Nghiên ứu thành phần hoá học và hoạt tính gây độc tế bào của loài hải miên petrosia nigricans

Cỏc nghiờn cứu trờn thế giới trong những năm gần đõy cho thấy hoạt chất tỏch chiết từ nguồn sinh vật biển thể hiện cỏc hoạt tớnh sinh học rất phong phỳ, là nguồn nguyờn liệu lý tưởng để

-

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

GÂY ĐỘ C T BÀO CỦ Ế A LOÀI H I MIÊN Ả

PETROSIA NIGRICAN

NGÀNH: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

MÃ SỐ:

ĐINH TH PHƯƠNG ANH Ị

Ngư i hư ờ ớ ng d n: PGS TS TRẦN THU HƯƠNG ẫ

HÀ NỘI 2008

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205139391000000

Luận văn này được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị và bạn bè Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS TS Trần Thu H ươ ng , Trường Đại học Bách Khoa Hà ội, người N

đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tô i cũng in gửi lời cảm ơn đến ập thể án ộ vi n chức ủa ộ x t C b ê c B mô n

Ho á H ữ u cơ, Bộ mô n Hoá dược & Hoá chất BVTV - Trường Đại ọc h B ách Khoa Hà Nội cùng gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn giúp

đỡ, cổ vũ và kịp thời động viên tôi trong suốt thời gian học tập, công tác để hoàn thành luận văn này.

Đinh Thị Phương Anh

MỤC LỤC

TrangLời cảm ơn

1 1 TỔNG QUAN CHUNG VỀ HẢI MIÊN 3

1.1.1 Vài nét về Hải miên (Petrosia) 3

1.1.2 Giới thiệu về loài Hải miên Petrosia nigricans 4

1 31 Mô tả về loài Hải miên Petrosia nigricans 5

1 41 Vài nét về sự phân bố Hải miên trong tự nhiên 6

1.1.5 Sơ lược về thành phần hóa học của Hải miên 7

1 6.1 Tác dụng dược lý của loài Hải miên Petrosia nigricans 14 1.1 .7 Tổng quan về lớ chất Sterop l 14

1.1.7.1 Giới thiệu về lớp chất Sterol 17

1.1.7.2 Một số Sterol quan trọng 21

1.2 HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI HẢI MIÊN 24

2.1.1 Đặc điểm chung của chiết 26

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 29

2.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 29

2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký 30

2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 35

3.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 36

3.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 36

3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 37

3.3.1 Phổ khối lượng (ESI-MS) 37

3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 37

3.5 Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất 423.5.1 Hợp chất PN1: Batilol 42

3.5.2 Hợp chất PN2: Petrosiol (chất mới) 42

3.5.3 Hợp chất PN3: 5,8-Epidioxycholest-6- -3- en ol 43

3.5.4 Hợ p chất PN4: Cholesterol 43 3.6 K ết quả thử hoạt ính t gây độc ế ào t b 44

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PN1: Batilol 45

4.2 Xác định cấu trúc hoá học của hợp chất PN2: Petrosiol 49

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PN3 57

4.4 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PN4 63

4.5 Thử hoạt tính các chất phân lập được

từ loài Hải miên Petrosia nigricans 66

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HMQC Heteronuclear multiple quantum corehence

HMBC Heteronuclear multiple bond connectivity

DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer

1 Vài nét chung về loài Hải miên (Petrosia nigricans)

Petrosia là một chi bọt biển sinh sống khá phổ biến tại các vùng biển Việt Nam Hiện nay chưa có công trình khoa học nào được công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi này Mặc dù ọt biển được biết đến như một nguồn tài nguyên rất dồi dào về Bcác hợp chất hóa học có cấu trúc phong phú và thể hiện các hoạt tính đáng quan tâm Loài Hải miên Petrosia nigricans được sưu tầm ở độ sâu 30 - 45m ở vùng biển Trường Sa, tỉnh Khánh Hoà, Việt Nam và được giám định tên khoa học bởi TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên

và Môi trường Biển, Viện KH & CN Việt Nam

2 Bằng phương pháp sắc ký kết hợ , 4 hợp chất: Batilol (PN1 Petrosiol p ); (PN2); 5,8 Epidioxycholest-6- -3 en ol (PN3 ; và Cholesterol (PN4) đã )được phân lập từ dịch chiết metanol của loài Hải miên Petrosia nigricans Trong đó hợp chất PN2 lần đầu tiên được phân lập từ chi Petrosia Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 1350 và DEPT 900), hai chiều (HSQC, HMBC và NOESY), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI)

3 Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được Kết quả thử nghiệm cho thấy, hợp chất PN2 (Petrosiol) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dòng tế bào thử với các giá trị IC50 là 3,82 μg/mL (KB tế bào ung thư biểu mô người) và 3,57 - μg/mL (HepG-2 - tế bào ung thư gan người); PN3 (5,8 Epidioxycholest- -

MỞ ĐẦU

Đại dương là một nguồn tài nguyên vô cùng to lớn, nơi chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất Đại dương cũng là nơi sinh sống của 34 trong số 36 ngành sinh vật trên trái đất với hơn 300.000 loài động thực vật đã được biết đến Đây chính là nguồn cung cấp vô số các sản phẩm tự nhiên quý giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người Tuy nhiên từ ngàn đời nay con người chỉ khai thác một phần rất nhỏ các loài sinh vật biển với tư cách là nguồn lợi hải sản Trên thực tế ngoài vai trò to lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm thì những sản phẩm của đại dương cũng đang bước đầu được nghiên cứu và sử dụng trong ngành công nghiệp dược Các nghiên cứu trên thế giới trong những năm gần đây cho thấy hoạt chất tách chiết từ nguồn sinh vật biển thể hiện các hoạt tính sinh học rất phong phú, là nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo ra hoặc cung cấp các mẫu hình cho các thế hệ thuốc mới điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, mô hình nghiên cứu liên ngành giữa các nhà khoa học thuộc các lĩnh vực Hoá-Sinh-Y-Dược nhằm tìm kiếm thuốc từ các nguồn hợp chất thiên nhiên biển đã được

áp dụng ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Hàn Quốc, Nhật Bản Rất nhiều thuốc mới có nguồn gốc sinh vật biển đã có mặt trên thị trường do các hãng dược lớn trên thế giới cung cấp như thuốc điều trị ung thư Ara C -(Cytarabin) được chiết tách từ loài Hải miên Cytotethy cryta, thuốc kháng sinh Phycocrythin có nguồn gốc từ tảo đỏ (Red algae) Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu các công nghệ chiết xuất, phân lập các hoạt chất từ các nguồn dược liệu biển có trữ lượng rất lớn như rong biển, hải sâm và các phế thải của ngành công nghiệp chế biến hải sản cũng được quan tâm đặc biệt Những

11000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc

tố hay có hoạt tính sinh học tiềm tàng Tuy nhiên, nguồn tài nguyên phong phú này vẫn chưa thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học, đến nay mới chỉ có một số rất ít những ngiên cứu về lĩnh vực này Vì vậy, việc nghiên cứu, phát triển và khai thác nguồn tài nguyên sinh vật biển hiện đang

là vấn đề cấp bách không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới

Theo hướng nghiên cứu trên, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Hải miên Petrosia

nigricans” được chúng tôi lựa chọn nghiên cứu rong khuôn khổ bản luận Tvăn này, chúng tôi xin trình bày những nét chính về việc nghiên cứu, phân lập các hợp chất có trong loài ải miên Petrosia nigricans H có hoạt tính sinh học cao, nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của các loài sinh vật biển

Nội dung luận văn gồm:

1 Phân lập một số hợp chất từ loài Hải miên Petrosia nigricans

2 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được

3 Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được

Hình 1.1.1 Chất nhuộm xanh chỉ ra

cách mà hải miên lọc nớc qua cơ thể

để lấy thức ăn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

- Giới (regnum): Động vật. - Nghành (divisio) : Porifera

- Lớp (class): Desmospongiae Bộ (ordo): Haplosclerida.-

- Họ (familia): Petrosiidae - Chi (branch): Petrosia

Hải miờn - bọt biển, gồm cú 900 loài tất cả, chiếm cứ hầu hết cỏc vựng nước trờn trỏi đất, từ những hồ nước ngọt tới cỏc vựng biển nhiệt đới, và cả những vựng lạnh giỏ ở Bắc Cực

Dưới mắt thường, chỳng hầu

như khụng cử động, hay đỳng hơn

là khụng cú sự sống, nhưng kỳ thực

những sinh vật này vẫn làm việc rất

cần mẫn Mỗi ngày, Hải miờn bơm

rất nhiều nước qua cơ thể để lọc lấy

cỏc sinh vật đơn bào bộ nhỏ làm

thức ăn Phải lọc 1 tấn nước, chỳng

mới cú được khoảng 30g thức ăn ưa

bào cổ áo) của chúng Trên mỗi tế bào có gắn một tiên mao nhỏ xíu (còn gọi

là roi), có thể rung động Các tiên mao này khỏa nước đi qua để đem lại thức

ăn, ôxy và đem đi khí CO2 cũng như các chất thải

Bọt biển mặc dù là một cơ thể có tổ chức cơ thể đa bào, dù các tế bào

cơ thể kết hợp lại với nhau thành hai lớp tế bào, nhưng mỗi tế bào vẫn có thể sống một cách độc lập khi bị tách rời

Năm 1907 H V Wilson đã làm thí nghiệm chứng minh tính độc lập và , tính hợp tác của các tế bào trong cơ thể bọt biển như sau: Cắt bọt biển thành nhiều mảnh nhỏ và nghiền nhẹ các mảnh này để cho các tế bào rời ra, sau đó dùng rây để lượt lấy các tế bào và cho vào môi trường nước biển, sau một thời gian nuôi nhận thấy các tế bào hợp lại với nhau hình thành cơ thể bọt biển mới

1.1.2 Giới thiệu về loài Hải miên Petrosia nigricans

Các tên thường dùng:

• Petrosia nigricans Lindgren, 1897;

• Petrosia imperforata Thiele, 1899;

• Petrosia cancellata Thiele, 1903;

• Petrosia nigricans var irregularis

Hentschel, 1912

H×nh 1.1.2 Petrosia nigricans

- Mô tả về hình dáng: Hình quạt, mỏng, dạng ống rộng có các kích

thước: chiều cao khoảng trên 150cm, đường kính 200 cm và bề dày mặt bên

10 cm Bề mặt ngoài xù xì, có các chỏm nhọn trông như tổ ong, trong khi bên trong nhẵn, có các lỗ không rõ ràng, đường kính 0,5 - 1 cm Khi cắt con Hải miên hoặc ngâm trong cồn, chất nhờn được ép ra với hàm lượng thay đổi tuỳ theo các mẫu khác nhau

- Màu sắc: Có thể là màu nâu sôcola đến màu đen, thường là màu nâu

đen, bên trong màu có nhạt hơn

- Bộ khung: Bộ khung ngoài là các bọc mắt lưới, trên các mắt có các

bó gai nhỏ, mỗi bó có từ 6 8 gai quấn vào nhau Bộ khung ngoài thường - chứa các hạt màu lớn Ống bên ngoài có 10 - 20 chiếc gai có đường kính 40 -

100 µm, vùng này tồn tại độc lập với vùng bên trong và có thể dễ dàng tách

ra khỏi nhau Bộ khung trong là hệ thống các bó gai tạo thành hình ống lớn,

có đường kính 500 - 900 µm Mỗi bó có khoảng 20 chiếc gai hoặc hơn và có đường kính 100 - 500 µm Không nhìn thấy các chất xốp nhưng sự hiện diện của các bó gai là rất rõ ràng bộ khung trong cũng xuất hiện các chất màu Ở nhưng không phong phú như bộ khung ngoài

- Gai: Có hình dạng như con giun lươn, phần lớn là đầu thuôn nhưng đôi khi là đầu nhọn, thậm chí cong vênh Có 3 loại kích cỡ khác nhau: 240 -

305 × 8 16- µ m; 120 - 180 × 9 10- µ m; 57 - 58 × 5 µ m Các loại kích thước nhỏ hơn chỉ xuất hiện trong các búi bên ngoài

- Môi trường sống: Ở độ sâu từ 3 45 m Các loại nhỏ thường sống - trong các rạn san hô hoặc bí ẩn hơn, các loại lớn thường phát triển trên các g

dốc cát Các động vật dạng hoa huệ biển hay dưa biển thuộc chi Synaptula thường sống xung quanh loài Hải miên này

- Phân bố: Xuất hiện nhiều ở vùng biển Indo Australian -

- Nhận xét: Kích thước mẫu của Lindgren có nguồn gốc từ biển Java là

bản mỏng 7 × 7 × 3 cm là phần còn lại của mẫu ban đầu Chắc như đá, màu nâu xám và không có lỗ Kích thước của gai (20µm) dày hơn các mẫu cùng loài từng được nghiên cứu (khoảng hơn 14 m); nhưng điều này có thể được µgiải thích là do chúng sống ở các tầng cát khác nhau, môi trường sống khác nhau nên định hình các đặc điểm khác nhau

Khảo sát mẫu P imperforata, Thiele (1899) và thấy bộ khung có những điểm tương đồng với mẫu đang nghiên cứu, nhưng mẫu của Thiele gồ ghề hơn, về cơ bản độ nhẵn giống mẫu của Lindgren

P pigmentosa, Fromont (1991) lấy từ vỉa san hô Great Barrier Reef là loại Hải miên lớn với các điểm lồi ngắn, một số điểm giống với P nigricans, không quan sát thấy các lỗ và điều quan trọng là chất nhầy ép ra ở đây Tuy nhiên, theo nhận định của các nhà khoa học, lượng chất nhầy bài tiết ra của cùng một loài nhưng ở các mẫu khác nhau có thể khác nhau, nhưng sau khi xem xét về tập tính, bề mặt và kích thước gai (ngắn và mỏng hơn P pigmentosa) các nhà khoa học kết luận đó là một loài khác

Thiele (1903) mô tả về loài P cancellata lấy từ Ternate (phía bắc Moluccas, Indonexia) là một mảnh lấy từ một mẫu lớn hơn ng cho rằng Ômẫu của ông giống với loài P nigricans nhưng bề mặt mẫu của Lindgren nhẵn hơn, trong khi thậm chí mẫu của ông xù xì hơn rất nhiều Có nhiều loại kích thước gai nhưng ông chỉ đưa ra kích thước lớn nhất 250 × 16 µm, tập

tính của nó cũng được mô tả rất mơ hồ Tuy nhiên do ông đề cập đến những nét tương đồng với loài P nigricans và do những thí nghiệm của các nhà khoa học trên các mẫu khác nhau cho thấy rằng bề mặt ngoài của loài có thể

từ nhẵn đến rỗ như tổ ong, vì vậy họ chấp nhận, P cancellata là cùng một loài với P nigricans

Hentschel (1912) mô tả về loài P nigricans var irregularis lấy từ đảo Aru (phía đông Moluccas, Indonexia) Ông đề cập đến những nét tương tự với mẫu của Lindgren nhưng bộ xương lộn xộn hơn và gai có nhiều hình dáng hơn

Có thể nói, P nigricans là loài bọt biển rất phổ biến, nổi bật và phân bố rộng rãi ở Spermonde Archipelago và những nơi khác ở phía đông Indonexia

và rất có thể đã từng được tìm thấy từ trước bởi các nhà sưu tầm

Từ loài Hải miên Xestospongia testudinaria các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất đó là:

11

1 3 14 17 18

19

20

21

25 2627

O O

10

13 17

HN N

Từ loài Hải miên Haliclona sp các nhà khoa học đã tiến hành phân lập

và xác định cấu trúc của một sterol (1) và furanocumarin ( Cấu trúc của các 2)hợp chất này được xác định là ostreasterol và isopimpinelin bằng các phương pháp phổ

10

13 17

S

O OCH3

2

4

9 10

8 7

6 2'

3'

Isopimpinelin

Cũng bằng quá trình phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất từ loài Hải miên cành xanh Gellius vairius, các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc của 5 hợp chất là:

O OH

OH

OH

OH O

O

OH OH

1-O-palmitoyl3-O- -D-[α galactopyranosyl(1→6)- -D-β sn-glycerol

O C O (CH2)14CH3

(2S)1, 2-di-O-palmitol-3-O-(6-sulfoα-D-quinovopyranosyl) glycerol

-O O

Metyl este của axit (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) eicosapentaenoic

- Các dẫn xuất của purin

- Các ankaloid indol

- Các chất chuyển hoá sơ cấp

Bảng 1.1. 5 Các chất đã được phân lập từ loài Hải miên

Metyl 2-(4 hydroxyphenyl)acetat.

-OH

O O

Etyl 2-(4 hydroxyphenyl)acetat

-OH

O O

Butyl 2-(4 hydroxyphenyl)acetat

-N

N N

N

NH2

O

OH OH

H H

H H

N N

N N

N N

O

OH H H H OH H O

HO

NH OH

C22H45

C12H25

OH O

O

OH H H

H OH H O

HO

NH OH

C 21 H 43

C 11 H 23

OH O

Theo một số nghiên cứu trên thế giới, một số hợp chất đã biết như Adenosin, Nicotinamid có những hoạt tính hết sức quan trọng, cụ thể:

 Adenosin: Giãn mạch vành, điều trị huyết áp cao, bạch huyết cầu và

1.1.7.1 Giới thiệu về Sterol

Sterol là lipit cấu trúc, tham gia cấu tạo màng của hầu hết các tế bào eukaryote Vi khuẩn không thể tổng hợp sterol, tuy vậy một số vi khuẩn có thể kết hợp sterol từ môi trường ngoài vào màng của chúng Ngoài vai trò tham gia cấu tạo màng, sterol còn đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp nên nhiều chất có vai trò sinh học quan trọng khác, ví dụ: các steroid hormone là những tín hiệu sinh học điều khiển sự biểu hiện gene, các axit mật là các dẫn xuất phân cực của cholesterol hoạt động như là những chất tẩy (detergent) trong ruột và nhũ tương hóa mỡ của thức ăn, từ đó làm cho chúng có thể tiếp cận được với enzyme lipase của đường tiêu hóa

Sterol phân bố rộng chúng thường có mặt song song với các ancaloi- t hoặc saponin steroit có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều - nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các este, một số ít ở dạng glicozit

a Cấu tạo hóa học

Các sterol là ancol bậc 2 nhiều vòng có nhân xiclopentano pehidro phenandren: Người ta gặp chúng ở dưới dạng este hoặc kết hợp với các đường

ở dạng heterozit

Nhân steroit:

• Xiclopentano

pehidrophenandren

• A, B, C: Nhân của phenandren

đã được hidro hóa

• D: xiclopentan

1 2 3 4

5 6 7 8

9 10

11

12 13

16 17

Các sterol có một nhóm hidroxi ở C-3, nhóm này có thể là α hoặc β đối với nhóm metyl góc ở C-10, do đó có các công thức cấu hình sau:

H

5β-Cholestan-3β-ol

5β-Cholestan-3α-ol

b Phân loại

Sterol được phân loại thành bốn nhóm:

• Nhóm sterol động vật (zoosterol): Cholesterol, Cholestan 3β- -ol, Coprostan- -β ol, Desosterol, Coprosterol, Cerebrosterol, Lathosterol

• Nhóm sterol của động vật biển không xương sống: Spongesterol, Clionasterol, 24-metylencholesterol, Fucosterol

• Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, Zymosterol, Acosterol, Fecosterol

• Nhóm sterol thực vật (phytosterol): Sistosterol (có các đồng phân α,

β, γ), stigmasterol, α Spinasterol, Brassicasterol Các sterol thực vật có trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu

-c Sinh tổng hợp Sterol

Từ sterol có thể tổng hợp được rất nhiều hợp chất steroit hoạt động hóa sinh học Con đường sinh tổng hợp sterol được trình bày ở sơ đồ 1.1.7

-D: Oxy hóa C-3β I: Thơm hóaE: hydroxyl hóa vị trí C-21

Sơ đồ 1.1 7: C on đường sinh tổng hợp của sterol

Corticosteron Cortisol

Aldosteron

(dạng aldehyt)

Aldosteron (dạng bán axetal)

Androstenedion là một androgenic steroit được tạo ra ở trong tinh hoàn,

vỏ tuyến thượng thận và buồng trứng Androstenedion là cấu trúc của estron trong quá trình chuyển hóa thành testosteron và các androgen khác Androstenedion được sử dụng như là một dạng thuốc kích thích

có thai, estrogen được bài tiết chủ yếu ở buồng trứng, chỉ một lượng rất nhỏ

do tuyến vỏ thượng thận bài tiết Khi có thai, rau thai bài tiết ra một lượng lớn estrogen Ở rau thai, estrogen do các tế bào lá nuôi bài tiết, nồng độ tăng dần, vào cuối thời kì có thai nồng độ có thể gấp 30 lần so bình thường Hầu hết là estron (hoạt tính yếu nhất), được tổng hợp từ androgen tuyến thượng thận của

mẹ và rau thai Tế bào lá nuôi chỉ là bước chuyển hóa trung gian androgen thành estrogen Estrogen có tác dụng làm xuất hiện và bảo tồn đặc tính sinh dục nữ thứ phát kể từ tuổi dậy thì bao gồm phát triển các cơ quan sinh dục, phát triển lớp mỡ dưới da, giọng nói trong, dáng mềm mại, ngoài ra estrogen còn có tác dụng làm tăng quá trình tổng hợp các protein ở gan, quá trình lưu thông máu, duy trì hàm lượng nước và muối ở trong máu, giảm nguy cơ ung thư vú

 Progesteron

O

OH O

Progesteron là một hocmon steroit được tạo ra ở tuyến thượng thận, vỏ não, bộ phận sinh dục Ở phụ nữ có thai, rau thai bài tiết một lượng đáng kể (0,25 mg/ngày) progesteron cho tới cuối thời kì có thai Progesteron có tác dụng àm giảm co bóp cơ tử cung, ngăn cản việc đẩy trứng đã thụ tinh ra lngoài và tạo môi trường ổn định cho bào thai phát triển ồng độ progesteron ncao có thể làm tăng tái hấp thu ion Na+, Cl- và nước ở ống lượn xạ; àm phát ltriển tế bào màng rụng nội mạc ở tử cung; giảm co bóp cơ tử cung khi có thai,

do đó ngăn cản sảy thai

• Corticosteron và cortisol

O

OH O

HO

Corticosteron

O

OH O

Cortisol Corticosteron và cortisol là hocmon tuyến thượng thận Chúng có tác dụng tăng tạo glycogen ở gan, thúc đẩy tạo đường mới do dị hóa protein; ức chế sử dụng glucose ở tế bào, tăng hấp thu glucose tại ruột, gây tăng đường huyết, ức chế tổng hợp lipit, tăng thoái hóa axit béo tạo ceton ở cơ dị hóa ;

O

Aldosteron là hocmon tuyến thượng thận,nó có tác dụng làm tăng tái hấp thu Na+ ở ống lượn xa, đoạn lên quai Henlé và ống góp, đồng thời còn trao đổi K+ ở ống lượn xa do đó làm tăng thể tích và áp suất máu trong cơ thể Aldosteron đóng vai trò như là một enzym kích thích quá trình sản sinh andosteron từ vỏ thượng thận

1.1.7.2 Một số Sterol quan trọng

Các sterol có cấu trúc từ 27 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc động - vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β - sitosterol, ergosterol, stigmasterol)

a Cholesterol

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10

11

12 13

14 15

16 17 18

19

HO

27 20

22 23

24 25

Cholesterol là sterol được biết đến đầu tiên Nó là thành phần chính của sỏi mật và đã được phân lập từ nguồn này bởi Conradi vào năm 1775 Tên gọi

cũng có nguồn gốc từ nguồn này (Tên Hy lạp cholesterin = mật rắn) (Sơvron, 1815) Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào, nó giúp tính lỏng của màng ổn định trong khoảng dao động nhiệt độ rộng hơn Nhóm hydroxyl trên phân tử tương tác với đầu phosphate của màng còn gốc steroid

và chuỗi hydrocarbon gắn sâu vào màng Nó là tiền chất chính để tổng hợp vitamin D, nhiều loại hormone steroid, bao gồm cortisol cortisone, , và aldosterone ở tuyến thượng thận, và các hormone sinh dục progesterone, estrogen, và testosterone Các nghiên cứu gần đây cho thấy cholesterol có vai trò quan trọng đối với các synapse ở não cũng như hệ miễn dịch, bao gồm việc chống ung thư

β-Sitosterol là dẫn xuất dihidro của stigmasterol, có một mạch nhánh

no Nó được thu nhận, cùng với các phytosterol khác, với lượng lớn dưới dạng sản phẩm phụ từ sự xà phòng hóa dầu đậu nành, một phần được sử dụng làm nguyên liệu đầu để điều chế các steroit hocmon như oestron Sitosterol được dùng để điều trị chứng phì đại (phình to) tuyến tiền liệt

Ngày nay người ta dùng stitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng động mạch, làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ

cholesterol ở ruột bằng cách tạo ra một phức chất không tan, mặt khác nó còn

có tác dụng trị xơ mỡ động mạch nhờ có đặc tính chống ôxy hóa

đã được xác định bởi sự thủy phân ozonit, mà isopropyl-metylaxetandehit (2,3-dimetylbutanal) đã được phân lập như là một sản phẩm phân cắt ằng Bcách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D2 có tác dụng trị còi xương

d Sigmasterol

HO

Sigmasterol còn gọi là (22) 24(S) 24- - -etylcholesta-5,22 dien 3β ol, -

-C29H47OH, xuất hiện trong đậu nành và chỉ phân biệt với cholesterol bởi mạch

nhánh của nó Giống như ergosterol nó có một nối đôi giữa các nguyên tử cacbon 22 và 23 Trong khi ergosterol có một nhóm thế metyl ở C 24, ở -stigmasterol có một nhóm etyl Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol có một nhóm etyl Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol là etyl-isopropyl-axetandehit (2 etyl- -3-metylbutanal)

Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hocmon và chúng ta đã nói đến việc sử dụng với khối lượng lớn Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin, diosgeni) được dùng để bán tổng hợp các hocmon sinh dục

Từ loài Hải miên Xestospongia testudinaria đã phân lập các hợp chất axit béo không no bị brôm hóa Các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính quí báu như: kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, một số hợp chất còn ức chế enzim HIV protease, một enzim thiết yếu cho sự tái bản của HIV [3]

Từ loài Gellius viarius phân lập được hợp chất 5,8-epidioxycholest-6en3- ol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả ba dòng tế bào ung thư gan bao gồm: tế bào ung thư biểu mô, tế bào ung thư màng tử cung và tế bào ung thư gan [4]

-Từ loài Haliclona sp hân lập được Maleimide-5-oxime nortetillapyrone pthể hiện hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn như Candida albicans, C glabata C.dubl, iniensis C.tropicalis, , C.krusei, C.parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, A.flavus A.N, iger , Microsporum gypseum,

Từ loài Petrosia corticata,phân lập ra được hợp chất

Strongylophorine-26, chất này thể hiện hoạt tính ức chế sự lan rộng và phát triển của các tế bào ung thư.[ ]5

Từ loài Petrosia similis đã phân lập được hợp chất isoquinolinequinone

có khả năng kháng lại một số chủng vi khuẩn như Staphylococus aureus (14 mm), Bacillus subtilis (16 mm), Escherichia coli (12 mm), Klebsiella pneumoniae ( 12 mm) ở nồng độ 100 µg/ đĩa đường kính 6,5 mm [11]

Hầu hết các chất phân lập từ các loài thuộc chi Petrosia đều có khả năng ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn, virut, kháng nấm, chống ung thư [3,4,6,7,13,16]

Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có công trình khoa học nào công bố về hoạt tính sinh học của loài Petrosia nigricans

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đặc điểm chung của chiết

- Khái niệm Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá : trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với nó

- Mục đích chiết:

• Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và gọi là chiết làm giàu

• Phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp, thường dùng trong phân ly các hợp chất thiên nhiên

2.1.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai pha lỏng không hoà lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:

2.1.3 Quá trình chiết động, thực vật

2.1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận

Nó cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, không độc, không dễ bốc cháy, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cầ được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất n khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat, tributylphotphat …do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Cloroform, metylen clorid và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một số bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế clo, người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào

Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị hoà tan đồng thời Thường thì dung môi cồn trong nước dường như

có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ Người ta ít dùng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dung dịch nước của metanol

Sau khi chiết dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2.1.3.2 Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

• Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:

Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục

và để tiết kiệm dung môi

• Chiết ngâm:

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra Cần lưu ý, sau khi chiết với dung môi 3 lần thì cặn thu được hầu như không còn chứa những chất giá trị nữa Việc kết thúc quá trình chiết được kiểm tra bằng một

số cách như:

- Với các ancaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của loại hợp chất này bằng việc phản ứng màu với một số tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer

- Với các flavonoit thường là những chất màu nên khi dịch chảy ra mà - không có màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp theo sẽ thể hiện việc kết thúc quá trình chiết

- Trong trường hợp các lacton của sesquiterpen và các glycozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho sự xuất hiện của các hydratcacbon

và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc Như vậy, tuỳ thuộc mục đích và yêu cầu của chất cần lấy để lựa chon dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao

Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tuỳ vào tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, độ phân cực ) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến các lớp pha tĩnh khác sẽ xảy

ra việc lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có

ái lực lớn pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có ái lực yếu hơn đối với pha này Nhờ đặc điểm này mà ta có thể tách các chất ra khỏi nhau qua quá trình sắc ký

2.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = n∝bC/ (1+bC)

trong đó:

• - n lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

• n∝ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

• - b hằng số

• - C nồng độ của chất bị hấp phụ

2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Theo trạng thái tập hợp của pha động chia sắc ký thành hai nhóm lớn là: sắc ký khí

và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký lại được chia thành nhiều cách khác nhau

2.2.3.1 Sắc ký cột

Là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, trong đó chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các hạt silica gel (có nhiều loại kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại) Độ mịn của chất hấp phụ là rất qua trọng vì n

nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ, độ mịn của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp lực trọng trường không đủ lớn sẽ gây hiện tượng tắc cột, dung môi không chảy được, khi đó người ta sẽ phải sử dụng áp suất như các phương pháp MPC áp suất trung bình) ( , HPLC (áp suất cao)

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực - tiếp vào cột khi còn khô, dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột, dùng dung môi chạy cột và chạy đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi - chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi

đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải chú ý để không có bọt khí bên trong (nếu có bọt khí sẽ gây hiện tượng chạy rối trong cột và làm giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gãy, rò

Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa đường kính (D) và chiều dài cột (L) thể hiện khả năng tách của cột, L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào từng hỗn hợp cụ thể

Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất thì giá trị này thường khác nhau, dựa vào đặc điểm này để tách các chất ra khỏi hỗn hợp

Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp khoảng 1/5 1/10, còn nếu - tách tinh thì cao hơn và phụ thuộc vào hệ số tách (tức là Rf) mà hệ số này trong khoảng 1/30 - 1/20

Việc đưa chất lên cột được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột Nếu tách tinh có thể đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan trong lượng tối thiểu dung môi chạy cột rồi đưa lên cột