Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm m t s hoạt tính sinh h c sộ ố ọ ẽ đóng góp vào việc tìm hiểu hóa thực vật cũng như cung cấp cơ sở khoa h c ch ng minh công
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Việt Nam NGUYỄN THỊ MINH THƯƠNG Thuong.NTMCB190038@sis.hust.edu.vn Chuyên ngành: Hóa học Giảng viên hướng dẫ n: TS Trầ n Thị Minh Viện: Kỹ thuật Hóa học Chữ ký GVHD Hà Nội, 2020 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132236511000000 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lậ p – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễ n Thị Minh Thương Đề tài luận văn: Nghiên cứu thành phầ n hóa học hoạt tính sinh học Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Việ t Nam Chuyên ngành: Hóa học Mã số HV: CB190038 Tác giả , Người hướng dẫ n khoa học Hội đồ ng ch ấ m lu ậ n văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hộ i đ ồng ngày 16/12/2020 với nội dung sau: - Sửa lỗi tả luận văn - Bổ sung, chỉnh sửa phầ n kết luậ n cho ngắn gọn Ngày 17 tháng 12 năm 2020 Giáo viên hướng dẫ n Tác giả luận văn TS Trần Thị Minh Nguyễn Thị MinhThương CHỦ TỊ CH HỘI ĐỒNG GS TSKH Trần Văn Sung ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu thành phầ n hóa học hoạt tính sinh học củ a Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Việ t Nam Giảng viên hướng dẫ n LỜI CẢM ƠN Năm năm h ọc tập rèn luyệ n Bách Khoa so với cuộ c đời chả đáng bao, lạ i năm tháng tuổ i trẻ đáng số ng đáng trân trọng Cảm ơn Bách Khoa, trả i nghiệm, ký ức khơng qn Luận văn hồn thành Phịng thí nghiệm Hóa hữu – Bộ mơn Hóa hữu cơ, Viện Kỹ thuậ t Hóa h ọc, Trường Đạ i h ọc Bách Khoa Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Trần Thị Minh, cô bước hướng dẫ n tậ n tình giúp đỡ q trình thực hồn thành luận văn Cảm ơn cô yêu thương, d y học viên , không v ề cách làm nghiên cứu mà cách sống Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đế n Q thầ y mơn Hóa hữu cơ, Ban lãnh đạ o Viện Kỹ thu ật Hóa họ c, Ban Giám hiệu trường Đạ i h ọc Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiệ n thuận lợi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Đặ c biệt bạn sinh viên tham gia nghiên cứu phịng thí nghiệm Hy vọng, sau mỗ i người đề u đạ t nh ững k ỳ v ọng ước định củ a bả n thân Cuối cùng, xin gửi lời m đ ế n gia đình, bạn bè ủ ng hộ đồ ng hành bên tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Nghiên cứu thành phầ n hóa học hoạt tính sinh học Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Việt Nam Tác giả luậ n văn: Nguyễ n Th ị Minh Thương Mã học viên: CB190038 Lớp: 19BHH Giảng viên hướng d ẫ n: TS Trần Thị Minh Khóa: 2019B Từ khóa (Keywords): Clerodendrum inerme, Ngọc nữ biển, stems, extraction, isolation, structures, phenolic glycosides, bioactives, antioxidant, DPPH, cytotoxicity Nội dung tóm tắt: Lý chọn đề tài Cây Ngọc nữ biể n (Clerodendrum inerme Gaertn.) loài đặc trưng hệ sinh thái vùng ngậ p mặ n, phân bố rộng khắ p từ Bắc vào Nam có trữ lượng lớn Trong dân gian Ngọc nữ biển dùng để chữa bệnh phong thấp, sốt rét, viêm gan… Ở Việt Nam chưa có nhiều cơng trình cơng bố thành phần hóa họ c hoạ t tính sinh họ c Chính vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học thử nghiệ m mộ t số hoạt tính sinh h ọ c đóng góp vào việc tìm hiểu hóa thực vật cung cấp sở khoa họ c chứng minh công dụng trị bệnh dân gian loài Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạ m vi nghiên cứu a Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu phân lập xác đị nh cấu trúc hóa học củ a chất từ thân Ngọc nữ biể n Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa gây độc tế bào ung thư số chấ t phân lập b Đối tượng phạ m vi nghiên cứu Mẫu thân Ngọ c nữ biể n thu hái vùng ven biển huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình, Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Mẫu thực vật xử lý sơ thành dạng bột khơ Sau ngâm chiết siêu âm kết hợp chiết phân bố lỏ ng - lỏ ng để thu phân đoạn chiết có độ phân cực tăng dần Phân lập hợp chấ t tinh khiết từ c ao chiế t EtOAc phương pháp s ắc ký c ột (CC) kết hợp với sắc ký lớp mỏng (TLC) Cấu trúc chất phân lập xác định s ự k ế t hợp phương pháp phổ ESI-MS, 1D, 2D-NMR Thử nghiệm hoạt tính hợp chất phân lậ p được: ho t tính chống oxy hóa phương pháp DPPH hoạt tính gây độc mộ t số dòng tế bào ung thư người b ằng phương pháp SRB Các nội dung đóng góp củ a tác giả a Nội dung Thu thập định danh mẫu thực vật Chiết tách, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chấ t t cao chiết ethyl axetat loài C inerme Đánh giá hoạt tính sinh học, bao gồm: chống oxy hóa gây độ c tế bào ung thư mộ t số h ợp chấ t phân lập b Đóng góp Năm h ợp chất phenolic glycoside phân lậ p xác định cấ u trúc từ cành Ngọ c nữ biển Hợp chất cistanoside D lần phân lập từ loài C inerme Kế t luậ n Sau trình nghiên cứu, đề tài thu kế t qu ả sau: Đã thu nhận 17g cao chiết EtOAc từ kg mẫu thân Ngọ c nữ biển Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học củ a h ợp chấ t phenolic glycoside từ cao chiết EtOAc, là: clerodenoside A (CI5), seguinoside K ( CI6), cistanoside D (CI7), verbascoside (CI8), isoverbascoside (CI9) Một số h ợp chất phân lập thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa gây độc mộ t số dòng tế bào ung thư ngư ời Kết cho thấ y, hai hợp chất verbascoside isoverbascoside thể hiệ n ho ạt tính chống oxy hóa với giá trị EC50 40,71±2,52 36,24±1,69 µg/ml Hai hợp chất clerodenoside A seguinoside K chưa thể hoạ t tính gây độc dịng tế bào ung thư n ng độ thử nghiệm Học viên Nguyễn Thị Minh Thương MỤC LỤC MỤC LỤ C i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH iv MỞ ĐẦ U vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổ ng quan th ực vật 1.1.1 Thực vậ t họ Verbenaceae 1.1.2 Thực vậ t chi Clerodendrum 1.1.3 Thực vậ t loài C inerme 1.1.4 Công dụ ng dân gian loài C inerme 1.2 Các nghiên cứu t hành phầ n hóa họ c loài C inerme 1.2.1 Các terpenoid 1.2.2 Các steroid 1.2.3 Các flavonoid hợp chất phenolic khác 1.3 Tổ ng quan v ề nghiên c ứ u ho t tính sinh họ c lồi C inerme 11 1.3.1 Hoạt tính kháng virus 11 1.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa, ung thư 12 1.3.3 Bảo vệ gan 12 1.3.4 Hoạt tính chố ng viêm, giả m đau 13 1.3.5 Hoạt tính diệt trùng gây hại 13 1.4 Tìm hiểu hợp chất phenylethanoid glycoside 14 1.4.1 Khái niệm sinh tổng hợp hợp chất phenylethanol glycoside 14 1.4.2 Hoạt tính sinh học hợp chất phenylethanoid glycoside 16 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰ C NGHIỆ M 18 2.1 Đối tượ ng phương pháp nghiên u 18 2.1.1 Mẫu thực vậ t 18 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.1.2.1 Phương pháp chiết mẫ u thực vật 18 2.1.2.2 Các phương pháp sắ c ký để phân lập chất 18 2.1.3 Các phương pháp phổ xác định c ấ u trúc hóa học chất phân lập 18 2.1.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 19 a Hoạt tính chống oxy hóa 19 b Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 19 2.2 Thực nghiệm 19 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 19 2.2.2 Chiết mẫ u thực vậ t 20 2.2.3 Phân lập chất từ cao chiết EtOAc loài C inerme 20 2.2.3.1 Quy trình phân lập chấ t từ cao chiết EtOAc củ a loài C inerme 20 2.2.3.2 Dữ liệ u phổ c hợp chất phân lập 22 i a Hằng số v ật lý số liệu phổ c hợp chất CI5 22 b Hằng số v ật lý số liệu phổ c hợp chất CI6 23 c Hằng số v ật lý số liệu phổ c hợp chất CI7 23 d Hằng số v ật lý số liệu phổ c hợp chất CI8 24 e Hằng số v ật lý số liệu phổ c hợp chất CI9 24 2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học chấ t phân lậ p đư ợc .25 2.2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa 25 2.2.4.2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26 CHƯƠNG 3: KẾ T QU Ả VÀ THẢ O LUẬN 27 3.1 Thu nguyên liệu chiết mẫu 27 3.2 Phân lập xác đị nh c ấ u trúc hóa họ c chấ t từ cao chiết EtOAc 27 3.2.1.Phân lập chất 27 3.2.2 Xác định cấ u trúc hợp chất phân lập 27 3.2.2.1 Hợp chất CI5 (clerodenoside A) 27 3.2.2.2 Hợp chất CI7 (cistanoside D) 34 3.2.2.3 Hợp chấ t CI8 (verbascoside) 39 3.2.2.4 Hợp chất CI9 (isoverbascoside) 44 3.2.2.5 Hợp chất CI6 (seguinoside K) 49 3.3 Kết thử nghiệ m ho t tính sinh họ c 55 3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa 55 3.3.2 Hoạt tính gây độ c tế bào ung thư 55 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 57 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦ A LU ẬN VĂN 58 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 59 DANH MỤC TÀI LIỆ U THAM KH ẢO 60 PHỤ LỤ C CÁC PHỔ 65 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Ký hiệu C inerme PhGs TLC CC RP18 HPLC IR ESI-MS H-NMR 13 C- NMR HSQC 1H Clerodendrum inerme Gaertn (Ngọc nữ biển) Phenylethanoid glycosides Thin Layer Chromatography (Sắ c ký lớp mỏng) Column Chromatography (Sắc ký cộ t) Reversed Phase Chromatography C18 (Sắc ký cột pha đảo C18) High Performance Liquid Chromatography (Sắ c ký lỏng hiệu cao) Infrared (Phổ h ồng ngoại) Electrospray Ionization Mass Spectrometry (Phổ khối lượng phun mù điện tử) Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton) Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ h ạt nhân carbon 13) Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua mộ t liên kế t) - 1H COSY 1H - 1H Correlation Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác hạ t nhân proton liề n kề) (Phổ tương tác đa liên kết dị h ạt nhân ) DEPT LD50 EC 50 IC50 ppm s d dd Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Lethal Dose 50% (Liều gây chết trung bình 50% đối tượng th nghiệm) Half Maximal Effective Concentration (Nồng độ 50% tác dụng tối đa) Half Maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm) part per million singlet doublet double doublet m t δ (ppm) J D A W M multiplet triplet Độ chuyển dị ch hóa họ c Hằng số tương tác spin-spin Dichloromethane Acetone Water Methanol iii DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH Hình 1: Cây Ngọc nữ biển (C inerme) Hình 2: Sơ đồ sinh tổng hợp phenylethanoid glycosides thực vật [35] 15 Hình 3: Tương quan nồng độ DPPH mật độ quang học 26 Hình 4: Phổ ESI-MS (negative) củ a hợp chất CI5 28 Hình 5: Phổ 1H-NMR hợp chất CI5 28 Hình 6: Phổ DEPT c ủ a hợp chất CI5 29 Hình 7: Tương quan (HC) HMBC củ a hợp chấ t CI5 30 Hình 8: Tương quan (HC) HMBC củ a hợp chấ t CI5 31 Hình 9: Cấu trúc hóa học hợp chất CI5 32 Hình 10: Phổ 1H-NMR hợp chất CI7 34 Hình 11: Phổ DEPT hợp chất CI7 35 Hình 12: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI7 36 Hình 13: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI7 37 Hình 14: Cấu trúc hóa học hợp chất CI7 39 Hình 15: Phổ 1H-NMR hợp chất CI8 39 Hình 16: Phổ DEPT hợp chất CI8 40 Hình 17: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI8 41 Hình 18: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI8 42 Hình 19: Cấu trúc hóa học hợp chất CI8 44 Hình 20: Phổ 1H-NMR hợp chất CI9 44 Hình 21: Phổ DEPT hợp chất CI9 45 Hình 22:Tương quan (HC) HMBC củ a hợp chấ t CI9 46 Hình 23: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI9 47 Hình 24: Cấu trúc hóa học c ủ a hợp chất CI9 49 Hình 25: Phổ 1H-NMR hợp chất CI6 49 Hình 26: Phổ 13C NMR DEPT hợp chất CI6 50 Hình 27: Tương quan (HC) HMBC hợp chất CI6 51 Hình 28: Tương quan (HC) HMBC củ a hợp chấ t CI6 51 Hình 29: Cấu trúc hóa học hợp chất CI6 54 Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết mẫu cành Ngọ c nữ biển 20 Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập ch ấ t từ cao EtOAC cành Ngọ c nữ biển 21 iv