) chất phân tích với điều kiện sắc ký thơng tinh định tính giúp ta khẳng định có mặt chất phân tích mẫu o Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính quang phổ thường gặp nhiều khó khăn Cho nên sắc ký thường dùng để tách thành phần trước phân tích quang phổ Mặc khác, định tính sắc ký khơng cho kết dương tính chắn Vì hai lý trên, để định tính chất hỗn hợp người ta kết hợp sắc ký – phổ IR sắc ký – khối phổ o Sắc ký khẳng định kết âm tính nên thường dùng để kiểm tra tạp chất mẫu - Phân tích định lượng o Phương pháp chuẩn ngoại:  Cả mẫu chuẩn thử tiến hành điều kiện  So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử với mẫu chuẩn tính nồng độ chất mẫu thử  Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa điểm nhiều điểm:  Chuẩn hỏa điểm 𝑆𝑋 Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử CX = CS 𝑆𝑆 Với : CX, CS nồng độ mẫu thử, chuẩn SX (HX), SS (HS) diện tích (chiều cao) pic mẫu thử, chuẩn  Chuẩn hóa nhiều điểm - Chuẩn bị dãy chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành sắc ký - Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mơ tả quan hệ diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định : Y = a + b.CX Với Y diện tích pic a giao điểm đường chuẩn với trục tung b độ dốc đường chuẩn CX nồng độ chất thử o Phương pháp chuẩn nội:  Chất chuẩn nội chất thêm vào mẫu chuẩn mẫu thử lượng chất tinh khiết tiến hành sắc ký điều kiện Tỷ số diện tích chất phân tích chất chuẩn nội thơng số phân tích dùng để xây dựng đường chuẩn  Yêu cầu chất chuẩn nội:  Chất chuẩn nội phải tách hồn tồn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích mẫu thử  Có cấu trúc hóa học tương tự mẫu thử  Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử  Không phản ứng với thành phần mẫu thử  Phải có hệ số tinh khiết cao dễ kiếm Hệ số đáp ứng FX: mối tương quan tỷ số khối lượng (hoặc nồng độ) chuẩn chuẩn nội với tỷ số diện tích hai pic: Fx = 𝑚𝐶 𝑆𝐼𝑆 𝑀𝐼𝑆 𝑆𝐶 = 𝐶𝐶 𝑆𝐼𝑆 𝐶𝐼𝑆 𝑆𝐶 Các sai số cực tiểu hóa hệ số FX xấp xỉ - Phương pháp chuẩn điểm: o Chuẩn nội thêm vào hai mẫu chuẩn mẫu thử tiến hành sắc ký o Lượng nồng độ thành phần mẫu thử tính sau: mT = CT = 𝑆𝑇 𝑆𝐼𝑆 𝑆𝑇 𝑆𝐼𝑆 mIS.FX CIS.FX - Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị dãy chuẩn có chứa nồng độ chất chuẩn khác tất chứa nồng độ chuẩn nội Sau sắc ký thu kiện diện tích, tiến hành vẽ đường chuẩn biểu thị tương quan tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic chuẩn chuẩn nội (SS/SIS) với tỷ số nồng độ chuẩn ngoại chuẩn nội (CS/CIS) Câu 4: Các bước phân tích thực nghiệm ứng dụng HPTLC? a) Các bước phân tích thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu phân tích Lựa chọn bảng mỏng Đưa mẫu lên bảng mỏng Pre-washing Khai triển sắc ký Hoạt hóa bảng mỏng Phát Quét xử lý, lưu trữ  Lưu chọn mỏng: tùy thuộc chất phân tích - Trên thị trường có mỏng tráng sẵn với chất hấp phụ đa dạng, phổ biến mỏng Silica gel 60F, Alumina, Cellulose… - 80% phép phân tích sử dụng mỏng Silicagel, có loại: + Loại G: silica gel có thêm thạch cao CaSO4.1,5H2O + Loại F: có thị huỳnh quang - Cellulose: phân tích amino acid, dipeptide, đường alkaloid - Bản mỏng pha đảo RP2, RP8 RP18: chất không phân cực acid béo, carotenoid, cholesterol - Bản mỏng kết hợp RPW F254s: phân tích chất bảo quản, barbiturat, thuốc giảm đau, phenothiazine  Pre – washing mỏng: - Để tránh ảnh hưởng tạp chất nước có khơng khí sau mở hộp cất giữ thời gian dài, người ta khuyến cáo mỏng nên làm trước sử dụng Quá trình gọi pre- washing - Pre-washing thực với kỹ thuật khác kỹ thuật lên, nhúng, liên tục… - Dung môi sử dụng thường là: + Chloroform: Methanol (1:1) + Methylene chloride: Methanol (1:1) + 1% amonia 1% acid acetic  Hoạt hóa mỏng: - Bản mỏng hộp mở khơng cần hoạt hóa - Bản mỏng đặt môi trường ẩm cao cầm tay thời gian dài cần hoạt hóa - Đặt tủ sấy nhiệt độ 110-120℃ 30 phút  Chuẩn bị mẫu chuẩn mẫu thử: nồng độ mẫu 0,1 – 1ug/ul - Tránh ảnh hưởng tạp chất nước - Tỷ lệ S/N cải thiện, đường thẳng LOD cao - Thường dùng dung môi pha mẫu: + Methanol + Chloroform: Methanol (1:1) + Ethyl acetat: Methanol (1:1) + Methylene chloride: Methanol (1:1) + Chloroform: Methanol: Amoniac (90:10:1) + 1% amonia 1% acid acetic  Đưa chất phân tích lên mỏng: - Chọn mẫu thiết bị đưa mẫu lên mỏng phụ thuộc vào: + Thể tích mẫu + Số lượng mẫu( số vết chấm) - Thể tích mẫu: 0.5-5µl (1 điểm) 10µl (theo dải) - Chấm theo dải( áp dụng lượng mẫu lớn) cho kết phân tách tốt hơn, đáp ứng tốt phân tích cường độ - Mẫu thường đưa lên thiết bị tự động/bán tự động qua mao quản: + Thiết bị đưa mẫu tay NANOMAT: dùng mao quản xác để đưa mẫu + Thiết bị đưa mẫu bán tự động LINOMAT:  Thích hợp phân tích mẫu thường quy  Việc thay đổi mẫu cần có thao tác người  Mẫu phun lên mỏng dạng băng hẹp (dạng dải) tác dụng khí N2  Dung mơi mẫu bốc gần hồn tồn, tập trung mẫu thành dải hẹp dài + Thiết bị đưa mẫu tự động ATS4:  Mẫu đưa lên tự động dạng chấm dải băng hẹp dạng chữ nhật kỹ thuật phun dòng khí N2  Mẫu đưa lên dạng hình chữ nhật cho phép đưa thể tích mẫu lớn lên mỏng mà đảm bảo độ phân tách  Lựa chọn pha động: - Nguyên tắc: Thử- Lỗi- Thử - SK pha thuận: + Pha động không phân cực, pha tĩnh phân cực + Chất không phân cực di chuyển nhanh - SK pha đảo: + Pha động phân cực, pha tĩnh không phân cực + Chất phân cực di chuyển nhanh - Tránh sử dụng hệ pha động chứa nhiều dung môi (3-4) - Pha động sử dụng lần nên tránh sử dụng lại  Khai triển sắc ký: - Bão hòa dung mơi: + Buồng sắc ký khơng bão hịa dung môi làm cho giá trị Rf cao + Sử dụng giấy kéo dung môi lên phân bố dung môi buồng + giảm giá trị Rf - Khai triển sắc ký thiết bị tự động: + Quá trình bão hịa dung mơi, theo dõi q trình khai triển sấy khô mỏng cài đặt tiến hành hoàn toàn tự động + Khai triển đẳng dòng (ADC), khai triển gradient (AMD)  Phát vết: - Phát đèn UV: 254nm 366nm, quan sát chất không bắt huỳnh quang bên UV (sử dụng silicagel GF) - Bình phun sắc ký, buồng phun thiết bị phun sấy mỏng  Định lượng lưu liệu: - Bản mỏng quét dải bước sóng UV chọn tín hiệu vết chuyển thành dạng pic - Thiết bị chuyển thông tin dải băng dạng pic, thơng số diện tích/ chiều cao pic tỷ lệ với nồng độ - Thiết bị video scan hoạt động theo kiểu: đo độ truyền qua đo độ tán xạ - Phần mềm kèm thiết bị b) Ứng dụng HPTLC: - Công nghiệp dược phẩm: kiểm tra chất lượng, đồng hàm lượng, kiểm tra tạp chất, độ tinh khiết, độ ổn định - Phân tích thực phẩm: quản lý chất lượng thực phẩm, chất phụ gia, thuốc trừ sâu, thử nghiệm độ ổn định,… - Ứng dung lâm sàng: nghiên cứu chuyển hóa, sàng lọc thuốc, ngộ độc,… - Kiểm sốt thuốc giả… - Phân tích liệu: kiểm sốt chất lượng dược liệu, phân lập chất dược liệu, fingerprint, xác định thành phần chế phẩm đông dược: + Xác định dấu vân tay dược liệu:  Vấn đề: liệu thu hái từ nhiều địa phương, thời vụ, nhầm lẫn loài, chi, liệu giả  Kỹ thuật dấu vân tay: ghi thơng tin hóa học dược liệu chế phẩm với sắc ký đồ, phổ đồ thị khác kỹ thuật phân tích hóa học  Có nhiều phương pháp ghi nhận dấu vân tay: sắc ký, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân khối phổ… + Đánh giá chất lượng dược liệu + Xác định tạp chất liên quan nguyên liệu thuốc:  Tầm quan trọng: độ ổn định, độc tính  HPTLC PP giúp đánh giá tạp chất nguyên liệu Câu 5: So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu cao với sắc khí lớp mỏng sắc khí lỏng hiệu cao? So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu cao sắc khí lỏng hiệu cao Tiêu chí HPTLC HPLC Pha động Lỏng Lỏng Pha tĩnh Rắn Rắn/lỏng Đọc kết Derector/ mắt Derector Phân tích Off – line On line Độ phân giải Trung bình đến cao Rất cao Phân tích song song Có Khơng u cầu áp suất cao Khơng Có Thời gian phân tích – 60 phút – 10 phút Tạo dẫn xuất sau phân Dễ dàng, đơn giản, thuận Phức tạp, chi phí cao tách lợi, chi phí thấp Thu thập phân đoạn Dễ dàng Cần có hệ thống colletor(SK điều chế) Tính chọn lọc Trung bình đến cao Cao đến cao Phân tích phổ Có thẻ Có Yêu cầu độ mẫu Không khắt khe Rất quan trọng Phân tích dấu vân tay Dễ dàng Hạn chế Giá thành Thấp Rất cao Yêu cầu bảo dưỡng Ít Nhiều So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu cao sắc khí lớp mỏng Tiêu chí HPTLC TLC Loại mỏng Tráng sẵn Tự chuẩn bị/ táng sẵn Bề dày lớp hấp phụ 100 𝜇𝑚 250 𝜇𝑚 Kích thước hạt trung bình – 𝜇𝑚 – 20 𝜇𝑚 Chiều cao đĩa lý thuyết 12 𝜇𝑚 20 𝜇𝑚 Hiệu lực tách Cao Thấp Thời gian phân tách Giảm quảng đường di Kéo dài chuyển nên giảm thời gian phân tích Bản chất pha tĩnh Đa dạng pha thuận, pha Silicagel, Aumiana đảo C8, C18… Chấm sắc khí Tự động/bán tự động/ thủ Thủ cơng cơng Thể tích chấm mẫu 0,1 – 0,5 𝜇𝑙 – 𝜇𝑙 Đường kính vết chấm – 1,5 mm – mm ban đầu Đường kính vết phân – mm – 15 mm tách Thể tích mẫu lớn Chấm dạng băng dài Gây hiệ tượng tải Số vết chấm tối đa 36 10 mỏng Chế độ quét Pre- washing LOD(hấp thụ UV) LOD(huỳnh quang) Thời gian khai triển Độ lăp lại kết Mục đích UV – Vis/huỳnh quang Bắt buộc 100 – 500 pg – 10 pg Không Không – pg 50 – 100 pg Tùy thuộc pha động Tốt Thấp Định tính/định lượng/bán Định tính định lượng CÂU 6: CẤU TẠO, NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA HPLC: Cấu tạo hệ thống HPLC: - Hệ thống cung cấp pha động ( dung môi pha động) - Bơm - Bộ phận tiêm mẫu ( tay tự động) - Cột pha tĩnh - Detector - Bộ phận thu nhận xử lý liệu HỆ THỐNG CUNG CẤP PHA ĐỘNG:  Bình chứa dung mơi: - Bình chứa dung mơi bình thủy tinh khơng màu, trung tính, tích từ 100 – 2000 ml, kín ( tránh bay dung môi)  Dung môi pha động: - Yêu cầu dung môi pha động: + Tinh khiết + Trơ mặt hóa học + Tương thích với detector + Hịa tan mẫu phân tích + Giá thành thấp - Dung môi bơm vào phải không chứa bụi bẩn vật lạ, điều làm ảnh hưởng đến tuổi thọ bơm làm kẹt cột tách  Vì vậy, cần phải lọc dung môi qua màng lọc 0,45 0,22 𝝁m Các loại màng lọc như: + Nước: màng lọc cellulose nitrat, cellulose acetat + Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon + Hỗn hợp DMHC nước: màng lọc RC, polyamid hay nylon - Cần phải loại bỏ đuổi khí hịa tan hay bọt khí dung mơi khí hịa tan làm biến dạng pic sinh bọt khí làm nhiễu đường Ta loại khí bình chứa dung mơi ( siêu âm, sục khí trơ) dịng chảy pha động trước dung môi vào bơm + Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung mơi + Sục khí trơ ( helium): đuổi khí hịa tan khỏi dung mơi + Khử dòng ( online membrane degassing) - pH dung mơi pha động: + Trong phân tích dược, nhiều trường hợp cần điều chỉnh pH pha động đệm pH + Thường sử dụng: đệm phosphat, perchlorate, sulfat, Một số acid mạnh như: TCA ( trichloroacetate acid), TFA ( trifloroacetate acid) + Ảnh hưởng đến độ phân tách độ chọn lọc peak  Phương pháp rửa giải: - Có cách rửa giải: + Đẳng dịng: Khơng thay đổi thành phần pha động q trình rửa giải + Gradient: Tỷ lệ thành phần pha động thay đổi trình rửa giải - Ưu điểm rửa giải gradient: + Rút ngắn thời gian phân tích + Giảm tượng kéo đi, cải thiện hình dạng pic + Tăng độ nhạy phân tích HỆ THỐNG BƠM:  Chức năng: - Chức bơm vận chuyển pha động qua cột tách với tốc độ xác định  Bơm cần đáp ứng số yêu cầu cao tính sau: - Có khả hoạt động áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên 10