Nghiên ứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây bách bệnh(eurycoma longifolia jack)

Trang 1 Tr-ờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội ---o0o--- Luận Văn Thạc sĩ Khoa học Ngành: cơng nghệ hố học Nghiên cứu thành phần hố học và hoạt tính sinh học của cây bách bệnh Eurycoma longifol

Tr-êng §¹i Häc B¸ch Khoa Hµ Néi

-o0o -

LuËn V¨n Th¹c sÜ Khoa häc

Ngµnh: c«ng nghÖ ho¸ häc

Nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc vµ

( Eurycoma longifolia Jack)

NguyÔn V¨n Th«ng

Hµ néi - 2008

Tr-êng §¹i Häc B¸ch Khoa Hµ Néi

-o0o -

LuËn V¨n Th¹c sÜ Khoa häc

Nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc vµ ho¹t

tÝnh sinh häc cña c©y b¸ch bÖnh

( Eurycoma longifolia Jack)

Ngµnh : C«ng nghÖ ho¸ häc M· sè :

Hµ néi - 2008

Mở đầu

Việt Nam là n-ớc nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi nh- vậy nên hệ thực vật Việt Nam phát triển rất đa dạng và phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loài tảo, rêu và nấm Nhiều loài trong số đó từ xa x-a đến nay đã đ-ợc sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ trong đời sống của nhân dân ta

Nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con ng-ời là một trong những nhiệm vụ quan trọng đã và đang đ-ợc các nhà khoa học trong và ngoài n-ớc hết sức quan tâm

Với việc phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo nh-: Penicillin (1941); Artermisinin (những năm 1970… để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất l-ợng cuộc sống của con ng-ời Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt d-ợc mà còn cung cấp các chất dẫn đ-ờng để tổng hợp ra các loại thuốc mới Cũng từ những tiền chất

đ-ợc phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hoá chúng thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao

Việt Nam nằm trong vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 150C đến 270C, l-ợng m-a lớn (trung bình từ 1200 đến 1800 mm), độ ẩm t-ơng đối cao (trên 80%) Điều kiện nh- vậy rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài thực vật nói chung và cây d-ợc liệu nói riêng [2] Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có khoảng 10500 lài, trong đó có khoảng 3200 loài cây

đ-ợc sử dụng trong y học dân tộc Theo dự đoán của các nhà khoa học, hệ thực

vật Việt Nam có khoảng 12000 loài trong đó có 4000 loài đ-ợc nhân dân ta dùng làm thảo d-ợc và là một trong những hệ thực vật phong phú nhất thế giới

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã và đang đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con ng-ời Các hợp chất thiên nhiên

đ-ợc dùng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật cũng nh- nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, h-ơng liệu và mỹ phẩm Đặc biệt là trong lĩnh vực làm thuốc, nguồn d-ợc liệu phong phú và đa dạng đã cung cấp cho nghành d-ợc cả n-ớc một khối l-ợng nguyên liệu lớn để chữa bệnh cũng nh- xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Về lâu dài đối với sự phát triển các d-ợc phẩm mới, các sản phẩm thiên nhiên có vai trò rất quan trọng, vì nhiều chất có thể là chất dẫn đ-ờng cho việc tổng hợp các sản phẩm mới, hoặc dùng làm các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các nguyên lý của d-ợc lý con ng-ời

Theo h-ớng nghiên cứu trên, mục tiêu luận văn là tập trung nghiên cứu, phân lập các hợp chất có trong cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack có )

hoạt tính sinh học cao nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các ph-ơng pháp thuốc mới cũng nh- giải thích đ-ợc tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền

Nhiệm vụ luận văn

1 Chiết tách và phân lập một số hợp chất từ cây Bách bệnh (Eurycoma

longifolia Jack )

2 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập từ cây Bách bệnh

(Eurycoma longifolia Jack)

3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của dịch chiết metanol lá cây Bách bệnh

(Eurycoma longifolia Jack )

Tên th-ờng gọi: Bách bệnh, Lồng bẹt, Bá bịnh, Mật nhơn, Tho nan

Eurycoma longifolia Jack

Bách bệnh thuộc loại cây nhỡ, cao 2-8 m, thân ít phân cành Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, gồm 21-25 lá chét không cuống, mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, mép nguyên, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt d-ới có lông mịn màu trắng xám, cuống lá kép màu nâu đỏ Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kéo hoặc chuỳ rộng, cuống có lông màu gỉ sắt; hoa màu đỏ nâu, đài hoa chia thành 5 thuỳ hình tam giác có tuyến ở l-ng, tràng hoa 5 cánh hình thoi cũng có tuyến; nhị 5 có lông dày và hai vảy nhỏ ở gốc, bầu có

5 noãn hơi dính nhau ở gốc

Phân bố: Eurycoma longifolia Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là

cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam á Vùng Đông Nam có 3 loài và một vài d-ới loài, trong đó đáng chú ý nhất là áloài Bách bệnh phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các n-ớc Đông D-ơng, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumantra Việt Nam, Bách bệnh phân bố rải rác ở các ởtỉnh vùng núi thấp (d-ới 1000 m) và trung du Các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung gặp nhiều hơn các tỉnh phía Bắc

rễ làm tăng testosteron nhiều hơn thân cây

- Một chế phẩm thuốc gồm 3 d-ợc liệu: Bách bệnh, Trâm bầu và Xấu hổ

có độc tính cấp diễn và tr-ờng diễn thấp Thuốc có tác dụng lợi mật rõ rệt và không làm thay đổi thành phần của mật ở chuột lang Thuốc làm thải trừ BSP của gan thỏ so với đối chứng

- Chế phẩm thuốc này có tác dụng làm chậm quá trình h- biến của gan chuột cống trắng gây nên do Carbon Tetraclorid Nó cũng làm tăng sự tái tạo của tế bào gan chuột nhắt trắng trong mô hình gây th-ơng tổn gan thực nghiệm

1.1.3 Thành phần hoá học

Cây Bách bệnh là cây thuốc nổi tiếng Cây chữa đ-ợc nhiều chứng bệnh (nên có tên là Bách - nghĩa là 100) Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hoá học cũng nh- hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này, nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây thuốc quí này

Năm 1970, ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về hoá học của cây Bách bệnh, các nghiên cứu này đ-ợc thực hiện bởi các tác giả L.V Thoi, N.N Suong [5, ], kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần hoá học của cây 30Bách bệnh có hợp chất Eurycomalactone; - Sitosterol; Campesterol; 2,6-Dimethoxybenzoquinone và Dihydroeurycomalactone

Năm 1982, Các tác giả Muchsin Darise, Hiroshi Kohda, Kenji Mizutani

và Osamu Tanaka [9] đã tiến hành những nghiên cứu về thành phần hoá học của rễ cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy trong thành phần của rễ cây Bách bệnh có chứa: Eurycomanone, Eurycomanol và Eurycomanone-2-O- -glycopyranoside, 9-Hydroxycanthin-6-one Cùng thời 

gian này, nhóm tác giả tại Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu tiếp theo về thành phần hoá học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần cây Bách bệnh của Việt Nam có Eurycomalactone Campesterol; ,

2,6-Dimethoxybenzoquinone và Dihydroeurycomalactone,7-Methoxy- -

carboline-1-propionic acid [28]

Năm 1983, nhóm tác giả Muchsin Darise và cộng sự [ ] tiến hành các 27nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy có -Sitosterol; 9-Hydroxycanthin-6- one-N-oxide

cộng sự Năm 1986, nhóm tác giả Chan, L., O’Neill, M J Phillipson và

[8] đã có những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính sinh học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy cây Bách bệnh có khả năng chống sốt rét

Năm 1989, Nhóm tác giả K L Chan, S Lee, T W Sam và B H Han [19] đã nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính chống sốt rét của cây Bách bệnh, kết quả đã tìm ra các hợp chất Eurycomanol-2-O- -glycopyranoside; 

Eurycomanol từ rễ cây Bách bệnh thể hiện hoạt tính chống sốt rét

Năm 1990, Nhóm tác giả Hiroshi Morita và cộng sự [26] tìm thấy có

các hợp chất Eurycomanol, Klaineanone 11, -Ketone ong thành phần hóa học trcủa cây Bách bệnh

Năm 1991, Itokawa, H., Kishi, E., Morrita, H [16], tìm thấy có hợp chất mới Eurylen có hoạt tính độc tế bào trong thành phần hoá học của Bách bệnh Cùng thời gian này nhóm tác giả K L Chan, S Lee, T W Sam và B H Han [7] đã phân lập đ-ợc hợp chất 3 ,18-Dihydroeurycomanol; 14, 15 - 

Dihydroxyklaineanone từ cây Bách bệnh Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính chống sốt rét của cây Bách bệnh cũng đã đ-ợc nghiên cứu bởi nhóm tác giả Leonardus B.S Kardono và cộng sự [ ], nhóm tác giả này đã phân lập 23

đ-ợc bốn alkaloit: 9-Methoxycanthin-6-one; oxide; 9-Hydroxycanthin-6-one và 9-Hydroxycanthin-6-one-N-oxid, một quassinoit: Eurycomanone và lần đầu tiên phân lập hai -Carboline alkaloid 

9-Methoxycanthin-6-one-N-( -carboline-1-proprionic acid; 7-Methoxy- -carboline-1-proprionic acid)  

Năm 1992, Hiroshi Morita, Etsuko Kishi, Koichi Takeya and Hideji Itokawa [13] nghiên cứu về thành phần hoá học của gỗ cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy trong gỗ cây Bách bệnh có 2,2’-Dimethoxy-4- -(3hydroxy-1-propenyl)- -(1,2,3-trihydroxypropyl) diphenyl ete và 2-H4’ ydroxy-3,2’,6’-trimethoxy-4’-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5- -hydroxy-1-(3

propenyl)-biphenyl và 2-Hydroxy-3,2’dimethoxy 4’-

-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5- -hydroxy-1-propenyl)-biphenyl Cùng năm này, các tác (3giả K L Chan, Y Iitaka, H Noguchi, H Sugiyama, I Saito and U Sankawa [ ] đã tìm ra một hợp chất mới có trong thành phần hoá học của cây Bách 20bệnh, hợp chất 6 -Hydroxyeurycomalactone, các tác giả cũng đã nghiên cứu 

hoạt tính gây độc tế bào của cây Bách bệnh Ngoài ra, nhóm tác giả Itokawa và

cộng sự [10] đã phân lập đ-ợc các hợp chất (Dihydroniloticin; Epoxytirucall-7-ene-3,23-diol; 24,25-Epoxytirucall-7-ene-3,23-diol;

24,25-(3,23 ,24 )-form, 3-R S Ketone, 23-Ac) trong thành phần hoá học của Bách

bệnh

Năm 1993, nhóm tác giả Hiroshi Morita và cộng sự [ ] tiếp tục các 14nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Bách bệnh, kết quả cho thấy hai hợp chất mới có khung quassinoid (C19)

6-Dehydroxylongilactone và 7 -Hydroxyeurycomalactone và 7 hợp chất 

(13(21)-Epoxyeurycomanone,15-Acetyl-13 (21)- 

Epoxyeurycomanone;12,15-diacetyl-13

(21)-Epoxyeurycomanone;12-Acetyl-13,12-dihydroeurcomanone; 15 -Acetyl- -hydroxyklaineanone; 6 - 14 

Acetoxy-14,15-dihydroxyklaineanone;6 -Acetoxy-14,15 -  

dihydroxyklaineanone Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất trên đã đ-ợc nghiên cứu, kết quả cho thấy hợp chất 6-Dehydroxylongilactone và 7 - 

Hydroxyeurycomalactone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao Nhóm tác giả này tiếp tục các nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học đã phân lập đ-ợc

4 hợp chất Eurylene, 14-Deacetyl eurylene và Longilene peroxide, Teurilene

và đã tiến hành các nghiên cứu về độc tế bào của các hợp chất này [2 Trong 5]năm 1993, một nhóm nghiên cứu khác do tác giả Itokawa, H., và cộng sự [18]

đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất: Eurylactone A, Eurylactone

B, Laurycolactone A, Laurycolactone B

Năm 1994, nhóm tác giả Mitsunaga và cộng sự 4] đã phân lập đ-ợc [29,10-Dimethoxycanthin-6-one; 10-Hydroxy-9-methoxycanthin-6-one;

11-Hydroxy- -methoxycanthin-6-one; 5,9-Dimethoxycanthin-6-one và 109-Methoxy-3-methylcanthin-5,6-dione

Năm 2000, nhóm tác giả Hooi Hoon Ang và cộng sự [4] đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất: Eurycolactone A, Eurycolactone B, Eurycolactone C từ cây Bách bệnh

Năm 2001, nhóm tác giả Suratwadee Jiwajinda, Vilai Santisopasri và cộng sự 9] đã nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây [2Bách bệnh, đã phân lập đ-ợc Longilactone, 6-Dehydroxylongilactone,

11-Dehydroxyklaineanone;15-Dihydroxyklaineanone;14,15 - 

Dihydroxyklaineanone; 15 -O-acetyl- -dihydroxyklaineanone  14

Năm 2002, Hooi Hoon Ang, Yukio Hitotsuyanagi và cộng sự [12] đã phân lập đ-ợc Eurycolactone E, Eurycolactone F, Eurycolactone B và Eurycomalactone

Năm 2003, nhóm tác giả Ping Chung Kuo và cộng sự 2] đã phân lập [2

và xác định cấu trúc hoá học đ-ợc 3 hợp chất mới:

n-Pentyl-carboline-1-propionate;5-Hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one; 1-Hydroxy-9-methoxycanthin-6-one và 9-Hethoxycanthin-6-one;

Canthin-6-one đã biết từ cây Bách bệnh Các hợp chất phân lập đ-ợc đã đ-ợc tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro và hoạt tính chống sốt rét in vitro Kết quả thử nghiệm cho thấy hợp chất 9-Methoxycanthin-6-one; Canthin-6-one thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung th- phổi

và dòng tế bào ung th- vú Trong thời gian này, nhóm tác giả Bedir và c g sự ộn[6] cũng đã phân lập đ-ợc hợp chất Eurycomaoside

Năm 2004, nhóm tác giả Ping Chung Kuo và cộng sự 1] đã phân lập [2

đ-ợc thêm hợp chất Eurycomalin A từ cây Bách bệnh

D-ới đây là một số hợp chất đ-ợc phân lập từ loài Eurycoma longifolia

7-Methoxy-carboline-1-propanoic acid C15H14N2O3 15

1-Hydroxy-9-methoxycanthin-6-one C15H10N2O3 26

5,9-Dimethoxycanthin-6-one C16H12N2O3 22

9,10-Dihydroxycanthin-6-one; 9-Me ether C15H10N2O3 22

9,10-Dihydroxycanthin-6-one; Di-Me ethe C16H12N2O3 22

19

Eurycomanol; 2-Ketone C20H24O9 7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 2-Ketone, 13 ,18-epoxide α

C20H24O10

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 2-Ketone, 13 ,18-epoxide, α

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 2-Ketone, 13 ,18-epoxide, α

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro

C20H28O9

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro, 2-ketone

C20H26O9

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro, 2-ketone,

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro, 2-ketone

C20H26O9

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro, 13-hydroxy,

7 0 1 2 5,,1 ,1 ,1 ,1

19 Eurycomanol; 13,18-Dihydro, 13 ,18-

Một số cấu trúc đặc tr-ng có trong thành phần hoá học của loài

HO

OH OH

HO

OH OH

HO

OH OH O

HO

OH OH

1-Hydroxy-9-methoxycanthin-6-one

O O

O

5,9-Dimethoxycanthin-6-one

O

O

O OH

O

O

OH HO

4'-(2,3-Epoxy-1-hydroxypropyl)-2-hydroxy-5- -hydroxy-1-propenyl)-(3

2',3-dimethoxybiphenyl

O HO

OH

O HO O

O

2-hydroxy-5- -hydroxy-1-(3propenyl)-2',3,6'-

4'-(2,3-Epoxy-1-hydroxypropyl)-trimethoxybiphenyl

O

HO OH

O O

Eurycolactone C

O O

O

HO

O HO

Eurycomalin A

O O

OH HO

OH OH

O O

HO HO HO OH

OH

OH OH

O O

O

Eurylactone B

O OHO

O

OH

O OH

Laurycolactone B

O O

OH HO

OH HO

O

OH O

OEurycolactone F

1.2 Giới thiệu về lớp chất ancaloit

1.2.1 Giới thiệu chung

Ancaloit là những hợp chất thiên nhiên có chứa N, đa số có nhân dị vòng, có tính bazơ, th-ờng gặp trong thực vật đôi khi gặp trong động vật Các

ancaloit th-ờng có hoạt tính mạnh và cho những phản ứng hoá học với một số thuốc thử chung của ancaloit

Ancaloit rất phổ biến trong thực vật Đến nay đã biết khoảng 6000 ancaloit từ hơn 5000 loài thực vật Ancaloit hầu hết có ở thực vật bậc cao, chiếm khoảng 15-20% tổng số loài cây, tập trung ở một số họ nh-: Apocynaceae (Trúc Đào), Papaveraceae (Thuốc Phiện), Fabaceae (Đậu), Liliaceae (Hành Tỏi)… các chất này đ-ợc tạo từ các axit amin trong quá trình phát triển của cây [3 ]

1.2.2 Các nhóm ancaloit

1.2.2.1 Ancaloit nhóm pyridin

Đại diện quan trọng của nhóm này là nicotin và anabazin

Nicotin: nicotin đ-ợc tạo thành từ các dị vòng piridin và pirrolidin, có

công thức nh- sau:

CH3

Nicotin có nhiều trong lá của cây thuốc lá (khoảng 3%) ở trạng thái tự

do, nicotin là chất lỏng nh- dầu, không mầu, sôi ở 2470C, tan trong n-ớc và các dung môi hữu cơ

Anabazin: Anabazin đ-ợc tạo thành từ các dị vòng piridin và piperidin,

có công thức nh- sau:

N

N H

Papaverin lµ chÊt r¾n, tinh thÓ nãng ch¶y ë 1470C, papaverin ®-îc trÝch

tõ qu¶ thuèc phiÖn, chiÕm kho¶ng 1% khèi l-îng

1.2.2.4 Ancaloit nhãm izoquinolin phenanthren:

Tiªu biÓu cho nhãm nµy lµ morphin vµ hai dÉn xuÊt cña morphin lµ Codein vµ Heroin

Tropan Tiêu biểu cho nhóm này là atropin và cocain

- Atropin có công thức cấu tạo nh- sau:

H2C HC CH2

H2C CH CH2

CHOOCCH(C 6H5)CH2OH NCH3

Atropin là ancaloit có nhiều trong hạt cà độc d-ợc (Atropa belladonna),

có tác dụng co thắt cơ trơn nh- ruột, cuống phổi và làm giãn đồng tử mắt

Atropin là chất rắn, nóng chảy ở 115-1170C, có vị đắng và là chất độc mạnh

- Cocain cã c«ng thøc cÊu t¹o nh- sau:

H2C HC CH2

H2C CH CH2

CHOOCC6H5NCH3

COOCH3

Cocain cã trong l¸ c©y coca (Erythroxylon coca) mäc nhiÒu ë Nam Mü Cocain lµ chÊt r¾n, nãng ch¶y ë 980C, Ýt tan trong n-íc dÔ tan trong r-îu, eter

Ch-ơng 2: thực nghiệm và kết quả

2.1 Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Lá cây Bách bệnh đ-ợc thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu cây đ-ợc

TS Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh Vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định

Mẫu tiêu bản đ-ợc giữa tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Ph-ơng pháp phân lập các hợp chất

2.1.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng đ-ợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng

đèn tử ngoại ở hai b-ớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đ-ợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp

điện từ từ đến khi hiện màu

2.1.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai b-ớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nh-

cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silicagel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

2.1.2.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột đ-ợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica l pha th-ờng và gepha đảo Silicagel pha th-ờng có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh) Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) Nhựa 

trao đổi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

2.1.3 Ph-ơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

2.1.3.3 Phổ khối l-ợng phun mù điện tử (ESI-MS)

Phổ khối l-ợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass

spectra) đ-ợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.3.4 Phổ cộng h-ởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng h-ởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135) và hai chiều (HMBC, HSQC): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đ-ợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cấu trúc của các hợp chất đ-ợc xác định bằng cách kết hợp các ph-ơng pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR); phổ khối l-ợng SI-MS) (E

• Bản mỏng điều chế pha th-ờng DC-Alufolien 60 F254 (Merck)

• Các loại dung môi hữu cơ nh- methanol, etanol, ethyl acetate,

chlorofrom, hexane, acetone, v.v… là loại hoá chất tinh khiết của Merck

2.2 Thực nghiệm và kết quả

2.2.1 Xử lý mẫu

Lá cây Bách bệnh (500g) đ-ợc sấy khô, nghiền nhỏ thành bột rồi chiết metanol bằng thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ 50oC Sau khi đuổi dung môi d-ới áp suất giảm thì đ-ợc 58 gam dịch cô metanol

2.2.2 Quy trình chiết phân đoạn bột lá khô cây Bách bệnh

700 ml n-ớc cất đ-ợc bổ sung vào 58 gam dịch cô metanol, lắc đều, sau

đó chiết lần l-ợt bằng n-hexan, clorofoc, etyl axetat và n-butanol, thu đ-ợc các cặn dịch chiết n-hexan (12 g), clorofoc (21 g), etyl axetat (7 g) và n-butanol (6 g) sau khi loại dung môi d-ới áp suất giảm

Qui trình đ-ợc biểu diễn theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 1 : Sơ đồ chiết các phân đoạn lá cây Bách bệnh

Bổ sung n-ớc n-hexan: n-ớc (1/1)

21 gam cặn dịch clorofoc đ-ợc tiến hành phân lập bằng các ph-ơng

pháp sắc ký khác nhau nh- đ-ợc chỉ ra trên sơ đồ 2

Sơ đồ 2 : Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết

2.2.4 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất

Các chất đã phân lập đ-ợc chúng tôi phân tích cấu trúc bằng các ph-ơng pháp vật lý nh-: đo điểm chảy, đo độ quay cực, kết hợp với các ph-ơng pháp phổ hiện đại nh- phổ cộng h-ởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 135 và DEPT 90)

2.2.4.1 Hợp chất 1: ELC3B: 9-Methoxycanthin-6-one

Tinh thể màu vàng ngà; Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC

Độ quay cực: [ ] 25C: + 85,0 (c, 1,0: CHCl3)

ESI-MS m/z : 251 [M+H]+, (C15H10N2O2)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) : 8,15 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1), 8,76 (1H, d,

J = 5,0 Hz, 2), 8,10 (1H, d, J = 10,0 Hz, 4), 6,95 (1H, d, J = 10,0 Hz, 5), 8,23 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 7,15 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-10), 8,23 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 3,93(s, OCH3)

H-13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) : 116,32 (d, C-1), 145,92 (d, C-2), 139,98

(d, C-4), 128,14 (d, C-5), 158,93 (s, C-6), 100,78 (d, C-8), 161,70 (s, C-9), 113,14 (d, C-10), 124,40 (d, C-11), 116,93 (s, C-12), 140,29 (s, C-13), 129,43 (s, C-14), 131,69 (s, C-15), 135,15 (s, C-16), 55,79 (OCH3)

2.2.4.2 Hợp chất 2: ELC4A : 9-Hydroxycanthin-6-one

Tinh thể màu vàng ngà; Nhiệt độ nóng chảy: 288-293oC

ESI-MS m/z : 237 [M+H]+, (C15H10N2O2)

Độ quay cực: [ ] 25C : + 87,0 (c, 1,0: CHCl3)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) : 8,11 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1), 8,73 (1H, d,

J = 5,0 Hz, 2), 8,10 (1H, d, J = 10,0 Hz, 4), 6,94 (1H, d, J = 10,0 Hz, 5), 7,98 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 6,99 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-10), 8,14 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 10,44 (1H, brs, 9-OH)

H-13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) : 115,96 (d, C-1), 145,93 (d, C-2), 139,99

(d, C-4), 128,08 (d, C-5), 158,97 (s, C-6), 102,92 (d, C-8), 161,51 (s, C-9), 114,04 (d, C-10), 124,60 (d, C-11), 115,60 (s, C-12), 140,56 (s, C-13), 129,91 (s, C-14), 131,69 (s, C-15), 135,05 (s, C-16)

2.2.4.3 Hợp chất 3: Elc3A: 11-Dehydroklaineanone

Chất rắn màu trắng, Nhiệt độ nóng chảy: 141-142oC

ESI-MS m/z : 263 [M+H]+, (C20H26O6)

Độ quay cực: [ ] 25C: -15,0 (c, 1,0: CHCl3)

1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) : 4,04 (1H, s, H-1), 5,99 (1H, d, d, J = 3,0 Hz,

H-3), 2,9 (1H, brd, H-5), 2,18 (2H, m, H-6), 3,73 (1H, brd, J = 3,0 Hz, H-7), 3,74 (1H, s, H-9), 4,51 (1H, dd, J = 2,5, 5,0 Hz, H-12), 2,26 (1H, m, H-13), 1,93 (1H, m, H-14), (2,65, dd, J = 6,5, 19,0 Hz, H-15a), (3,69, dd, J = 12, 19,0 Hz, H-15b), 1,99 (3H, s, H-17), 1,26 (3H, s, H-19), 1,14 (3H, s, H-20), 1,11 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21)

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) : 86,06 (d, C-1), 200,17 (s, C-2), 126,11 (d,

C-3), 165,01 (s, C-4), 44,16 (d, C-5), 26,17 (t, C-6), 82,88 (d, C-7), 41,08 (s, C-8), 47,68 (d, C-9), 47,10 (s, C-10), 212,83 (s, C-11), 83,87 (d, C-12), 36,55 (d, C-13), 45,83 (d, C-14), 29,71 (t, C-15), 173,85 (s, C-16), 22,39 (q, C-18), 10,03 (q, C-19), 22,81 (q, C-20), 13,74 (q, C-21)

2.2.4.4 Hợp chất 4: ELL3B: Longilactone

Chất rắn màu trắng, Nhiệt độ nóng chảy: 130-132oC

H-13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) : 82,39 (d, C-1), 199,08 (s, C-2), 125,91 (d,

C-3), 165,86 (s, C-4), 49,50 (d, C-5), 63,46 (d, C-6), 85,77 (d, C-7), 42,24 (s, C-8), 40,73 (d, C-9), 48,97 (s, C-10), 71,76 (d, C-11), 73,77 (d, C-12), 26,24 (d, C-13), 54,85 (d, C-14), 175,89 (s, C-15), 24,45 (q, C-16), 11,95 (q, C-17), 20,43 (q, C-18), 14,49 (q, C-19)

2.2.4.5 Hợp chất 5: ELL5A: 4(18)-Isomer, 2-alcohol-longilactone

Chất rắn màu trắng, Nhiệt độ nóng chảy: 145-147oC

ESI-MS m/z : 369 [M+H]+, (C19H28O7)

Độ quay cực: [ ] 25C: +68,0o (c, 1,0: MeOH)

1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) : 3,29 (1H, d, J = 4,5, H-1), 3,53 (1H, ddd, J =

12,0, 6,0, 4,5, H-2), 2,06 (dd, J = 12,0,12,0 Hz, H-3a), 2,57 (dd, J = 12,0, 6,0 Hz,H-3b), 2,18 (1H, d, J = 11,0, H-5), 4,21 (1H, dd, J = 3,5, 11,0, H-6), 4,09 (1H, d, J = 3,5, H-7), 1,78 (1H, d, J = 2,0, H-9), 4,81 (1H, dd, J = 2,0, 3,0, H-11), 3,27 (1H, dd, J = 3,0, 2,0, H-12), 2,33 (1H, m, H-13), 2,31 (1H, d, J = 5,0, H-14), 4,91 (1H, d, J = 5,0 Hz, H18a), 5,09 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-18b), 1,06 (3H, s, H-19), 1,57 (3H, s, H-20), 1,39 (3H, d, J = 7,0, H-21)

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) : 83,14 (d, C-1), 74,70 (d, C-2), 45,14 (t, C-3),

141,86 (s, C-4), 53,14 (d, C-5), 65,22 (d, C-6), 87,95 (d, C-7), 44,66 (s, C-8), 43,86 (d, C-9), 45,14 (s, C-10), 73,58 (d, C-11), 75,98 (d, C-12), 28,19 (d, C-13), 57,14 (d, C-14), 179,30 (s, C-15), 111,00 (t, C-18), 13,89 (q, C-19), 21,40 (q, C-20), 14,75 (q, C-21)

2.2.4.6 Hợp chất 6: ELC3: Eurycomalactone

Chất rắn màu trắng, Nhiệt độ nóng chảy: 268-270oC

ESI-MS m/z : 349 [M+H]+, (C19H24O6)

Độ quay cực: [ ] 25C: +72,0 (c, 1,0: MeOH)

1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) : 4,03 (1H, s, H-1), 6,10 (1H, br s, H-3), 2,95

(H-5), 2,80-2,86 (H-6), 1,86 (1H, d, 3,5, H-9), 4,78 (1H, dd, 5,0, 8,0, H-11), 4,36 (1H, dd, 1,5, 5,0, H-12), 2,93 (1H, m, H-13), 2,94 (1H, d, 1,5, H-14), 1,94 (3H, s, H-18), 1,25 (3H, s, H-19), 1,55 (3H, s, H-20), 1,15 (3H, d, 6,5, H-21)

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) : 81,23 (d, C-1), 197,39 (s, C-2), 124,42 (d,

C-3), 162,15 (s, C-4), 49,31 (d, C-5), 36,19 (t, C-6), 205,44 (s, C-7), 51,11 (s, C-8), 49,04 (d, C-9), 46,89 (s, C-10), 69,78 (d, C-11), 83,10 (d, C-12), 32,27 (d, C-13), 52,86 (d, C-14), 176,17 (s, C-15), 21,89 (q, C-18), 12,10 (q, C-19), 23,60 (q, C- ), 16,60 (q, C-20 21)

2.2.5 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết metanol lá cây Bách

bệnh

2.2.5.1 Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định đ-ợc tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết đ-ợc thực hiện trên các phiến vi l-ợng 96 giếng (96-Well microtiter plate) theo ph-ơng pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và MCKane, L., & Kandel (1996)

* Các chủng Vi sinh vật kiểm định bao gồm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 2592)

Pseudomanas aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212);

Staphylococus aureus (Sa)

- Nấm sơi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum

+ Ampicilin đối với vi khuẩn Gr(+)

+ Tetracylin đối với vi khuẩn Gr(- )

+ Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm sợi và nấm men

- Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong dung môi DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0,04mM

:

Chứng âm tính

+ Vi sinh vật kiểm định không trộn chất kháng sinh và chất thử

- Môi tr-ờng nuôi cấy vi sinh vật:

+ Môi tr-ờng duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB) cho nấm men và nấm mốc Vi khuẩn trong môi tr-ờng Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma

+ Môi tr-ờng thí nghiệm: Eugon Broth cho vi khuẩn, Myco phil cho nấm

Tiến hành thí nghiệm: Các chủng kiểm định đ-ợc hoạt hoá và pha

loãng tơi nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm

Đọc kết quả: Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm

370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men

Kết quả d-ơng tính là nồng độ mà ở đó không có Vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi tr-ờng thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum inhibitory concentration) của chất có hoạt tính:

Các mẫu đã có hoạt tính đ-ợc sàng lọc ban đầu đ-ợc pha loãng theo các nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà

ở đó sinh vật bị ức chế phát triển gần nh- hoàn toàn

Định l-ợng kháng khuẩn:

*

Theo ph-ơng pháp hệ nồng độ: Ph-ơng pháp định l-ợng kháng khuẩn nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các chất kháng khuẩn thông qua giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất kháng khuẩn

Định tính kháng khuẩn: Nguyên tắc của ph-ơng pháp dựa trên sự

*

khuyếch tán của hoạt chất vào môi tr-ờng có cấy vi khuẩn Vi sinh vật kiểm

định và sự ức chế vi khuẩn đ-ợc đánh giá qua đ-ờng kính vòng kháng khuẩn Tiến hành thử hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định với dịch chiết metanol của lá cây Bách bệnh, chúng tôi đã thu đ-ợc kết quả sau:

Bảng 1: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men

E.coli P aeru B subti S.aureus Asp.niger F.oxy S.cere C.albic

2.2.5.2 Hoạt tính chống ô hóa xy

DPPH có khả năng tạo ra gốc tự do bên trong dung dịch EtOH bão hoà Khi cho có chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm c-ờng độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống ô hoá đ-ợc đánh giá thông qua giá trị hấp xyphụ ánh sáng của dung dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở b-ớc sóng 515 nm

Giá trị SC biểu hiện khả năng bắt giữ các gốc tự do thông qua hệ ô xyhóa tự tạo bởi DPPH Kết quả thử hoạt tính chống ô hoá của mẫu cây Bách xybệnh đ-ợc trình bày thông qua bảng và kết quả đánh giá giá trị IC50 của các mẫu có hoạt tính

Tiến hành thử hoạt tính chống ô hoá với dịch chiết metanol của lá cây xyBách bệnh, chúng tôi thu đ-ợc kết quả sau:

Bảng 2: Kết quả đánh giá hoạt tính chống ô xy hóa

2.2.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào

Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào với dịch chiết metanol của lá cây Bách bệnh, chúng tôi thu đ-ợc kết quả sau

Bảng 3: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào

ch-ơng 3: Thảo luận kết quả

3.1 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất

3.1.1 Hợp chất 1: ELC3B: 9-Methoxycanthin-6-one

Hợp chất thu đ-ợc ở dạng tinh thể có màu vàng ngà, có nhiệt độ nóng 1

chảy 178-179oC Phổ 1H-NMR của xuất hiện hai tín hiệu doublet tại 1

 8,15 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1) và 8,76 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2), hai tín hiệu doublet khác tại 8,10 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-4) và các tín hiệu của một vòng 

thơm có hệ t-ơng tác ABX của ba proton tại 6,95 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-5), 

8,23 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8) và 7,15 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-10), 8,23 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11) Ngoài ra, trên phổ này còn xuất hiện tín hiệu singlet của nhóm metoxi tại 3,93(s, OCH 3)

Hình 3.1.a Phổ 1H-NMR của 1

N N

O

H3CO

1 2 3

4 5 6

7 8

9

10 11 12

13

14 15 16

Hình 3.1.b Cấu trúc hoá học của 1

Hình 3.1.c Phổ 1 H-NMR dãn rộng của 1

Phổ 13C-NMR của xuất hiện tín hiệu của 15 cacbon, trong đó bằng 1

phổ DEPT 90 và DEPT 135 đã xác định đ-ợc hợp chất này có 6 cacbon bậc bốn tại 158,93 (C-6), 116,93 (C-12), 140,29 (C-13), 129,43 (C-14), 131,69 

(C-15), 135,15 (C-16), 7 cacbon metin tại 116,32 (C-1), 145,92 (C-2), 

139,98 (C-4), 128,14 (C-5), 100,78 (C-8), 113,14 (C-10), 124,40 (C-11), nhóm metoxi taị  55,79 (OCH3) và nhóm cacbonyl tại  161,70 (s, C-9) So với tín hiệu của các nhóm cacbonyl thông th-ờng thì ở đây tín hiệu của nhóm cacbonyl lại dịch chuyển mạnh về phía tr-ờng cao, mà giá trị độ dịch chuyển hóa học thấp hơn cả tín hiệu của các nhóm este Đây là một điểm đáng chú ý của các hợp chất thuộc vòng Canthin, tức là hợp chất chứa nitơ Kiểm tra định tính lại bằng thuốc thử dragendoff cho kết quả phản ứng d-ơng tính, chứng tỏ

đây là một ancaloit Dự đoán sự có mặt của vòng canthin đ-ợc khẳng định thêm bằng giá trị hằng số t-ơng tác J của H-1 và H-2 (J = 5,0 Hz) và của H-4

và H-5 (J = 10,0 Hz) [23]

H×nh 3.1.d Phæ 13 C-NMR cña 1

H×nh 3.1.e Phæ 13 C-NMR vµ c¸c phæ DEPT cña 1

Những dữ kiện phổ nêu trên cho phép dự đoán công thức phân tử của 1

là C15H10N2O2 với khung vòng canthin có 2 nguyên tử nitơ Kết quả này cũng

đ-ợc khẳng định thêm bằng phổ khối l-ợng với sự xuất hiện píc ion m/z tại

251 [M+H]+ Kết quả so sánh các dữ kiện phổ của và 1

9-Methoxycanthin-6-one hoàn toàn phù hợp (Bảng 3.1.1)

Bảng 3.1 Kết quả phổ NMR của 1 và của 9-Methoxycanthin-6-one 1.