Việc tuân thủ và chấp hành các nội quy, quy Trang 5 1 Chỉ được làm thí nghiệm khi có sự hiện diện của giáo viên trong phòng thí nghiệm.2 Đọc kỹ hướng dẫn và suy nghĩ trước khi làm thí
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI Khoa Hóa Mơi trường BÀI GIẢNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CNSH Giảng viên: TS Cao Thị Huệ Bộ môn: Công nghệ Sinh học Hà Nội - 2021 Chương Giới thiệu phịng thí nghiệm 1.1 An tồn phịng thí nghiệm 1.2 Nhật kí phịng thí nghiệm báo cáo thực nghiệm 1.3 Hóa chất dụng cụ 1.4 Các loại pipet lấy dung dịch 1.1 An tồn phịng thí nghiệm gì? An tồn phịng thí nghiệm tiêu chí đặt để người làm việc phịng thí nghiệm tn thủ theo Việc tn thủ chấp hành nội quy, quy định giúp việc nghiên cứu trở nên an toàn thuận lợi Tránh rủi ro không xảy người phịng thí nghiệm Quy định chung Phịng thí nghiệm 1) Chỉ làm thí nghiệm có diện giáo viên phịng thí nghiệm 2) Đọc kỹ hướng dẫn suy nghĩ trước làm thí nghiệm 3) Ln ln nhận biết nơi để trang thiết bị an toàn 4) Phải mặc áo chồng phịng thí nghiệm 5) Phải mang kính bảo hộ 6) Phải cột tóc gọn lại Quy định chung Phịng thí nghiệm (2) 7) Làm bàn thí nghiệm trước bắt đầu thí nghiệm 8) Khơng nếm hóa chất thí nghiệm Khơng ăn uống phịng thí nghiệm 9) Khơng nhìn xuống ống thí nghiệm 10) Nếu làm đổ hóa chất xảy tai nạn, báo cho giáo viên 11) Rửa da tiếp xúc với hóa chất 12) Nếu hóa chất rơi vào mắt, phải rửa mắt 13) Bỏ chất thải thí nghiệm vào nơi quy định hướng dẫn 14) Nếu bạn chưa rõ vấn đề nào, hỏi Trách nhiệm cán bộ, nhân viên việc bảo đảm an tồn phịng thí nghiệm Quy định an tồn làm việc PTN 1/ Kiểm tra cẩn thận phương tiện, dụng cụ thí nghiệm trước sử dụng 2/ Khi cất nước phải thường xuyên kiểm tra nguồn nước vào thiết bị, không để xảy cạn nước 3/ Khi sử dụng xong thiết bị lò nung, tủ sấy, bếp đun…trong phịng thí nghiệm, phải tắt cơng tắc thiết bị tắt nguồn điện 4/ Phịng thí nghiệm CNSH, Hóa học phải trang bị quạt hút, vịi sen cấp cứu 5/ Khơng đổ hóa chất ngun vào bồn rửa dụng cụ cống xả gây nguy hiểm 6/ Khơng nhìn vào hóa chất chất lỏng sơi để tránh bắn vào mắt 7/ Phải nắm rõ vị trí cần thiết để thao tác cách nhanh gọn an toàn Quy định an toàn làm việc PTN (2) 7/ Sau thao tác xong thí nghiệm rửa dụng cụ dọn dẹp nơi quy định vệ sinh nơi làm việc luôn sẽ, khô 8/ Vệ sinh mặt bàn làm việc nhà xưởng sau ca làm việc 9/ Mang găng tay thu nhặt mảnh thủy tinh vỡ 10/ Khơng để vật dụng, hóa chất sàn nhà, lối 11/ Tất cố phịng thí nghiệm CNSH ghi chép đầy đủ vào sổ ghi nhận cố, thông báo cho Phụ trách PTN 12/ Trước kiểm tra máy móc thiết bị tắt nguồn điện Kiểm soát chất thải PTN Chất thải Phịng thí nghiệm kiểm sốt theo quy định quản lý chất thải Nhà máy Dung dịch mẫu nguyên dư phải tập trung lại nơi cung cấp mẫu, trả lại cho đơn vị giao mẫu Dung dịch sau thử mẫu thu gom hồ xử lý nước thải Hoá chất hết thời hạn sử dụng, hố chất rơi vãi, bao bì phế thải… cần thải bỏ phải cho vào bình chứa phù hợp, có nút đậy kín, có dán nhãn với tên đầy đủ, không viết tắt Báo cho quan quản lý để tiêu hủy cách 6.2.2 Cấu tạo phổ kế tử ngoại khả kiến Phổ tử ngoại khả kiến thiết kế đo vùng phổ từ 200 – 1000 nm Nó gồm hai loại: loại chùm tia đo điểm loại hai chùm tia quét vùng phổ 1/ Ngồn sáng: dùng đèn Tungsten halogen (đo vùng 350-1000nm) đèn đơteri hay đèn hiđro (đo vùng 200-350 nm) 2/ Bộ chọn sóng: dùng kính lọc đơn sắc Bộ đơn sắc dùng lăng kính chế tạo thạch anh cách tử (vạch từ 2000 – 3600 vạch/mm) 3/ Detectơ: phổ biến dùng tế bào nhân quang, có độ nhay độ bền cao Một số máy dùng detectơ dàn diot gồm 1024 diot cho vùng tử ngoại khả kiến 4/ Bộ phận đọc tín hiệu: loại máy đo điểm thường có phận đọc tín hiệu đồng hồ đo điện phận số Máy hai chùm tia dùng phận tự ghi ghép nối với máy vi tính máy in 6.2.3 Ứng dụng phổ tử ngoại – khả kiến Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến có ý nghĩa quan trọng lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử phân tích định lượng Nguyên tắc phương pháp phân tích định lượng dựa vào mối quan hệ mật độ quang nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer Ưu điểm phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến phân tích định lượng có độ nhạy cao, phát lượng nhỏ chất hữu ion vô dung dịch, sai số tương đối nhỏ (chỉ đến 3%) Ngồi ra, cịn sử dụng để xác định số cân bằng, số phân li nghiên cứu động 6.3 Ứng dụng phương pháp phổ định lượng protein nucleic acid Xác định nồng độ Protein phương pháp Lowry Cơ sở lý thuyết Phương pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 750 nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu NỘI DUNG ÔN TẬP Kiến thức phương pháp phổ Phương pháp phổ hồng ngoại khả kiến (UV-VIS) Ứng dụng phương pháp phổ định lượng protein nucleic acid TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI Khoa Hóa Mơi trường BÀI GIẢNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CNSH (9) Giảng viên: TS Cao Thị Huệ Bộ môn: Công nghệ Sinh học Hà Nội - 2021 Nội dung chương 9.1 Nguyên lý kỹ thuật Elisa 9.2 Các phương pháp Elisa 9.3 Ứng dụng phương pháp Elisa Elisa gì? ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an tồn chất lượng sản phẩm sinh học 9.1 Nguyên lý ELISA Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể gồm bước sau: (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme; (3) Thêm vào chất (substance): enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa KN-KT Sự diện phức hợp KN-KT định cường độ sáng phát Như vậy, ELISA giúp xác định có mặt hay khơng có mặt lượng KN mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate) Phương thức cố định không đặc hiệu Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA) Giữa bước ELISA, protein KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN lấy nhờ loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, KT liên kết với KN giữ lại Sau thêm vào, chất chịu tác dụng enzyme liên kết với KT phức hợp KT-KN Phản ứng phát quang (biến đổi chất) xảy Trước chất tạo màu sắc sử dụng ELISA ngày chất phát quang dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu độ xác ELISA Lịch sử phát triển Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT Năm 1966, Wide Porath phát triển phương pháp gắn KN KT bề mặt rắn (bề mặt vi phiếm hay đĩa) nhờ mà KN hay KT khơng gắn kết dễ dàng rửa trôi 9.2 Các phương pháp Elisa 9.2.1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) 9.2.2 Sandwich ELISA: Phương pháp sử dụng để phát KN mẫu nghiên cứu 9.2.3 ELISA cạnh tranh (1) "Ủ" KT không đánh dấu với KN (2) Đưa hỗn hợp vào giếng vi phiếm có chứa KN (3) Rửa đĩa, KT không gắn kết bị rửa trôi Lượng KN lớn, lượng KT gắn thành công với KN đĩa thấp "cạnh tranh" (4) Thêm KT thứ cấp (KT KT bước 1) KT thứ cấp gắn với enzym (5) Thêm chất Lượng enzym dư giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc cao, tín hiệu sản sinh yếu Một số trường hợp, enzym gắn với KN KT 9.3 Ứng dụng phương pháp Elisa Xác định nồng độ KT huyết thanh; Kiểm tra có mặt KN; Phát yếu tố có khả gây dị ứng thực phẩm; Xác định có mặt dược phẩm; Xác định hoạt tính hợp chất sinh học