Cỏc nghiờn cứu trờn thế giới trong những năm gần đõy cho thấy hoạt chất tỏch chiết từ nguồn sinh vật biển thể hiện cỏc hoạt tớnh sinh học rất phong phỳ, là nguồn nguyờn liệu lý tưởng để
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI HẢI MIÊN PETROSIA NIGRICAN NGÀNH: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC MÃ SỐ: ĐINH THỊ PHƯƠNG ANH Người hướng dẫn: PGS TS TRẦN THU HƯƠNG HÀ NỘI 2008 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205139391000000 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực Bộ mơn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Trong suốt trình thực luận văn này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS TS Trần Thu Hương, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người giao đề tài, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Cán viên chức Bộ mơn Hố Hữu cơ, Bộ mơn Hố dược & Hố chất BVTV - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội gia đình, bạn bè người thân ln ln giúp đỡ, cổ vũ kịp thời động viên suốt thời gian học tập, cơng tác để hồn thành luận văn Hà nội, tháng 11 năm 2008 Đinh Thị Phương Anh MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng hình vẽ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN CHUNG VỀ HẢI MIÊN 1.1.1 Vài nét Hải miên (Petrosia) 1.1.2 Giới thiệu loài Hải miên Petrosia nigricans 1.1.3 Mơ tả lồi Hải miên Petrosia nigricans 1.1.4 Vài nét phân bố Hải miên tự nhiên 1.1.5 Sơ lược thành phần hóa học Hải miên 1.1.6 Tác dụng dược lý loài Hải miên Petrosia nigricans 14 1.1.7 Tổng quan lớp chất Sterol 14 1.1.7.1 Giới thiệu lớp chất Sterol 17 1.1.7.2 Một số Sterol quan trọng 21 1.2 HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ LỒI HẢI MIÊN 24 CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Tổng quan chung phương pháp chiết 26 2.1.1 Đặc điểm chung chiết 26 2.1.2 Cơ sở trình chiết 26 2.1.3 Quá trình chiết thực vật 27 2.1.3.1 Chọn dung mơi chiết 27 2.1.3.2 Q trình chiết 28 2.2 Tổng quan chung phương pháp sắc ký 29 2.2.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 29 2.2.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 29 2.2.3 Phân loại phương pháp sắc ký 30 2.2.3.1 Sắc ký cột 30 2.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng 32 2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất 32 2.2.4.1 Phổ hồng ngoại IR 32 2.2.4.2 Phổ khối lượng MS 33 2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 33 2.2.4.3 Phổ DEPT 34 2.2.4.4 Phổ 2D NMR 34 2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 35 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 36 3.1 Mẫu Hải miên 36 3.2 Phương pháp phân lập hợp chất 36 3.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 36 3.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 36 3.2.3 Sắc ký cột (CC) 37 3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 37 3.3.1 Phổ khối lượng (ESI-MS) 37 3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 37 3.4 Phương pháp thực nghiệm 39 3.5 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất 42 3.5.1 Hợp chất PN1: Batilol 42 3.5.2 Hợp chất PN2: Petrosiol (chất mới) 42 3.5.3 Hợp chất PN3: 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol 43 3.5.4 Hợ p chất PN4: Cholesterol 43 3.6 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 44 CHƯƠNG THẢO LUẬN 45 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN1: Batilol 45 4.2 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất PN2: Petrosiol 49 4.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN3 57 4.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PN4 63 4.5 Thử hoạt tính chất phân lập từ loài Hải miên Petrosia nigricans 66 KẾT LUẬN 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT CC Sắc ký cột (Column chromatography) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) [α ]D Độ quay cực MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C C-NMR 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton H-NMR HMQC Heteronuclear multiple quantum corehence HMBC Heteronuclear multiple bond connectivity DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Me Nhóm metyl EtOAc Etylacetat BuOH Butanol δ Độ chuyển dịch hoá học (ppm) J Hằng số tương tác (Hz) TÓM TẮT LUẬN VĂN Vài nét chung loài Hải miên (Petrosia nigricans) Petrosia chi bọt biển sinh sống phổ biến vùng biển Việt Nam Hiện chưa có cơng trình khoa học cơng bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thuộc chi Mặc dù Bọt biển biết đến nguồn tài nguyên dồi hợp chất hóa học có cấu trúc phong phú thể hoạt tính đáng quan tâm Loài Hải miên Petrosia nigricans sưu tầm độ sâu 30 - 45m vùng biển Trường Sa, tỉnh Khánh Hoà, Việt Nam giám định tên khoa học TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên Môi trường Biển, Viện KH & CN Việt Nam Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất: Batilol (PN1); Petrosiol (PN2); 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol (PN3); Cholesterol (PN4) phân lập từ dịch chiết metanol lồi Hải miên Petrosia nigricans Trong hợp chất PN2 lần phân lập từ chi Petrosia Cấu trúc hợp chất xác định nhờ vào phương pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT 135 DEPT 900), hai chiều (HSQC, HMBC NOESY), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập Kết thử nghiệm cho thấy, hợp chất PN2 (Petrosiol) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với hai dịng tế bào thử với giá trị IC50 3,82 μg/mL (KB - tế bào ung thư biểu mô người) 3,57 μg/mL (HepG-2 - tế bào ung thư gan người); PN3 (5,8-Epidioxycholest- 6-en-3-ol) thể hoạt tính mạnh với dòng tế bào thử với giá trị IC50 2.0 µg/mL (KB), 3.93 µg/mL (FL) 2.4 µg/mL (HepG-2); cịn hợp chất PN1, PN4 khơng biểu hoạt tính dịng tế bào thử Từ khóa: Bọt biển, Petrosia nigricans, Sterol, Petrosiol, Hoạt tính gây độc tế bào MỞ ĐẦU Đại dương nguồn tài nguyên vô to lớn, nơi chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất Đại dương nơi sinh sống 34 số 36 ngành sinh vật trái đất với 300.000 loài động thực vật biết đến Đây nguồn cung cấp vơ số sản phẩm tự nhiên quý thiên nhiên ban tặng cho người Tuy nhiên từ ngàn đời người khai thác phần nhỏ loài sinh vật biển với tư cách nguồn lợi hải sản Trên thực tế ngồi vai trị to lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm sản phẩm đại dương bước đầu nghiên cứu sử dụng ngành công nghiệp dược Các nghiên cứu giới năm gần cho thấy hoạt chất tách chiết từ nguồn sinh vật biển thể hoạt tính sinh học phong phú, nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo cung cấp mẫu hình cho hệ thuốc điều trị bệnh, đặc biệt bệnh hiểm nghèo Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, mơ hình nghiên cứu liên ngành nhà khoa học thuộc lĩnh vực Hố-Sinh-YDược nhằm tìm kiếm thuốc từ nguồn hợp chất thiên nhiên biển áp dụng nhiều nước giới Mỹ, Úc, Hàn Quốc, Nhật Bản Rất nhiều thuốc có nguồn gốc sinh vật biển có mặt thị trường hãng dược lớn giới cung cấp thuốc điều trị ung thư Ara-C (Cytarabin) chiết tách từ loài Hải miên Cytotethy cryta, thuốc kháng sinh Phycocrythin có nguồn gốc từ tảo đỏ (Red algae) Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu công nghệ chiết xuất, phân lập hoạt chất từ nguồn dược liệu biển có trữ lượng lớn rong biển, hải sâm phế thải ngành công nghiệp chế biến hải sản quan tâm đặc biệt Những