ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN MẠNH CƢỜNG ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀO GIẢNG DẠY HOÁ HỌC PHỔ THÔNG Chuyên ngành Hoá phân tích Mã số 60 44 29 LUẬ[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN MẠNH CƢỜNG ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀO GIẢNG DẠY HỐ HỌC PHỔ THƠNG Chun ngành: Hố phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS ĐÀO HỮU VINH HÀ NÔI – 2011 MỤC LỤC Mở đầu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển sắc ký 1.2 Định nghĩa, nguyên tắc sắc ký phân loại phƣơng pháp sắc ký 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Nguyên tắc sắc ký 1.2.3 Phân loại phương pháp sắc ký 1.3 Cơ sở lý thuyết sắc ký 1.3.1 Các khái niệm 1.3.2 Thuyết đĩa 1.3.3 Thuyết tốc độ 1.4 Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 1.4.1 Các chất hấp thụ dùng sắc ký lớp mỏng 1.4.2 Dung môi khai triển thuốc thử màu 1.5 Sắc ký giấy (paper chromatography) 1.5.1 Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy 1.5.2 Giấy sắc ký 1.5.3 Dung môi sắc ký giấy 1.5.4 Ứng dụng sắc ký giấy 1.6 Sắc ký hấp phụ lỏng (trên cột) 1.6.1 Nguyên tắc 1.6.2 Ứng dụng sắc ký hấp phụ lỏng 1.7 Khái quát chất diệp lục (chlorophyl) carotenoit 1.7.1 Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl) 1.7.2 Carotenoit 1.7.3 Các phương pháp sắc ký dùng để tách diệp lục carotenoit 1.8 Khái quát ion Co2+, Cu2+, Fe3+, Ni2+ muối chúng 1.8.1 Sơ lược muối sắt(III) ion Fe3+ 1.8.2 Sơ lược muối đồng(II) ion Cu2+ 1.8.3 Sơ lược muối coban(II) ion Co2+ 1.8.4 Sơ lược muối niken(II) ion Ni2+ 1.8.5 Các phương pháp sắc ký dùng để tách ion Fe3+, Cu2+, Co2+ ion Ni2+ Trang 3 4 4 7 11 14 16 17 18 18 19 19 20 21 21 21 24 24 24 26 28 29 29 31 32 33 34 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Các hoá chất thiết bị cần thiết 2.2 Chế tạo mỏng từ tinh bột sắn dây 2.3 Chiết dịch từ xanh 2.4 Tiến hành sắc ký cột 2.5 Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 2.6 Tiến hành sắc ký giấy (paper chromatography) CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sắc ký cột 3.1.1 Tách chất màu xanh a) Pha tĩnh silicagel, pha động hệ dung môi ete dầu hoả - axton b) Pha tĩnh silicagel, pha động hệ dung môi toluen - axeton c) Pha tĩnh bột canxi cacbonat, pha động hệ dung môi ete dầu hoả - axeton d) Pha tĩnh bột canxi cacbonat, pha động hệ dung môi toluen - axeton e) Pha tĩnh glucozơ, pha động hệ dung môi ete dầu hoả - axeton f) Pha tĩnh glucozơ, pha động hệ dung môi toluen - cồn etylic nguyên chất 3.1.2 Tách ion Fe3+, Cu2+, Co2+ a) Pha tĩnh silicagel, pha động hệ dung môi NH4NO3 4M - NH3 4M b) Pha tĩnh silicagel, pha động hệ dung môi CH3COONH4 1,5M -CH3COOH 1,5M c) Pha tĩnh silicagel, pha động hệ dung môi Axeton – HCl đặc d) Pha tĩnh bột canxi cacbonat, pha động hệ dung môi NH4NO3 4M - NH3 4M e) Pha tĩnh silicagel, pha động dung dịch axit axetic f) Pha tĩnh tinh bột sắn dây 2.7.3 Kết luận 3.2 Sắc ký lớp mỏng Trang 35 35 36 36 37 38 39 40 40 40 40 41 42 43 45 46 46 46 48 49 49 49 49 49 50 3.2.1 Tách chất màu xanh a) Bản mỏng hãng Merck, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton b) Bản mỏng sắc ký tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 3.2.2 Tách ion kim loại Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+ a) Bản mỏng hãng Merck, hệ dung môi NH3 4M – NH4NO3 4M b) Bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi axeton - HCl đặc 3.2.3 Kết luận 3.3 Sắc ký giấy 3.3.1 Tách chất màu xanh a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton b) Giấy sắc ký giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton c) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi toluen - cồn etylic tuyệt đối d) Giấy sắc ký giấy lọc, hệ dung môi toluen - cồn etylic tuyệt đối 3.3.2 Tách ion Fe3+, Cu2+ Co2+ a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi axeton - HCl đặc b) Giấy sắc ký giấy lọc, hệ dung môi axeton - HCl đặc 3.3.3 Kết luận KẾT LUẬN CHUNG KIẾN NGHỊ Tài liệu tham khảo I Tiếng việt II Tiếng Anh Trang 50 50 52 54 54 56 58 59 59 59 61 63 65 66 66 68 68 70 71 72 72 73 MỞ ĐẦU 1/Lý chọn đề tài Sắc ký đời từ năm 1903 nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến sắc ký phát triển mạnh mẽ trở thành môn học quan trọng hố phân tích đại ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Nhờ có khả tách riêng rẽ chất cho kết phân tích định tính định lượng rõ ràng Sắc ký tham gia vào phân tích mẫu phức tạp lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến hoạt động phục vụ đời sống chữa bệnh, điều tra hình Ngồi sắc ký cịn công cụ phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học Thí dụ sản xuất nơng nghiệp, sắc ký góp phần tách định lượng chất dinh dưỡng sản phẩm, phân tích độc tố, hóa chất bảo vệ thực vật, kim loại nặng thực phẩm, nước uống… Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân tích thuốc kháng sinh, phân tích dược phẩm, dược liệu… Sắc ký phục vụ đắc lực quan trắc môi trường, đánh giá tác động môi trường tới đời sống người Thí dụ tách định lượng hàm lượng chất độc hại không khí Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức sắc ký cần thiết, nhiên chương trình mơn Hố Học bậc học phổ thơng nước ta chưa có phần nói sắc ký Có lẽ khó khăn thí nghiệm thực hành sắc ký thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ đại đắt tiền, thời gian làm thí nghiệm lâu có trường hợp diễn thời gian dài, nhiều hố chất khó kiếm đắt tiền khơng phù hợp với trường THPT Với mong muốn đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hố Học phổ thơng nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, trực tiếp hướng dẫn thực luận văn “Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hố học phổ thơng” 2/ Mục đích nghiên cứu Khảo sát để lựa chọn thí nghiệm sắc ký áp dụng dạy cho học sinh phổ thơng Nghĩa thiết bị, hố chất, đơn giản, khơng độc hại, dễ tìm kiếm phịng thí nghiệm trường THPT Việt Nam Chọn thành phần pha động, pha tĩnh chất phân tích cho thí nghiệm dễ làm, thời gian cho nghiệm khoảng từ đến 15 phút đảm bảo chuyển tải cho học sinh kiến thức chất, nguyên lý ứng dụng sắc ký 3/ Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Kiến thức sắc ký rộng, mục tiêu nêu thời gian nghiên cứu khả thân có hạn, nên tơi tập trung nghiên cứu khảo sát việc thay đổi hoá chất dụng cụ để thực thí nghiệm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sắc ký giấy mức tách định tính chất màu xanh (chlorophyl, carotenoit), số ion kim loại thơng dụng có màu đặc trưng (Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+) 4/ Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu sở lý thuyết chung sắc ký, tài liệu hướng dẫn thực hành sắc ký Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sắc ký giấy; nghiên cứu thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh chất phân tích để tìm thí nghiệm phù hợp với mục đích nêu 6 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19] Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet dùng cột nhơm oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh pha động ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ Ơng giải thích tượng lực hấp phụ khác sắc tố đặt tên phương pháp phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa ghi màu tách chất có màu Tuy nhiên phát minh Tsvet gần bị lãng quên thời gian dài Mãi tới năm 1931 sau Vinterstin Lederer dùng phương pháp Tsvet tách caroten thô thành caroten nhận thấy giá trị phương pháp phương diện điều chế, phương pháp sắc ký bắt đầu ý mức phát triển nhanh chóng Đặc biệt năm 30 kỷ XX, nhu cầu phân tích tách hỗn hợp chất trở nên cấp thiết nên sắc ký phát triển nhanh chóng Năm 1938 Izmailov Shraiber đặt móng cho sắc ký lớp mỏng sau cơng trình Stahl làm cho sắc ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng ứng dụng rộng rãi Năm 1941 Tiselius phát triền kỹ thuật tách sắc ký phương pháp phân tích tiền lưu, phân tích đẩy phân tích rửa giải Cũng năm 1941 sắc ký phân bố đời Martin Synge đề xuất phương pháp tách theo lực cấu tử chất hấp thụ, mà phân bố khác cấu tử hai chất lỏng không trộn lẫn Các tác giả phát triển dạng sắc ký phân bố: sắc ký giấy Do có cơng đóng góp tác giả nhận giải Nobel năm 1952 Vào năm 1941 – 1942, Martin làm bước ngoặt lớn sắc ký dùng sắc ký giấy tách thành công ancaloit chiết từ thuốc Năm 1952, Martin cơng bố cơng trình sắc ký khí dựa phân bố chất pha tĩnh chất lỏng pha động chất khí Vào năm 1970, sắc ký khí phát triển, với nó, sắc ký lỏng nâng cao hiệu phương pháp, vật liệu làm pha tĩnh khơng ngừng cải tiến, từ hiệu lực phương pháp sắc ký đạt thành tựu đáng kể tách hỗn hợp chất giống (thí dụ nguyên tố đất hiếm), ancaloit, hiđrocacbon mẫu dầu…Ngày sắc ký lỏng chất nhồi cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7 m, có khả chịu áp suất nhiệt độ tốt, hình thành phương pháp hiệu (Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) tách nhanh hợp chất khó thời gian vài chục giây Ngoài phương pháp siêu tới hạn (Supercritical fluid chromatography – SFC) phát triển để phù hợp với chất có khối lượng phân tử lớn Vào cuối thể kỷ trước, phương pháp tách đời phương pháp điện di, đặc biệt điện di mao quản Phương pháp có hiệu lực tách cao, nhanh, tách nhiều đối tượng vô hữu Năm 1994, máy điện di mao quản bán thị trường, sử dụng có hiệu để phân tích dược phẩm, mẫu sinh học, đặc biệt mẫu khó protein, enzim… Sự phát triển phong phú sắc ký làm cho danh từ “sắc ký” khơng cịn theo ý nghĩa ban đầu Tuy nhiên tất phương pháp sắc ký có nét chung nhất: trình tách dựa chuyển dịch hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) chất rắn chất lỏng mang chất rắn giấy chuyển dịch thực chất khí chất lỏng (pha động) 1.2 Định nghĩa, nguyên tắc phân loại phƣơng pháp sắc ký [10, 15] 1.2.1 Định nghĩa Tính đa dạng muôn màu phương pháp sắc ký làm nảy sinh nhiều định nghĩa, nhiều tên gọi lĩnh vực sắc ký Nhưng định nghĩa nhiều nhà hoá học thừa nhận hoàn chỉnh nhất, tổng quan sau: Sắc ký trình tách liên tục vi phân hỗn hợp chất phân bố không đồng chúng pha tĩnh pha động xuyên qua pha tĩnh - Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh pha động 1.2.2 Nguyên tắc sắc ký Nguyên tắc chung phương pháp sắc ký dựa phân bố chất hai pha: pha thường cố định gọi pha tĩnh(stationary phase) pha chuyển động gọi pha động (mobile phase) Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích hồ tan dung mơi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh phân bố chất cần phân tích hai pha khác nên tốc độ di chuyển chúng khác tách khỏi sau thời gian định 1.2.3 Phân loại phƣơng pháp sắc ký 1.2.3.1 Phân loại theo trạng thái liên hợp pha động pha tĩnh - Theo cách phân loại tất phương pháp sắc ký phân thành hai nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng sắc ký khí Đây cách phân loại lơgic sử dụng rộng rãi - Pha tĩnh chất rắn chất lỏng (được mang chất rắn) 1.2.3.2 Phân loại theo chế trình tách Phương pháp phân loại dựa chế trình hấp thụ - giải hấp thụ, nghĩa theo tương tác chất sắc ký với pha động Có bốn chế sắc ký sau A Sắc ký hấp phụ Sự tách lực khác chất chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) Đối với chất hấp phụ phân cực, lực chủ yếu tương tác cực Do nhóm phân cực phân tử ảnh hưởng tới kết tách mạnh mạch hiđrocacbon không phân cực B Sắc ký phân bố Trong phương pháp người ta lợi dụng phân bố khác chất pha tĩnh lỏng (được giữ chất mang rắn) pha động Trong sắc ký lỏng pha tĩnh thường phân cực pha động, nhiên có trường hợp ngược lại Về nguyên tắc có nhiều tổ hợp hai pha lỏng Tuy nhiên thực tế số bị hạn chế lớn Như biết qui tắc độ tan “các chất giống hoà tan vào nhau”, độ phân cực chất sắc ký pha tĩnh pha động có ảnh hưởng tới q trình tách C Sắc ký trao đổi ion Sự tách xảy lực khác ion dung dịch trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) chất rắn pha tĩnh Chất rắn quan trọng trường hợp nhựa trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion chủ yếu dùng dung môi nước hỗn hợp nước - dung mơi hữu mơi trường có độ điện mơi tương đối lớn để ion tồn tự bền D Sắc ký rây phân tử Trong phương pháp người ta sử dụng vật liệu rắn có độ xốp lớn Có lỗ với kích thước định để rây chọn lọc cấu tử tuỳ theo kích thước hình dạng phân tử Các zeolit tổng hợp có giá trị lớn sắc ký rây chất khí Có thể dùng hợp chất vô cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách chất vô hữu cơ; đặc biệt nhóm polime ưa nước (loại dextran mạng) dùng để tách chất có hoạt tính sinh học Ngồi cịn có loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxi hoákhử, chúng có giá trị thực tế Cuối cần nhấn mạnh rằng, q trình sắc ký có chế chủ đạo, xảy chế phụ khác Ví dụ sắc ký hấp phụ có phần trao đổi ion (hấp phụ hoá học, tạo phức) chế phân bố 1.2.3.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ Cơ sở phương pháp phân loại dựa cách chuyển dịch tương đối pha động so với pha tĩnh Có thể khai triển sắc đồ theo ba phương pháp: tiền lưu, đẩy rửa giải Phương pháp rửa giải quan trọng phổ biến nhất, sau phương pháp đẩy, cịn phương pháp tiền lưu sử dụng A Phương pháp tiền lưu Theo phương pháp này, người ta cho hỗn hợp chất phân tích, ví dụ, dung mơi chứa cấu tử A, B liên tục vào lớp pha tĩnh (đầu cột) di chuyển tới lớp cuối pha tĩnh (cuối cột) Nếu chất B bị hấp thụ mạnh chất A tuyến dung mơi phía trước nghèo cấu tử B kết dung môi khỏi cột chứa cấu tử A nguyên chất Cấu tử B không bị hấp thụ lớp chất hấp thụ bão hoà cấu tử B chuyển động dọc cột với cấu tử A Cuối dung môi chứa hỗn hợp A, B khỏi cột Như phương pháp cho phép thu lượng A nguyên chất B Phương pháp đẩy Nguyên tắc phương pháp đưa mẫu tương đối nhỏ hỗn hợp chất phân tích chứa cấu tử A, B lên lớp đầu pha tĩnh (lúc xảy q trình tiền lưu ít) Sau cho dung môi chứa chất E (pha động) qua Điều kiện quan trọng chất E bị hấp thụ mạnh A, B Do E đẩy cấu tử A, B chuyển động xuống phía Vì B bị giữ mạnh A B lại đẩy A phía trước Kết ta vùng A nguyên chất, B nguyên chất pha động chứa E nguyên chất Hình 1.1 Phương pháp đẩy Như vậy, khác với phương pháp tiền lưu, nhờ phương pháp đẩy ta thu phân đoạn chứa cấu tử nguyên chất C Phương pháp rửa giải Trước hết đưa mẫu nhỏ gồm hỗn hợp cấu tử A, B vào lớp pha tĩnh Giả sử B bị hấp thụ mạnh A Sau cho pha động chứa cấu tử E qua cột Điều kiện quan trọng cấu tử E bị hấp thụ yếu Lúc pha động rửa A, B với tốc độ khác tuỳ theo mức độ cấu tử bị pha tĩnh giữ Vì A bị hấp thụ yếu nên dịch chuyển nhanh với pha động 10 Đó kết chuyển dịch cân hấp thụ-giải hấp thụ cấu tử A, B, E Nếu tốc độ chuyển dịch A, B đủ khác nhau, vùng A, B chồng chập lúc đầu tách cuối tạo thành hai vùng riêng biệt ngăn cách dung môi nguyên chất (chứa E) Vùng A chuyển dịch trước vùng B Hình 1.2 Phương pháp rửa giải Nếu đường đẳng nhiệt hấp thụ tuyến tính, đường cong biểu diễn biến thiên nồng độ cấu tử có dạng hình chng (phân bố Gauss) Nhược điểm phương pháp dùng lượng lớn dung mơi nồng độ chất khỏi đầu cột loãng 1.2.3.4 Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ Theo phương pháp phân loại này, tất phương pháp sắc ký chia thành hai nhóm: Sắc ký cột sắc ký phẳng Trong sắc ký cột (kể sắc ký cột mao quản) trình tách hỗn hợp thực cột hình trịn nạp chất hấp thụ thích hợp Cịn sắc ký phẳng hình thành sắc đồ tiến hành lớp phẳng chất hấp thụ (giấy lớp mỏng) Cuối cần nói tuyệt đại đa số phương pháp sắc ký tiến hành theo lối động, nghĩa pha đứng im pha chuyển động; nhiên có số trường hợp tách theo lối tĩnh nghĩa hai pha đứng im tương đối phải khuấy trộn mạnh để cân hấp thụ - giải hấp thụ xảy nhanh Lý thuyết sắc ký không áp dụng cho lối tĩnh 1.3 Cơ sở lí thuyết sắc ký [10, 15] 1.3.1 Các khái niệm Hệ số phân bố Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động pha tĩnh phân bố hai pha theo tỷ số nồng độ định, vậy, có hệ số phân bố riêng, nói cách khác cân phân bố thiết lập, có phương trình: 11 Am As (3.1) Hệ số phân bố tỷ số nồng độ chất phân tích hai pha KD = [A s ] [A m ] (3.2) Trong [As] nồng độ chất phân tích pha tĩnh [Am] nồng độ chất phân tích pha động Mối liên hệ hệ số phân bố tốc độ di chuyển chất hệ sắc ký Chất phân tích A muốn di chuyển phải pha động Gọi fa phần thời gian chất A pha động fa = Số milimol A pha động/số milimol A toàn cột fa = [A]m Vm [A]m Vm +[A]s Vs (3.3) Biến đổi phương trình 3.3 (chia phân sơa cho [A]m.Vm ta có: fa 1 K DA Đặt k 'A K DA (3.4) Vs Vm Vs , ta có f A Vm k ,A (3.5) Trong k ,A gọi hệ số lưu Tốc độ tuyến tính cấu tử A pha động, UA là: u A u.f A hay u A u (1 k ,A ) u tốc độ tuyến tính pha động (cm/s) Qua ta thấy hệ số KD hệ số lưu k ,A tỉ lệ nghịch với tốc độ di chuyển chất tan Thời gian lƣu tR thời gian lƣu hiệu chỉnh tR’ Thời gian lưu tR thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới pic đạt giá trị cực đại t RA L L(1 k ,A ) uA u L/u = tm thời gian cấu tử khơng lưu giữ cột, cịn gọi thời gian chết t RA t m (1 K DA Vs ) t m (1 k ,A ) Vm (3.6) Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R thời gian lưu khơng tính thời gian chết , , t’RA = tRA – tm = tm.k’A k ,A t R VR tm (3.7) Vm Thể tích lƣu VR thể tích lƣu hiệu chỉnh VR’ Thể tích lưu VR thể tích dung dịch rửa giải tính từ bắt đầu bơmmẫu 12 vào cột đến pic đạt giá trị cực đại Gọi F tốc độ chảy pha động (ml/phút) Thể tích lưu VR tính theo cơng thức: VRA = tRA.F; Vm = tm.F; thay vào 3.6 ta có VRA = Vm(1+ K’A) (3.8) Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R thể tích lưu để loại thể tích trống cột V’RA = VR – Vm = Vm.k’A = KDA.Vs (3.9) Thể tích lưu riêng Vg thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, thể tích dung dịch rửa giải để rửa giải chất phân tích đơn vị trọng lượng hay thể tích pha tĩnh V’RA/Vs = KDA = Vg Hệ số tách Hệ số tách đại lượng đánh giá khả tách chất phương pháp sắc ký Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố chúng tỉ số hệ số phân bố chất, chất phân tích A chất khác B chất chuẩn Điều kiện cần thiết để hai chất A B tách khỏi (3.10) Nói cách khác hệ số phân bố hai chất A B pha tĩnh pha động phải khác Mặt khác từ số thể tích lưu riêng hai chất, t’RA/t’RB tỉ số hệ số phân bố , K DA k ,A t ,RA VRA , Vậy tóm tắt là: K DB k ,B t ,RB VRB Đĩa lý thuyết + Khái niệm đĩa lý thuyết Đĩa lí thuyết phần cột mà cân thiết lập Theo quan niệm Martin synge, cân phân bố thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên điều gặp khó khăn giải thích giãn rộng vùng mẫu, tượng pic sắc ký không cân đối Amoudson Lapidus sau Van Deemter cho đĩa hình thành đạt cân chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh ngược lại, + Sắc đồ tính số đĩa lí thuyết Sắc đồ đường biểu diễn phụ thuộc diện tích S chiều cao h tín hiệu đo độ hấp thụ quang, độ dẫn điện, tần số xung điện…liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có mẫu thời gian Các tín hiệu gọi “pic” sắc ký Định lượng chất phân tích dựa vào diện tích pic sắc ký xác Ngày nay, hầu hết máy sắc ký đại trang bị phần mềm để tính diện tích pic cách tự động Có thể hiểu phần cột gọi đĩa lí thuyết cân 13 phân bố chất phân tích đáp ứng Gọi N số đĩa lí thuyết, độ lệch chuẩn; tỉ lệ thuận với N Đối với cột sắc ký N lớn pic hẹp, thời gian lưu tR tỉ lệ thuận với số đĩa lí thuyết N, nên ta viết: tR t N hay N ( R )2 N Mặt khác w = hay (3.11) w Số đĩa lí thuyết N viết lại là: N 16( tR t ) 5,54( R ) w w1/2 (3.12) Trong sắc ký cột nhồi, số đĩa lí thuyết tính tương đối dựa vào chiều dài cột chiều cao đĩa lí thuyết, H 2-3dp Độ phân giải Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tử khỏi phép tách sắc ký Hay cấu tử A B tách khỏi triệt để, độ phân giải cao Độ phân giải đánh giá qua đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu tRA, tRB, độ rộng pic wA, wB Độ phân giải R định nghĩa: R 2(t RB t RA ) t RB t RA WA WB WA WB 2 (3.13) Trong đó: tRB – tRA = t R chênh lệch thời gian lưu (cũng dùng thể tích lưu VRA – VRB) hai cấu tử A B Đại lượng so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo giây ml nói lên khả tách cột Khi R = 1, hai cấu tử A B tách khỏi đạt 95%, nghĩa 2,5% A B, 2,5% A Khi R = 1,5 hai cấu tử A B tách khỏi đạt 99,8% có nghĩa cịn 0,1% A B ngược lại Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: t R N , chiều rộng pic tỉ lệ với N R N hay R L N Thí dụ tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải R’ R’= 2R Cách làm tăng độ phân giải a) Dựa thay đổi cấu trúc cột: - Tăng chiều dài cột - Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng - Thay đổi pha tĩnh - Giảm đường kính cột 14 b) Dựa thay đổi vận hành cột - Tối ưu hoá tốc độ pha động - Giảm lượng mẫu - Giảm nhiệt độ (GC) - Thay đổi thành phần pha động (LC) 1.3.2 Thuyết đĩa * Thiết lập phƣơng trình rửa giải Đĩa lý thuyết khái niệm vừa trừu tượng vừa thực Nó thực chỗ phần cột sắc ký, nhiên trừu tượng chỗ phân biệt ranh giới cụ thể Có thể định nghĩa: “đĩa lý thuyết phần cột mà cân phân bố thiết lập trình tách” Số đĩa lý thuyết sắc ký thường không cố định cho cột sắc ký nào, chí cho phép sắc ký khác cột Gọi thuyết đĩa tác giả xây dựng phương trình tính thể tích lưu cho phép tách sắc ký dựa việc tính tốn lượng chất tan có đĩa lý thuyết Đặt KD hệ số phân bố, V thể tích trống đĩa Vm thể tích trống tồn cột Gọi Sx,n phần chất phân tích vào pha tĩnh, Lx,n phần chất phân tích lại pha động Theo định nghĩa hệ số phân bố ta có: KD Sx,n (3.14) L x,n Trong x số lần đưa V ml dung dịch rửa giải vào, n số thứ tự đĩa Khi nạp chất phân tích Mẫu nạp vào đĩa số 0, đây, cân phân bố thiết lập: S0,0 = KD.L0,0 (3.15) Mặt khác nạp chất phân tích vào cột đơn vị khối lượng, ta có: S0,0 + L0,0 = (3.16) Thay (3.15) vào (3.16) ta có: KD.L0,0 + L0,0 = Từ dễ dàng suy ra: L0,0 Và S0,0 1 KD KD 1 KD (3.17) (3.18) Khi đƣa 1V ml dung dịch rửa giải vào: Pha động đĩa số di chuyển xuống đĩa số Tại đĩa số 0: Chất phân tích từ đĩa số phân bố lại: S1,0 L1,0 S0,0 KD (1 K D ) từ (3.14) ta có S1,0 K D L1,0 thay vào biểu thức vừa 15 ta có: K D L1,0 L1,0 L1,0 KD suy ra: (1 K D ) K 2D KD ; S 1,0 (1 K D )2 (1 K D )2 (3.19) Tại đĩa số 1: Khi x = 1, toàn chất phân tích pha động đĩa số chuyển xuống đĩa số 1, phân bố vào pha tĩnh pha động, ta có S1,1 L1,1 L0,0 từ (3.14) ta có S1,1 K D L1,1 thay vào biểu thức vừa ta (1 K D ) có: K D L1,1 L1,1 L1,1 suy ra: (1 K D ) KD ; S1,1 (1 K D ) (1 K D )2 (3.20) Khi đƣa 2V ml dung dịch rửa giải vào: Tại đĩa số 0: Pha động đĩa số lại di chuyển xuống đĩa số lần nữa, sau cân đĩa lại phân bố lại, ta có: S2,0 L2,0 S1,0 K 2D từ (3.14) ta có S2,0 K D L2,0 thay vào biểu thức vừa ta (1 K D )2 có: K D L2,0 L2,0 K 2D suy ra: (1 K D )2 L2,0 K 3D K 2D S ; 2,0 (1 K D )3 (1 K D )3 (3.21) Tại đĩa số 1: Khi x = 2, lượng chất phân tích đĩa gồm nguồn, từ đĩa số chuyển xuống, hai từ pha tĩnh đĩa số cân lại: S2,1 L2,1 S1,1 L1,0 KD KD 2K D 2 (1 K D ) (1 K D ) (1 K D )2 từ (3.14) ta có S2,1 K D L2,1 thay vào biểu thức vừa ta có: K D L2,1 L 2,1 L2,1 2K D suy ra: (1 K D ) 2K 2D 2K D S ; 2,1 (1 K D )3 (1 K D )3 (3.22) Tại đĩa số 2: Khi x = 2, tồn chất phân tích pha động đĩa số chuyển xuống đĩa số 2, phân bố vào pha tĩnh pha động, ta có: S2,2 L2,2 L1,1 (1 K D )2 16 từ (3.14) ta có S2,2 K D L2,2 thay vào biểu thức vừa ta có: K D L2,2 L2,2 L2,2 suy ra: (1 K D )2 KD ; S2,2 (1 K D ) (1 K D )3 (3.23) Tính tốn tương tự cho đĩa lượng chất pha động có kết bảng sau: Bảng 1.1 Giá trị Lx,n n=0 n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 x=0 1 KD x=1 KD (1 K D ) (1 K D ) x=2 K 2D (1 K D )3 2K D (1 K D )3 (1 K D )3 x=3 K 3D (1 K D ) 3K 2D (1 K D ) 3K D (1 K D ) (1 K D ) x=4 K 4D (1 K D )5 4K 3D (1 K D )5 6K 2D (1 K D )5 4K D (1 K D )5 (1 K D )5 x=5 K 5D (1 K D )6 5K 4D (1 K D )6 10K 3D (1 K D )6 10K 2D (1 K D )6 5K D (1 K D )6 (1 K D )6 x=6 K 6D (1 K D )7 6K 5D (1 K D )7 15K 4D (1 K D )7 20K 3D (1 K D )7 15K 2D (1 K D )7 6K D (1 K D )7 x=7 K 7D (1 K D )8 7K 6D (1 K D )8 21K 5D (1 K D )8 35K 4D (1 K D )8 35K 3D (1 K D )8 21K 2D (1 K D )8 Phương trình tổng qt tính lượng chất phân tích cho đĩa sau: Sx,n + Lx,n = Sx-1,n + Lx-1,n-1 (3.24) Sx,n K Dx n 1 x! (x n)!n! (1 K D ) x 1 (3.25) L x,n K Dx n x! (x n)!n! (1 K D ) x 1 (3.26) Điều kiện x n , x < n Lx,n = 0; Sx,n = Khi x tăng, Lx,n qua giá trị cực đại sau giảm dần tới Trong sắc ký, số đĩa lý thuyết thường lớn Giá trị Lx,n cực đại ký hiệu Lx*,n không khác nhiều so với Lx-1,n Ta viết: Lx*,n = Lx*-1,n Giá trị n lớn, vậy, giá trị Lx*,n viết lại là: 17 K Dx n K Dx 1n x* ! (x* 1)! * L * * x* 1,n (x n)!n! (1 K D ) x 1 (x * n)!n! (1 K D ) x * L x* ,n * Nhân hai vế phương trình với phân số: (x* n)!n! (1 K D ) x ta có: * (x* 1)! K Dx 1n * K Dx n KD x* ! (x* n)!n! (1 K D ) x x* * 1 * * x* n x* 1 n (x n)!n! (1 K D ) (x 1)! x n 1 KD KD * * x*.K D (x* n).(1 K D ) ; rút được: x* = n(1+KD) (3.27) x*.V = VR lượng dung dịch cực đại đường cong rửa n.V = Vm thể tích trống cột Nhân phương trình (3.27) với V ta có phương trình quan trọng để giải thích q trình sắc ký: VR = Vm(1+KD) (3.28) 1.3.3 Thuyết tốc độ, phƣơng trình Van Deemter Sự giãn rộng vùng mẫu Theo thuyết này, yếu tố tốc độ pha động có vai trị quan trọng hiệu tách sắc ký Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa hệ số khuếch tán chất phân tích pha động pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều tốc độ pha động Ngoài ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột , ảnh hưởng nhiều tới giãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng pic thu sắc đồ Các tác giả đưa đại lượng đặc trưng cho độ giãn rộng vùng chất phân tích chiều cao đĩa lý thuyết, H Chiều cao đĩa lý thuyết cấu thành yếu tố H1, H2, H3 đại lượng độ giãn rộng thành phần H = H1 + H2 + H3 (3.29) H1 đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng hạt nhồi, đường kính hạt nhồi, khả nạp cột, viết: H1 2d p (1.30) hệ số nạp cột, nạp cột tốt, = 1,5; d p đường kính hạt nhồi H2 đại lượng khuếch tán theo chiều dọc Nó hình thành khuếch tán chất phân tích hai đầu cột, phụ thuộc vào tốc độ pha động, hệ số khuếch tán chất phân tích pha động, đường chất phân tích, biểu diễn phương trình: H2 = B/u Trong B 2 Dm đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán chất phân tích pha động hệ số đường Trong điều kiện nạp cột tốt, 18 đường chất phân tích khơng q khúc khuỷu, ; Dm hệ số khuếch tán chất phân tích pha động, vậy, H2 viết là: (1.31) H2 2 Dm / u H3 đại lượng đặc trưng cho trình chuyển khối lượng, yếu tố phụ thuộc nhiều vào tốc độ hấp thụ giải hấp Quá trình phụ thuộc vào pha tĩnh pha động H3 viết: (1.32) H3 (Cs Cm )u Cs hệ số đặc trưng cho chuyển khối chất phân tích pha tĩnh phụ thuộc vào pha tĩnh, có giá trị nhỏ, tốc độ dòng, F 1ml / phút, Cs Cs K.d f2 / Ds (1.33) K – hệ số Ds – hệ số khuếch tán chất phân tích pha tĩnh d f2 - chiều dày pha tĩnh Cm số đặc trưng cho chuyển khối chất phân tích pha động, phụ thuộc vào pha động, Cm d p2 / Dm (1.34) hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1 D m hệ số khuếch tán chất phân tích pha động Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là: H 2d p 2 Dm / u (K.d f2 / Ds d p2 / Dm )u (1.35) Phương trình (1.35) thường viết tắt H = A + B/u + Cu Trong thực tế tính gần H 4d p Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm phương trình Van Deemter, ta có: H' B/ u C Tại cực tiểu, H' hay B/ u C u2t.ư=B/C 1/2 u t.ư= (B/C) (1.36) 1/2 Hmin = A + 2.(B/C) (1.37) 19 Hình 1.3 Đường cong Van Deemter Ngồi cịn có yếu tố làm giãn rộng vùng mẫu ngun nhân ngồi cột thể tích pha động đầu cột sắc ký detector lớn, thể tích mẫu bơm vào cột lớn, lượng mẫu lớn… Vì mục đích phạm vi nghiên cứu luận văn trình bày nên chúng tơi giới thiệu chi tiết sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography), sắc ký giấy (paper chromatography) sắc ký hấp phụ lỏng cột (Adsorption liquid chromatography on columns) 1.4 Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) [15, 18] Sắc ký lớp mỏng hay gọi sắc ký phẳng kỹ thuật phân bố rắn – lỏng Trong pha động chất lỏng xuyên qua lớp chất hấp thụ trơ silicagel nhôm oxit, chất hấp thụ tráng thành lớp mỏng, phủ lên phẳng kính, nhơm, plastic Do chất hấp thụ tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký lớp mỏng (hay sắc ký lớp mỏng) Trước Sắc ký lớp mỏng chủ yếu dùng phân tích định tính, đến áp dụng sang phân tích định lượng tiến kỹ thuật làm tăng tính lặp lại độ xác Hệ số di chuyển Rf đại lượng đặc trưng quan trọng mức độ tách Hệ số di chuyển R f tính theo cơng thức: Rf l v R f l0 v0 ... dung sắc ký vào chương trình Hố Học phổ thơng nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, trực tiếp hướng dẫn thực luận văn ? ?Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột sắc ký lớp mỏng vào giảng. .. đầu cột lỗng 1.2.3.4 Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ Theo phương pháp phân loại này, tất phương pháp sắc ký chia thành hai nhóm: Sắc ký cột sắc ký phẳng Trong sắc ký cột (kể sắc ký cột. .. theo ba phương pháp: tiền lưu, đẩy rửa giải Phương pháp rửa giải quan trọng phổ biến nhất, sau phương pháp đẩy, cịn phương pháp tiền lưu sử dụng A Phương pháp tiền lưu Theo phương pháp này, người