Nghiên ứu góp phần xây dựng quy trình hiết xuất hỗn hợp saponin, flavonoid (sf) từ khô dầu hạt camellia sp (theaeae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU GĨP PHẦN XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT HỖN HỢP SAPONIN, FLAVONOID (SF ) TỪ KHÔ DẦU HẠT CAMELLIA SP (THEACEAE) NGUYỄN QUANG KHÁNH HÀ NỘI - 2006 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131698691000000 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 CAMELLIA SP (THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU 1.1.1 Một số đặc điểm Camellia sp 1.1.2 Hạt khô dầu từ hạt Camellia sp 11 1.2 1.3 KHÁI NIỆM VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 14 HỢP CHẤT SAPONIN 16 1.3.1 Khái niệm chung saponin 16 1.3.2 Phân loại 17 1.3.2.1 1.3.2.2 1.3.3 1.4 Saponin triterpenoid 17 Saponin steroid 20 Một vài nghiên cứu gần saponin 22 CHIẾT XUẤT 25 1.4.1 1.4.1.1 1.4.1.2 1.4.1.3 1.4.2 1.4.2.1 1.4.2.2 1.4.2.3 Một số q trình biến đổi q trình chiết xuất 27 Khuếch tán 27 Quá trình thẩm thấu 28 Q trình thẩm tích 29 Những yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 29 Về nguyên liệu 29 Dung môi chiết 30 Yếu tố kỹ thuật 30 1.4.3 Phân loại phương pháp chiết xuất 31 1.4.4 Một số lưu ý chiết xuất hợp chất saponin 31 Chương 34 THỰC NGHIỆM 34 2.1 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Phương pháp tổng hợp tư liệu 34 2.2.2 Phương pháp hóa lý, hóa học khảo sát nguyên liệu chiết tách 35 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.4 Xác định độ ẩm nguyên liệu (theo TCVN 4801:89) 35 Xác định hàm lượng tinh bột 35 Xác định hàm lượng dầu khô Du trà (TCVN 4331:2001) 36 Định lượng saponin, flavonoid dầu thu từ khô Du trà 36 2.2.1.5 2.2.1.6 2.2.1.7 Định tính thành phần hóa học cao chiết tồn phần khơ Du trà 37 Xác định hàm lượng hỗn hợp saponin, flavonoid S f tồn phần 38 Độ hịa tan dung môi hỗn hợp saponin flavonoid 39 2.2.3 Chiết xuất, phân tách hỗn hợp saponin flavonoid S f 39 2.2.4 Thử hoạt tính sinh học hỗ hợp S f 40 2.2.5 Thiết bị thí nghiệm 41 Chương 42 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 42 3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG CHIẾT XUẤT HỖN HỢP S F TỪ KHÔ DU TRÀ 46 3.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT S F TỪ KHÔ DU TRÀ 50 3.3.1 Khảo sát quy trình chiết xuất dung mơi methanol nước 50 3.3.2 Quy trình chiết xuất S f dung môi nước 57 3.3.2.1 Xử lý nguyên liệu 57 3.3.2.2 Giai đoạn chiết nước xử lý dịch chiết 59 3.3.2.3 Giai đoạn tinh chế 63 3.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM CHIẾT S F 67 3.4.1 Thử hoạt tính phá huyết 67 3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm 69 3.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm 69 KẾT LUẬN 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1: Camellia sp (Theaceae) trồng Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) Bảng 1: Kích thước, trọng lượng quả, hạt Du trà Việt Nam [8] 11 Hình 2: Hạt Camellia sp (12/2005) 12 Bảng 2: Kết phân tích hạt Du trà chất lượng dầu Du trà [8] 12 Hình 3: Khơ dầu hạt Camellia sp Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) 13 Bảng 3: So sánh hàm lượng saponin số loài thực vật 14 Hình 4: Dạng cấu trúc phổ biến hợp chất flavonoid 15 Hình 5: Sapotalen 17 Hình 6: Bốn cấu trúc aglycone chủ yếu saponin triterpenoid pentancyclic 18 Hình 7: Cấu trúc aglycone saponin triterpenoid tetracyclic 20 Hình 8: Một vài cấu trúc phổ biến Saponin steroid 21 Hình 9: Các q trình diễn chiết dung mơi 25 Hình 1: Khơ dầu từ hạt Du trà Nghĩa Đàn - Nghệ An (2005) 34 Sơ đồ 1: Phân lập thu cao chiết soxhlet 38 Sơ đồ 2: Tách hỗn hợp S f từ cao chiết MeOH 39 Bảng 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu 42 Bảng 2: Xác định hàm lượng tinh bột 42 Bảng 3: Xác định hàm lượng chất béo 43 Bảng 4: Xác định hàm lượng saponin có dầu 43 Bảng 5: Định tính thành phần cao chiết từ khô Du trà 44 Hình 1: Thử phản ứng Lieberman –Burchard 44 Bảng 6: Xác định hàm lượng saponin, flavonoid toàn phần 45 Bảng 7: Saponin, flavonoid dầu khô Du trà loại dầu 45 Bảng 8: Thời gian tan hồn tồn (phút) dung mơi điểm nhiệt độ khác (0,1g saponin/5ml dung môi) 46 Hình 2: So sánh thời gian hịa tan S f số dung môi phân cực 47 Bảng 9: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết tới hàm lượng thu hồi S f 48 Hình 3: Đồ thị mô tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 48 Bảng 10: Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi tới hàm lượng S f thu 49 Hình 4: Đồ thị mơ tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 49 Bảng 11: Ma trận kế hoạch 23 51 Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách hỗn hợp S f methanol, quy mô 100g nguyên liệu/mẻ 52 Sơ đồ : Quy trình chiết tách hỗn hợp S f nước, quy mô 100g nguyên liệu/mẻ 53 Bảng 12 Kết tính tốn phương sai 55 Hình 5: Kết tối ưu từ phẩm mềm Nemrodw 56 Bảng 13: Thơng số quy trình chiết xuất S f từ khô Du trà 57 Bảng 14: Xử lý ngun liệu có loại dầu khơng loại dầu 58 Hình 6: Thử phá huyết mẫu dầu béo loại sau chiết nước 59 Bảng 15: So sánh việc xử lý màu than hoạt tính 60 Sơ đồ 3: Giai đoạn chiết nóng xử lý dịch chiết 62 Sơ đồ 4: Giai đoạn tinh chế cao chiết từ nước 64 Bảng 16: Tham số quy trình chiết xuất S f từ kg khô Du trà 65 Sơ đồ 5: Quy trình hồn thiện chiết xuất S f từ khơ hạt Du trà 66 Bảng 17: Chi phí dung mơi tiêu hao quy trình chiết xuất S f quy mơ 2kg/mẻ (sơ đồ 3.5) 67 Hình 7: Vòng phá huyết mẫu sản phẩm chiết theo phương pháp đục giếng, nồng độ chế phẩm 0,1g/5 ml 68 Hình 8: Vịng phá huyết theo phương pháp đặt giấy tẩm dung dịch S f chiết nước nồng độ 0,1 g/ ml 68 Hình 9: Vịng kháng nấm chủng Candida albicans ATCC 10231 nồng độ S f ức chế 1mg/ml nồng độ 3mg/ml 69 MỞ ĐẦU Từ hạt Camellia sp (tên thường gọi Du trà), qua ép người ta thu dầu Loại dầu sử dụng chủ yếu dùng sản xuất dầu thực phẩm Bã khô sau ép phần người dân dùng làm chất xử lý hồ ao có tác dụng diệt cá tạp, có nơi đưa vào bổ sung làm thức ăn chăn ni, cịn lại bỏ đi, khơng ý đến Trong đó, ngành Lâm nghiệp đưa Du trà vào thành phủ xanh đất trống, đồi trọc rừng phòng hộ nên nguồn bã khô lớn Trong số nghiên cứu Việt Nam giới, người ta bã khơ sau ép có chứa lượng dồi hợp chất có tên khoa học saponin Tuy nhiên, việc chiết xuất hợp chất saponin tinh khiết khó khăn tính chất hóa lý phức tạp chúng Người ta chứng minh số tác dụng có ý nghĩa hợp chất ví dụ tác dụng kháng nấm, tác dụng phá huyết, tác dụng làm giảm cholesterol máu Đáng ý gần với đề tài thuộc chương trình nghiên cứu Khoa học Nhà nước - Hướng khoa học tự nhiên, mã số 511402, giai đoạn 2002-2005, GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ cộng chiết xuất thu hỗn hợp saponin flavonoid gọi tên S f nghiên cứu dược lý học tác dụng (in vitro in vivo) S f chiết xuất từ khô Du trà Camellia Kết cho thấy hỗn hợp chất chiết thu có tính chất có giá trị lĩnh vực y học Các kết nghiên cứu khẳng định hoạt chất S f có tác dụng diệt nấm Candida albicans, loại nấm bệnh phụ khoa phổ biến Trong hoạt chất S f lại khơng tiêu diệt nấm Lactobacillus loại nấm có tác dụng ổn định độ pH phần kín phụ nữ Hoạt chất S f ức chế tinh trùng, làm cho tinh trùng không di chuyển nhanh dừng lại chỗ, khơng hoạt động chết Điều bảo đảm tinh trùng khơng cịn khả tiếp cận với trứng, khơng cịn khả gây thụ thai Nghiên cứu cịn sâu vào tìm quy trình bào chế tạo thuốc kháng nấm viên đặt âm đạo diệt tinh trùng người Ngoài ra, đề tài tiến hành thử nghiệm sản xuất số sản phẩm dược phẩm có sử dụng S f hoạt chất [15] Điều đặc biệt nghiên cứu xác định hỗn hợp S f có chứa ngồi saponin số flavonoid Trong nghiên cứu dược liệu để làm thuốc, chiết đơn chất thường xuyên sử dụng hỗn hợp chất nhằm tranh thủ tác dụng có lợi chúng, tác động hiệp đồng điều trị bệnh Kế thừa kết nghiên cứu với khả chiết tách từ bã khô Du trà, vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách phù hợp để khai thác saponin, flavonoid từ bã khô Du trà có ý nghĩa vấn đề trồng rừng, xóa đói giảm nghèo vùng nơng thơn góp phần tạo nguồn ngun liệu quý cho ngành dược phẩm Các kết nghiên cứu thực nhiều nhà khoa học cho thấy biện pháp chủ yếu để tách saponin từ bã khô dầu Du trà sử dụng dung môi nước, methanol, cồn dung dịch chúng tỷ lệ khác Tuy nhiên, nghiên cứu chưa đưa quy trình có khả áp dụng vào thực tế, quy mô chiết tách mang tính thăm dị lượng nhỏ ngun liệu sâu vào nghiên cứu tác dụng saponin, chứng minh tính quý saponin Du trà ngành dược Đã có nghiên cứu khả tách saponin từ bã khô Du trà Song hầu hết đó, tập trung xác định hàm lượng saponin nguyên liệu đưa phác thảo quy trình chiết tách với nghèo nàn yếu tố công nghệ Và, nay, chưa có quy trình cơng nghệ áp dụng thực tế nước ta để thu saponin với tính chất q từ bã khơ Du trà Như vậy, vấn đề đề tài xây dựng quy trình chiết tách saponin từ bã khơ Du trà có tính dễ thực quy mô nguyên liệu lớn, tiếp cận với thực tế sản xuất công nghiệp Để giải vấn đề nghiên cứu trên, nhiệm vụ quan trọng đề tài tìm lời giải cho câu hỏi nghiên cứu đặt đây: Khả chiết xuất hỗn hợp saponin từ khô Du trà dung môi nước? Làm xây dựng mơ hình chiết tách có hiệu có tính ứng dụng cao? Chất lượng saponin thu được đánh giá sở nào? Tuy nhiên điều kiện hạn chế sở vật chất nghiên cứu, đề tài hướng tới mục tiêu nghiên cứu sau Mục tiêu nghiên cứu: Để giải câu hỏi nghiên cứu nêu góp phần giải vấn đề nghiên cứu đặt ra, đề tài tiến hành nhằm mục tiêu nghiên cứu góp phần xây dựng hồn thiện quy trình chiết tách S f từ khơ dầu hạt Camellia sp Nội dung nghiên cứu: o Khảo sát nguyên liệu khô Du trà o Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết tách o Xây dựng quy trình chiết xuất S f từ khơ Du trà o Xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm S f Việc nghiên cứu đề tài có ý nghĩa quan trọng khoa học thực tiễn Về mặt khoa học, đề tài góp phần chắt lọc hồn thiện quy trình cơng nghệ phù hợp với điều kiện trình độ kỹ thuật Việt Nam Về mặt thực tiễn, đề tài cung cấp sở cho nghiên cứu quy mô thử nghiệm, chuẩn bị cho quy mơ cơng nghiệp Qua gián tiếp góp phần nâng cao giá trị Du trà, cải thiện cho người chăm sóc thu hái, tạo nguồn dược liệu tốt phục vụ sản xuất thuốc phòng chữa bệnh Chương TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 CAMELLIA SP (THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU 1.1.1 Một số đặc điểm Camellia sp Camellia sp (Theaceae) thuộc Theales (thường gọi Du trà) loại thân gỗ nhỏ, cao trung bình khoảng 3-5m, thân to khoảng 812cm, gốc thường có từ 3-5 thân khơng phân biệt thân hay phụ chỉa cành sớm, vỏ màu nâu hay xám, tán nhỏ dày phân bố tạo thành nhiều dạng khác nhau: hình ơ, hình trứng, hình nón, hình tháp, trụ Lá đơn mọc cách, cuống ngắn, mép có cưa nhỏ, hình dạng kích thước khác Qua nghiên cứu, tác giả Nguyễn Quang Khải cộng kết luận loài Du trà có khác rõ rệt hình dạng, màu sắc kích thước cá thể khác [8] Hình 1: Camellia sp (Theaceae) trồng Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) Hoa Du trà thuộc loại lưỡng tính, màu trắng khơng có cuống Hoa có 5-7 tràng, 35-40 nhị màu vàng, bầu hạ thường có từ 3-4 Du trà hoa từ tháng 10-12 hàng năm, hình thành mầm hoa vào mùa xuân phân hoá rõ rệt vào tháng 5-6 Quả Du trà hình trịn, đầu lõm hay thn dài, có loại phình to, hai đầu lõm Kích thước trọng lượng khác số giống Du trà vùng trồng khác Đường kính trung bình 3-6 cm, độ dầy vỏ từ 0.5-1cm Quả có nhiều hạt mầu nâu vàng nâu xám, chín có mầu nâu đen Nhân hạt có chứa dầu, theo nhiều tài liệu nghiên cứu hàm lượng khoảng 45-50% khối lượng nhân Dầu có dạng lỏng sánh, màu vàng, không mùi, vị dịu [8] Có phân bố rộng vùng nhiệt đới châu Á, Du trà có mặt nước Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Myanma, Ấn Độ từ 18 o21 đến 34o34 độ vĩ bắc Ở nước ta, Du trà trồng đến vĩ tuyến 17o thuộc Vĩnh Linh, Cam Lộ Lồi ưa khí hậu ấm ẩm, nhiệt độ khơng khí bình qn năm từ 18 -240C, chịu rét đến o-3o C Nó cần có nhiệt độ tháng giêng mát giúp cho việc tích lũy dầu Tuy nhiên có khả chịu nhiệt độ cao gió Lào nóng vào tháng mùa hè Du trà ưa thích độ ẩm tương đối thời kỳ hoa 65-70%, thời kỳ ni 80-85% Lượng mưa năm thích hợp từ 1300-1500mm Tổng số nắng từ 1500 giờ/năm trở lên Giai đoạn năm cần che bóng nhẹ, lớn cần ánh sáng hoàn toàn hoa kết tốt Du trà sinh trưởng tốt vùng đồi có độ cao 500 mét so với mực nước biển Một đặc điểm sinh thái quan trọng Du trà khơng kén đất, sống vùng đất bạc màu, đất trống đồi trọc, đất thối hóa khơ cằn Cây sinh trưởng hoa kết tốt loại đất nâu vàng, đỏ vàng, vàng đỏ loại đá mẹ phiến thạch sét, sa phiến thạch, ryôlit Lạng Sơn, đất đỏ bazan vùng Vĩnh Linh- Quảng Trị, đất cát cố định Vĩnh Chấp- Vĩnh Linh Cây sinh trưởng nhiều đất đỏ bazan có tầng đất dày 50cm, tỷ lệ mùn đất 1% [29] Cây Du trà có rễ cọc đâm sâu tới 1,5m tùy theo loại đất trồng, có hệ rễ bàng phân nhánh phát triển mạnh thường phân bố độ sâu từ 20-40cm Chiều dài rễ bàng trung bình từ 3-3,5m Ngồi ra, cịn có rễ cám phát triển