Nghiên ứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây côm elaeocarpus tonkinensis

Trang 1 ĐÀO THU NGABỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Đào Thu NgaKỸ THUẬT HÓA HỌCNGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CƠM ELAEOCARPUS TONKINE

TỔ NG QUAN

Gi ớ i thi ệ u v chi Côm Elaeocarpus 9 ề – 1 Đặ c đi ể m hình thái

17 Elaeocarpus hookerianus Pokaka, New Zealand

18 Elaeocarpus holopetalus New South Wales, Victoria (Australia)

19 Elaeocarpus williumsianus New South Wales, Australia

20 Elaeocarpus variabilis Nam Ấn Độ

23 Elaeocarpus sylvestris Nhậ t B ản, Đài Loan, Trung Quốc, Đông

24 Elaeocarpus stipularis Đông dương, Malaysia

25 Elaeocarpus sikkimensis Ấn Độ , Bhutan

27 Elaeocarpus robustus Ấn Độ , Bangladesh

Các loài cây này thuộc nhóm viên trân châu với nhiều màu sắc khác nhau Cánh hoa của chúng thường chia thành nhiều rìa nhọn, và hoa của loài này thường là hoa lưỡng tính hoặc có cấu trúc khác biệt Các bông hoa mọc thành cụm với nhau, tạo nên vẻ đẹp đặc trưng.

Các loài trong chi Côm (Elaeocarpus) phân bố rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Nhiều loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng cao, chủ yếu do mất môi trường sống.

Chi Côm là loài phân bố chủ yếu ở đảo Borneo và đảo New Guinea, nhưng cũng xuất hiện ở một số khu vực khác trên thế giới như Madagascar, Ấn Độ, Đông Nam Á, Malaysia, nam Trung Hoa, Nhật Bản, Úc, New Zealand, Fiji và Hawaii.

Ở Việt Nam, Chi Côm bao gồm 46 loài, chủ yếu là các cây trung bình và đại mộc, trong đó nhiều loài là cây rừng Phân bố chủ yếu ở các tỉnh Ngh An, Thanh Hóa, Tuyên Quang, và Bắc Cạn.

Các loài thực vật thuộc chi Côm ự ậ ộ đã được nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học Kết quả nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học của chi này chủ yếu bao gồm các nhóm chất như alkaloid, triterpene, flavonoid, phenolic, tannin và glycoside.

B ng 1.3: Mả ột số nhóm ch t phân lấ ập được từcác loài thực vật chi Côm

TT Tên h p ch t ợ ấ Nguồn th c vự ật, mô t ả

1 Elaeocarpine Ba indolizidine alkaloid thơm từ

4 Epiiisoelaeocarpiline Các alkaloids đồng phân CTPT

C16H21NO2, t lá ừ Elaeocarpus sphaericus (Gaertn.) K Schum [25]

8 Rudrakine Các indozolidine alkaloid không thơm từ Elaeocarpus sphaericus

9 Elaeokanine A, B, C, D, E Các indolizidine alkaloid có trong

11 Grandisines C, D, E, F & G Năm indolizilidine alkaloid grandisines m i C, D, E, F, và G t ớ ừ

12 Isoelaeocarpiline Indolizidine alkaloid isoelaeocarpiline từ lá Elaeocarpus grandis [27]

13 Elaeocarpidine Alkaloid từ Elaeocarpus densiﬂorus

14 15, 16 dihydroelaeocarpine Hai indolizidine alkaloid không thơm đã biết t ừ Elaeocarpus dolichostylis [23]

16 Elaeocarpenine Indolizidine alkaloid mới t lá ừ

17 Isoelaeocarpicine Ba alkaloids đã biế ừt t Elaeocarpus fuscoides [28]

20 Các cucurbitacin I, G, H, B,… Các h p ch t có hoợ ấ ạt tính độ ếc t bào v i dòng KB t ớ ừ Elaeocarpus mastersii [21]

V cây ỏ Elaeocarpus parvifolius chứa 3 d n xu t acid ellagic m i ẫ ấ ớ

26 4- -O methylellagic acid 3′ (3″- -O- acetyl)- -rhamnoα side

D n xuẫ ất của acid gallic t ừ

30 Myricetin Flavonoid of Elaeocarpus lanceofolius [39]

32 Quercetin Flavonoid of Elaeocarpus species

31 Acid gallic Hai tannin t lá ừ Elaeocarpus sphaericus [10]

33 Tannin, geraniin và 3, 4, 5- trimethoxy geraniin

Hình 1.1: Công thức hóa học mộ ốt s chất phân lập được từ chi Côm

Nhiều loài th c v t chi ự ậ Elaeocarpus cũng được nghiên c u cho th y có ho t tính ứ ấ ạ sinh học đáng chú ý

Loài Elaeocarpus grandiflorus có khả năng kháng khuẩn, và nước chiết xuất từ lá, quả và cành của loài này được sử dụng trong dân gian để điều trị bệnh tiểu đường Các indolizidine alkaloid như grandisine A và isoelaeocarpiline có trong Elaeocarpus grandiflorus cũng có đặc tính giảm đau.

Vỏ cây Elaeocarpus grifﬁthii (Wight) A Gray chứa hợp chất 3,3’,4’-tri O methylellagic acid 4-O β-D-acetylglucopyranosid, có hoạt tính chống lại tế bào ung thư KB và MCF-7 với giá trị IC50 lần lượt là 7,04 và 24,8 μg/ml Ngoài ra, hợp chất 6-hydroxy-1,12-oleanadien-3-one cũng cho thấy hoạt tính chống lại bốn dòng tế bào ung thư.

Các dòng tế bào KB, MCF-7, LU1 và Hep-G2 có giá trị IC50 lần lượt là 57,27; 49,88; 45,99 và 62,33 μg/ml Hợp chất 3,3’-di-methylellagic acid 4-O-α-L-rhamnopyranoside thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB với giá trị IC50 là 28,3 μg/ml.

C n chi t chloroform c a v ặ ế ủ ỏthân Elaeocarpus mastersiithể ệ hi n ho t tính gây ạ độ ế bào đáng kểc t khi th nghi m v i dòng t ử ệ ớ ế bào ung thư cho người [30] Qu cây ả

Elaeocarpus oblongus có tính sát trùng và được sử dụng để chữa bệnh khớp, viêm phổi, loét, trĩ và bệnh hôi miệng Elaeocarpus parvifolius được dùng để chữa bệnh sốt rét Thân cây đắng và nước lá chua của Elaeocarpus petiolatus được sử dụng để phòng ngừa say nắng và chữa sốt Các loài thực vật như Elaeocarpus polydactylus, Elaeocarpus dolichostylis và Elaeocarpus densiflorus có hoạt tính kháng u, giảm đau và thể hiện hiệu quả trong việc chữa trị các bệnh tim mạch.

Elaeocarpus serratus được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường và giải độc Vỏ cây của loài này có tác dụng chữa sốt xuất huyết, trầm cảm và viêm loét Elaeocarpus tuberculatus có khả năng điều trị bệnh khớp, thương hàn và động kinh Các chiết xuất ethanol từ Elaeocarpus ganitrus thể hiện hoạt tính giảm đau Ngoài ra, các chiết xuất ete dầu hỏa, benzene, chloroform, acetone và ethanol từ Elaeocarpus sphaericus cho thấy hoạt tính điều trị hen phế quản, cùng với tính kháng viêm, kháng khuẩn và chống loét.

D ch chi methanol t và v ị ết ừ lá ỏ thân của Elaeocarpus ﬂoribundus Blume thể

Gi ớ i thi ệ u v cây Côm B ề ắ c b ộ - Elaeocarpus tonkinensis

Cây Côm Elaeocarpus tonkinensis A DC, còn gọi là Côm Bọ, là loại cây đại mộc cao từ 7-8 m với nhánh mộc nhẵn, không lông Lá cây có đáy nhọn, không lông, khi khô có màu nâu giống lá trà, với gân phẳng và 8 cặp gân; cuống lá dài từ 1-1,5 cm Hoa của cây mọc thành chùm dài từ 3-5 cm, có màu nhạt, với lá đài không lông, cánh hoa chẻ đôi và có 15-16 rìa ngắn, cùng với 40 nhị Dĩa mật nguyên và có lông, noãn sào cũng có lông và chia thành 3 buồng.

1.3.2 Phân bố n nay Vi t Nam, cây Côm B phân b y u t i các t nh B c Trung

1.3.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước n nay, t Nam và trên th gi

Hiệ ở Việ ế ới chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố về thành ph n hóa h c và ho t tính sinh h c củầ ọ ạ ọ a cây Côm B c Bộ ắ

Hình 1.2: Cây Côm Elaeocarpus tonkinensis A DC

Ho ạ t tính kháng virus

1.4.1 Hoạt tính kháng virus c a các h p ch t phân lủ ợ ấ ập được từ chi Elaeocarpus

Chi Elaeocarpus chứa nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, và phenolic như acid gallic, acid ellagic và geraniin Mặc dù hoạt tính kháng virus của các loài trong chi này chưa được nghiên cứu nhiều, nhưng hoạt tính kháng virus của các hợp chất có trong chi đã được nghiên cứu từ lâu.

Nghiên cứu của Guan-Heng Chen và các cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng acid gallic và acid ellagic có khả năng ức chế virus cúm A với nồng độ IC50 khoảng 6 μM.

Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ 50 μM có khả năng ức chế virus trên 50% Các hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol và isorhamnetin cũng cho thấy khả năng ức chế virus A/PR/08/34 (H1N1) Cụ thể, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl (12)-α-L-rhamnoside, kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside và quercetin-3-O-α-L-rhamnoside có khả năng chống lại virus RSV với nồng độ IC50 trong khoảng 1.9-57.3 µg/mL Đặc biệt, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside có tác dụng mạnh hơn nhưng độc tính thấp hơn so với thuốc ribavirin hiện đang được sử dụng để điều trị RSV.

Nghiên cứu của Mi-Jeong Ahn và các cộng sự (2002) cho thấy acid gallic, chebulagic, quercetin cùng một số flavonoid khác có khả năng ức chế virus HIV-1 với IC50 trong khoảng 4.4-75.2 μM Acid chebulagic cũng đã được chứng minh có tác dụng mạnh mẽ đối với nhiều loại virus khác nhau như HSV-1, HCMV, HCV, DENV, MV và RSV Các hợp chất phenolic khác như 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose và 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose cũng cho thấy khả năng ức chế virus HCV-NS3, HBV, HIV và HSV ở các nồng độ khác nhau.

Nghiên cứu năm 2013 của nhóm tác giả Kyoko Ueda đã chỉ ra rằng tannin chiết xuất từ cây hồng (Diospyros kaki) có tác dụng mạnh mẽ và ảnh hưởng đến 12 loại virus khác nhau, bao gồm cả virus có vỏ như H3N2, H5N3, HSV-1, VSV, SeV, NDV và virus không có vỏ.

1.4.2 Virus cúm a Giới thiệu v virus cúm ề [36]

Bệnh cúm là một bệnh lây nhiễm qua đường hô hấp với triệu chứng chủ yếu là sốt cao đột ngột, sổ mũi, nhức đầu, mệt mỏi và đau toàn thân Nếu không được kiểm soát tốt, sau vài tháng, bệnh cúm có thể lây lan ra diện rộng, gây ra đại dịch.

 Đạ ịi d ch 1889-1890: virus cúm đã gây dịch h u hở ầ ết các nước trên th gi i ế ớ Không thống kê đượ ố ngườc s i bệnh và t vong ử

 1918-1919: đạ ịi d ch cúm do dòng virus H1N1 t Tây Ban Nha lan ra nhi u ừ ề nước, làm 500 triệu người m c b nh và 20 triắ ệ ệu người ch t ế

 1957- 1959: đạ ịi d ch lan ra t Châu Á sang các lừ ục địa khác (cúm Châu Á) làm 40% nhân loại mắc b nh Mi n B c Việ ề ắ ệt Nam, năm 1957 thống kê được g n ầ

1 tri u bệ ệnh nhân và năm 1959 gần 2 triệu.

Từ năm 1968 đến 1970, dịch cúm Hồng Kông đã lan rộng khắp các địa phương, với đỉnh điểm vào đầu năm 1970 khi cúm bùng phát ở miền Bắc Việt Nam, ghi nhận khoảng 1,6 triệu ca mắc Kể từ đó, dịch cúm này đã tái phát nhiều lần, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, với nhiều đơn vị ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân lên tới 30-40% quân số chỉ trong vài tuần.

Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, được phân loại thành ba loại: A, B và C, gây bệnh cho người và động vật Trong số này, loại A và C có khả năng gây bệnh cho cả người và động vật, trong khi loại B chủ yếu ảnh hưởng đến con người và hải cẩu Virus cúm loại A được coi là nguy hiểm nhất do khả năng gây ra các đợt cúm nghiêm trọng ở người và có tốc độ biến đổi nhanh chóng.

Triệu chứng của bệnh cúm bao gồm sốt trên 38°C, lạnh run và đổ mồ hôi, nhức đầu, ho khan, nghẹt mũi, đau nhức cơ bắp, đặc biệt là ở lưng, tay và chân Người bệnh thường cảm thấy mệt mỏi, yếu ớt, có cảm giác chán ăn, chảy mũi và có thể bị tiêu chảy Bên cạnh đó, hoạt tính kháng virus cúm cũng là một yếu tố quan trọng cần lưu ý.

Như đã nêu ở ụ m c 1.4.1, các h p ch t có trong chi ợ ấ Elaeocarpus th hi n ho t ể ệ ạ tính kháng nhiều loại virus cúm như: H1N1, H3N2, H5N3…

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất flavonoid như apigenin và kaempferol có hoạt tính kháng virus cúm H1N1, với giá trị EC50 gần tương tự ribavirin Catechin, epicatechin và các dẫn xuất của chúng cũng cho thấy hiệu quả chống lại virus A/H1N1 và A/H3N2 Quercetin, quercitrin và rutin đã được chứng minh có khả năng ngăn ngừa virus cúm A/H1N1, A/H3N2 và cúm B Theo nghiên cứu của Robert H Green, tannic acid có khả năng kìm hãm sự nhân lên của virus cúm A trong thí nghiệm in vivo và ngăn chặn hoạt động của virus trong thí nghiệm in vitro Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng tannic acid, acid gallic và các dẫn xuất của chúng thể hiện khả năng kháng virus cúm A/H1N1.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đố i tư ợ ng nghiên c u 20 ứ 2.2 Thiết bị , hóa ch t 20ấ 2.3 Phương pháp nghiên cứ u

Nguyên liệu được thu hái từ cành và lá cây Côm B (Elaeocarpus Tonkinensis A.DC) tại vườn quốc gia Vũ Quang, tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam Việc xác định nguyên liệu này được thực hiện bởi tiến sĩ Đỗ Ngọc Đài, thuộc khoa Lâm Nghiệp, trường Đại học Kinh Tế Nghệ An.

An Mẫu tiêu bản được lưu trữ ạ t i Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật – VAST

Hình 2.1: M u cành lá cây Côm Bẫ ắc Bộ 2.2 Thiết bị, hóa ch t ấ

 D ng c và hóa chụ ụ ất:

Dụng cụ thí nghiệm bao gồm bình tam giác với các dung tích 250 mL, 500 mL, 1000 mL và 2000 mL, bình cầu từ 100 mL đến 500 mL, cốc đo, ống nghiệm, bình chứa tinh thể với dung tích 25 mL, 50 mL và 100 mL, ống đong với các kích thước 5 mL, 10 mL, 50 mL và 250 mL, phễu chiết, pipet và ống hút chia độ.

Hóa ch t thí nghi m: dung môi methanol (MeOH), dichlo methane (DCM)ấ ệ ro , ethyl acetate (EtOAc), n-hexane (H), acetone,… Bột silica gel 60 Merck c h t 0,063-ỡ ạ 0,2 mm, b t Sephadex LH-20,ộ …

 Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R 210 –

 B n s c ký l p m ng silica gel Merck 60 Fả ắ ớ ỏ 254 dày 0,2 mm

2.3.1 Các phương pháp phân l p ch t ậ ấ [3]

Mũi vẫy sau khi thu hái được sấy khô và nghiền nhỏ, sau đó tiến hành ngâm chiết với methanol Dịch chiết thu được sẽ loại bỏ dung môi, cho ra cao chiết ổn định Cao tổng sau đó sẽ được phân đoạn hóa bằng các dung môi từ kém phân cực đến phân cực mạnh.

2.3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp m ng TLCỏ

S c kí l p mắ ớ ỏng TLC được th c hi n trên b n m ng TLC Silica gel 60 Fự ệ ả ỏ 254

Sau khi triển khai, các bản mẻ ả ỏng TLC này được kiểm tra trong các thủ tục sử dụng: dung dịch anisaldehyde (AS), dung dịch kiềm (KOH), dung dịch ferric (FeCl3), Iot (I2) và dung dịch CAM (Ceric Ammonium Molybdate).

Các dung dịch chứa anisaldehyde, dung dịch kiềm và dung dịch feric được phun hoặc quết đều lên bề mặt màng Sau đó, sấy khô ở nhiệt độ cao trên bếp điện cho đến khi hiện màu.

2.3.1.3 Phương pháp sắc ký cột

Sắc kí cột thường (CC), chất hấp ph ụ là silica gel (Merck, 60Å) có cỡ ạt từ h 40 ÷ 63 μm và 15 ÷ 40 μm

S c kớ cắ ột gel (Sephadex LH20) (Sigma, particle 100 àm) được ngõm trương n ở trong MeOH trước khi đổ vào c t s c ký ộ ắ

Hệ thống sắc ký HPLC sử dụng máy dò Hitachi L-2455 diode và máy bơm L-2130, với cột phân tích kích thước 4,6 x 150 mm (TOSOH, RP-18, Nhật Bản) và cột chuẩn bị 10 mm x 150 mm (Cosmosil, RP-18, Nhật Bản) Tốc độ dòng chảy được thiết lập ở mức 3,0 mL/phút, cùng với việc sử dụng máy đo UV ở bước sóng 231 nm.

2.3.2 Các phương pháp xác định cấu trúc c a các ch t phân lủ ấ ập được

Cấu trúc của các chất phân lập được xác định bằng phương pháp khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ MS được đo bởi máy Mass Spectrometer LTQ Orbitrap XL tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phổ NMR được đo trên máy Bruker.

Máy NMR AM 500 FT-NMR (500 MHz cho ^1H NMR, 125 MHz cho ^13C NMR và DEPT NMR) được sử dụng tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cùng với Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Chất chuẩn nội là TMS (Tetrametylsilan).

2.3.3 Phương pháp thử nghi m hoệ ạt tính kháng virus cúm

Các thí nghiệm thử hoạt tính kháng virus được thực hiện b i Nhóm nghiên c u ở ứ virus, Vi n nghiên c u công ngh hóa h c Hàn Qu c, Daejeon, Hàn Quệ ứ ệ ọ ố ốc.

Phương pháp in vitro được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính kháng virus thông qua việc đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) Các chủng virus A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8), A/Hong Kong/8/68 (H3N2; HK) và B/Lee/40 (Lee) được cung cấp bởi ATCC Virus cúm A (PR8 và HK) được nhân giống trong trứng gà mười ngày tuổi ở 37°C trong 3 ngày, trong khi virus cúm B (Lee) được nhân trên tế bào MDCK trong điều kiện không huyết thanh Tế bào MDCK được duy trì trong môi trường MEM với 10% huyết thanh bào thai bò ở 37°C và 5% CO2 Các thuốc kháng virus như amantadine hydrochloride, ribavirin và oseltamivir carboxylate được sử dụng làm đối chứng dương Trong thử nghiệm, tế bào MDCK được cấy vào khay 96 giếng và gây nhiễm virus cúm với bội số gây nhiễm (MOI) là 0,001 trong 1 giờ ở 35°C Các đối chứng dương và hợp chất thử nghiệm được hòa tan trong MEM có bổ sung TPCK-trypsin, sau đó mật độ huỳnh quang phản ánh khả năng sống sót của tế bào được đo bằng cách nhuộm fluorescein diacetate Nồng độ CC50 được xác định để đánh giá hiệu quả của các hợp chất kháng virus.

EC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism 6 (Phần mềm GraphPad) Chỉ số chọn lọc (S.I.) được biểu diễn bằng tỉ số CC50/EC50.

3.1.1 Thu thập mẫu thực vật

M u cành và lá cây Côm B c B - ẫ ắ ộ Elaeocarpus tonkinensis D.C sau khi mua v ề được làm sạch, phơi hoặ ấc s y khô nhiở ệ ột đ 50°C Mẫu sau đó được nghi n m n và ề ị b o qu n trong bình hút m ả ả ẩ

3.1.2 Quá trình ngâm và phân l p c n chi tậ ặ ế

Trong quá trình chiết xuất methanol công nghiệp, 9,5 kg bã côm được ngâm trong 20 lít dung môi trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau khi lọc, dịch chiết thu được được cô quay chân không ở 55°C, cho ra 1,1 kg cồn chiết methanol.

T d ch chi t t ng b sung thêm 5ừ ị ế ổ ổ L nước để chiết phân b l ng-l ng v i các ố ỏ ỏ ớ loại dung môi khác nhau có độ phân cực tăng dầ (Sơ đồn 3.2):

 D ch chi t A: chi t 3 l n, m i l n chi t v i 5L -hexane (Vị ế ế ầ ỗ ầ ế ớ n d ch ị : V n-hexane = 1 :

1) Ph n d ch n-ầ ị hexane đem cô quay chân không loại dung môi và sấy khô thu được 247,8g c n hexane ặ

 Dịch chiết B: chi t 3 l n, m i l n chi t v i 5L dichloromethane (DCM) ế ầ ỗ ầ ế ớ (Vd ch ị

: VDCM=1 : 1) Ph n dầ ịch DCM đem cô quay chân không loại dung môi và s y khô ấ thu được 50,1 g c n DCM ặ

 D ch chi t C: chi t 3 l n, m i l n chi t v i 5L ethyl acetate (EtOAc) ị ế ế ầ ỗ ầ ế ớ (Vd ch ị :

VEtOAc = 1 : 1) Ph n dầ ịch EtOAcđem cô quay chân không loại dung môi và s y khô ấ thu được 241,4 g c n EtOAc Ph n dặ ầ ịch nước được đậy kín và b o qu n trong t hút ả ả ủ

Sơ đồ 3.2: X lý c n chi t MeOH ử ặ ế

3.2 Phân lập một số ợ h p ch t trong c n DCM ấ ặ

3.2.1 Khảo sát sơ bộ ặn 2 bằng sắ c c ký l p mớ ỏng.

Chúng tôi sử dụng 50,1 g chất cần phân tích trong DCM, sau đó lấy ra khoảng vài mg để hòa tan hoàn toàn bằng DCM và MeOH Dịch thu được sẽ được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các dung môi triển khai khác nhau: HE 8/2, HE 7/3, DM 50/1, EMW 100/13/10 và EMW 77/13/10.

Trướ c khi hi n b ng Iot Sau khi hi n b ng Iot ệ ằ ệ ằ

Hình 3.1: Khảo sát c n ặ chiết DCM b ng s c ký l p m ng ằ ắ ớ ỏ Qua TLC ta chọn h ch y HE 7/3 là h chệ ạ ệ ạy đầu tiên, sau đó tăng 10% EtOAc

3.2.2 Phân đoạn hóa c DCM ặn

Tiến hành ch y s c ký c t v i ạ ắ ộ ớ 7 g c n DCM: ặ

 Chuẩn b ch t ch y c 7 g c n DCM ị ấ ạ ột: ặ được hòa tan hoàn toàn và tẩm với 30 g silica gel cỡ ừ v a Cô quay chân không loại dung môi đến khô

Chọn c t ộ  45 mm, dài 70 cm, có van khóa Lượng silica gel nh i cồ ột: khoảng

Tiến hành gradient r a gi i v i ử ả ớ h dung môi rệ ửa giải H/E (8:2-0:1, v/v) và E/M (1:0-1:1, v/v) trong bình tam giác có dung tích từ 400 đến 500 ml Sau đó, cô quay ứ ị ử ả ằ ả – chân không để loại bớt dung môi và gom d ch vào ng nghi m.

Kiểm tra b ng s c ký b n m ng, ti n hành gom các ng nghi m có các v t chất ằ ắ ả ỏ ế ố ệ ế tương đương nhau trên bản mỏng thu được 15 phân đoạn khác nhau (PĐ2.1-PĐ2.15)

Phân đoạn PĐ2.6 (45 mg) đã được chiết xuất bằng gel Sephadex LH20 và dung môi metanol 70%, thu được ba phân đoạn PĐn (2.6.1 - PĐ2.6.3) Phân đoạn PĐ2.5.1 sau đó được phân tích bằng HPLC với cột C-18 (10x150 mm) và dung môi MeOH/H2O (4:6-7:3) trong 45 phút, sau đó chuyển sang dung môi MeOH 100% trong 5 phút Kết quả cho thấy chất 1 (5,6 mg) có thời gian lưu 6,5 phút và chất 2 (24,9 mg) có thời gian lưu 22,6 phút.

Phân đoạn PĐ2.10 (738 mg) ti p tế ục được ti n hành s c ký c t silica gel v i h ế ắ ộ ớ ệ dung môi r a gi i EtOAc/MeOH (1:0-ử ả 0:1), thu được 6 phân đoạn (PĐ2.10.1-

Từ phân đoạn PĐ2.10.5, chúng tôi đã thực hiện các bước cần thiết để thu được sản phẩm Phân đoạn sau đó được xử lý bằng cách lọc, rửa và kết tinh lại với dung môi DCM/MeOH (9:1, v/v), kết quả thu được là 32 mg chất 3 (Sơ đồ 3.3).

Sơ đồ 3.3: Phân l p các ch t t c n DCM ậ ấ ừ ặ

3.3 Phân lập một số ợ h p ch t trong c n EtOAc ấ ặ

3.3.1 Khảo sát sơ bộ ặn c 3 bằng sắc ký l p mớ ỏng

T 241,4 g chất cần ủ EtOAc, lấy khoảng vài mg cho vào ng nghiấ ả ố ệm, hòa tan hoàn toàn bằng methanol Dằ ịch thu được ti n hành kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi trình khai, hiện b n m ng bằng Ce(SO4)2.

Hình 3.2: Kh o sát TLC c n chi t EtOAc ả ặ ế

Tiến hành ch y s c ký c t vớạ ắ ộ i 30g c n EtOAc ặ

L y 30g c n 3 hoà tan hoàn toàn b ng methanol và t m v i 45g silica gel c ấ ặ ằ ẩ ớ ỡ vừa, cô quay chân không loại dung môi đến khô

 Chuẩn b c t: ị ộ Chọn c t  45 mm, dài 70 cm, có van khóa ộ Lượng silica gel chạy c t: ộ 600 g silica gel c hỡ ạt 0,043-0,06 mm

Tiến hành r a gi i b ng h dung môi DCM/MeOH (1:0-0:1) ử ả ằ ệ theo độ tăng dần của hệ dung môi phân cực

H ng d ch r a gi i b ng bình tam giác kho ng 400 500 ml Cô quay chân ứ ị ử ả ằ ả – không lo i b t dung môi và gom d ch vào ng nghi m ạ ớ ị ố ệ

THỰ C NGHI M 24 Ệ 3.1 Chu ẩ n b ị ẫ m u chi t 24ế 3.1.1 Thu thậ p m ẫu thực vậ t

Phân l ậ p m ộ t s ố ợ h p ch t trong c n DCM 26 ấ ặ 1 Kh ảo sát sơ bộ ặ c n 2 b ằ ng s ắ c ký l p mớ ỏ ng

3.2.1 Khảo sát sơ bộ ặn 2 bằng sắ c c ký l p mớ ỏng.

Chúng tôi lấy 50,1 g chất cần phân tích trong DCM, sau đó hòa tan hoàn toàn trong dung môi DCM và MeOH Dịch thu được sẽ được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các dung môi triển khai sau: HE 8/2, HE 7/3, DM 50/1, EMW 100/13/10, và EMW 77/13/10.

Trướ c khi hi n b ng Iot Sau khi hi n b ng Iot ệ ằ ệ ằ

Hình 3.1: Khảo sát c n ặ chiết DCM b ng s c ký l p m ng ằ ắ ớ ỏ Qua TLC ta chọn h ch y HE 7/3 là h chệ ạ ệ ạy đầu tiên, sau đó tăng 10% EtOAc

3.2.2 Phân đoạn hóa c DCM ặn

Tiến hành ch y s c ký c t v i ạ ắ ộ ớ 7 g c n DCM: ặ

 Chuẩn b ch t ch y c 7 g c n DCM ị ấ ạ ột: ặ được hòa tan hoàn toàn và tẩm với 30 g silica gel cỡ ừ v a Cô quay chân không loại dung môi đến khô

Chọn c t ộ  45 mm, dài 70 cm, có van khóa Lượng silica gel nh i cồ ột: khoảng

Tiến hành gradient rã giải với dung môi hệ H/E (8:2-0:1, v/v) và E/M (1:0-1:1, v/v) trong bình tam giác có dung tích từ 400 đến 500 ml Sử dụng phương pháp cô quay chân không để loại bỏ dung môi, sau đó gom dịch vào ng nghiêm.

Kiểm tra b ng s c ký b n m ng, ti n hành gom các ng nghi m có các v t chất ằ ắ ả ỏ ế ố ệ ế tương đương nhau trên bản mỏng thu được 15 phân đoạn khác nhau (PĐ2.1-PĐ2.15)

Phân đoạn PĐ2.6 (45 mg) được tách ra bằng kỹ thuật gel Sephadex LH20 với dung môi metanol 70%, thu được ba phân đoạn PĐn (PĐ2.6.1 - PĐ2.6.3) Phân đoạn PĐ2.5.1 sau đó được phân tích bằng HPLC với cột C-18 (10x150 mm) và dung môi MeOH/H2O (4:6-7:3) trong 45 phút, tiếp theo là dung môi MeOH 100% trong 5 phút Kết quả thu được chất 1 (5,6 mg) tại thời gian lưu 6,5 phút và chất 2 (24,9 mg) tại thời gian lưu 22,6 phút.

Phân đoạn PĐ2.10 (738 mg) ti p tế ục được ti n hành s c ký c t silica gel v i h ế ắ ộ ớ ệ dung môi r a gi i EtOAc/MeOH (1:0-ử ả 0:1), thu được 6 phân đoạn (PĐ2.10.1-

Từ phân đoạn PĐ2.10.5, chúng tôi đã thay đổi xuất hiện kết tủa Phần tách ẩm sau đó được lọc lấy, rửa và kết tinh lại với dung môi DCM/MeOH (9:1, v/v), kết quả thu được là 32 mg chất rắn (Sơ đồ 3.3).

Sơ đồ 3.3: Phân l p các ch t t c n DCM ậ ấ ừ ặ

Phân l ậ p m ộ t s ố ợ h p ch t trong c n EtOAc 28 ấ ặ 1 Khảo sát sơ bộ ặn 3 bằng sắ c c ký l p m ngớỏ

3.3.1 Khảo sát sơ bộ ặn c 3 bằng sắc ký l p mớ ỏng

T 241,4 g của chất cần ử dụng EtOAc, sau đó thêm vài mg vào ng nghiấ ả ố ệm và hòa tan hoàn toàn bằng methanol Dung dịch thu được sẽ được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi tri n khai, hi n b n m ng b ng Ce(SO4)2.

Hình 3.2: Kh o sát TLC c n chi t EtOAc ả ặ ế

Tiến hành ch y s c ký c t vớạ ắ ộ i 30g c n EtOAc ặ

L y 30g c n 3 hoà tan hoàn toàn b ng methanol và t m v i 45g silica gel c ấ ặ ằ ẩ ớ ỡ vừa, cô quay chân không loại dung môi đến khô

 Chuẩn b c t: ị ộ Chọn c t  45 mm, dài 70 cm, có van khóa ộ Lượng silica gel chạy c t: ộ 600 g silica gel c hỡ ạt 0,043-0,06 mm

Tiến hành r a gi i b ng h dung môi DCM/MeOH (1:0-0:1) ử ả ằ ệ theo độ tăng dần của hệ dung môi phân cực

H ng d ch r a gi i b ng bình tam giác kho ng 400 500 ml Cô quay chân ứ ị ử ả ằ ả – không lo i b t dung môi và gom d ch vào ng nghi m ạ ớ ị ố ệ

Kiểm tra bảng số liệu ký bản mỏng, tiến hành gom các nhóm nghiệm có các vật chất ằ, ắ, ả, ỏ, ế, ố, ệ, ế tương đương nhau, từ đó thu được 8 phân đoạn khác nhau (PĐ3.1 đến PĐ3.8).

Phân đoạn PĐ3.4 (624 mg) được tiếp tục xử lý bằng cách sử dụng gel Sephadex LH-20 với dung môi MeOH, thu được 15 phân đoạn từ PĐ3.4.1 đến PĐ3.4.15 Từ phân đoạn PĐ3.4.3 và PĐ3.4.10, chúng tôi đã thu được kết quả khả quan Phân đoạn sau đó được lọc, rửa và kết tinh lại với dung môi DCM/MeOH (95:5, v/v), kết quả thu được là 20 mg chất 4 và 27 mg chất 5.

Phân đoạn PĐ3.6 (728 mg) được tiến hành chiết lỏng bằng silica gel với dung môi rã giề ử EtOAc/MeOH, thu được 12 phân đoạn (PĐ3.6.1-PĐ3.6.12) Từ phân đoạn PĐ3.6.8, chúng tôi thấy xuất hiện kết tủa Phân tách này sau đó được lọc, rửa, kết tinh lại với dung môi DCM/MeOH (9:1, v/v), kết quả thu được 24 mg chất rắn (Sơ đồ 3.4).

Sơ đồ 3.5: ân lPh ập các ch t t c n EtOAc ấ ừ ặ

 Dung môi r a gi MeOH ử ải

3.4 Tính chất vật lý và d ữliệu phổcác hợp ch t phân lấ ập được

Chất 1: b t màu tr ng; ộ ắ ESI-MS m/z 403 [M+H] + (C24H34O5); 1 H-NMR (CD3OD,

500 MHz ),δ H (ppm): 5,82 (1H, , = 3,0 Hz, H-6), 4,81 (1H, t J brm, H-16), 4,58 (1H, dd J, = 6,0; 13,0 Hz, H-2), 3,52 (1H, , = 14,5 Hz, H-12a), 3.23 (1H, , = 7,0 Hz, d J d J

H-17), 3,03 (1H, d, J = 13,0 Hz, H-10), 2,45 (1H, , = 14,5 Hz, H-12b), 2,43 (1H, d J ddd, J = 3,0; 8,5; 17,5 Hz, H-7b), 2,19 (3H, s, H-21), 2,10 (1H, ddd J = 3,5; 5,8; 12,5 ,

15b), 1,51 (1H, d, J = 13,5 Hz, H-15a), 1,41 (3H, , H-24), 1,31 và 1,29 (6H, , H-23 s s và H-22), 1,22 (1H, brd J, = 12,5 Hz, H-1b), 1,05 (3H, , H-18), 0,67 (3H, , H-19); s s

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz), δ C (ppm): 37,1 (C-1), 72,8 (C-2), 214,0 (C-3), 51,8 (C-4), 142,1 (C-5), 121,0 (C-6), 24,9 (C-7), 44,3 (C-8), 49,9 (C-9), 34,8 (C-10), 213,9 (C-11), 48,2 (C-12), 51,3 (C-13), 50,2 (C-14), 46,1 (C-15), 72,5 (C-16), 67,9 (C-17), 20,2 (C-18), 20,1 (C-19), 210,7 (C-20), 31,8 (C-21), 29,8 (C-22), 21,9 (C-23), 19,5 (C-24)

Chất 2: b t màu tr ng; ộ ắ ESI-MS m/z 539 [M+Na] + (C30H44O7); 1 H-NMR (CDCl3,

23), 5,78 (1H, dd, J = 3,5; 2,5 Hz, H-6), 4, 45 (1H, dd J = , 6,0; 13,0 Hz, H-2), 4,34 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-16), 3,31 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-12a), 2,78 (1H, br d, J = 13,0

Hz, H-10), 2,69 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-12b), 2,56 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-17), 2,40 (1H, ddd, J = 17,0; 5, 2,5 Hz, H- ), 2,32 (1H, 5; 7b ddd J = , 9,0; 6,0; 3,5 Hz, H-1a), 1,97 (1H, , H-8), 1,95 (1H, H-7a), 1,87 (1H, m m, dd, J = 13,0; 8,5 Hz, H-15b), 1,37 (1H, m, H-15a), 1,39 (3H, , H-21), 1,34 s (6H, s, H-29 và H-30), 1,35 (6H, , H-26 và s

H-27), 1,30 (3H, s, H-28), 1,21 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1b), 1,08 (3H, , H-19), 0, s 98 (3H, s, H-18); 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δ C (ppm): 36,0 -1), 71,6 -(C (C 2), 213,0 (C-3), 50,3 -4), 140,5 -5), 120,3 -6), 23,9 -7), 42,4 -8), 48,3 -9), 33,8 (C (C (C (C (C (C (C-10), 212,2 -11), 48,7 -12), ,8 (C-13), 48,4 (C (C 50 (C-14), 45,5 -15), 71,5 (C (C-

Chất : 3 b t màu tr ng; ộ ắ 1 H-NMR (500MHz, CD3OD), δ C (ppm): 6,67 (1H, m, H-

13C-NMR (500MHz, CD3OD) δ H (ppm): 172,8 (C=O), 135,2 (C-2), 134,3 (C-1), 73,5 (C-4), 68,4 (C-5), 67,6 (C-3), 33,1 -6) (C

Chất : 4 b t màu tr ng; ộ ắ 1 H-NMR (CD3OD), δ H (ppm): 7,06 (1H, , H-2, H-6); s

Chất 5: tinh th hình kim màu tr ng vàng; ể ắ 1 H-NMR (CD3OD), δ H (ppm): 8,44 (1H, d J, = 9,0 Hz, H-1), 7,37 (1H, , H-7), 6,77 (1H, , = 9,0 Hz, H-2); s d J 13 C-NMR (CD3OD), δ C (ppm): 119,2 (C-1), 112,5 (C-2), 144,0 (C-3), 133,3 (C-4), 140,9 (C- 4a), 163,9 -6), 112,0 (C-6a), 108,2 (C-7), 146,4 (C-8), 146,7 (C-9), 141,9 (C-10), (C 118,5 (C-10a), 112,8 (C-10b)

Chất 6: b t màu tr ng; ộ ắ 1 H-NMR (DMSO), δ H (ppm):MHz), δH (ppm): 7,81 (1H, s, H-5), 7,61 (1H, , H-5’), 5,37 (1H, s d, J = 8,0 Hz, H-1”), 4,82 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-2”), 3,45 (2H, , H-m 6a” và H 6b”), 4,02- (3H, , H-8), 3,97 (3H, , H-s s 8’), 3,95 (3H, s, H-9’), 2,05 (3H, s, 8”-CH3); 13 C- NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz), δC (ppm): 170,2 (C- 7”), 158,9 (C-7), 158,7 -(C 7’), 154,9 (C 4’), 151,7 (C- -4), 142,2 (C-3), 141,7 -3(C ’), 141,6 (C-2’), 141,4 (C-2), 114,7 (C-6), 113,1 (C-1), 113,1 (C-6’), 112,9 (C 1’), 112,8 - (C-5), 108,1 -(C 5’), 99,3 (C 1”)- , 77,7 (C-4”), 74,0 (C 2”), 73,0- -(C 3”), 69,9 (C 5”), - 62,0 -8), 61,8 (C-(C 8’), 60,8 (C 6’’), 57,2 (C 9’), 21,2 (C 8”).- - -

3.5 Thửnghiệm ho t tính sinh h c kháng virus cúm ạ ọ

3.5.1 Thửnghiệm hoạt tính kháng virus cúm c a ủ các cao chiết cây Côm Bắc Bộ

Các mẫu cao chiết MeOH, n-hexane, DCM và EtOAc đã được thực hiện thí nghiệm in vitro để đánh giá hoạt tính kháng virus đối với hai chủng virus cúm A: A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8), A/Hong Kong/8/68 (H3N2; HK) và một chủng virus cúm B: B/Lee/40 (Lee) thông qua phương pháp đánh giá khả năng gây bệnh tích tụ bào-ế CPE.

3.5.2 Thửnghiệm ho t tính kháng virus cúm c a các ch t phân lạ ủ ấ ập được cây Côm

Các chất sắc chiết phân lập từ DCM và EtOAc đã được tiến hành thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng virus với hai chủng virus cúm A: A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8) và A/Hong Kong/8/68 (H3N2; HK), cùng với một chủng virus cúm B: B/Lee/40 (Lee) theo phương pháp đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào - CPE.

Thử nghiệ m ho t tính sinh h c kháng virus cúm 31 ạ ọ 1 Th ử nghi ệ m ho t tính kháng virus cúm c a các cao chi t cây Côm ạủế

3.5.1 Thửnghiệm hoạt tính kháng virus cúm c a ủ các cao chiết cây Côm Bắc Bộ

Các mẫu cao chiết MeOH, n-hexane, DCM và EtOAc đã được thử nghiệm in vitro để đánh giá hoạt tính kháng virus đối với hai chủng virus cúm A: A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8), A/Hong Kong/8/68 (H3N2; HK) và một chủng virus cúm B: B/Lee/40 (Lee) bằng phương pháp đánh giá khả năng gây bệnh tích tụ bào-ế CPE.

3.5.2 Thửnghiệm ho t tính kháng virus cúm c a các ch t phân lạ ủ ấ ập được cây Côm

Các chất sắc phân lập từ DCM và EtOAc đã được tiến hành thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng virus đối với hai chủng virus cúm A: A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8), A/Hong Kong/8/68 (H3N2; HK) và một chủng virus cúm B: B/Lee/40 (Lee) theo phương pháp đánh giá khả năng gây bệnh tích tụ bào-ế CPE.

KẾ T QU VÀ TH O LU N 33 Ả Ả Ậ 4.1 Xác đị nh c u trúc c a các h p ấủợ ch ấ t phân l ập đượ c

C u trúc hóa h ấ ọ c c ủ a ch ấ t 1

Hình 4.1: C u trúc hóa hấ ọc của chất 1

Phổ ESI-MS của hợp chất 1 cho thấy pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 403,1, tương ứng với công thức phân tử C24H34O5 Đồng thời, phổ 1H-NMR của hợp chất 1 cho thấy tín hiệu của sáu nhóm methyl trong khoảng 0,67 đến 2,19 ppm (3H, s) và hai proton cacbinol tại 4,58 ppm (1H, dd, J = 6,0; 13,0 Hz, H-2) và 4,81 ppm (1H, br m).

Tín hiệu proton olefin xuất hiện ở 5,82 ppm (1H, t, J = 3,0 Hz, H-6) ở trường thấp hơn, trong khi các tín hiệu proton methine và methylene nằm trong khoảng 1,22 đến 2,45 ppm Ảnh hưởng của nhóm carbonyl gần đó làm cho proton methylene (H-12) và proton methine (H-17, H-10) dịch chuyển sang vùng thấp hơn, cụ thể là trong khoảng 3,03-3,52 ppm (Hình 4.3).

Hình 4.3: Ph ổ 1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz) của ch t 1 ấ

Phổ J ủ ợ ất 1 cho thấy sự phân bố của các tín hiệu carbon, bao gồm sáu nhóm methyl từ 19,5 đến 31,5 ppm, hai nhóm carbinol tại 72,5 và 72,8 ppm (C-16 và C-2), ba nhóm carbonyl tại 210,7; 213,9 và 214,0 ppm (C-20, C-11 và C-3), cùng với hai nhóm carbon olefin tại 142,1 (C-5) và 121,0 ppm (C-6) Hơn nữa, các tín hiệu carbon ở nhóm methylene xuất hiện tại 37,1 (C-1), 24,9 (C-7), 48,2 (C-12) và 46,1 ppm (C-15), trong khi các tín hiệu carbon methine được ghi nhận tại 44,3 (C-8), 34,8 (C-10) và 67,9 ppm (C-17), cùng với các tín hiệu carbon bậc bốn khác.

Phổ Jmod-NMR (CD3OD, 125 MHz) của chủ chất 1 cho thấy các tín hiệu proton liên kết trực tiếp với carbon Sự khẳng định này được xác nhận qua phổ HSQC Bên cạnh đó, phổ HMBC chỉ ra sự tương tác giữa carbon carbonyl tại 214,0 (C-ở).

3) với H-1 (2,10 và 1,22), H-2 (4,58), CH3-22 và CH3-23 (1,31 và 1,29); 213,9 (C-ở

11) v H-12 (3,52 và 2,45); 210,7 (C-20) với ở ới CH3-21 (2,19), H-17 (3,23) và H-16 (4,81) Ngoài ra, vị trí nhóm olefin, nhóm hydroxyl cũng được khẳng định d a trên ự các tương tác HMBC (Hình 4.7) Các dữ liệu trên cho th y h p chấ ợ ất 1 là một triterpene có 4 vòng, 3 nhóm carbonyl, 1 nhóm oleﬁn, 2 nhóm carbinol và 6 nhóm methyl So sánh với tư liệu [17 chúng tôi kh], ẳng định chất 1 là hexanorcucurbitacin D v i tên ớIUPAC: (2S,8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R)-17-acetyl-2,16-dihydroxy-4,4,9,13,14- pentamethyl-7,8,9,10,12,13,14,15,16,17-decahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,11(2H,4H)-dione (Bảng 4.1)

Hình 4.5: Ph HSQC c a chổ ủ ất 1

Hình 4.6: Ph COSY c a chổ ủ ất 1

Hình 4.7: Ph HMBC c a chổ ủ ất 1

B ng 4.1: So sánh d u ph c a chả ữliệ ổ ủ ất 1

STT Hexanorcucurbitacin D (CDCl3) Chất 1 (CD3OD) δ C δ C

C u trúc hóa h ấ ọc củ a ch ất 2

Hình 4.9: PhổESI MS a ch t 2 - củ ấ kh i ESI-MS c h p ch cho pic gi ion phân t [M+Na]

Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy sự hiện diện của tám nhóm methyl tại 0,98 đến 1,39 ppm, cùng với hai proton của nhóm carbinol tại 4,34 và 4,45 ppm (H-16 và H-2) Bên cạnh đó, phổ còn ghi nhận tín hiệu proton olefin tại 5,78 ppm (H-6) và hai tín hiệu của trans-olefin tại 6,63 và 7,13 ppm (H-23 và H-24) Phổ khối lượng tại m/z 539,3 tương ứng với công thức phân tử C30H44O7.

Hình 4.10: Phổ 1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz) c a chủ ất 2 Phổ 13 C-NMR c a chủ ất 2 cũng cho thấy 30 tín hi u carbon bao g m tám nhóệ ồ m methyl t 19,3 ừ đến 29,5 ppm; b n carbon carbinol ố ở 71,6 (C-2), 71,5 (C-16), 78,1 (C-

20) và 71,2 ppm (C-25) và ba carbon carbonyl 202,5 (C-22), 212,2 (C-11) và 213,0 ở ppm (C-3 So sánh d u ph c a ch) ữliệ ổ ủ ất 2 và chất 1, chúng tôi nh n thậ ấy chất 1 là d n xu t hexanor c a chẫ ấ ủ ất 2 So sánh với tư liệu [41], chúng tôi khẳng định chất 2 là h p ch t cucurbitacin D v i tên IUPAC: (2S,8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R)-17-ợ ấ ớ ((R,E)-2,6-dihydroxy-6-methyl-3-oxohept-4- -2-yl)-2,16-dihydroxy-4,4,9,13,14-en pentamethyl-7,8,9,10,12,13,14,15,16,17-decahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene- 3,11(2H,4H)-dione) (Bảng 4.2)

Hình 4.11: Phổ 13 C-NMR (CDCl 3 , 125 MHz) c a chủ ất 2

B ng 4.2: So sánh d u ph c a chả ữliệ ổ ủ ất 2 STT Cucurbitacine D (CDCl3, 500

Chất 2 (CDCl3, 500 MHz) δ C δ H (J,Hz) δ C δ H (J, Hz)

Hình 4.13: Phổ 1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz) c a chủ ất 3

Hình 4.14: Phổ 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) c a ủ chất 3

Phổ 1 H-NMR c a chủ ất 3 cho th y m t proton oleﬁn 6,67 ppm (1H, , H-2)ấ ộ ở m ; ba proton methine c nh nhóm hydroxyl 4,36 (1H, , = 4,5 Hz, H-3), 3,98 (1H, ạ ở brt J m, H-5) và 3,64 (dd, J = 8,5, 4,5 Hz, H-4) và hai proton methylene c nh nạ ối đôi ở 2,80 (dd, J = 18,0, 5,0, Hz, H-6 ) và 2,23 (α dd, J = 18,0, 7,0 Hz, H-6 ) Ph β ổ 13 C-NMR c a chủ ất 3 cho th b y tín hi u ấy ả ệ carbon Ở trường th p, m t tín hi u carbon xu t hi n ấ ộ ệ ấ ệ t i 172,8 ạ (C-7) thuộc v ềcarbon carboxylic Ngoài ra, hai carbon olefin cũng xuất hiện ở 134,3 -2) và 135,2 (C-1) và m(C ột carbon methylene hi n di n 33,1 (C-6) Các ệ ệ ở tín hi u carbon còn l i xu t hi n trong kho ng 67,6-ệ ạ ấ ệ ả 73,5 đặc trưng cho carbon liên k v i nhóm hydroxyl (Hình 4.13 và 4.14) Các d u trên ch ng t h p chết ớ ữliệ ứ ỏ ợ ất 3có chứa m t nhóm carboxylic, m t nộ ộ ối đôi và ba nhóm hydroxyl So sánh với tư liệu

[29, 50], chúng tôi kh nẳ g định chất 3 là acid shikimic ((3R S R,4 ,5 )-3,4,5- trihydroxycyclohex-1-ene-1-carboxylic acid) (Bảng 4.3)

B ng 4.3: So sánh d u ph c a ả ữliệ ổ ủ chất 3

STT A shikimic (CDcid 3OD, 300 MHz) Chất 3 (CD3OD, 500 MHz) δC δH ( J,Hz) δC δH ( J, Hz)

C u trúc hóa h ấ ọ c c ủ a ch ấ t 4

Hợp chất 4 được phân lập từ dung môi EtOAc dưới dạng bột màu trắng Phổ 1H-NMR (CD3OD) của hợp chất 4 cho thấy có sự xuất hiện của một tín hiệu proton đặc trưng ở δH = 7,06 ppm (1H, s, H-2, H-6), cho thấy sự tồn tại của 2 proton vòng thơm đối xứng.

Hình 4.17: Phổ 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) c a ủ chất 4

Phổ 13 C-NMR (CD3OD) cho th y 7 tín hiấ ệu carbon thơm Ở trường th p, 1 tín ấ hi u carbon xu t hi n ệ ấ ệ ở δC = 170,6 ppm c tr ng cho nhóm carboxyl (C-7) và 1 tín đặ ư hi u ệ ở δC = 110,4 ppm c tr ng cho 2 nhóm methine vòng th m c nh nhóm th đặ ư ơ ạ ế hydroxyl (C-2, C-6) Ngoài ra, 2 tín hi u carbon th m xu t hi n ệ ơ ấ ệ ở δC = 146,3 ppm (C-3 và C-5) và δC = 139,5 ppm (C-4) c tr ng cho 3 carbon ch a nhóm th đặ ư ứ ế hydroxyl Tín hi u còn lệ ại đặc tr ng cho carbon th m g n v i nhóm th carboxyl tư ơ ắ ớ ế ại δC = 122,1 ppm (C-1) Các d u trên ch ng t ữliệ ứ ỏchất 4 có c u trúc mấ ột vòng thơm g n v i 3 nhóm hydroxyl và m t nhóm carboxyl So sánh v i d u ph [19], chắ ớ ộ ớ ữliệ ổ ất

4được xác định là acid gallic (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) (Bảng 4.4)

B ng 4.4: D u ph c a acid gallic và chả ữliệ ổ ủ ất 4 STT Gallic acid (CD3OD, 500 MHz) Chất 4 (CD3OD, 500 M ) Hz δC δH ( J,Hz) δC δH ( J,Hz)

4.1.5 C u trúc hóa hấ ọc của chất 5

Phổ 1 H-NMR (CD3OD) của chất 5 cho thấy sự xuất hiện của 3 tín hiệu proton, bao gồm 2 tín hiệu doublet tại 6,76 ppm (H-2) và 8,43 ppm (H-1) với độ rộng J = 9 Hz, đặc trưng cho 2 proton vòng thơm ở vị trí ortho Tín hiệu singlet tại 7,37 ppm (H-7) đặc trưng cho proton vòng thơm ở vị trí khác.

Phổ 13 C-NMR (CD3OD) cho th y s hi n di n c a 13 carbon Các tín hi u thu ấ ự ệ ệ ủ ệ được trong kho ng 108,2-163,9 ppm g i ý s hi n di n cả ợ ự ệ ệ ủa hai vòng thơm và một vòng lactone Tín hi u ệ carbon ở 163,9 ppm (C-6) tại trường thấp đặc trưng cho carbon carbonyl Các tín hi u carbon trong kho ng 133-ệ ả 149 ppm đặc trưng cho 5 carbon thơm mang nhóm thế hydroxyl: 133,3 ppm (C-4), 140,9 ppm (C-3), 141,9 ppm (C-

Chất 5 có cấu trúc gồm hai vòng thơm và một vòng lacton với năm nhóm hydroxyl, được xác định qua phổ 1H-NMR và 13C-NMR Các tín hiệu đặc trưng cho 7 carbon trên nhân thơm không có nhóm thế lần lượt là 108,2 ppm (C-7), 112,0 ppm (C-6a), 112,5 ppm (C-10b), 112,8 ppm (C-2), 118,5 ppm (C-10a), 119,2 ppm (C-1) và 146,8 ppm (C-4a) So sánh với tài liệu [22], chất 5 được xác định là urolithin M-5, với tên IUPAC là 3,4,8,9,10-pentahydroxy-dibenzo[b,d]pyran-6-one.

Hình 4.20: Phổ 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) c a chủ ất 5

B ng 4.5: D u ph ả ữliệ ổso sánh c a h p chủ ợ ất 5

STT Urolithin M5 H p ch t B ợ ấ δC δH ( J,Hz) δC δH ( J,Hz)

4.1.6 C u trúc hóa hấ ọc của chất 6

Ph ổ 1 H-NMR (DMSO-d 6) c a h p chủ ợ ất 6 có s xu t hi n 3 tín hi u singlet ự ấ ệ ệ ở 4,02; 3,97 và 3,95 ppm Đây là các tín hiệu đặc trưng cho proton nhóm methoxy (H-

Các tín hiệu proton ở 7,81 và 7,61 ppm đặc trưng cho proton của vòng thơm (H-5, H-5’), trong khi các tín hiệu proton trong khoảng 3,45 đến 5,37 ppm đặc trưng cho proton của gủ ốc đường Bên cạnh đó, tín hiệu proton ở 2,05 ppm (H-8’’) cùng với các tín hiệu carbon ở 170,2 ppm (C-7’’) và 21,2 ppm (C-8’’) trên phổ cũng được ghi nhận.

J-mod (DMSO-d 6) ch ng t h p chứ ỏ ợ ất 6 có ch a nhóm acetyl (Hình 4.22) ứ PhổJ-mod cũng xuất hi n tín hi u carbon 99,3 ppm (C-ệ ệ ở 1’’), 74,0 ppm (C 2’’), 73,0 ppm (C- - 3’’), 77,7 ppm (C 4’’), 69,9- ppm (C-5’’) và 60,8 ppm (C-6’’) đặc trưng cho các carbon c a ph n ủ ầ đường glucopyranose Ở trường th p, xu t hi n 2 tín hi u carbon ấ ấ ệ ệ carboxylic ở δC = 158,9 và 158,7 ppm (C-7 và C-7 ) Ph HMBC cho th y ba nhóm ’ ổ ấ methoxy ở 4,02; 3,97 và 3,95 ppm (3H, s, H-8, H-8’, H 9’) lần lượt tương tác vớ- i các carbon C-3 (δC = 142,2 ppm), C- 3’ (δC = 141,7 ppm) và C-4’ (δC = 154,9 ppm) Ngoài ra, tương tác giữa proton anomeric H-1’’ (δH = 5,57 ppm) v i carbon C-ớ 4 (δC = 151,7 ppm), ch ng t phứ ỏ ần đường glucopyranose liên k t v i ph n khung ellagic v trí C-ế ớ ầ ở ị

Trong nghiên cứu, carbon C-6’’ (δC = 170,2 ppm) đã thể hiện sự tương tác với proton H-5’’ (δH = 2,05 ppm) qua phương pháp HMBC Dựa trên các dữ liệu so sánh với tài liệu [6], chất này được xác định là một dạng của ellagic glucoside, với tên gọi theo IUPAC là 3,3’,4’–tri-O-methyl-ellagic acid-4-O-β-D-acetylglucopyranose.

STT Tư liệu Chất 6 δC δH ( J, Hz) δC δH ( J, Hz)

Hình 4.22: Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) c a chủ ất 6

Hình 4.23: Phổ J-mod (DMSO-d 6 , 125 MHz) c a chủ ất 6

Hình 4.24: Phổ HMBC c a chủ ất 6 4.2 K t qu ế ảthửhoạt tính c a các cao chi t ủ ế

K t qu ế ảthử nghiệm ho t tính kháng virus cạ ủa các c n -hexane, DCM, EtOAc ặ n và MeOH của E tonkinensisđược trình bày trong b ng 4.7 ả

B ng 4.7: Kả ết quảthử hoạt tính kháng virus của các cao chi t ế

(>1,5) μg/mL AMT k >100,0 >100,0 (N.A n ) 3,2 ± 1,6 (>31,3) >100,0 (N.A n ) μM b ng 4.7, ta y, c n -Hexane và DCM không th hi n ho t tính kháng

Theo nghiên cứu, virus bị ức chế dưới nồng độ CC50 280,0 μg/mL và 111,2 μg/mL Chiết xuất MeOH cho thấy hiệu quả ức chế với giá trị EC50 lần lượt là 19,8 μg/mL cho chủng PR8, 5,1 μg/mL cho chủng HK và 107,7 μg/mL cho chủng Lee Bên cạnh đó, chiết xuất EtOAc cho hoạt tính kháng virus với EC50 dao động từ 52,7 μg/mL đến 205,0 μg/mL đối với các chủng Hơn nữa, chiết xuất MeOH và EtOAc từ cây Côm B không gây độc tế bào đối với dòng MDCK ở nồng độ cao nhất (CC50 > 300,0 μg/mL) Tuy nhiên, so với các thuốc đặc hiệu đang được sử dụng, khả năng ức chế của các mẫu này vẫn chưa cao.

4.3 K t qu ế ảthửhoạt tính c a các ch t phân lủ ấ ập được

K t qu ế ảthử nghiệm ho t tính kháng virus cạ ủa sáu chất 1 6- phân lập đượ ừ ặc t c n DCM và EtOAc của E tonskinensisđược trình bày trong b ng 4.8 ả

B ng 4.8: Kả ết quảthử hoạt tính kháng virus của các ch t phân lấ ập được

Theo bảng 4.8, chất 1 và chất 2 không thể hiện hoạt tính kháng virus thử nghiệm ở nồng độ CC50 300,0 μg/mL Chất 6 không có khả năng ức chế virus PR8 và không thể hiện hoạt tính ức chế virus HK và Lee Chất 3 và chất khác cũng không cho kết quả khả quan.

Bài viết trình bày về bốn chất ức chế có hiệu quả đối với chủng virus thử nghiệm, với giá trị EC50 lần lượt là 61,4 và 8,1 μg/mL đối với virus PR8, và 26,3 cùng 7,8 μg/mL đối với virus khác.

Chất 3 và 4 cho thấy hoạt tính kháng virus đáng kể với nồng độ lần lượt là 71,4 và 19,4 μg/mL đối với chủng HK và 141,2 cùng 161,4 μg/mL đối với chủng MDCK Đặc biệt, chất 5 thể hiện khả năng kháng ba loại virus với nồng độ 58,9 μg/mL cho chủng PR8, 34,3 μg/mL cho chủng HK và 59,6 μg/mL cho chủng Lee, mà không gây độc tế bào ở nồng độ cao nhất (CC50>300,0 μg/mL) So với các thuốc đặc hiệu hiện đang sử dụng, khả năng ức chế của chất 3, 4 và 5 thậm chí còn vượt trội hơn so với RBV, mặc dù không cao bằng AMT và OSV-1.

Qua quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi đã thu được các k t quả ế sau:

1 T ng quan các tài liổ ệu (trong và ngoài nước) có liên quan đến thành ph n hóa hầ ọc c a chi Côm (ủ Elaeocarpus) cây Côm (Elaeocarpus tonkinensis A.DC)

2 Bằng các phương pháp chiết xu t và s c ký, t c n t ng metanol c a cành và lá ấ ắ ừ ặ ổ ủ

Elaeocarpus tonkinensis A.DC, đã thu được 6 chất sạch: 3 ch t s ch t c n DCM và ấ ạ ừ ặ

3 Bằng các phương pháp phổ như 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC và so sánh với tư liệu đã xác định được c u trúc c a các ch t phân lấ ủ ấ ập được lần lượt là: hexanorcucurbitacin D, cucurbitacin D, acid shikimic, acid gall , urolithin-M-5 và ic

3, 3’, 4’–tri-O-methyl-ellagic acid-4-O- -D-β 2’’-O-acetylglucopyranose Đây là các h p chợ ấ ầu tiên đượt đ c phân l p t cây Côm Bậ ừ ắc Bộ-Elaeocarpus tonkinensis

4 Thử nghi m ho t tính kháng virus c a các cao chi t và 6 ch t s ch phân lệ ạ ủ ế ấ ạ ập được đối v i 2 ch ng virus cúm A (PR8 và HK) và 1 ch ng cúm B (Lee) K t qu cho th y, ớ ủ ủ ế ả ấ c n MeOH và EtOAc c a cây Côm B c B và chặ ủ ắ ộ ất 5 có kh ả năng ức ch virus t t và ế ố không gây độ ở ồng độc n tác d ng Ch t ụ ấ 3 4 , có ho t tính kháng virus mạ ạnh nhưng lại gây độc ở ồng độ n tác dụng; chất 1 2 , không có tác d ng kháng virus và chụ ất 6 có kh ả năng kháng virus kém Đây là nghiên cứu đầu tiên v ềhoạt tính c a chủ ất 1 3 5 và - ,

T nh ng k t qu ừ ữ ế ảkhả quan mà đề tài thu được, tôi đề xu t ti p t c nghiên c u các ấ ế ụ ứ vấn đềsau:

1 Tiế ụp t c nghiên c u thành ph n hóa hứ ầ ọc của cây Côm có trong các c n chi ặ ết.

2 Nghiên cứu thành ph n hóa h c và ho t tính sinh h c c a các loài khác thu c chi ầ ọ ạ ọ ủ ộ

[1] Võ Văn Chi (1999), T ừ điển cây thu c Vi t Namố ệ , NXB, Y học.

[2] Phạm Hoàng H (1998), ộ Cây c ỏViệt Nam , NXB Tr , T p 1 ẻ ậ

[3] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Vi t T u (1985), ế ự Phương pháp nghiên cứu hóa h c ọ cây thuốc, Nhà xu t b n Y hấ ả ọc, Hà Nội.

[4] Đỗ ấ T t L i (2001), ợ Những cây thu c và v thu c Vi t Namố ị ố ệ , Nhà xuấ ảt b n Y h c, ọ

Vũ Anh Tài, Trần Thúy Vân và các tác giả khác đã nghiên cứu về tính đa dạng và sự phân bố địa lý của bộ chua me đất (Oxlidales Bercht & J.Presl) tại Việt Nam Nghiên cứu này được trình bày trong hội nghị lý toàn quốc lần thứ 8, tổ chức tại TP Hồ Chí Minh vào năm 2014.

Ph ổ 1 H-NMR (DMSO-d 6) c a h p chủ ợ ất 6 có s xu t hi n 3 tín hi u singlet ự ấ ệ ệ ở 4,02; 3,97 và 3,95 ppm Đây là các tín hiệu đặc trưng cho proton nhóm methoxy (H-

Các tín hiệu proton ở 7,81 và 7,61 ppm đặc trưng cho proton của vòng thơm (H-5, H-5’), trong khi các tín hiệu proton trong khoảng 3,45 đến 5,37 ppm biểu thị cho các proton của gủ ốc đường Bên cạnh đó, sự xuất hiện của tín hiệu proton tại 2,05 ppm (H-8’’) cùng với các tín hiệu carbon ở 170,2 ppm (C-7’’) và 21,2 ppm (C-8’’) trên phổ cũng được ghi nhận.

J-mod (DMSO-d 6) ch ng t h p chứ ỏ ợ ất 6 có ch a nhóm acetyl (Hình 4.22) ứ PhổJ-mod cũng xuất hi n tín hi u carbon 99,3 ppm (C-ệ ệ ở 1’’), 74,0 ppm (C 2’’), 73,0 ppm (C- - 3’’), 77,7 ppm (C 4’’), 69,9- ppm (C-5’’) và 60,8 ppm (C-6’’) đặc trưng cho các carbon c a ph n ủ ầ đường glucopyranose Ở trường th p, xu t hi n 2 tín hi u carbon ấ ấ ệ ệ carboxylic ở δC = 158,9 và 158,7 ppm (C-7 và C-7 ) Ph HMBC cho th y ba nhóm ’ ổ ấ methoxy ở 4,02; 3,97 và 3,95 ppm (3H, s, H-8, H-8’, H 9’) lần lượt tương tác vớ- i các carbon C-3 (δC = 142,2 ppm), C- 3’ (δC = 141,7 ppm) và C-4’ (δC = 154,9 ppm) Ngoài ra, tương tác giữa proton anomeric H-1’’ (δH = 5,57 ppm) v i carbon C-ớ 4 (δC = 151,7 ppm), ch ng t phứ ỏ ần đường glucopyranose liên k t v i ph n khung ellagic v trí C-ế ớ ầ ở ị

Trong nghiên cứu này, các tín hiệu trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa carbon C-6’’ (δC = 170,2 ppm) và proton H-5’’ (δH = 2,05 ppm) So sánh với tài liệu [6], chất được xác định là ellagic glucoside, với tên IUPAC là 3,3’,4’–tri-O-methyl-ellagic acid-4-O-β-D-acetylglucopyranose.

STT Tư liệu Chất 6 δC δH ( J, Hz) δC δH ( J, Hz)

Hình 4.22: Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) c a chủ ất 6

Hình 4.23: Phổ J-mod (DMSO-d 6 , 125 MHz) c a chủ ất 6

Hình 4.24: Phổ HMBC c a chủ ất 6 4.2 K t qu ế ảthửhoạt tính c a các cao chi t ủ ế

K t qu ế ảthử nghiệm ho t tính kháng virus cạ ủa các c n -hexane, DCM, EtOAc ặ n và MeOH của E tonkinensisđược trình bày trong b ng 4.7 ả

B ng 4.7: Kả ết quảthử hoạt tính kháng virus của các cao chi t ế

(>1,5) μg/mL AMT k >100,0 >100,0 (N.A n ) 3,2 ± 1,6 (>31,3) >100,0 (N.A n ) μM b ng 4.7, ta y, c n -Hexane và DCM không th hi n ho t tính kháng

Theo nghiên cứu, virus bị ức chế dưới nồng độ CC50 lần lượt là 280,0 μg/mL và 111,2 μg/mL Chiết xuất MeOH cho thấy hiệu quả ức chế mạnh với giá trị EC50 là 19,8 μg/mL cho chủng PR8, 5,1 μg/mL cho chủng HK và 107,7 μg/mL cho chủng Lee Ngoài ra, chiết xuất EtOAc cho hoạt tính kháng virus với giá trị EC50 dao động từ 52,7 μg/mL đến 205,0 μg/mL đối với các chủng khác nhau Cả hai chiết xuất MeOH và EtOAc từ cây Côm B có khả năng không gây độc tế bào cho dòng MDCK ở nồng độ cao nhất (CC50 > 300,0 μg/mL) Tuy nhiên, so với các thuốc đặc hiệu hiện có, khả năng ức chế của các mẫu này vẫn chưa cao.

4.3 K t qu ế ảthửhoạt tính c a các ch t phân lủ ấ ập được

K t qu ế ảthử nghiệm ho t tính kháng virus cạ ủa sáu chất 1 6- phân lập đượ ừ ặc t c n DCM và EtOAc của E tonskinensisđược trình bày trong b ng 4.8 ả

B ng 4.8: Kả ết quảthử hoạt tính kháng virus của các ch t phân lấ ập được

Theo bảng 4.8, chất 1 và chất 2 không thể hiện hoạt tính kháng virus ở nồng độ CC50 300,0 μg/mL Chất 6 không có khả năng ức chế virus PR8, trong khi chất 3 và chất 4 cho thấy hoạt tính ức chế virus yếu đối với HK và Lee.

Các kết quả cho thấy hoạt chất này có hiệu quả ức chế đáng kể đối với cả hai chủng virus thử nghiệm, với giá trị EC50 lần lượt là 61,4 và 8,1 μg/mL đối với chủng PR8, 26,3 và 7,8 μg/mL đối với chủng khác.

Chất 3 và 4 có độc tính đối với tế bào MDCK ở nồng độ lần lượt là 141,2 và 161,4 μg/mL Đặc biệt, chất 5 thể hiện hoạt tính kháng virus với nồng độ 58,9 μg/mL đối với chủng PR8, 34,3 μg/mL với chủng HK và 59,6 μg/mL với chủng Lee, mà không gây độc tế bào ở nồng độ cao nhất (CC50 > 300,0 μg/mL) So với các thuốc đặc hiệu hiện có, khả năng ức chế của chất 3, 4 và 5 thậm chí còn cao hơn RBV, tuy nhiên, không vượt trội hơn AMT và OSV-1.