Nghiên ứu thành phần hóa họ và hoạt tính sinh họ ủa ây ngọ nữ biển (clerodendrum inerme gaertn ) ở việt nam

Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm m t s hoạt tính sinh h c sộ ố ọ ẽ đóng góp vào việc tìm hiểu hóa thực vật cũng như cung cấp cơ sở khoa h c ch ng minh công

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Giảng viên hướ ng d n: ẫ TS Tr n Th ầ ị Minh

Hà Nội, 2020

Chữ ký của GVHD

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132236511000000

CỘNG HÒA XÃ H I CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Ộ

Độ ậ c l p – Tự do – H ạ nh phúc

H ọ và tên tác giả luận văn : Nguyễ n Th Minh Thương ị

Đề tài luận văn: Nghiên cứu thành ph n hóa hầ ọc và hoạt tính sinh học c a cây ủ

Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) ở ệ Vi t Nam

Chuyên ngành: Hóa học

Mã số HV: CB190038

Tác giả, Ngư i hườ ớng d n khoa hẫ ọc và Hội đồng ch m lu n văn xác nhận tác ấ ậgiả đã s a ch a, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hộ ồử ữ i đ ng ngày 16/12/2020 với các nội dung sau:

- Sửa lỗi chính tả trong luận văn

- B ổ sung, chỉnh sửa phầ ết luận k n cho ngắn gọn

ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

Nghiên c u thành ph n hóa hứ ầ ọc và hoạt tính sinh học c a câủ y Ngọc nữ biển

(Clerodendrum inerme Gaertn.) ở Vi t Nam ệ

Giảng viên hướng d n ẫ

LỜI CẢM ƠN

Năm năm học tập và rèn luyệ ởn Bách Khoa so với cả cuộc đời chả đáng là bao, nhưng đó lại là những năm tháng tuổi tr ẻ đáng ng và đáng trân trsố ọng nhất Cảm ơn Bách Khoa, vì những tr i nghiệm, vì nh ng ký c không bao giả ữ ứ ờ quên Luận văn được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – Bộ môn Hóa hữu cơ, Viện Kỹ thu t Hóa h c, Trườậ ọ ng Đại h c Bách Khoa Hà Nội ọ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Trần Thị Minh, cô đã từng bước

hướng d n và t n tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn ẫ ậCảm ơn cô đã luôn yêu thương, chỉ ạ d y học viên không chỉ ề, v cách làm nghiên cứu mà còn là cách sống

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Quý th y cô b môn Hóa hữu cơ, Ban lãnh ầ ộ

đạo Vi n Kỹệ thu t Hóa h c, Ban Giám hiệu trường Đạ ọậ ọ i h c Bách Khoa Hà Nội

đã tạo điều ki n thu n l i trong ệ ậ ợ suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Đặc bi t là các b n sinh viên tham gia nghiên cứu t i phòng thí nghiệ ạ ạ ệm

Hy vọng, sau này mỗi ngư i trong chúng ta đềờ u đ t đưạ ợc nh ng k v ng và ước ữ ỳ ọ

định c a b n thân ủ ả

Cuối cùng, tôi xin ử ờ ảg i l i c m đ n gia đình, bạn bè đã luôn ủế ng h và đ ng ộ ồhành bên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài: Nghiên cứu thành ph n hóa hầ ọc và hoạt tính sinh học c a câủ y Ngọc

nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) ở Việt Nam

Tác giả ậ lu n văn: Nguyễn Th ị Minh Thương

Mã học viên: CB190038 Lớp: 19BHH Khóa: 2019B

Giảng viên hướng d n: TS Trần Thị Minh ẫ

Từ khóa (Keywords): Clerodendrum inerme, Ngọc nữ biển, stems,extraction, isolation, structures, phenolic glycosides, bioactives, antioxidant, DPPH, cytotoxicity

Nội dung tóm tắt:

Cây Ngọc nữ ể bi n (Clerodendrum inerme Gaertn.) là loài đặc trưng của hệ

sinh thái vùng ngập m n, phân bố ộặ r ng khắ ừp t Bắc vào Nam và có trữ lượng l n ớTrong dân gian cây Ngọc nữ biển được dùng chữa các bệnh phong thấp, sốt rét, đểviêm gan… Ở Việt Nam hiện chưa có nhiều công trình công bố về thành phần hóa

học cũng như hoạt tính sinh họ ủc c a cây này Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm m t s hoạt tính sinh h c sộ ố ọ ẽ đóng góp vào việc tìm hiểu hóa thực vật cũng như cung cấp cơ sở khoa h c ch ng minh công dụng trị ọ ứbệnh trong dân gian của loài cây này

a Mục đích nghiên cứu

Nghiên c u phân lứ ập và xác định cấu trúc hóa học c a các chủ ất từ thân cây Ngọc nữ ể bi n Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư của

một số chấ phân lập được t

b Đối tượng và ph m vi nghiên cạ ứu

Mẫu thân cây Ngọc n bi n đượữ ể c thu hái vùng ven bi n huy n ở ể ệ Tiền Hải, tỉnh Thái Bình, Việt Nam

3 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu thực vật được x lý sơ b thành dạng bột khô Sau đó được ngâm chiết ử ộsiêu âm kết hợp chiết phân bố ỏ l ng - lỏng để thu được các phân đoạn chiết có độ phân cực tăng dần

Phân lập các h p chợ ất tinh khiết từ c ao chi t EtOAc bằng các phương pháp ế

a Nội dung chính

Thu thập và định danh mẫu thực vật

Chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các h p chợ ấ ừt t cao chiết ethyl axetat của loài C inerme

Đánh giá hoạt tính sinh học, bao gồm: chống oxy hóa và gây độ ếc t bào ung thư của mộ ố ợt s h p ch t phân lập được ấ

Sau quá trình nghiên cứu, đề tài đã thu được các k t qu sau: ế ả

Đã thu nhận được 17g cao chiết EtOAc ừ kg mẫu thân cây Ngọt 5 c n biển ữ

Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 5 h p ch t ợ ấ phenolic glycoside

t ừ cao chiết EtOAc, đó là: clerodenoside A (CI5), seguinoside K ( CI6),

cistanoside D (CI7), verbascoside (CI8), isoverbascoside (CI9)

Một số ợp chất phân lập đã đượ h c th nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và gây ử

độc trên mộ ốt s dòng tế bào ung thư ở ngư i K t qu cho th y, hai h p ch t ờ ế ả ấ ợ ấverbascoside và isoverbascoside thể hiện ho t tính chống oxy hóa với giá trị ECạ 50

lần lượt là 40,71±2,52 và 36,24±1,69 µg/ml Hai hợp chất clerodenoside A và seguinoside K chưa thể ệ hi n ho t tính gây độạ c trên các dòng t bào ung thư tại ế

nồng độthử nghiệm

Học viên Nguyễn Thị Minh Thương

i

MỤC LỤC

MỤC LỤ i C

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH iv

MỞ ĐẦU vi

CHƯƠNG 1: TỔ NG QUAN 1

1.1 Tổ ng quan th c vật 1 ự 1.1.1 Thự ậ ọc v t h Verbenaceae 1

1.1.2 Thự ậc v t chi Clerodendrum 2

1.1.3 Thự ậc v t loài C inerme 3

1.1.4 Công d ng trong dân gian cụ ủa loài C inerme 3

1.2 Các nghiên cứu về hành phầ hóa họ ủ t n c c a loài C inerme 4

1.2.1 Các terpenoid 4

1.2.2 Các steroid 8

1.2.3 Các flavonoid và hợp chất phenolic khác 8

1.3 Tổng quan v nghiên c u ho t tính sinh h c c a loài C inerme 11 ề ứ ạ ọ ủ 1.3.1 Hoạt tính kháng virus 11

1.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa, ung thư 12

1.3.3 Bảo vệ gan 12

1.3.4 Hoạt tính chống viêm, gi m đau 13 ả 1.3.5 Hoạt tính diệt côn trùng gây hại 13

1.4 Tìm hiểu về các hợp chất phenylethanoid glycoside 14

1.4.1 Khái niệm và sinh tổng hợp các h p chợ ất phenylethanol glycoside 14

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các h p chợ ất phenylethanoid glycoside 16

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰ C NGHI M 18 Ệ 2.1 Đố i tư ng và phương pháp nghiên c ợ ứ u 18

2.1.1 Mẫu thực vậ 18 t 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.1.2.1 Phương pháp chiết mẫu th c vật 18 ự 2.1.2.2 Các phương pháp sắc ký để phân lập chất 18

2.1.3 Các phương pháp phổ xác định c u trúc hóa học các chất đã phân lập 18 ấ 2.1.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 19

a Hoạt tính chống oxy hóa 19

b Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 19

2.2 Thực nghiệ 19 m 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 19

2.2.2 Chiết mẫu th c v t 20 ự ậ 2.2.3 Phân lập chất từ cao chiết EtOAc của loài C inerme 20

2.2.3.1 Quy trình phân lập chấ ừt t cao chiết EtOAc c a loài C inerme 20 ủ 2.2.3.2 Dữ ệ li u ph c a các hợp chất phân lập được 22 ổ ủ

ii

a Hằng số ật lý và số liệu phổ ủ v c a h p chợ ất CI5 22

b Hằng số ật lý và số liệu phổ ủ v c a h p chợ ất CI6 23

c Hằng số ật lý và số liệu phổ ủ v c a h p chợ ất CI7 23

d Hằng số ật lý và số liệu phổ ủ v c a h p chợ ất CI8 24

e Hằng số ật lý và số liệu phổ ủ v c a h p chợ ất CI9 24

2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chấ t phân l p đư c ậ ợ 25

2.2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa 25

2.2.4.2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26

CHƯƠNG 3: KẾ T QU VÀ TH O LU N 27 Ả Ả Ậ 3.1 Thu nguyên liệu và chiết mẫu 27

3.2 Phân lập và xác đị nh c u trúc hóa h c c a các chấ ừ ấ ọ ủ t t cao chiết EtOAc 27

3.2.1.Phân lập chất 27

3.2.2 Xác định c u trúc các hợp chất phân lập được 27 ấ 3.2.2.1 Hợp chất CI5 (clerodenoside A) 27

3.2.2.2 Hợp chất CI7 (cistanoside D) 34

3.2.2.3 Hợp chấ CI8 (verbascoside) 39 t 3.2.2.4 Hợp chất CI9 (isoverbascoside) 44

3.2.2.5 Hợp chất CI6 (seguinoside K) 49

3.3 K ết quả thử nghi m ho t tính sinh h c 55 ệ ạ ọ 3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa 55

3.3.2 Hoạt tính gây độ ếc t bào ung thư 55

K ẾT LUẬ 57 N KIẾN NGHỊ 57

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦ A LU N VĂN 58 Ậ DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 59

DANH M Ụ C TÀI LIỆ U THAM KH Ả O 60 PHỤ LỤ C CÁC PH 65 Ổ

RP18 Reversed Phase Chromatography C18 ( c ký cSắ ột pha đảo C18)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký l ng hiệu năng cao) ỏ

IR Infrared (Phổ hồng ngoại)

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry

(Phổ khối lượng phun mù điện tử)

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

(Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton) ừ

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng t h t nhân carbon 13) ừ ạHSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy

(Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên k t) ế

COSY

1H - 1H Correlation Spectroscopy (Phổ tương tác giữa các h t nhân proton li n kạ ề ề)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

(Phổ tương tác đa liên kết dị hạt nhân ) DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

LD50 Lethal Dose 50% (Liều gây chết trung bình 50% đối tượng th nghiệm) ử

EC50 Half Maximal Effective Concentration (Nồng độ 50% tác dụng tối đa)

IC50 Half Maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ ứ c chế 50% đối tượng

thử nghiệm) ppm part per million

iv

DANH M C B Ụ Ả NG, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Hình 1: Cây Ngọc nữ biển (C inerme) 3

Hình 2: Sơ đồ sinh tổng hợp các phenylethanoid glycosides trong thực vật [35] 15

Hình 3: Tương quan nồng độ DPPH và mật độ quang học 26

Hình 4: Phổ ESI MS (negative) c a h p ch- ủ ợ ất CI5 28

Hình 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất CI5 28

Hình 6: Phổ DEPT c a h p chủ ợ ất CI5 29

Hình 7: Tương quan (HC) HMBC củ ợa h p ch t CI5 30ấ Hình 8: Tương quan (HC) HMBC củ ợa h p ch t CI5 31ấ Hình 9: Cấu trúc hóa học c a h p chủ ợ ất CI5 32

Hình 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất CI7 34

Hình 11: Phổ DEPT của h p chợ ất CI7 35

Hình 12: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI7 36

Hình 13: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI7 37

Hình 14: Cấu trúc hóa học của hợp chất CI7 39

Hình 15: Phổ 1H-NMR của hợp chất CI8 39

Hình 16: Phổ DEPT của h p chợ ất CI8 40

Hình 17: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI8 41

Hình 18: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI8 42

Hình 19: Cấu trúc hóa học của hợp chất CI8 44

Hình 20: Phổ 1H-NMR của hợp chất CI9 44

Hình 21: Phổ DEPT của h p chợ ất CI9 45

Hình 22:Tương quan (HC) HMBC củ ợa h p ch t CI9 46ấ Hình 23: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI9 47

Hình 24: Cấu trúc hóa họ ủc c a hợp chất CI9 49

Hình 25: Phổ 1H-NMR của hợp chất CI6 49

Hình 26: Phổ 13C NMR và DEPT của h p chợ ất CI6 50

Hình 27: Tương quan (HC) HMBC của h p chợ ất CI6 51

Hình 28: Tương quan (HC) HMBC củ ợa h p ch t CI6 51ấ Hình 29: Cấu trúc hóa học của hợp chất CI6 54

Sơ đồ 1: Sơ đ chiết mẫu cành Ngọ ữồ c n biển 20

Sơ đồ 2: Sơ đồ phân l p ch t t cao EtOAC cành Ngọ ữậ ấ ừ c n biển 21

Bảng 11: Kết qu thử nghiệm hoạt tính gây độ ếả c t bào ung thư của CI6 56

vi

M Ở ĐẦ U

Các h p chợ ất thiên nhiên nói chung và các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng là một trong những lĩnh vực nghiên cứu nhận được nhi u quan tâm của các ềnhà khoa học trong và ngoài nước T xa xưa, con người đã khám phá và biết ừcách sử dụng nhiều loài thực vật nhằm m c đích ch a bệnh Vì v y, viụ ữ ậ ệc nghiên cứu thành phần hóa h c và hoọ ạt tính sinh học nhằm góp phần nâng cao giá trị ử s dụng của các loài cây có tác dụng trị ệ b nh trong dân gian là c n thiầ ết và có giá trị khoa học

Theo Trung tâm dữ ệ li u thực vật Quốc gia, thực vậ ừng ngập mặn nước ta t r

có kho ng 47 hả ọ ớ v i hơn 100 loài phân b theo t ng khu v c Có kho ng 21 loài ố ừ ự ảtrong s này có giá trố ị làm dư c li u trong các bài thuốc cổợ ệ truy n, được nhân ềdân ta sử ụ d ng đ chữa các bệnh viêm nhiễm, u nhọt, cầm máu… ể

Trong dân gian, cây thuốc thuộc chi Mò Clerodendrum) thường đượ ử ( c s

dụng chữa trị các bệnh phong thấp, tiêu viêm, hen suyễn, thanh nhiệt giải độc, ngăn ngừa t bào ung thư,…Nổi bật nhất vẫế n là th c vật Ngọự c n biển ữ

(Clerodendrum inerme Gaertn , bên cạnh tác d.) ụng chữa bệnh, còn có tác dụng diệt côn trùng gây hại nhờ ộ m t số thành ph n hóa hầ ọc có độc tính mạnh Các nghiên cứu trên thế ớ ề gi i v ho t tính sinh học c a cây này tạ ủ ập trung theo hướng gây độc tế bào ung thư, kháng virus, bảo vệ gan Tuy nhiên những nghiên cứu

trong lĩnh vực hóa học cũng như hoạt tính sinh h c v loài này ở trong nước ọ ềkhông nhiều

Chính vì vậy, việc l a chự ọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của y câ Ngọc nữ ể bi n (Clerodendrum inerme Gaertn.) ở Việt Nam’’ s ẽ đóng góp vào việc tìm hiểu hóa thực vật cũng như cơ sở khoa h c ọchứng minh công dụng trị bệnh trong dân gian của loài cây này

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan thực vật

1.1.1 Thực vật họ Verbenaceae

H C ọ ỏ roi ngựa có tên khoa h c là Verbenaceae, gồọ m kho ng 100 chi và ả

2600 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệ ớt đ i và cận nhiệ ớt đ i, ít có vùng ôn đới ởThực vật họ Verbenaceae khá đa dạng, từ loài thân gỗ đế n loài thân bụi và thân

cỏ Các loài thuộc d ng thân gỗạ ho c bụi có rễ ụ ớặ tr , v i các loài thân cỏ thì có rễ chùm và các loài thực vật chi Mắm Avicennia spp mọ ở- c vùng đất ngập mặn ven biển có rễ hô h p Lá m c đ i hay mọc vòng, không có lá kèm, phiến lá ấ ọ ốthường đơn, đôi khi kép chân vịt hay lông chim Cụm hoa d ng bông, xim hai ạngả ho c các bi n d ng khác Hoa thườặ ế ạ ng lư ng tính, lá noãn 2, hợp thành bầu ỡthượng 2-4 ô Quả thường là h ch v i v qu n c hay khô, ạ ớ ỏ ả ạ thường 1 ạch, ít khi h

Trong Hệ ự th c v t Vi t Nam, h Verbenaceae tuy không lớn nhưng rất đa ậ ệ ọ

dạng về các đặc điểm hình thái và sinh thái Hi n có khoệ ảng 20% số loài và gần 66,7% số ứ th đã biết đư c coi là đặợ c h u M t s chi th c v t n i bậ ởữ ộ ố ự ậ ổ t Việt Nam:

- Chi Vọng Cách (Premna L.): hiện có 2 loài đó là Cách (Premna

serratifolia L.) và Cách lá rộng (Premna latifolia Roxb.)

- Chi Mò (Clerodendrum L.): là chi có số loài đa dạng và phong phú nhất, gồm 8 loài và 2 thứ được coi là đặc hữu

- Chi Tử châu (Callicarpa L.): có tới 6 loài-chiếm 30% s ốloài trên thế giới Điển hình là từ lá loài Nàng nàng (C candicans (Burm f.) Hochr) đãtách được một diterpen là callicarpone e có hoạt tính kháng khu n và diẩ ệt côn trùng mạnh, vớ ội đ độc cao hơn nhiều lần so với rotenone Trong dân gian, Nàng nàng được dùng chữa cảm, giải nhiệt, gi m đau, vàng da, kém ăn, ảbuồn nôn, lở loét

- Chi Bình linh (Vitex L.): gồm 2 loài là Ngũ trào (V negundo L.) và ạn M

kinh (V trifolia L.) Trong dân gian, chúng đượ ửc s dụng như thuốc ch a ữnhức đầu và kích thích tiêu hóa

- Chi Bội tinh (Sphenodesme Jack.): đây là chi ít được nghiên cứu Trong

Y học dân tộc ở Malaysia, nướ ắ ừc s c t r cễ ủa mộ ốt s loài trong chi Bội

- Chi Mắm (Avicennia L.): có 3 loài, trong đó loài Mắ m bi n (A Marina ể(Forsk.) Vierh.) được coi là đặc h u Chúng phân bố trong các dải rừng ữngập mặn ven bi n t Quảng Ninh đến Kiên Giang ể ừ

- Chi Cỏ roi ngựa (Verbena L.): có 2 loài là ỏ roi ngựa (V officinalis L.) C

và Mã tiên bông (Verbena hybrida Hort ex Vilm)

- Chi Ngũ sắc (Lantana : L.) ở nước ta ch gặp 1 loài Ngũ sắc (L camara L.) ỉvới các tên gọi khác nhau như Bông ổi, Trâm ổi, Thơm ổi hay Hoa tứ ờ th i Các h p chợ ất phân lập từ cây có tác dụng kháng khu n, di t ký sinh trùng ẩ ệ

sốt rét

- Chi Hải tiên (Stachytarpheta Vahl.): chỉ có 1 loài Hải tiên (S jamaicensis

(L.) Vahl.) được s d ng làm thuốc chữa đườử ụ ng ti t ni u, viêm họng, ế ệviêm thấp khớp, gan, d dày, sốt rét, kiết lỵ, giang mai ạ [1]

Ở Việt Nam, một số loài thuộc h ọVerbenaceae đượ ửc s dụng phổ biến trong các bài thuốc c truyền, tuy nhiên các nghiên c u v thành phổ ứ ề ần hóa học của chúng còn hạn chế

1.1.2 Thực vật chi Clerodendrum

Chi Mò hay Bạch đồng có tên khoa học là Clerodendrum, gồm khoảng hơn

500 loài, phân bố ủ ch yếu ở các khu v c cự ận nhiệ ớt đ i và nhiệ ớt đ i trên thế ớ gi i

Thực vật chi Clerodendrum thường là cây nhỏ, cây bụi và các loại thảo mộc Lá mọc đối xứng, có răng cưa hoặc không, cuống lá gắn xung quanh thân cây Cụm hoa mọc trên thân cây hoặc nách lá, hoa lưỡng tính, đài hoa bền, tràng hoa có dạng ống hình trụ ỏ t a rộng với năm thùy, nhị 4 hoặc 5 (s ố lượng b ng tràng hoa), ằ

b ộnhụy có 4 lá noãn không đều nhau

Một số loài từ chi này đã đượ ử ục s d ng làm thuốc chữa bệnh bởi các bộ ộ t c khác nhau ở Châu Phi và các bài thuốc dân gian Châu Á như n ĐẤ ộ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản… Rễ và chiết xu t lá c a các loài C phlomidis, C ấ ủ

trị bệnh thấp khớp, hen suyễn và các bệnh viêm khác

Loài C inerme đượ ử ục s d ng đ đi u tr ho, nhi m trùng huy t thanh, bể ề ị ễ ế ọng nước, nhi m trùng hoa liễ ễu, b nh v da… Các bộ ạệ ề l c sử ụ d ng loài C inerme làm

thuốc giải độc do ngộ độ ừ c t cá, cua và cóc Ngoài ra, các loài C phlomidis, C

-bệnh tăng huyết áp và an thần Loài C cyrtophyllum và C chinense được s ử

3

dụng đ điềể u trị ốt, vàng da, thương hàn và giang mai Rễ, lá và nước ép tươi s

của loài C infortunatum đượ ử ục s d ng làm thuốc nhu n tràng.ậ

Loài C phlomidis đã đượ ử ục s d ng đ làm lành vết thương và điềể u tr b nh ị ệ

lậu Rễ ủa loài C serratum đã đượ ử ụ c c s d ng trong rối lo n tiêuạ hóa Loài C

Y học Trung Quốc sử ụ d ng loài C bungei trong điều trị nh c đầu, chóng mặt, ứmụn nhọt và bệnh sa tử cung và quả ủ c a loài C petasites s dử ụng làm thuốc cho

bệnh ốt rét Lá của loài C buchholzii chữa viêm dạ dày Bên cạnh đó, một số s

thực vật loài C inerme, C thomosonae và C spe ciosum cũng đượ - c tr ng làm ồ

cây cảnh [2]

1.1.3 Thực vật loài C inerme

Cây Ngọc nữ ể bi n có tên gọi khác là Vọng đắng, Chùm gọng hay Vạng hôi,

có tên khoa học là Clerodendrum inerme Gaertn., thuộc chi Mò (Clerodendrum),

h C ọ ỏroi ngựa (Verbenaceae)

2m, có thể ọ m c trườn dài t i 2-3m Cành không có lông, v màu nâu tím, bóng ớ ỏ

Lá đơn, mọc đối, phi n nguyên, dạng xoan bầu dục, dày đày, không lông, có 5-7 ếcặp gân phụ, cu ng dài 6-8mm Xim có 3 hoa, màu trắng, đài hình ng, 5 lá đài, ố ốtràng dài 4-5cm, thùy trắng tim tím, nhị dài thò ra ngoài, màu đỏ tím Quả ạ h ch

có 4 khía, tròn, to (đường kính 10-13mm) Cây ra hoa quanh năm, thường g p ặvào tháng 5-7, quả chín vào tháng 11.9-

Cây Ngọc nữ biển là loài sống phổ biế ởn các nước ven biển nhiệ ớt đ i Ở nước ta, cây mọ ởc các vùng bờ biển và c a sông từ Bắc vào Nử am [ ] 3

Hình 1: Cây Ngọc nữ ể bi n (C inerme)

1.1.4 Công dụng trong dân gian của loài C inerme

Loài C inerme ó vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệ c t, gi i đ c, tán ứ, ả ộ

tr thừ ấp, dịch lá có tác dụng gi i nhiệả t, h sốt Trong dân gian, cây dùng để trị ạ

Thực vật thuộc chi Clerodendrum từ lâu đã được dùng làm thuốc trừ sâu

thảo mộ ấc r t hi u qu v i tác d ng gây ngán ăn và ức chế sinh trưởng côn trùng ệ ả ớ ụ

Một số bài thuốc chữa bệnh t ừ loài C inerme:

• Bài thuốc chữa bệnh cảm lạnh, đau mỏi gân c t, đau dây thần kinh: ố

30g rễ loài C inerme c nước uống ít nh sắ ất 3 lần trong ngày, uống liên tục trong 3-4 ngày

• Chữa v t thương đau nhứế c, b m tím do b ngã: ầ ị

Giã lá tươi và thêm ít rượu, hơ nóng để đắ p ngoài vùng bị đau

• Bài thuốc chữa đau lưng:

1

Chuẩn bị kg thân loài C inerme khô, 10 quả ứ tr ng gà, 2l rượu Đầu tiên cắt mỏng thân cây, sao vàng, hạ ổ th , sau đó cho cây vào ngâm với 2l rượu cho ra hết chất thu c màu đỏ thì bỏố bã Ti p t c đ p 10 quả ứế ụ ậ tr ng gà lấy lòng đỏ khu y ấtan cho nổi b t, cho thêm trọ ứng mật ong vào rượu thu c Ngày uống 1 ly nhỏ lúc ốsáng sớm và trư c khi đi ngủớ , có tác dụng trị suy thận, đau khớp ngang hông [4]

1.2 Các nghiên cứu về t hành phần hóa học của loài C inerme

là Ấn Độ Trên th gi i đã có r t nhiều nghiên c u v thành phế ớ ấ ứ ề ần hóa học, hoạt tính sinh học cũng như tác dụng chữa bệnh của loài cây này Có khoảng 80 hợp chất đã được báo cáo tìm thấy trong các bộ ph n của cây, chủ ếậ y u thuộc các lớp chất: terpenoids, steroid , flavonoid và phenolics s s Dưới đây trình bày khái quát

v ềcác chất phân lập đượ ừc t loài C inerme

1.2.1 Các terpenoid

Các nghiên cứu đã chỉ ra các h p chợ ất terpenoid phân lập từ loài C inerme

chủ yếu ở ạng: monoterpenes, diterpenes, triterpenes và dẫn xu d ất của chúng.Các h p chợ ất monoterpene phân lậ ừp t loài C inerme chủ ế y u ở 2 dạng: iridoid glycosides và megastigmane glycosides Bao gồm 9 h p ch t iridoid ợ ấ

gl cosidey s: inerminoside A1 (1), inerminoside C (2), inerminoside C heptaaceatate

(2a), inerminoside D (3) , inerminoside A , inerminoside B (5), sammangaoside (4)

C (6), monomelittoside (7), melittoside (8) và 2 hợp chất megastigmane

glycosides m i ớ là: sammangaoside A ( ) và sammangaoside B (9 10) [5,6,7]

O O

O OR

O

O

CHOR2OR RO

COOH

(2) R= H(2a) R= Ac

O

O

CH2OH OH HO

O OH

O

O

2 OH OH OH

COOH

O OH

CH3

(5) HO

HO (9)

HO

O O-Glc

(10)

Các h p chợ ất diterpene ở loài C.inerme khá đa dạng T dịch chiết MeOH của ừ

lá C.inerme các nhà nghiên cứu phân lập được 2 h p ch t clerodane diterpenes, ợ ấ

đó là clerodemic acid (11a), methyl clerodermate ( b 11 ) [8]

6

Bên cạnh đó, các neoclerodane diterpenoid cũng được tìm th y trong dịch ấ

chiết n-hexane của thân và lá loài C inerme được thu hái ở Ấ n Độ năm 2003, đó

là: 3-epicayoptin (12) , clerodendrin B ( ) 13 , clerodendrin C ( ) 14 , clerodendrin

acetate (15), 15 hydroxyepicaryoptin ( )- 16 , inermes A ( ) 17 , inermes B ( ) 18 ,

14,15-dihydro-15β-methoxy-3-epicaryoptin (19) và 14,15-dihydro 15-hydroxy-

-3-epicaryoptin (20) Trong đó, c h ác ợp chất (12) ( ) , 13 , ( ) 15 thể hiện hoạt tính gây

ngán ăn ở côn trùng [9,10,11]

O O COOR

(11a) R=H

(11b) R=Me

O O

AcO O

O O

(13) O

OH O

CH2OAc OAc C

O OAC

O O

O

OH

O

CHOAc OAc C

O

OAC

(14)

O O

O

AcO O

CH2OAc OAc C

O OAC

(15)

O O

O AcO

CH2OAc

AcO

OAc O

(19) R1 =H, R2= OMe (20) R1 , R2 = OH, H

R2

R1

(24 )

OH HO

O O HO

7

O

OH

O OH (21)

O OH

HO O

OH OH

(22)

O OH

HO

OH OH

(23)

Ngoài ra, 3 h p chợ ất diterpenoid khung abietane lần lượt là: uncinatone (21),

crolerodendrum B ( ) 22 , crolerodendrum A ( ) 23 cũng được phân l p t thân và lá ậ ừ

loài C inerme [12,13] Năm 2010, từ phân đo n chi t EtOAC loài C inerme ở ạ ếViệt Nam, đã phân l p đưậ ợc 1 h p ch t diterpene khung ent-ợ ấ labdan có tên là e

andrographolide (24) [14]

Từ nh ng phân đoạn chiết khác nhau của loài C inerme, các nhà nghiên cứu ữ

đã phân l p đưậ ợc 10 h p chất triterpenes Bên cạnh hợp chất: 3-O-acetyloleanolic ợ

acid (25) thể ệ hi n hoạt tính c ch dòng t bào ung thư ruứ ế ế ột k t ế ở người 116) [12,15], m ột lupene triterpene glycoside mới là lup 1,5,20(29)-trien- -O-- 3 β-

(HCT-D-glucopyranoside (26) được phân l p từ lá loài C inerme thu hái tại Ấn Độ [16] ậ

Từ loài C inerme Vi t Nam m t ester lupanhexacosanoat cũng đã được ở ệ ộphân lập đó là 20(29) lupen- -3 -O-β yl hexacosano at (27) [14]

(25)

(26 )

H O

O

OH

HO HO

OH

O O

(27)

5,9(11),22E-trien-3β-ol (31), 4α-methylsterol (32a) ở ạng dẫn xuất acetyl, d

5α ,8α epidioxyergosta 6,22- - -diene-3 -β ol (33) mvà ột số ợp chấ sterol đã biết h t như: 24β-etyl 25-dehydrolophenol (32b) và gramisterol (32c), obtusifoliol (34c), -stigmast-5- -3 - en β ol (35) [11,13,14,19]

R

HO

H (34 )

(35) HO

9

3,7,4’-trimethyl ether (42) là những hợp chất khung flavone và flavonol được tìm

thấy từ các phân đoạn chiết của loài C.inerme [8,13,14,20]

(37) R=CH3 , R'=H (38) R=R'=CH3

O RO

HO O

OR (39) R=CH3

OMe MeO

OMe

Các hợp chất enolicph cũng được tìm th y trong các phân đoạấ n chi t khác ếnhau t ừ loài C inerme chủ ế, y u ở ạ d ng phenylalcohoid monoglycoside và diglycoside với gốc caffeoyl… thường g n các v trí C-ắ ở ị 2, C 3, C 4 và C-6 của - -đơn v đưị ờng glucose trong phân tử Bao gồm, 3 h p ch t phenylethanoid ợ ấglycosides hay gặp: verbascoside ( ) 43 , leucosceptoside A ( ) 44 , isoverbascoside ( ) 45 và 4 hợp chất phenylethanoid glycosides ít gặp lần lượt là: clerodenoside A

( ) 46 , decaffeoylverbascoside (47), darendoside B (48), salidroside (49) [5,21 ]

O O HO

O O O O

O O

O OH

OH O O

HO

OH O

(46)

O O

O HO

O HO

OH OH

HO

HO

OH OH

(47)

OH OH HO

HO OH OH

OH OH

(45)

OH

OH OH

Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng chỉ ra s có mặ ủự t c a 2 h p ch t benzyl ợ ấ

alcohol glycosides là: benzyl alcohol β-glucopyranoside ( ) 50 , benzyl alcohol

β-(2’-O-β-xylopyranosyl) glucopyranoside (51), cùng với đó là 2 h p ch t khung ợ ấhydroquinone glycosides: 2,6-dimethoxy- -p hydroquinone 1-O-β-glucopyranoside

(52) , seguinoside K 53 cũng đã đượ ( ) c phân l p t d ch chiết MeOH loài ậ ừ ị

Clerodendrum inerme [5]

O O HO

(51)

(52)

O O O

O

O

OH O

OH O

HO HO

O

OH

(53)Các neolignan và neolignan glycosisde cũng đã được phân l p t các d ch ậ ừ ị

chiết lá và hạt loài C inerme: (7S, 8R) dehydrodiconiferyl alcohol 9-

-O-β-glucopyranoside (54), (7S, 8R) dehydrodiconiferyl alcohol 4-

-O-β-glucopyranoside (55), neolignan 1 (56) và neolign an 2 (5 7) [5,22]

O

O

CH2OH O

OH OH

OH

HO

(56) R = Me, R1 = R2= R3= R4= -CH2(57) R = Me, R1 = R2= - CH2- ; R3= R4= Me

5 mg/ml, 10 mg/ml và 15 mg/ml) được ki m tra bằng phương pháp khuyếch tán ểđĩa Kết qu là d ch chiết methanol, ethyl acetate và nước cho thấả ị y kh năng c ả ứchế đáng k v i 15 trong tổng số 18 vi khuẩn đượể ớ c th nghiệm Trước đó, các ửnghiên cứu cũng chỉ ra r ng dịch chiếằ t EtOH có tác d ng h huy t áp Dịch chiết ụ ạ ế

12

thô cho hiệu qu ả cao nh t là ethyl acetateấ , dịch chiết MeOH ức chế ự s tăng trưởng c a 15 vi khuẩn gây bệnh cho người [ ].ủ 23

Năm 2008, Sayyed Hamid cùng các cộng s đã đánh giá kh năng chự ả ống

nhau Với dịch chiết EtOH, nước và hloroform nc ở ồng độ500 µg/ml, hiệu quả

ức ch ch ng l i các vi sinh v t tiế ố ạ ậ ếp xúc, trong đó dịch chiết EtOH có hoạt tính cao nhất, CCl4 có hoạt tính thấp nhấ [24] t

Năm 2006, Kavitha cùng các cộng s ự đã nghiên cứu khả năng chống ung thư miệng từ lá c a loài ủ C inerme Tạ ều lượng 500 mg/kg trọi li ng lư n g cơ thểợ có tác dụng ngăn ngừa đáng kể ỷ t l mệ ắc ung thư, giảm trọng lượng và s lượng các ốkhối u trên chuộ ồt đ ng đã được tiêm DMBA K t qu cho th y d ch chi t nư c ế ả ấ ị ế ớ

của lá loài C inerme có tác dụng triệt tiêu sự tăng sinh tế bào ung thư [25]

Năm 2010, Trần Th Minh và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính gây độc mộ ốị t s dòng tế bào ung thư ngưở ờ ủi c a h p ch t andrographolide – phân lập từ lá loài C ợ ấ

t ế bào ung thư phổi (LU) rất tố ạt, t i IC50 = 4,32 µg/ml [14]

Năm 2015, Donghai Li và cộng s nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của ựdịch chiết tổng EtOH và d ch chiị ết phân đoạn của loài C inerme Kh năng ả

chống oxy hóa của dịch chiết từ loài C inerme và dịch chiế ừt t 5 dung môi khác nhau có hoạt tính chống oxy hóa trong xét nghiệm g c t do DPPH và ABTS ố ựTổng hàm lượng phenolic (TPC) hàm lượng flavonoid (TFC) đã được s d ng đ ử ụ ểđịnh lượng các hợp ch t chấ ống oxy hóa Dịch chiết EtOAc và n-BuOH cho thấy

các đặc tính ch ng oxy hóa mạố nh nh t [26] ấ

Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Kumar thử nghiệm hoạt tính chống ung thư

t ừcành và lá loài C inerme Chiết xuất cho thấy độc tính tế bào dưới 100 ppm và

LD50 = 30 ppm Sự ả gi m kh năng tồn tạ ủả i c a tế bào được quan sát ở ồ n ng đ ộ

213 μg/ml và cho thấy hiệu quả chống ung thư, chống l i các tế bào lympho ạBurkitt; thử nghiệm tại khối u chuột cho thấy tuổi thọ tăng so v i nhóm đở ớ ối chứng, khi được điều tr t loài C inerme (200 - 400 mg/kg) và doxorubicin (2,5 ị ừmg/kg thể trọng) thể hiện tác đ ng đáng kểộ lên các kh i u Do đó có thể nói rằng ố

Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy loài C inerme là nguồn thực vật đầy ti m ềnăng trong các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư

Năm 2008, Gopal và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan t d ch ừ ịchiết EtOH (H2O/EtOH = 1/1) ủa lá loài c C inerme trên chuột ạch Thụb y Sĩ ởliều lượng 200 mg/kg Các nhà khoa học đã gây t n thương gan bằng cách tiêm ổ

13

phúc mạc tác nhân gây độc CCl4 ,5 (0 ml/kg), các nồng độ enzyme huyế thanh t alanine amin transferase asparate amino transf, erase, phosphate kiềm, triglyceride và cholesterol tăng lên rõ rệt S dụng dịch chiếử t EtOH c a C inerme ủlàm giảm ALT, AST, ALP, triglyceride, cholesterol và tăng lên đáng kể ứ m c glutathione khi so sánh với silymarin (25 mg/kg) - một loại thuốc bảo vệ gan được s d ng trư c đó V c tính, không thử ụ ớ ề độ ấy cá thể nào chết khi tăng liều lượng đến 2000 mg/kg trọng lư ng cơ thợ ể [ ] 28

Viêm là phản ứng sinh học phức tạp của các mô mạch máu v i các kích thích ớbao gồm các tác nhân gây bệnh, chất kích thích hoặc các tế bào b tổn thương ịViêm là bước đầu trong quá trình tự ữ ch a lành vết thương ở cơ th sinh vật, loại ể

b ỏcác kích thích gây hại, tuy nhiên nếu không được ki m soát đúng cách, viêm ểdẫn đến các b nh nguy hiểm ệ

Năm 2010, Yankanchi và cộng s đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm, giảm ựđau trên chuộ ừ ịt t d ch chiết MeOH của lá loài C inerme cho hiệu quả đáng kể

trong việc ức ch quá trình viêm ế ở các mô h t (các u hạ ạt đã được lo i bạ ỏ ở chu t ộtrước đó để th nghiệử m) li u lư ng 400 mg/kg cho hiệu quả Ở ề ợ cao hơn so với liều lượng 150 mg/kg trọng lư ng cơ thểợ [ ].29

Đến năm 2014, nhóm nghiên cứu của Dipa Khanam đã thử nghiệm hoạt tính chống viêm và giảm đau từ ị d ch chi t EtOH c a lá ế ủ loài C inerme trên chuột Các

nhà khoa học đã gây ra vết thương bằng cách tiêm phúc mạc acid acetic Dịch chiết có tác dụng kháng viêm, giảm đau đáng kể ở ề li u lượng 250 mg/kg cho hiệu quả 26,39% và ở 500 mg/kg cho hiệu quả 45,83%, gần so v i tác d ng c a thu c ớ ụ ủ ốgiảm đau natri diclofenac là 57,64% Các nhà khoa học cũng gây phù tai chuột bằng xylene Dịch chi t có hiệu lực kháng viêm cao nhất 25,54% tại liều lượng ế

500 mg/kg tương đương với thu c chu n so sánh diclofenac natri ố ẩ (10 mg/kg trọng lư ng cơ thợ ể) với hiệu quả là 29,4% [30]

Năm 2014, Palti và các cộng s đã nghiên cứu tính chất diệự t côn trùng c a ủdịch chiế ừt t loài C inerme trên ấu trùng giai đoạn 3 và 4 c a các loài muỗi A ủ

phát triển của ấu trùng loài A aegypti, do hoạt tính của các hợp chấ tanin, t phytosteriod, terpenoid và glycoside Dịch chi t n-hexane cũng đã đượế c th ử

nghiệm với loài C quinquefasciatus cho tác dụng gây rối loạn tăng trưởng, đối

với ấu trùng giai đoạn th tư của hai loài A aegypti và C quinquefasciatus [ ].ứ 31

Mahesh C.Arya và nhóm cộng sự đã nghiên cứu khả năng tiêu diệt côn trùng

gây hại của dịch chiết lá loài C inerme trên sâu bướm tr ng gây h i cho cải bắp ắ ạ

và các loại rau ăn lá (Pieris brassicae) vào năm 2014 Kết qu dả là ch chiết khá ị

14

hiệu quả đố ớ ả i v i c ba giai đoạn, đặc biệt là nhộng T i n ng đ 12,5% cho thấy ạ ồ ộ

t l t ỷ ệ ử vong 20% đối v i u trùng và hiệu quả ớ ấ này tăng lên đến 55% đố ới v i nhộng Hiệu quả đạ t 100% nở ồng độ 10% đến 17,5%, hiệu quả ả gi m hoặc không đổi cho các giai đoạn phát triển khác nhau Nghiên c u này cho thứ ấy tiềm năng chống côn trùng gây hại mở ra các hướng nghiên c u thuứ ốc trừ sâu có ngu n gồ ốc

t ự nhiên thay thế cho các chất hóa học độc hại và dễ gây kháng thuốc trên côn trùng [32]

Như vậy, nghiên cứu t ng quan ổ đã cho thấy thành ph n hóa học và hoạt tính ầsinh học của loài C.inerme rấ phong phú và đa dạt ng Vi t Nam, đã có mộ ốỞ ệ t s công trình công bố ề v thành ph n hóa học và hoạt tính sinh học từ lá của loài C ầ

luận văn s tẽ ập trung nghiên cứu phân lập các h p chợ ất t ừ cành của loài C

chất phân lập được

1.4 Tìm hiể u v ề các ợp chất phenylethanoid glycoside h

O OH

OH HO

OH

Glc= β-D-glucopyranose Ara= α-L-arabinopyranose Gal=β-D- galactopyranose

O OH

HO

OH

O OH

OH HO OH

O OH HO

HO

Rha= α-L-rhamnopyranose All= β-D-allopyranose Xyl= β-D-xylopyranose

O OH

15

Phenylethanoid glycosides (PhGs) là một nhóm các hợp chất tan trong nước và được phân lập ch yếu từ ủ các cây thuốc Nồng độ các hợp chất phenylethanoid glycoside khác nhau khi phân l p tậ ừ các bộ phận: cành, r , lá, hoa, quễ ả và hạt của cây Dưới đây là sơ đồ sinh tổng h p các h p ch t phenylethanoid glycoside ợ ợ ấtrong thực vật:

OH

O

Phenylalanine PAL

OH O Cinnamic acid

C4H

OH O

C3H

OH O

HO

HO

Caffeic acid OH

CHO

HO

Dihydroxyphenylacetoaldehyde Reduction

HO HO

O O O

OH O O

OH

OH OH

O HO

beta

O-PhGs

Các h p chợ ất phenylethanoid glycoside là nhóm chấ ặt đ c trưng bởi 1 nhóm phenethyl alcohol (C6-C2) gắn v i 1 phân tử glucose như: β-glucopyranose hoớ ặc

β-allopyranose bằng liên kết glycoside Đố ớ ấi v i c u trúc ph c tạp, phân tử có ứthêm các nhóm thế acid thơm như: cinnamic, caffeic, coumaric, ferulic, isoferulic acid gắn v i phân tử glucose qua liên kết ester Hay nhóm thế glucose như: ớ

OH OH

OH

HO

O HO OH OH

Calceolarioside A (58)

O O

O HO

O

O O

HO

OH OH

OH

OH OH

Martynoside (59)

O O

O OH

O

O OH O

OH

OH

HO

HO HO

OH

HO HO

OH OH

Echinacoside (60)

Các nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất PhGs có hoạt tính bắt các gốc tự do DPPH, bởi sự có mặ ủt c a nhóm –OH gốc phenyl Poliumoside B và poliumoside

là 2 chất thuộc nhóm chất trisaccharides có khả năng bắt gố ực t do cao hơn các hợp chất flavonoid glycoside với nồng độ EC50 lần lượt: 4,8 và 7,0 µM [36]

Verbascoside có hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 Các nghiên cứu chỉ ra r ng verbascoside ằ có khả năng gây ra quá trình apoptosis, s ựchết của tế bào, khiến tế bào ung thư t ự “chết” sau khi điều trị 4 giờ ớ v i IC50 = 26,7µM [ ] 35

Verbascoside và đồng phân c a nó có khủ ả năng ức ch m nh mẽế ạ ho t đ ng ạ ộ

của virus HIV-1 tại giá trị IC50 lần lượt là 7,8 ± 3,6 và 13,7 ± 6,0 µM [37]

Các hợp chất PhG tinh khiết cũng thể ệ hi n ho t tính kháng khuẩn Khi tiến ạhành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của 2 hợp chất là: forsythoside B và

17

verbascoside (acteoside) với loài S Aureus cho kết qu rất khả quan với nồng độ ả

ức ch t i thi u (MIC - Minimal Inhibitory Concentration trong khoế ố ể ) ảng từ 64 µg/l đến 256 µg/l [38]

Alzheimer là mộ ệt b nh gây mất trí nh r t ph bi n do sự tích tụ c a ớ ấ ổ ế ủ amyloid beta (chủ ếu là Aβ40 và y Aβ42) Nghiên cứu chỉ ra r ng verbascoside có khả ằnăng ức ch quá trình tổng hợp nên các Aβ, góp phần làm giảm nguy cơ mắc ếbệnh [39]

Tổn thương gan thường x y ra khi viêm t bào hoả ế ặc mô Thí nghiệm MTT (3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromide) giữa PhGs với D-GalN thành phần gây độ ế- c t bào gan chuột, cho kết quả: echinacoside (IC50 = 10,2 µM), acteoside (IC50 = 4,6 µM), 2’-acetylacteoside (IC50 = 4,8 µM),isoaceteoside (IC50 = 5,3 µM), tubulosides A (IC50 = 8,6 µM) kết quả cho thấy tác dụng ức chế mạnh c a PhGs [41] ủ

Như vậy, các h p ch t phenylethanoid glycoside có cấu trúc rất đa dạng và có ợ ấphổ ộ r ng hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, gây độc tế bào ung thư, chống viêm, alzheimer… Điều này ứng tỏ ằch r ng PhGs có tiềm năng ng d ng l n trong ngành công nghiệp hóa dược Các ứ ụ ớphenylethanoid glycoside cũng là một trong những nhóm ch t chính ấ được phân

lập từ loài C inerme trong nước cũng như trên thế giới

18

2.1 Đố i tư ng và phương pháp nghiên cứ ợ u

Đối tượng nghiên c u c a đ tài là thân cây Ngọứ ủ ề c n bi n được thu hái tại ữ ểvùng ngập mặn ven bi n huyệể n Ti n Hả ỉề i, t nh Thái Bình, Vi t Nam Tên khoa ệhọc do PGS.TS Trần Huy Thái, Vi n Sinh thái và Tài nguyên Sinh vệ ật (VAST) giám định đó là Clerodendrum inerme Gaertn., thuộc chi Mò (Clerodendrum), họ

Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)

Xây dựng quy trình chiết mẫu thân cây Ngọ ữc n biển trong các dung môi có

b ổ sung nước và chiế ầt l n lượ ớt v i các dung môi có độ phân c c tăng dần: n-ựhexane, EtOAc Cất lo i dung môi b ng máy cô quay giạ ằ ảm áp thu được các cao chiết tương ứng

Cấu trúc của các chất phân lập ra được xác định b ng s kết hợp giữa các ằ ựphương pháp phổ: ph khối lượng phun ổ bụi điện tử(ESI MS), Ph c ng hưởng - ổ ộ

t hừ ạt nhân 1 chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR và p ổ ộng hưởh c ng t h t ừ ạnhân 2 chi u (2Dề -NMR): HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY

19

a Hoạt tính chống oxy hóa

1,1-diphenyl picrylhydrazyl-2- (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Kai Marxen[42]

b Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Sử dụng phương pháp thử độ độc tế bào in vitro: được Viện Ung thư Quốc

gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp

của Skekan [43]

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật

độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB)

Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein,

do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn

2.2 Thự c nghi m ệ

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

Sắc ký c t (CC): c t th y tinh kích cỡộ ộ ủ thích h p, sử dợ ụng chất hấp phụ là silica gel Merk, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (Merk), silica gel pha đảo RP-18

Sắc ký gel sử ụ d ng đ ể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau Pha tĩnh sử dụng là gel Sephadex LH-20 (Merk)

Sắc ký b n mỏng phân tích (TLC): sử dụng bảng nhôm tráng sẵn silica gel ảpha thường silica gel 60 F254 và pha đảo RP18 60 F- 254S độ dày 0,2 mm (Merk)

Ph ESIổ -MS ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL

Các phổ NMR ghi trên máy NMR c a hãng Bruker Avance 500, chủ - ất nội chuẩn TMS, độ chuyển d ch hóa hị ọc (δ) được biểu th bằng ppm ị

Các thiế ị ử ụt b s d ng: máy cô quay giảm áp, bể chi t siêu âm, bộ chưng cất ếdung môi

Các thiế ị ửt b th nghiệm hoạt tính sinh học: đĩa 96 gi ng nh a (Corning, ế ựUSA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 gi ng (Biotek) ế

Hóa chất: Hóa chất dùng để nghiên cứu: n-hexane, ethyl acetate, methanol,

acetone, ethanol, dichloromethane, CH3COOH Các dung môi dùng cho sắc ký đều được c t l i trướấ ạ c khi s dụng ử

20

Thuốc hiện b n mả ỏng: Vanillin + H2SO4, đèn UV (λ= 254-366nm)

Hóa chất dùng trong thử nghiệm hoạt tính sinh học:

Chất tham khảo: Ellipticine

TCA (Sigma), SRB (Sigma)

Các dòng tế bào do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US

và GS Jeanette Maier, trường Đạ ọi h c Milan, Italia cung cấp

Mẫu cành cây Ngọ ữc n biển sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi trong bóng râm

và sấy khô ở 40oC sau đó được nghiền thành bột Bột mẫu (5 kg) được ngâm, chiết siêu âm 3 l n vầ ới MeOH 80% nhiở ệt độ -45 50oC Dịch chiết tổng đượ ấc c t lo i ạdung môi dưới áp su t giảm thu được 185 g cao tổấ ng MeOH Cao t ng MeOH ổđược hòa tan trong 3 lit nước, r i chi t phân bố ầồ ế l n lượ ớt v i các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan và EtOAc Cô quay giảm áp các dịch chiết thu được e

lần lượt 27 g cao chiết n-hexane; 17 g cao chiết EtOAc và 95 g cao chiết nước

Quy trình chiết mẫu cành cây Ngọ ữc n biển được trình bày sơ đồ 1 dưới đây: ở

Sắc ký c t s d ng c t th y tinh có đường kính 5 cm, dài 80 cm Sử dộ ử ụ ộ ủ ụng 17

g cao chiết EtOAc t ừ thân cây Ngọc n biển cho qua cột ữ 400 silica g gel (tỉ ệ l

- Ngâm, chiết siêu âm 3 lần trong MeOH 80%

- L ọ c, cô quay giảm áp

Bột cành Ngọc n biển ữ

(5 kg)

185 g cao tổng MeOH

Chiết với n-hexane B ổsung 3l H2O

Chiết với EtOAc

Cô quay giảm áp

Cô quay giảm áp

21

chất/silica gel = 1/20) Hệ dung môi rửa giải là dichloromethan/methanol (D/M)

với tỷ ệ MeOH tăng dần từ l 0% đ n 100% Hứng các phân đoạn vào các ống ếnghiệm 200ml đã đánh dấu, theo dõi quá trình rửa gi i b ng s c ký l p mỏng ả ằ ắ ớ(TLC) với các hệ dung môi thích hợp, các ống nghiệm hiện vết giống nhau trên sắc ký lớp mỏng g p l i thành phân đoộ ạ ạn lớn, cô quay dung môi thu được 10 phân đoạn tập hợp chính, ký hiệ ừu t F1- F10

Quy trình phân lập chấ ừt t cao EtOAc của loài C inerme được trình bày ở sơ

đồ 2 dưới đây:

a Phân đo n ạ F7 (hợp chất CI5)

Ở ệ h dung môi D/M = 9/1 thu được F7 (2,0 g) Cô quay h t dung môi, ế tinh chế ằ b ng sắc ký c t Sephadex LHộ -20 với dung môi rửa giải MeOH, thu được 5 phân đoạn nhỏ ừ, t F.7.1 - F.7.5 Tiếp tục tinh chế F7.4 bằng sắc ký cột silica gel

pha đảo RP18 với hệ dung môi rửa gi i M/W = 3/2 Sau đó, kếả t tinh l i trong ạacetone, thu được 51,0 mg ch t d ng b t, màu ngà, ký hiệu là CI5, Rf = 0,26 ấ ạ ộ(M/W = 3/2)

17g cao chiế EtOAc t

F9.2

Sephadex: LH-20 MeOH

F9.2.1

RP18: M/W = 1/2

CC: Silicagel D/M = 9/1

CI7 (11,4 mg)

RP18: M/W = 1/1

CI9 (54,4 mg) CI6

22

b Phân đoạn F9 ( hợp chất CI6, CI7, CI8 và CI9)

Ở ệ h dung môi D /M = 7/3 thu được F9 (3,98g) Cô quay h t dung môi, ế tinh chế ằ b ng sắc ký c t Sephadex LHộ -20 với dung môi rửa giải MeOH, thu được 5 phân đoạn nhỏ ừ, t F.9.1 đến F.9.5

Tiến hành phân tách F9.2 ằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP18, vb ới hệdung môi rửa giải là M/W = 1/2, thu được 2 phân đoạn nh , t ỏ ừF9.2.1 đến F.9.2.2

Lần lượt tinh chế 2 phân đoạn này bằng sắc ký cột silicagel pha thuận v i h ớ ệdung môi rửa giải là D/M = 9/1, thu đượ ầc l n lư t 2 h p ch t, gồm: 25,7 mg chất ợ ợ ấ

dạng bộ , màu trắng, ký hiệu là CI6, Rft = 0,38 (TLC: D/M 5/1) và 11,4 mg chất =

bột màu vàng nhạt, tan trong MeOH, DMSO, ký hiệu là CI7, Rf = 0,31 (D/M 7/1) =

rửa giải M/W = 2/3 thu được 62,1 mg chất, dạng ột, màu b vàng nh , ký hiạt ệu là

CI8, R f = 0,46 (M/W = 1/1)

Tinh chế F9.5 ng sắbằ c ký cột silica gel pha đảo RP18 với hệ dung môi rửa giải M/W = 1/1 thu được 54,4 mg chất, dạng b t ộ màu vàng nhạt, ký hiệu là CI9,

R f = 0,34 (M/W 1/1) =

Hợp chấ CI5 thu được khi tinh chế F7.4, là chấ ạt t d ng b t, màu ngà, Rf ộ = 0,26 (M/W = 2/3)

ESI-MS (negative): m/z 735 [M-H]ˉ (C35H43O17)

1H-NMR (500MHz, CD3OD) δH (ppm) 6,75: (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 2); 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 6,71 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz, H-6); 4,08 (1H, m, H- ) α ; 3,76 (1H, m, H- )α ; 2,84 (2H, m, H-β); 3,83 (3H, s, 3-OMe); 4,39 (1H, d, J = 8,0

23

171,6 (2”-OCOCH3); 20,6 (2”-OCOCH3); 172,2 (3”-OCOCH3); OCOCH3); 127,6 (C-1”’); 111,9 (C-2”’); 149,4 (C-3”’); 150,8 (C-4”’); 112,9 (C-5”’); 124,3 (C-6”’); 168,1 (C- )α ’ ; 115,0 (C- ) β ’ ; 148,0 (C- ) γ ’ ; 56,4 (3”’-OCH3)

13C-NMR (125MHz, DMSO δ) C (ppm): 150,1 1); 102,1 2); 147,7 3); 141,3 (C-4); 115,0 (C-5); 107,7 (C-6); 55,3 (3-OCH3); 99,9 (C-1’); 76,0 (C-2’); 76,9 (C-3’); 70,2 (C-4’); 77,0 (C-5’); 60,7 (C-6’); 108,4 (C-1”); 76,7 (C-2”); 77,4 (C-3”); 73,9 (C-4”); 67,1 (C-5”); 120,4 (C-1”’); 112,7 (C-2”’); 147,3 (C-3”’); 151,5 (C-4”’); 115,0 (C-5”’); 123,5 (C-6”’); 165,3 (C=O), 55,6 (3”’-OCH3)

CI7 thu được khi tinh chế F9.2.2, là h p chất dạng bột, màu vàng nhạt, Rf = ợ0,31 (D/M=7/1)

1H-NMR (500MHz, DMSO) δH (ppm): 6,68 (1H, d, J = 2,0 Hz, H 2); 6,82 (1H, d, = 8,5 Hz, HJ -5); 6,63 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-6); 3,91 (1H, m, H-α); 3,64 (1H, m, H-α); 2,76 (2H, m, H-β); 3,72 (3H, s, 3-OMe); 4,36 (1H, d, = 8,0 J

3,74 (1H, m, H-α); 2,82 (2H, m, J = 7,0 Hz, H-β); 4,40 (1H, d, = 8,0 Hz, H J -1’); 3,41 (1H, m, H-2’); 3,83 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3’); 4,94 (1H, t, J = 9,5 Hz, H 4’); -3,55 (1H, m, H 5’); 3,65 (1H, m, H- a-6’); 3,55 (1H, m, Hb-6’); 5,21 (1H, d, = 2,0 J

(C-76,2 (C-2’); 81,6 (C-3’); 70,6 (C-4’); 76,0 (C-5’); 62,4 (C-6’); 103,0 (C-1”); 72,3 (C-2”); 72,0 (C-3”); 73,8 (C-4”); 70,4 (C-5”); 18,4 (C-6”); 127,7 (C-1”’); 115,2

(C-2”’); 146,1 (C-3”’); 149,7 (C-4”’); 116,5 (C-5”’); 123,2 (C-6”’); 168,3 (C-α’); 114,7 (C-β’); 148,0 (C- γ’)

(3H, d, J = 6,0 Hz, H-6”); 7,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2”’); 6,80 (1H, d, = 8,0 J

Hz, H-5”’); 6,56 (1H, dd, = 8,0; 2,0 Hz, 6”’); 6,32 (1H, d, = 16,0 Hz, HJ H- J -

13C-NMR (125MHz, CD3OD) δC (ppm): 131,4 1); 117,1 2); 144,6 3); 146,1 (C-4); 116,3 (C-5); 121,2 (C-6); 72,4 (C- )α ; 36,6 (C- ); β 104,4 (C-1’); 75,6 (C-2’); 84,0 (C-3’); 70,0 (C-4’); 75,4 (C-5’); 64,6 (C-6’); 102,7 (C-1”); 72,3 (C-2”); 72,2 (C-3”); 74,0 (C-4”); 70,4 (C-5”); 17,8 (C-6”); 127,1 (C-1”’); 115,1

(C-25

(C-2”’); 146,7 (C-3”’); 149,6 (C-4”’); 116,5 (C-5”’); 121,2 (C-6”’); 169,1 (C-α’);

114,8 (C- )β ’ ; 147,2 (C- γ’)

Mẫu thử nghiệm: 04 hợp chất phân lập đượ ực l a ch n đ th ho t tính ch ng ọ ể ử ạ ốoxy hóa bao gồm clerodenoside A (CI5), seguinoside K (CI6), verbascoside

(CI8), isoverbascoside (CI9)

Phép thử được th c hiện trong điều kiệ ụ ểự n c th như sau:

Pha dung dịch DPPH có nồng độ1 mM trong MeOH Các chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cu i cùng đ t đượố ạ c 1 dãy các n ng đ : 256; ồ ộ64; 16; 4 µg/ml

Để th i gian phờ ản ứng 30 phút ở 37ºC, đọc mậ ộ ất đ h p th c a DPPH chưa ụ ủ

ph n ả ứng bằng máy đọc Biotek ở λ = 517 nm

% quét gố ực t do DPPH của mẫu th được tính theo công thức sau: ử

SC% = (ODtrắng – ODmẫu thử)/ODtrắng(%)Trong đó:

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các n ng đ khác nhau của ồ ộchất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3

Đường chu n bi u thị ốẩ ể m i tương quan giữa nồng độ DPPH và m t đ quang ậ ộ

học thể hiện trong hình vẽ dưới đây:

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH

y = 0.3225x + 0.0241

0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000

26

Hình 3: Tương quan n ng đ ồ ộ DPPH và mậ ộ t đ quang học

Kết quả thử nghiệm hoạt tính sẽ được trình bày ở mục 3.3.1 trang 55

Mẫu thử nghiệm: 02 hợp chất phân lập đượ ực l a ch n để ửọ th hoạt tính gây

độc tế bào ung thư bao gồm clerodenoside A ( CI5 và seguinoside K ) ( CI6 )

CI5 và CI6 pha trong DMSO 100% ở ồ n ng đ ộstock 20 mg/mL và nồng độcuối cùng để ế ti p xúc tế bào lần lượt là: 100; 20; 4; 0,8 µg/mL

Các dòng tế bào đượ ử ục s d ng cho nghiên cứu:

MCF7: Tế bào ung thư vú ở ngư i (human breast carcinoma) ờ

SK-LU 1: Tế bào ung thư phổi ở- ngư i (human lung carcinoma) ờ

HepG2: Tế bào ung thư gan ở ngư i (human hepatocellular carcinoma) ờPhép thử được th c hiện trong điều kiệ ụ ểự n c th như sau:

Trypsin hóa t bào thí nghiế ệm để làm r i tế bào và đếờ m trong bu ng đ m đ ồ ế ểđiều ch nh m t độ cho phù hợp v i thí nghiỉ ậ ớ ệm Ch t th đã pha các nồng độ ấ ử ởđược đưa vào các giếng c a đĩa 96 giếủ ng Gi ng không có chất thử nhưng có ếTBUT (190 µl) sẽ được sử ụ d ng làm đối ch ng ngày 0 Sau 1 giờ, giếứ ng đối chứng ngày 0 t bào sế ẽ được c nh b ng Trichloracetic acid – TCA 20% ố đị ằ Ủtrong tủ ấm 72 gi Sau 72 giờ ờ, tế bào đượ ốc c định b ng TCA trong 1 gi , đư c ằ ờ ợnhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, l c nh ắ ẹtrong 10 phút Đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader Phần trăm ức chế ự s phát triển của tế bào khi có mặt chất th s được ử ẽxác định thông qua công thức sau:

% inhibition = 100% −  − 0

 − 0Phép thử đượ ặc l p lại 3 lần để đả m bảo tính chính xác Ellipticine ở các ồng n

độ 10 µg/ml; 2 g/ml; 0,4 µ µg/ml; 0,08 µg/ml đượ ửc s dụng như là ch t đấ ối ch ng ứdương DMSO10% luôn đượ ử ục s d ng như đối ch ng âm Giá trị ICứ 50 (nồng độ

ức ch 50% sựế phát tri n) sẽ đượể c xác định nh vào phần mềm máy tính ờTableCurve 2Dv4

Hoạt tính độc tế bào được th nghiệm tại viện Công ngh Sinh hử ệ ọc-Vi n Hàn ệlâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam, theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc ệgia Hoa Kỳ NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính t t v ( ố ới IC50 ≤ 20 μg/ml, trong khi c t tinh khihấ ết được coi có ho t tính t t khi ICạ ố 50 ≤ 5 μM

Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độ ếc t bào ung thư sẽ được trình bày ở bảng 10 và bảng 11, mục 3.3.2 trang 56

27

CHƯƠNG 3 : KẾ T QU VÀ THẢ Ả O LU N Ậ

3.1 Thu nguyên liệ u và chi t mẫu ế

Mẫu thực vật là thân cây Ngọc n bi n (C.inerme) đư c thu hái vào tháng ữ ể ợ5/2018, tại bãi cát ven biển huyện Tiền Hả ỉi, t nh Thái Bình

Mẫu thân ủa cây Ngọ c c n bi n sau khi thu hái đượữ ể c ch t nh , phơi ở nơi ặ ỏthoáng gió, sau đó sấy ở nhiệt độ º40 C trong khoảng 24 gi cho hờ ết nước Ở nhiệt

độ này sẽ tránh đượ ực s phân h y các chấ ồủ t, r i đem nghiền thành dạng b t mịn và ộtiến hành nghiên c u theo quy trình thứ ực nghiệm đã tóm tắt ở sơ đồ 1 trang 20

3.2 Phân l p ậ và xác đị nh c u trúc hóa h c c a các chấ ừ ấ ọ ủ t t cao chiết EtOAc

3.2.1 Phân lập chất

Phân lập chất từ 17 g cao chiết EtOAc ủ thân c a cây Ngọc nữ ểbi n b ng s c ằ ắ

ký cột silica gel pha thuận v i h dung môi rửa giải là D/M, t l ớ ệ ỷ ệMeOH tăng dần

t ừ 0% đến 100%, thu được 10 phân đo n chính, từ ạ F1- F10 Tinh chế các phân đoạn có chứa các cấu tử chính đã thu được 5 h p ch t đư c tóm t t ở ảợ ấ ợ ắ b ng 2 dưới đây Quy trình phân lập ch t được trình bày ở ấ sơ đồ 2 trang 21

Ph ESIổ -MS ion âm cho peak ion gi phân tả ử ạ t i m/z 735 [M H]- ˉ Phân tích

dữ liệu phổ NMR ủa CI5, kết hợp với dữ liệu phổ ESI MS cho phép xác định c

-công thức phân tử của hợp chất CI5 là C35H44O17 (M=736)

của hai phân tử đường (β-D-glucose và α-L-rhamnose) được nh n biết bởi các tín ậ

hiệu đặc trưng của hai proton anomer tại δH 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’); 5,21

(1H, J = 1,5 Hz, H-1”) và tín hiệu đ c trưng củặ a 1 nhóm methyl c a phân tủ ửđường rhamnose tại δH 1,16 (3H, d, J = 6 Hz, H-6”) Ngoài ra trên phổ còn xuất

hiện mộ ốt n i đôi cấu hình trans tại δH 7,70 (1H, d, J = 6,0 Hz, H- ’1 γ ) và 6,40 (1H,

O CH 2 CH 2

OCH3OH

4 1'