Nghiên ứu góp phần xây dựng quy trình hiết xuất hỗn hợp saponin, flavonoid (sf) từ khô dầu hạt camellia sp (theaeae)

Đáng chú ý gần đây với đề tài thuộc chương trình nghiên cứu Khoa học cơ bản Nhà nước Hướng khoa học tự nhiên, mã số - 511402, giai đoạn 2002-2005, GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ và các cộng

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ 3

MỞ ĐẦU 5

Chương 1 8

TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 8

1.1 CAMELLIA SP THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU ( 8

1.1.1 Một số đặc điểm cơ bản của cây Camellia sp 8

1.1.2 Hạt và khô dầu từ hạt Camellia sp 11

1.2 KHÁI NIỆM VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 14

1.3 HỢP CHẤT SAPONIN 16

1.3.1 Khái niệm chung về saponin 16

1.3.2 Phân loại 17

1.3.2.1 Saponin triterpenoid 17

1.3.2.2 Saponin steroid 20

1.3.3 Một vài nghiên cứu gần đây về saponin 22

1.4 CHIẾT XUẤT 25

1.4.1 Một số quá trình biến đổi chính trong quá trình chiết xuất 27

1.4.1.1 Khuếch tán 27

1.4.1.2 Quá trình thẩm thấu 28

1.4.1.3 Quá trình thẩm tích 29

1.4.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 29

1.4.2.1 Về nguyên liệu 29

1.4.2.2 Dung môi chiết 30

1.4.2.3 Yếu tố kỹ thuật 30

1.4.3 Phân loại phương pháp chiết xuất 31

1.4.4 Một số lưu ý về chiết xuất hợp chất saponin 31

Chương 2 34

THỰC NGHIỆM 34

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Phương pháp tổng hợp tư liệu 34

2.2.2 Phương pháp hóa lý, hóa học khảo sát nguyên liệu và chiết tách 35

2.2.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu (theo TCVN 4801:89) 35

2.2.1.2 Xác định hàm lượng tinh bột 35

2.2.1.3 Xác định hàm lượng dầu trong khô Du trà (TCVN 4331:2001) 36

2.2.1.4 Định lượng saponin, flavonoid trong dầu thu được từ khô Du trà 36

2.2.1.5 Định tính thành phần hóa học cao chiết toàn phần khô Du trà 37

2.2.1.6 Xác định hàm lượng hỗn hợp saponin, flavonoid S f toàn phần 38

2.2.1.7 Độ hòa tan của dung môi đối với hỗn hợp saponin và flavonoid 39

2.2.3 Chiết xuất, phân tách hỗn hợp saponin và flavonoid S f 39

2.2.4 Thử hoạt tính sinh học của hỗ hợp S f 40

2.2.5 Thiết bị thí nghiệm 41

Chương 3 42

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 42

3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG CHIẾT XUẤT HỖN HỢP S F TỪ KHÔ DU TRÀ 46

3.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT S F TỪ KHÔ DU TRÀ 50

3.3.1 Khảo sát quy trình chiết xuất bằng dung môi methanol và nước 50

3.3.2 Quy trình chiết xuất S f bằng dung môi nước 57

3.3.2.1 Xử lý nguyên liệu 57

3.3.2.2 Giai đoạn chiết nước và xử lý dịch chiế t 59

3.3.2.3 Giai đoạn tinh chế 63

3.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM CHIẾT S F 67

3.4.1 Thử hoạt tính phá huyết 67

3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm 69

3.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm 69

KẾT LUẬN 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1 1: Camellia sp Theaceae) trồng tại Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) ( 8

Bảng 1 1: Kích thước, trọng lượng quả, hạt của cây Du trà Việt Nam [8] 11

Hình 1 2: Hạt Camellia sp (12/2005) 12

Bảng 1 2: Kết quả phân tích hạt Du trà và chất lượng dầu Du trà [8] 12

Hình 1 3: Khô dầu hạt Camellia sp Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005) 13

Bảng 1 3: So sánh hàm lượng saponin trong một số loài thực vật 14

Hình 1 4: Dạng cấu trúc phổ biến của hợp chất flavonoid 15

Hình 1 5: Sapotalen 17

Hình 1 6: Bốn cấu trúc aglycone chủ yếu của saponin triterpenoid pentancyclic 18

Hình 1 7: Cấu trúc aglycone của saponin triterpenoid tetracyclic 20

Hình 1 8: Một vài cấu trúc phổ biến của Saponin steroid 21

Hình 1 9: Các quá trì nh chính diễn ra trong chiết bằng dung môi 25

Hình 2 1: Khô dầu từ hạt Du trà Nghĩa Đàn Nghệ An (2005) - 34

Sơ đồ 2 1: Phân lập thu cao chiết bằng bộ soxhlet 38

Sơ đồ 2 2: Tách hỗn hợp S f từ cao chiết MeOH 39

Bảng 3 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu 42

Bảng 3 2: Xác định hàm lượng tinh bột 42

Bảng 3 3: Xác định hàm lượng chất béo 43

Bảng 3 4: Xác định hàm lượng saponin có trong dầu 43

Bảng 3 5: Định tính thành phần cao chiết từ khô Du trà 44

Hình 3 1: Thử phản ứng Lieberman –Burchard 44

Bảng 3 6: Xác định hàm lượng saponin, flavonoid toàn phần 45

Bảng 3 7: Saponin, flavonoid trong dầu và khô Du trà đã loại dầu 45

Bảng 3 8: Thời gian tan hoàn toàn (phút) trong dung môi ở các điểm nhiệt độ khác nhau (0,1g saponin/5ml dung môi) 46

Hình 3 2: So sánh thời gian hòa tan S f của một số dung môi phân cực 47

Bảng 3 9: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết tới hàm lượng thu hồi S f 48

Hình 3 3: Đồ thị mô tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 48

Bảng 3 10: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng S f thu được 49

Hình 3 4: Đồ thị mô tả hàm lượng thu hồi S f theo thời gian chiết 49

Bảng 3 11: Ma trận kế hoạch 23 51

Sơ đồ 3 1: Quy trình chiết tách hỗn hợp S f bằng methanol, quy mô 100g nguyên liệu/mẻ 52

Sơ đồ 3 2 : Quy trình chiết tách hỗn hợp S f bằng nước quy mô 100g nguyên liệu/mẻ , 53

Bảng 3 12 Kết quả tính toán phương sai 55

Hình 3 5: Kết quả tối ưu từ phẩm mềm Nemrodw 56

Bảng 3 13: Thông số quy trình chiết xuất S f từ khô Du trà 57

Bảng 3 14: Xử lý nguyên liệu có loại dầu và không loại dầu 58

Hình 3 6: Thử phá huyết mẫu dầu béo loại sau khi chiết nước 59

Bảng 3 15: So sánh việc xử lý màu bằng than hoạt tính 60

Sơ đồ 3 3: iai đoạn chiết nóng và xử lý dịch chiết G 62

Sơ đồ 3 4: Giai đoạn tinh chế cao chiết từ nước 64

Bảng 3 16: Tham số quy trình chiết xuất S f từ 2 kg khô Du trà 65

Sơ đồ 3 5: Quy trình hoàn thiện chiết xuất S f từ khô hạt Du trà 66

Bảng 3 17: Chi phí dung môi tiêu hao trong quy trình chiết xuất S f quy mô 2kg/mẻ (sơ đồ 3.5) 67

Hình 3 7: Vòng phá huyết của các mẫu sản phẩm chiết theo phương pháp đục giếng, nồng độ các chế phẩm 0,1g/5 ml 68

Hình 3 8: Vòng phá huyết theo phương pháp đặt giấy tẩm dung dịch S f chiết nước nồng độ 0,1 g/ 5 ml 68

Hình 3 9: Vòng kháng n ấm đối với chủng Candida albicans ATCC 10231 ở nồng độ Sf ức chế 1mg/ml và ở nồng độ 3mg/ml 69

MỞ ĐẦU

Từ hạt Camellia sp (tên thường gọi là Du trà), qua ép người ta thu được dầu Loại dầu này được sử dụng chủ yếu dùng sản xuất dầu thực phẩm Bã khô sau ép một phần người dân dùng làm chất xử lý hồ ao do có tác dụng diệt

cá tạp, có nơi đưa vào bổ sung làm thức ăn chăn nuôi, còn lại hầu như là bỏ

đi, không được chú ý đến Trong khi đó, ngành Lâm nghiệp đã đưa cây Du trà vào thành một trong những cây phủ xanh đất trống, đồi trọc và rừng phòng hộ nên nguồn bã khô là khá lớn

Trong một số nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới, người ta chỉ ra rằng bã khô sau ép có chứa một lượng khá dồi dào hợp chất có tên khoa học

là saponin Tuy nhiên, việc chiết xuất hợp chất saponin tinh khiết là rất khó khăn vì tính chất hóa lý phức tạp của chúng

Người ta cũng chứng minh được một số tác dụng có ý nghĩa của hợp chất này ví dụ như tác dụng kháng nấm, tác dụng phá huyết, tác dụng làm giảm cholesterol máu Đáng chú ý gần đây với đề tài thuộc chương trình nghiên cứu Khoa học cơ bản Nhà nước Hướng khoa học tự nhiên, mã số -

sự đã chiết xuất thu được hỗn hợp saponin v flavonoid gọi tên là Sà f và nghiên cứu về dược lý học và tác dụng (in vitro và in vivo) của Sf chiết xuất

từ khô Du trà Camellia Kết quả cho thấy hỗn hợp chất chiết thu được này có những tính chất có giá trị trong lĩnh vực y học Các kết quả nghiên cứu khẳng định hoạt chất Sf có tác dụng diệt nấm Candida albicans, một loại nấm bệnh

phụ khoa phổ biến Trong khi đó hoạt chất Sf lại không tiêu diệt nấm

Lactobacillus là một loại nấm có tác dụng ổn định độ pH trong phần kín của phụ nữ Hoạt chất Sf cũng ức chế được tinh trùng, làm cho tinh trùng không

di chuyển nhanh và dừng lại tại chỗ, không hoạt động được và chết Điều đó bảo đảm tinh trùng không còn khả năng tiếp cận được với trứng, không còn khả năng gây thụ thai Nghiên cứu này còn đi sâu vào tìm quy trình bào chế tạo thuốc kháng nấm và viên đặt âm đạo diệt tinh trùng ở người Ngoài ra, đề tài cũng đã tiến hành thử nghiệm sản xuất một số sản phẩm dược phẩm có sử dụng Sf là hoạt chất chính [15] Điều đặc biệt của nghiên cứu này là đã xác định được hỗn hợp Sf có chứa ngoài saponin là một số flavonoid Trong

nghiên cứu dược liệu để làm thuốc, có thể chiết đơn chất nhưng cũng thường

tác động hiệp đồng trong điều trị bệnh

Kế thừa kết quả nghiên cứu đó cùng với khả năng chiết tách từ bã khô

Du trà, vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình chiết tách phù hợp để khai thác saponin, flavonoid từ bã khô Du trà là hết sức có ý nghĩa cảtrong vấn đề trồng rừng, xóa đói giảm nghèo ở các vùng nông thôn cũng như góp phần tạo ra nguồn nguyên liệu quý cho ngành dược phẩm

Các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện của nhiều nhà khoa học cho thấy biện pháp chủ yếu để tách saponin từ bã khô dầu Du trà là sử dụng dung môi như nước, methanol, cồn hoặc dung dịch của chúng ở các tỷ lệ khác

năng áp dụng vào thực tế, quy mô chiết tách chỉ mang tính thăm dò trên một lượng rất nhỏ nguyên liệu hoặc là đi sâu vào nghiên cứu tác dụng của saponin, chứng minh tính năng quý của saponin Du trà đối với ngành dược Đã có những nghiên cứu về khả năng tách saponin từ bã khô Du trà Song hầu hết trong đó, chỉ tập trung xác định hàm lượng saponin trong nguyên liệu và đưa

ra một phác thảo về quy trình chiết tách với sự nghèo nàn các yếu tố công nghệ Và, cho đến nay, chưa có một quy trình công nghệ nào được áp dụng trên thực tế tại nước ta để thu được saponin với tính chất quý của nó từ bã khô

Du trà

Như vậy, vấn đề của đề tài này là xây dựng quy trình chiết tách saponin

từ bã khô Du trà có tính dễ thực hiện và trên quy mô nguyên liệu lớn, tiếp cận với thực tế sản xuất công nghiệp

Để giải quyết được vấn đề nghiên cứu trên, nhiệm vụ quan trọng của đề tài là tìm ra lời giải cho các câu hỏi nghiên cứu đặt ra dưới đây:

Khả năng chiết xuất hỗn hợp saponin từ khô Du trà của dung môi nước? Làm thế nào xây dựng được mô hình chiết tách có hiệu quả và có tính ứng dụng cao?

Chất lượng saponin thu được được đánh giá trên cơ sở nào?

Tuy nhiên trong điều kiện hạn chế của cơ sở vật chất nghiên cứu, đề tài hướng tới mục tiêu nghiên cứu sau

Mục tiêu nghiên cứu:

Để giải quyết các câu hỏi nghiên cứu nêu trên cũng như góp phần giải

quyết vấn đề nghiên cứu đặt ra, đề tài này được tiến hành nhằm mục tiêu

nghiên cứu óp phần xây dựng hoàn thiện quy trình chiết tách g Sf từ khô

dầu hạt Camellia sp

Nội dung nghiên cứu:

o Khảo sát nguyên liệu khô Du trà

o Xác định một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chiết tách

o Xây dựng quy trình chiết xuất Sf từ khô Du trà

o Xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm Sf

Việc nghiên cứu đề tài này có ý nghĩa quan trọng về khoa học cũng như thực tiễn Về mặt khoa học, đề tài góp phần chắt lọc và hoàn thiện quy trình công nghệ phù hợp với điều kiện và trình độ kỹ thuật của Việt Nam Về mặt thực tiễn, đề tài này cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu ở quy mô thử nghiệm, chuẩn bị cho quy mô công nghiệp Qua đó gián tiếp góp phần nâng cao giá trị cây Du trà, cải thiện cho người chăm sóc và thu hái, tạo ra nguồn dược liệu tốt phục vụ sản xuất thuốc phòng và chữa bệnh

Chương 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1 CAMELLIA SP (THEACEAE) VÀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU

1.1.1 Một số đặc điểm cơ bản của cây Camellia sp

Camellia sp (Theaceae) thuộc bộ Theales (thường được gọi là cây Du trà) là loại cây thân gỗ nhỏ, cao trung bình khoảng 3-5m, thân to khoảng 8-12cm, một gốc thường có từ 3-5 thân cây không phân biệt thân chính hay phụ

bố đều tạo thành nhiều dạng khác nhau: hình ô, hình trứng, hình nón, hình tháp, trụ Lá đơn mọc cách, cuống ngắn, mép lá có răng cưa nhỏ, hình dạng và kích thước lá khác nhau Qua nghiên cứu, tác giả Nguyễn Quang Khải và cộng sự đã kết luận rằng ngay trong cùng một loài Du trà đã có sự kh ác nhau

rõ rệt về hình dạng, màu sắc và kích thước của lá giữa nh ng cá thể cây khác ữ

nhau [8]

Hình 1 1: Camellia sp. (Theaceae) tr ồng tại Nghĩa Đàn, Nghệ An (2005)

Hoa Du trà thuộc loại lưỡng tính, màu trắng không có cuống Hoa có 5-7 tràng, 35-40 nhị màu vàng, bầu hạ thường có từ 3-4 ô Du trà ra hoa từ giữa tháng 10-12 hàng năm, hình thành mầm hoa vào mùa xuân và phân hoá rõ rệt vào tháng 5-6 Quả Du trà hình tròn, đầu hơi lõm hay thuôn dài, có loại quả giữa phình to, hai đầu hơi lõm Kích thước và trọng lượng quả khác nhau do một số giống Du trà và vùng trồng khác nhau Đường kính trung bình 3-6 cm,

độ dầy của vỏ từ 0.5 1cm Quả có nhiều hạt mầu nâu vàng hoặc nâu xám, khi chín có mầu nâu đen Nhân hạt có chứa dầu, theo nhiều tài liệu nghiên cứu thì hàm lượng khoảng 45 50% khối lượng nhân Dầu có dạng lỏng sánh, màu -vàng, không mùi, vị dịu ngọt [8]

-Có phân bố khá rộng ở vùng á nhiệt đới châu Á, Du trà có mặt tại các n

bắc Ở nước ta, Du trà đã được trồng đến vĩ tuyến 17o thuộc Vĩnh Linh, Cam Lộ

Loài cây này ưa khí hậu ấm và ẩm, nhiệt độ không khí bình quân năm từ

180-240C, chịu rét đến 2o-3oC Nó cần có nhiệt độ tháng giêng mát giúp cho việc tích lũy dầu của quả Tuy nhiên nó cũng có khả năng chịu được nhiệt độ cao của gió Lào nóng vào các tháng mùa hè Du trà ưa thích độ ẩm tương đối

ở thời kỳ ra hoa 65 70%, thời kỳ nuôi quả 80- -85% Lượng mưa năm thích

cây con dưới 2 năm cần che bóng nhẹ, cây lớn cần ánh sáng hoàn toàn mới ra hoa kết quả tốt Du trà sinh trưởng tốt ở vùng đồi có độ cao dưới 500 mét so với mực nước biển

Một đặc điểm sinh thái rất quan trọng đó là cây Du trà không kén đất, sống được trên các vùng đất bạc màu, đất trống đồi trọc, đất thoái hóa khô cằn Cây sinh trưởng ra hoa kết quả tốt ở các loại đất nâu vàng, đỏ vàng, vàng

đỏ trên các loại đá mẹ phiến thạch sét, sa phiến thạch, ryôlit như ở Lạng Sơn, trên đất đỏ bazan vùng Vĩnh Linh Quảng Trị, trên đất cát cố định nh- ư Vĩnh

đất dày 50cm, tỷ lệ mùn trong đất trên 1%[29]

Cây Du trà có rễ cọc đâm sâu tới 1,5m tùy theo loại đất trồng, có hệ rễ bàng phân nhánh và phát triển mạnh thường phân bố ở độ sâu từ 20-40cm Chiều dài rễ bàng trung bình từ 3 3,5m Ngoài ra, còn có rễ cám phát triển -

dày đặc ngay trên mặt đất Do đó, cây Du trà được chọn là một trong các loại cây trồng rừng phòng hộ, chống xói mòn, phủ xanh đất trống đồi trọc.

Du trà có khả năng tái sinh hạt và chồi trong đó tái sinh chồi rất mạnh

Nó sinh trưởng ch m trong những năm đầu (1 4 năm) và mức độ sinh trưởng ậ nhanh hơn từ năm thứ 5 Cây trồng trên đất tốt sau 5 năm bắt đầu ra hoa kết quả nhưng sản lượng quả và hạt chỉ ổn định khi rừng Du trà đạt từ 15 năm trở

-đi Cây sống lâu năm vẫn cho thu hoạch quả lâu dài nhưng cần phải quản lý chăm sóc và nuôi dưỡng đều đặn hàng năm nếu không rất dễ hoang hóa

Ở nước ta, các nhà khoa học đã xác định được hai loài Du trà phân bố tự nhiên và được trồng chủ yếu là Camellia oleifera Abel và Camellia sasanqua

Thunb Trong đó, loài C oleifera Abel hay Camellia drupifera Lour, còn

có tên địa phương là sở Chè, phân bố và trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Thanh Hóa, Nghệ An đến Huế Tại mỗi địa phương, nhân dân gọi Du trà bằng các tên khác nhau như trà mai, sở, sở dầu, chè dầu, mắc cà dầu…Ở vùng Nghĩa Đàn, Nghệ An, có rừng Du trà 30 năm tuổi được xác định là thuộc loài C sasanqua Thunb hay thường gọi là Sở Chè [8] Tuy nhiên, nhà thực vật học

Đỗ Huy Bích (Viện Dược liệu) lại xác định rằng đó là loài sở Chè Camellia drupifera Lour [18]

Nguyên liệu khô Du trà dùng trong luận văn nghiên cứu này được chúng tôi thu nhận từ vùng Nghĩa Đàn Đây là một huyện miền núi phía Tây Bắctỉnh Nghệ An với 30.000 ha đất lâm nghiệp trong đó có tới 14.008 ha đất trống đồi núi trọc Cây Du trà có mặt tại đây từ năm 1968 và được trồng tập trung Tuy nhiên do chưa có nhiều hiểu biết về khả năng phòng hộ và giá trị kinh tế của nó nên sau đó diện tích đã trồng bị chặt bỏ gần hết Đến nay chỉ còn 15 ha Du trà hơn 30 năm tuổi, còn lại là khoảng 1670 ha trồng mới từ những năm 1997 Qua theo dõi của ngành nông nghiệp tỉnh, cây Du trà sau khi trồng đến năm thứ 4 cho quả bói, năm thứ 7 bắt đầu cho thu hoạch khoảng 1 1.5 tấn hạt/ha Nếu chăm sóc đúng kỹ thuật, đến năm thứ 10 có thể -cho sản lượng 2.5-3 tấn hạ/ha [4]

Trong những năm tới, diện tích trồng Du trà theo dự kiến sẽ lớn hơn rất nhiều Vì vậy, vấn đề nâng cao giá trị kinh tế từ cây Du trà là hết sức có ý

nghĩa góp phần tăng nhanh diện tích trồng và chăm sóc rừng cây Du trà vừa ,

có giá trị phòng hộ, môi trường vừa giúp người dân các vùng miền núi có cơ hội cải thiện đời sống

1.1.2 Hạt và khô dầu từ hạt Camellia sp

Quả Du trà có hình dạng tròn hơi thuôn dài hay dẹt ở cuống và đuôi quả Tuy nhiên, cũng giống như đối với lá, quả Du trà cũng có sự khác nhau về hình dạng, kích thước, trọng lượng và tỷ lệ hạt quả

Loài và xuất

xứ

Kích thước quả (cm)

Trọng lượng 100 quả tươi (g) hạt/quả Tỷ lệ

tươi

Tr.lượng

1000 hạt khô (g)

Hình dạng quả Đ.kính C.dài Quả tươi Hạt tươi

(C oleifera) 4.6 5.0 4560 2100 46.1 1000 Tròn đều, vỏ dày

Ghi chú: NĐ: Nghĩa Đàn (Nghệ An) QB: Quảng Bình

VL: Vĩnh Linh (Quảng Trị) LS: Lạng Sơn

Nếu hạt Du trà có độ chắc cao (nội nhũ hạt dày, hạt căng đều, vỏ hạt láng bóng…) sẽ cho trọng lượng 1000 hạt cao Qua bảng số liệu có thể thấy trọng lượng 1000 hạt ở sở Chè cao hơn so với sở Quýt Thực tế cho thấy không phải kích thước hạt lớn hay nhỏ mà chính do độ đầy đặn của nội nhũ hay độ chắc của hạt quyết định đến trọng lượng 1000 hạt

Thu hoạch là khâu quan trọng trong phát triển kinh tế trồng rừng Du trà, thu hoạch đúng thời vụ, bảo quản tốt sau thu hoạch và chế biến kịp thời sẽ đem lại năng suất và chất lượng thành phẩm từ hạt một cách rõ rệt Mùa thu

hoạch hạt Du trà thường từ tháng 9 đến tháng 10 hàng năm Trong quá trình chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang màu vàng và khi chuyển thành màu vàng nâu là có thể thu hái được Thu hái ngay trên cây là tốt nhất Nếu thu hái trên cây, quả đem về phải phơi nắng (khoảng 4 5 nắng)- để hạt tự tách ra

cm theo đường đồng mức, quả chín rụng hạt rồi thu nhặt

Hình 1 2 : Hạt Camellia sp (12/2005)

Hạt thu về cần được phơi nắng khoảng 5 6 nắng trên nền ximăng là tốt

quản nơi khô mát để đảm bảo chất lượng dầu ép cũng như thành phần của bã

Hàm

ẩm (%)

Tỷ trọng

Độ chiết quang

15 o C

Chỉ số Iod (mgI 2 /g dầu)

Chỉ số xà phòng hóa

Vỏ (%)

Nhân ( %)

Du trà Việt Nam 35.27 64.73 44.2 9.7 0.92 1.467 78.5 189

Du trà Trung Quốc 39.42 60.58 44.0 9.4 0.92 1.467 74.6 187

(*) : Hạt thu từ một số cây Du trà 4.5 tuổi trồng tại Hậu Lộc, Thanh Hóa

Hàm lượng dầu trong hạt Du trà là rất cao (khoảng 40% đến 50%) so với trong đậu tương chỉ khoảng 20% Dầu từ các loài Camellia được đánh giá có chất lượng không kém dầu ôliu và có thành phần chất béo chủ yếu là axít oleic chiếm hơn 88% [31] Chính vì vậy, từ trước đến nay, chủ yếu người ta quan tâm tới việc ép hạt thu lấy dầu rồi xử lý làm dầu ăn thực vật hoặc ứng dụng trong công nghiệp sơn, công nghiệp mỹ phẩm Nó cũng là loại dầu ăn chính của người dân các tỉnh miền nam Trung Quốc như ở Hoa Nam, hơn 50% dầu thực vật sử dụng là từ Camellia Có tác giả đã xác định được trong

dầu Du trà thuộc loài C oleifera Abel có một lượng chất sesamin (CTPT:

C20H18O6) thuộc nhóm lignan, một nhóm chất được coi là phytoestrogene.Hirose và cộng sự (1991), Hirata và cộng sự (1996) chứng minh in vitro và in vivo rằng sesamin có hoạt tính chống ôxy hóa, ngăn chặn sự hình thành của gốc tự do tăng cường trao đổi lipid, làm giảm cholesterol có tác dụng tốt cho , hoạt động của tim [24]

Hình 1 3: hô K dầu hạt Camellia sp Nghĩa Đàn, Nghệ An (200 5)

Sau khi ép dầu, phần bã ép được gọi là khô Du trà, , là chất thải thường

bỏ đi gây hại tới môi trường, ô nhiễm không khí và đồng thời là một sự lãng phí Một tấn hạt cho khoảng 240 kg dầu béo và khoảng 500 kg bã khô dầu Trong khô Du trà có một lượng khá phong phú các hợp chất có hoạt tính sinh học như các alcaloid, flavonoid, glucoside, polyphenol Đặc biệt, khô Du trà

có một lượng khá cao hợp chất saponin Theo tác giả Đinh Ngọc Thức [18],

hàm lượng hỗn hợp saponin thu được có trong khô Du trà Nghĩa Đàn chiếm khoảng 7,17% khối lượng khô tuyệt đối ông bố của một số tác giả cho rằng Ckhô hạt Du trà (loài Camellia oleifera Abel) hàm lượng saponin chiếm từ 11-

15% [28] Cũng có tác giả đưa ra kết quả nghiên cứu trên khô Du trà cho thấy

hàm lượng saponin thô chiếm tới 20,4% [5] Cần chú ý rằng, ngoài saponin, hỗn hợp bột chiết thu được còn chứa nhiều chất khác như flavonoid

Có thể thấy rằng hàm lượng saponin trong khô Du trà là khá cao [ ] 1,6

Panax ginseng Nhân sâm - (củ) 3,5

Delavaya toxocarpa French (lá) 1,27

Ardisia sylvestris Pitard (lá) 1.21

Camellia spp - Du trà (khô dầu) 7-8

Như vậy, việc khai thác saponin từ khô Du trà có khả năng cho sản lượng cao, là một hướng đi đúng đắn, cần được nghiên cứu ứng dụng để bào chế các loại thuốc hoặc sử dụng làm phụ gia trong công nghiệp như sơn, verni, chất hoạt động bề mặt Ngoài tác dụng của saponin, còn có tác dụng của một số hợp chất có hoạt tính khác đặc biệt là flavonoid Trong nghiên cứu

về khô Du trà, tác giả Phạm Trương Thị Thọ cũng xác định rằng hỗn hợp chấtchiết thu được có chứa saponin và flavonoid trong đó hàm lượng saponin chiếm tỷ lệ lớn nhất, và gọi tên là hỗn hợp Sf

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật Chúng là những hợp chất phenol tạo màu cho thực vật với cấu trúc cơ bản

gồm 15 nguyên tử C Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự

do hoặc đã thay thế một phần tạo glycoside, hay kết hợp với protein Vì thế flavonoid có bản chất là các phenol có tính axít Khác với các hợp chất tạo màu carotenoid, glycoside của flavonoid tan được trong nước [21]

Người ta coi các flavonoid là dẫn xuất của croman và cromon thuộc nhóm chất phenyl propan vì chúng có chứa khung carbon C6 –C3

5 6

2 3

5 6

2 3

5'

1' 6'

8 7

5 6

2 3

O

1

4

3' 4' 2'

5'

1' 6'

OH

8 7

5 6

2 3

O+

1

4

3' 4' 2'

5'

1' 6'

OH

Hình 1 4: Dạng cấu trúc phổ biến của hợp chất flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng rãi trong thiên nhiên ở thực vật bậc cao, với hơn 2000 hợp chất đã được biết rõ cấu trúc Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của thực vật bậc cao như hoa, lá, quả, rễ, gỗ và khu trú ở thành tế bào Ngoài vai trò là chất tạo màu sắc cho cây hấp dẫn các loài động vật có ích đảm bảo sự sinh tồn và phát triển hoa quả, chúng còn đóng vai trò sinh lý quan trọng Chúng gây ức chế hay kích thích sinh trưởng của thực vật, hòa tan các chất để dễ dàng đi qua các màng sinh lý, có tác dụng như một chất chống oxy hóa, bảo vệ axít ascorbic, ức chế enzyme và các chất độc của cây Một số flavonoid không màu trong lá cây làm mất cảm giác ngon cho động vật ăn cỏ do đó bảo vệ cây phát triển bình thường[16]

Đối với y học, nhiều hợp chất flavonoid ít độc đối với cơ thể sống, có tác dụng sinh học quan trọng, đặc biệt là tác dụng dọn gốc tự do và chống oxy hóa đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới rất quan tâm nghiên cứu Các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch hiện đang được sử dụng đều rất đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm như diệt tế bào máu, tế bào miễn dịch và tế bào niêm mạc ruột Nhiều flavonoid còn có tác dụng kháng khuẩn, tác dụng nâng cao tính bền của thành mạch máu Ngoài ra, một số flavonoid có những tác dụng khác như chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, dãn mạch và phế quản, lợi mật và diệt nấm Khi chiết nguyên liệu thực vật bằng cồn hoặc nước, các flavonoid sẽ vào dịch chiết cùng với các glucoside, tanin, đường… Với cấu trúc rất đa dạng và phong phú, việc tác loại chúng ra khỏi dịch chiết là công việc gặp nhiều khó khăn

1.3 HỢP CHẤT SAPONIN

1.3.1 Khái niệm chung về saponin

Saponin là một nhóm hợp chất glucoside tự nhiên thường gặp trong thực vật, có một số tính chất chung như khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có tính nhũ hóa, có tính chất phá huyết, tạo phức khi kết hợp với cholesterol Ngoài ra, chúng còn làm kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi và có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có tác dụng long đờm, lợi tiểu Người ta cũng nhận thấy saponin độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá loài cá do nó làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô h p khiến cho cơấ thể mất các chất điện giải cần thiết [17]

Người ta chia saponin ra thành 2 nhóm lớn dựa trên cấu trúc phân tử Đó

là các saponin triterpenoid và saponin steroid Phân tử saponin được cấu tạo

từ hai phần: phần cấu trúc triterpenoid hoặc steroid được gọi là aglycone (còn gọi là sapogenin) và được liên kết với phần đường Dưới tác dụng của enzim của thực vật hoặc vi khuẩn hay axit loãng, saponin thuỷ phân tạo thành 2 phần này Phần đường có thể là một vài phân tử đường hoặc nhiều hơn Các đường phổ biến là D-glucoza, D galactoza, L arabinoza, axit galactunoic, axit D -

glucuronic [16]

Saponin có loại acid, trung tính hoặc kiềm yếu Trong đó, saponin triterpenoid thường là trung tính hoặc acid (phân tử có nhóm COOH) Saponin steroid nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glycoalcaloid thuộc loại kiềm.

Các saponin đều là các chất hoạt quang Thường các steroid saponin thì

tả truyền (L)còn triterpenoid saponin thì hữu truyền (D) Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao, từ 2000C trở lên và có thể tới trên 3000C

Saponin có vị đắng, khó chịu, thường ở dạng vô định hình Chúng tan trong nước, cồn loãng, và rượu methylic, khó tan trong cồn cao độ, rất ít tan trong các dung môi khác (ether, acetone, hexane) do đó có thể làm kết tủa saponin trong quá trình chiết xuất Do có phân tử lớn nên saponin cũng khó bị thẩm tích

Chỉ riêng đối với nhóm saponin triterpenoid, người ta đã xác định được tới

750 dạng saponin với 360 cấu trúc aglycone [30]

1.3.2 Phân loại

Dựa vào cấu trúc hóa học của phần aglycone, người ta phân biệt saponin thành hai nhóm chính như nêu trên

1.3.2.1 Saponin triterpenoid

Phần aglycone của nhóm saponin này là triterpenoid có một khung

học và được chia thành hai nhóm dựa trên số lượng vòng hydrocarbon:

- Saponin triterpenoid pentacyclic (STP);

- Saponin triterpenoid tetracyclic (STT)

Các saponin triterpenoid khi

deshydrogen hóa với selen thì cho hỗn hợp

các dẫn xuất na apht len và phenanthren,

chủ yếu là sapotalen (1,2,7 trimethyl

Mạch đường càng lớn thì khả năng hòa tan của nhóm saponin này càng tăng trong các dung môi phân cực Chúng thường là các hợp chất trung tính, một số thể hiện tính axít yếu do có mặt nhóm carboxyl ở phần sapogenin.

Ở thực vật, các saponin triterpenoid được sinh tổng hợp trên nguyên tắc đóng vòng qualen Người ta đã tìm thấy chúng trong khoảng 70 họ thực vật, phần lớn là loài 2 lá mầm và chúng tồn tại ở dạng hòa tan trong dịch tế bào

1.3.2.1.1 Saponin triterpenoid pentacyclic

tử C và 8-9 nguyên tử C thuộc nhóm CH3 Chúng gồm 4 loại cấu trúc gọi là oleane, ursan , lupan và hopan (hình 1e e e 5)

10 5 1

4

2 3

9 8

6 7

11 12

14 13

15 16

18 17

19 22 21

H3

29

10 5 1

4

2

3

9 8

6 7

11 12

14 13

15 16

18 17

19 20

22 21

H H

10 5 1

4

2

3

9 8

6 7

11 12

14 13

15 16

18 17

19 20

22 21

H

10 5 1

4

2 3

8 7 9

6

13 14

12

16 18

15

21

20 19

Nhóm oleane đặc trưng với sự có mặt của 2 nhóm chức CH3 ở các vị trí

C20 Đây là nhóm saponin quan trọng và chiếm hầu hết so với các STP khác,

đặc biệt là β-amyrin Cấu trúc của oleane gồm 5 vòng A, B, C, D và E Các phân tử đường thường gắn ở C3, C22, C28, C29 Vị trí ở C3 luôn có một nhónm

OH và phần đường thường nối vào đó theo dây nối acetal để tạo thành glycoside Nếu có thêm một mạch đường thứ hai trong phân tử (loại bidesmosid) thì mạch này thường gắn vào C28 theo dây nối ester nếu ở đó là nhóm COOH Một điều đáng lưu ý là đa số các aglycone nhóm oleane đều có một nối đôi ở C12

Nhóm ursane rất ít gặp trong tự nhiên, có cấu trúc tương tự như oleane,

gắn vào vị trí 19 Các aglycone thuộc nhóm này thường là dẫn chất của βamyrin (3β-hydroxy- -12 en)

-Nhóm lupane ít gặp trong tự nhiên, chủ yếu ở một số cây thuộc các chi

Menyanthes, Melodinis, Melaleuca, Betula Cấu trúc có 5 vòng trong đó vòng

E là vòng 5 cạnh., C20 nằm ngoài vòng Đa số đều có nối đôi ∆20(29)

Nhóm hopane cũng hiếm gặp, được tìm thấy trong loại cỏ thảm Mollugo

hirta L Cấu trúc tương tự như lupane nhưng nguyên tử C22 nằm ngoài vòng

và không có nhóm methyl gắn ở C17

Ngoài các cấu trúc trên, còn thấy một vài STP có cấu trúc không đủ 30

C, đó là dẫn chất nor triterpenoid như axít nor rjunolic có trong vỏ quả cây - -aMộc thông Akebia quinata

1.3.2.1.2 Saponin triterpenoid tetracyclic

Nhóm saponin bốn vòng này chiếm số lượng không nhiều trong tự nhiên, nhưng đều là những sapogenin quan trọng Đáng chú ý nhất là dạng dammaran trong họ Nhân sâm và các cucurbitain trong họ bầu bí (Cucurbitaceae) Phần aglycone của nhóm này được chia thành 3 nhóm chủ yếu là dammaran, cucurbitan và lanostan

30 18

28 29

15

17 16 19

H

H

H 20

22 21

23

24 25 26

27

5 1

4

2

3

9 8

6 7

11 12

14

13

15

17 16

20

22 23

27

24 25 26 21

4

2 3

9 8

6 7

11 12

14 13

30

28 29

15

17 16

Hình 1 7: Cấu trúc aglycone của saponin triterpenoid tetracyclic

Nhóm dammaran có cấu trúc 4 vòng và một mạch nhánh Các cây thuộc

chi Panax, họ Araliacea (đặc biệt là cây Nhân sâm Triều Tiên, sâm Ngọc

Linh Việt Nam) có chứa rất nhiều hợp chất saponin thuộc nhóm này và đã được nghiên cứu rất chi tiết về cấu trúc và tác dụng của chúng Ngoài ra, người ta cũng thấy có trong hạt táo Zizyphus jujuba Lamk, trong cây Rau

đắng biển Bacopa monniera

Nhóm lanostan được tìm ra trong các loài thuộc ngành Da gai

ít saponin được tìm thấy trong các loài không phải là thực vật Chúng có tính phá huyết còn mạnh hơn saponin thực vật

Nhóm cucurbitan là những chất đắng, phần lớn gặp trong họ

Cucurbitaceae và họ Apiaceae Nhóm chất này tồn tại chủ yếu ở dạng tự do,

một số ít ở dạng glycoside

1.3.2.2 Saponin steroid

Saponin steroid khác với triterpenoid được gặp chủ yếu ở những cây 1 lá

Zingiberaceae,…ngoại trừ một số loài 2 lá mầm như Cà Solanaceae, Hoa

mõm sói Scrophulariaceae Nguồnquan trọng nhất để tổng hợp các saponin

này là các sterol như cholesterol và sitosterol

Nhân steroid trong saponin lần đầu tiên được làm sáng tỏ vào năm 1935

được 3’-methyl (1:2) cyclopentenophenanthren do Jacobs và Simpson thực hiện Các nghiên cứu sau này chứng minh rằng khi deshydrogen hóa các sapogenin steroid bằng selen thu được hydrocarbon của các dien

Aglycone của nhóm này cấu trúc bằng khung stero tiêu biểu với 27 id

chung một nguyên tử C22 Phần lớn các saponin steroid phân lập trong tự nhiên đều có vòng F là hydropyran Tuy vậy, cũng xác định được một số saponin steroid có vòng F mở và nhóm alcol bậc 1 ở C26 lại được nối với glucose Phần đường thường gắn với vòng A tại nhóm OH ở các vị trí C1, C2,

và C3

Tùy theo cấu trúc của mạch nhánh mà người ta xếp thành các nhóm saunhư spirostanol glycoside, furostanol glycoside và steriodal alkaloid (glucoal aloid).k Cấu trúc mạch nhánh thì rất phức tạp và tồn tại nhiều cách giải thích khác nhau

13 14 9

8 10

17 12 11

15 16

7 5

20 22 O

25 24 26

23 O

27 21

H H

13 14 9 8 10

17 12 11

15 16

7 5 6

18

19 1

4

2 3

20 22 O

21 23 24

25 26

27 H

H

H H

H

Spirosolane

10 5 1

4

2 3

9 8

6 7

11 12

14 13 15

17 16

20

O

29 22

N H

28

23 27

H

Hình 1 8: Một vài cấu trúc phổ biến của Saponin steroid

Saponin spirostanol ngoài nhân steroid còn có mạch nhánh thể hiện ở đặc điểm có sự tạo thành mạch 8 C có chứa các nguyên tử O Thường xuất hiện nối đôi ở C5, đôi khi ở C9 và C25

Saponin furostanol có vòng F mở, phần đường gắn ở vị trí C3 và có cả ở

vị trí C26 nên cũng gọi là bidesmosid Khi thủy phân bằng enzyme cắt bớy phân tử đường ở C26 này, vòng F sẽ đóng lại và thu được saponin spirostanol Saponin furostanol không tạo phức với cholesterol do đó không có tính phá huyết Chúng cũng không có tính kháng khuẩn như các saponin khác Do đó, người ta cho rằng chúng là tiền chất sinh ra các spirostan

Nhóm spirosolanol có cấu trúc hóa học gần giống với nhóm spirostanol chỉ khác ở nguyên tử O vòng F thay bằng nguyên tử N Một điểm khác nữa là các spirostanol không có dạng isomer ở C22 nhưng ở nhóm spirosolanol thì

có

Nhóm solanidanol mà điển hình là solanidin phân lập trong khoai tây có hai vòng E và F chung nhau bởi một C và 1 dị tố N Chúng vừa mang tính chất của một alkaloid vừa là một saponin

Các nhà khoa học cũng phân lập được một loại glycoalkaloid từ cây

Solanum paniculatum là jurubin và được xếp vào nhóm aminofurostanol

Chúng có cấu trúc giống nhóm furostan nhưng khác ở chỗ nhóm NH2 thay chỗ cho nhóm OH ở vị trí C3 Vòng F cũng mở và nối với đường glucose Chất này khó kết tinh, không phá huyết và không tạo phức với cholesterol

1.3.3 Một vài nghiên cứu gần đây về saponin

saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (25) (thu suất khoảng 5% và chiếm phân nửa lượng saponin toàn phần)

Thành phần đặc biệt này đã giúp Sâm Việt Nam trở thành một loài Panax độc đáo không những về mặt hoá phân loại mà còn về mặt dược lý Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy Sâm Việt Nam có những tác dụng rất giống Nhân sâm Ngoài ra, nó còn có tác động kháng khuẩn đáng kể đối với các loài Streptococci bệnh lý và có tác dụng tốt với chứng viêm họng Các

thử nghiệm dược lý cho thấy majonosi R2, saponin chủ yếu của Sâm Việt Nam, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tiến chống ung thư quan trọng Cấu trúc của các saponin mới trong Sâm Việt Nam còn giúp giải thích quá trình sinh tổng hợp các triterpen dammaran trong thực vật [7]

d-Nhiều nghiên cứu chỉ ra vai trò của saponin trong việc chống lại vi sinh vật gây bệnh Chính saponin là tiền tố có vai trò ngăn chặn bước đầu sự nhiễm độc hay nói cách khác là phương tiện phòng thủ đầu tiên của nhiều loài thực vật Tuy nhiên cơ chế chống nấm, kháng khuẩn cho đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ [26]

Từ loài Campanula lactiflora, các nhà nghiên cứu thuộc Đại học

Karadeniz Technical và Đại học Sakarya (Thổ Nhĩ Kỳ) đã phân tách được 2 hợp chất vòng saponin mà được xác định có phần aglycone là axít 13,14-epoxy 3,8,12,15 tetrahydroxy- - -(17E,21E)-17,21-campanuldien-30-oic và axít13,14-epoxy 3,8,12- -trihydroxy (17- E,21E)-17,21-campanuldien-30-oic Đểthu đư c các saponin này, ngượ ời ta đã tiến hành chiế ầt l n lư t b ng dung môi ợ ằchloroform và methanol từ bột lá khô Tuy nhiên, kỹ thuật này không được

mô tả chi tiết [35]

Trong khi đó, từ cây đậu ván dại, người ta đã chiết tách các thành phần glycoside, digoxin và saponin nhờ hệ thống Soxhlet với các dung môi là methanol và methanol:nước (80% MeOH) Kết quả cho thấy hiệu quả chiết tách là tương tự như nhau đối với 2 hệ dung môi này Ngoài ra, hiệu suất tách khi tiến hành ở quy mô nhỏ được khẳng định là cao hơn so với quá trình chiết tách ở quy mô lớn rất nhiều Thời gian chiết được cố định là 2 (h) và 3,5 (h)

Từ dịch chiết thu được, người ta phân tách thu được hợp chất saponin và đặt tên thương mại là Atragaloside I VII và được xác định là một triterpenoid có -tác dụng chống oxy hóa Chế phẩm này hiện được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược [23]

Một nghiên cứu rất lý thú về ứng dụng saponin vào chế phẩm vaccine chống bệnh lở mồm long móng ở gia súc được tiến hành bởi E Smitsaart và cộng sự Các test được tiến hành trên 109 con bò dòng Hereford 18-24 tháng tuổi, 22 con lợn giòng Duroc Jersey 60 ngày tuổi và 30 con 30 ngày tuổi, 35 con bò cái đẻ Các kết quả cho thấy việc thêm saponin vào chế phẩm vaccine chống lở mồm long móng đem lại khả năng miễn dịch cao, liên tục và lâu dài Kiểm tra cũng cho thấy không có bất kỳ tác dụng phụ nào và có thể dùng để tiêm phòng khẩn cấp trong trường hợp xảy ra dịch mà hiệu quả kháng vẫn đạt được yêu cầu Đây là một thông tin rất có ý nghĩa trong tình hình các dịch bệnh trên gia súc gia cầm liên tục bùng phát như hiện nay, mở ra triển vọng ứng dụng vào phòng chống dịch bệnh [36]

Trong nghiên cứu khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết từ hạt của loài Picralima nitida (loài phổ biến có ở Nigeria), Nkene và Iroegbu

đã tiến hành chiết tách theo phương pháp ngâm chiết trong các hệ dung môi khác nhau là ethanol, benzen, chlorform, và nước lạnh ở nhiệt độ 27oC trong 18h và nước nóng (100oC) trong 2h Sau đó dịch chiết thu được để thử các phản ứng định tính alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, glycoside và protein Tiếp đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Kết quả cho thấy dịch chiết từ nước lạnh có hàm lượng chất khô lớn nhất (6.8%) rồi đến nước nóng và ethanol Thành phần dịch chiết trong cả ethanol, nước nóng và lạnh là tương đồng bao gồm các alcaloid, saponin, steroid, tanin, flavonoid, protein và terpenoid Đặc biệt, trong nước nóng và nước lạnh, phản ứng định tính saponin là rất rõ rệt

Qua thử trên 5 chủng vi sinh (S aureus ATCC 12600, P aeruginosa

ATCC 10145, E coli ATCC 11775, B subtilis ATCC 6051 và Salmonella kintambo Human), kết quả cho thấy dịch chiết từ benzen và chloroform không

có tác dụng nào Trong khi đó dịch chiết từ ethanol cho kết quả kháng tốt nhất, còn 2 dịch chiết từ nước nóng và lạnh cũng cho kết quả rõ rệt và tương

tự nhau [34]

Như vậy, có thể thấy rằng saponin chiết xuất có khả năng ứng dụng cao trong đời sống đặc biệt là lĩnh vực y học phục vụ con người Tìm kiếm nguồn nguyên liệu giàu hoạt chất này và khai thác nó là một hướng đi có ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả

1.4 CHIẾT XUẤT

Chiết rắn-lỏng là một quá trình phân tách dưới tác dụng của một dung môi lỏng để chuyển chất tan từ pha rắn sang pha lỏng Để tách các hợp chất ra khỏi nguyên liệu rắn ban đầu, thông thường người ta sử dụng các dung môi để hòa tan chất cần tách (trích ly chất rắn) Sau đó sẽ loại bỏ dung môi và thu hồi chất cần tách Trong quá trình chiết, nồng độ chất tan trong pha rắn thay đổi không ngừng Một chuỗi các hiện tượng xảy ra do tương tác giữa chất tan chứa trong phần tử pha rắn và dung môi gây ra sự phân tách bao gồm:

- Sự xâm nhập của dung môi vào mạng lưới pha rắn;

- Sự hòa tan và/hoặc phá vỡ các hợp phần;

- Chuyển chất tan ra bề mặt ngoài mạng lưới pha rắn;

- Sự xâm nhập chất tan từ bề mặt ngoài mạng pha rắn vào pha lỏng;

- Chuyển dịch pha lỏng đối với pha rắn và tách pha lỏng khỏi pha rắn Quá trình chuyển chất với tốc độ được biểu diễn dưới dạng khối lượng chất chiết trên một đơn vị thời gian hoặc rõ hơn là sự thay đổi nồng độ chất chiết trong pha rắn trên một đơn vị thời gian Mỗi giai đoạn kể trên có tốc độ khác nhau và trong một chuỗi các giai đoạn tiếp nhau đó, tốc độ chung của quá trình chiết được xác định bởi giai đoạn nào có tốc độ nhỏ nhất [25]

Hình 1 9: Các quá trình chính diễn ra trong chiết bằng dung môi

Muốn chiết một chất ra khỏi một chất khác ta phải chọn dung môi chiết

có độ hòa tan nhiều hơn chất kia Có một lượng dung môi xác định dùng để chiết không nên chiết một lần mà phải chia ra nhiều lần để chiết có hiệu quả hơn Dung môi dùng để chiết thường là các hợp chất hữu cơ như diethyl ether, benzen, ether dầu hỏa, xăng, ester, chloroform, ethyl acetate, methanol, ethanol và nước

Dung môi là yếu tố rất quan trọng trong quá trình chiết xuất Việc lựa chọn dung môi dựa trên một số tính chất sau:

o Khả năng thu hồi, tái sử dụng trong những quá trình chiết sau đó;

o Sức căng bề mặt và độ nhớt Dung môi cần có khả năng thấm ướt nguyên liệu và có độ nhớt không cao tránh ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất;

cháy nổ, không gây hại tới môi trường và rẻ

Tinh chế dịch chiết thô là cần thiết nhất là đối với dịch chiết cồn nhằm mục đích cải thiện tính chất oxy hóa và thu được sản phẩm có mùi, vị và màu tươi sáng phù hợp với mục đích sử dụng sau này Chưng cất chân không và chưng phân tử là những biện pháp hiệu quả mặc dù chúng có thể ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với nhiệt của bản chất sản phẩm Việc loại bỏ các thành phần không mong muốn như lipid, carotenoid và các chất tan trong dầu có thể được tiến hành bằng cách rửa dịch cô đặc với một dung môi phù hợp như hexane Việc tách hoạt chất có thể đạt được bằng cách cất đuổi dung môi trong điều kiện áp suất giảm, hòa tan phần cao sệt thu được bằng nước và trích ly bằng ethyl ether Chloroform cũng được dùng để loại bỏ caffeine hay các sắc tố từ dịch chiết nước của flavonoid như đối với dịch chiết chè Cũng

có thể dùng một lượng ethyl acetate để thu được phần chiết giàu flavonoid hay các hợp chất tương tự

Phân đoạn các lớp chất bằng cột sắc ký lỏng để tinh chế dịch chiết là một phương pháp rất phù hợp và có hiệu quả, nhưng có hạn chế để áp dụng trên quy mô lớn do vấn đề kinh tế, giá thành Vì vậy, phương pháp này thường chỉ

sử dụng ở quy mô nhỏ trong các phong thí nghiệm Một biện pháp khác là sử

dụng màng phân tách, thường được áp dụng với dịch chiết trà xanh bằng dung dịch cồn Màng phân tách chủ yếu loại bỏ caffein từ nhóm chất polyphenol của catechin, là thành phần chống oxy hóa chủ yếu có trong chè Nồng độ cồn ảnh hưởng tới hiệu quả của lọc phân tử và cho thấy ở nồng độ cồn cao (80%), lượng catechin được giữ lại cao hơn và tách triệt để caffeine hơn [25]

1.4.1 Một số quá trình biến đổi chính trong quá trình chiết xuất

Nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau Dung môi thấm vào nguyên liệu, các chất trong tế bào nguyên liệu hòa tan vào dung môi rồi khuếch tán ra ngoài tế bào Các quá trình chính diễn ra là khuếch tán, thẩm thấu và thẩm

tích 9 1] [1 , 2

1.4.1.1 Khuếch tán

Hiện tượng khuếch tán là hiện tượng di chuyển vật chất có bản chất là sự chuyển động nhiệt hỗn loạn của các phân tử không có phương ưu tiên dẫn tới trạng thái cân bằng nồng độ, là trạng thái có xác suất nhiệt động cực đại hoặc

có entropi cực đại khi không có tương tác với môi trường ngoài

Khuếch tán phân tử:

Các phân tử luôn luôn chuyển động hỗn loạn và va chạm vào nhau, cho nên khi ta để hai tập hợp phân tử lại gần nhau dù chúng ở thể rắn, lỏng hay khí chúng cũng chuyển động ngẫu nhiên xuyên lẫn vào nhau Ðó là hiện tượng khuếch tán phân tử

Do sự cản trở của pha này với pha kia nên vùng tiếp xúc giữa hai pha xuất hiện một lớp màng, với chế độ chuyển dòng Quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và tác dụng tương hỗ giữa chúng Động lực của quá trình là gradient nồng độ theo hướng đường đi x.Định luật thứ nhất Fick: vận tốc khuếch tán tỷ lệ với gradient nồng độ theo công thức sau:

x

C D F

6

Ngoài ra ta cũng thấy rằng hiện tượng khuếch tán không chỉ xảy ra với phân tử chất tan mà còn xảy ra với cả dung môi Các phân tử dung môi sẽ chuyển động ngược chiều với các phân tử chất tan có nghĩa là từ nơi có nồng

độ dung môi lớn đến nơi có nồng độ dung môi nhỏ

Trong quá trình chiết xuất, đặc trưng của quá trình khuếch tán qua màng

tế bào chính là khuếch tán phân tử Vì vậy, từ định luật Fick, có thể kết luận một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ mịn của nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ chiết, dung môi chiết, biện pháp khuấy trộn, kích thước phân tử khuếch tán

Khuếch tán đối lưu:

Đặc trưng cho quá trình chuyển khối trong lòng chất lỏng Đây là quá trình khuếch tán của chất chiết trong lòng dung môi chiết

1.4.1.2 Quá trình thẩm thấu

Thẩm thấu là quá trình vận chuyển dung môi qua một màng bán thấm ngăn cách hai dung dịch có thành phần khác nhau khi không có các lực ngoài như trọng lực, lực điện từ, lực đẩy pistông Hai dung dịch có thể khác nhau

về bản chất, nồng độ chất hòa tan Ðộng lực của quá trình thấm thấu là áp

suất thẩm thấu Các loại màng trong cơ thể hầu hết là màng bán thấm bởi vì

sự tồn tại của tế bào phụ thuộc vào sự thấm những chất cần thiết từ môi trường bên ngoài vào và loại trừ những chất chuyển hóa cặn bã từ nó ra ngoài.Trong tế bào nguyên liệu, màng nguyên sinh chất có tính bán thấm Do

đó khi nguyên liệu ở dạng tươi, nguyên sinh chất chưa bị biến đổi nên dung môi thấm vào được trong tế bào làm trương nở nhưng không thoát chất ra ngoài tế bào được

Để chiết rút kiệt được chất mong muốn, cần loại bỏ hoặc làm biến đổi tính chất của nguyên sinh chất trong các tế bào nguyên liệu

tử keo, tạp chất thì bị chặn lại không đi vào dịch chiết Vai trò màng tế bào như một màng chọn lọc

1.4.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

1.4.2.1 Về nguyên liệu

Màng tế bào: có ảnh hưởng nhiều đến quá trình chiết do trao đổi chất có tính chọn lọc Đối với thực vật non hoặc các bộ phận mỏng, mềm, thành phần màng tế bào chủ yếu là cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu

cơ khác, bền với nhiệt độ, có tính mềm dẻo và đàn hồi Dung môi chiết nhờ

đó dễ dàng thấm vào nguyên liệu Vì vây, đối với loại nguyên liệu này, không nên xay mịn khi chiết để hạn chế tạp chất lẫn trong dịch chiết Ngược lại, đối với thực vật đã già hoặc các bộ phận rắn chắc như hạt, thân gỗ, vỏ, rễ thì màng tế bào thường bị bần hóa, cutin hóa, gỗ hóa, khoáng hóa hay phủ thêm khoáng, sáp hoặc bị dầy lên do đó dung môi chiết rất khó thấm vào trong tế bào Ngoài ra, tế bào cũng có thể bị phủ thêm một màng chất nhầy thường bị trương nở, tạo nhớt khi gặp nước khiến bít các mao quản trên màng tế bào,

cản trở sự thấm của dung mỗi lẫn quá trình khuếch tán Vì vây, các loại nguyên liệu dạng này cần xay nhỏ để tao điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển chất Tuy nhiên, cần chú ý vì nếu quá nhỏ, bột sẽ dính bết với nhau khi hòa trong dung môi hoặc dễ vón cục gây cản trở quá trình chiết.

Màng nguyên sinh: có tính đàn hồi không tan trong nước, kém bền nhiệt,

là môi trường dị thể phức tạp tạo thành những hợp chất cao phân tử tan trong nước Do đó, để hạn chế ảnh hưởng đến quá trình chiết, cần xử lý làm biến tính màng nguyên sinh chất bằng các biện pháp như dùng nhiệt

Cấu tử cần chiết trong nguyên liệu: Bản chất của cấu tử chiết ảnh hưởng tới việc lựa chọn dung môi chiết Nếu là chất phân cực thì thường chọn các dung môi phân cực như nước, methanol, ethanol…ngược lại nếu là chất

như n-hexane, ether, acetone, chloroform, ethyl acetate…

Tạp chất trong dược liệu: Pectin, gôm nhầy, tinh bột, chất béo, tinh dầu,

nhựa và enzyme thường có trong các phần của thực vật và có ảnh hưởng nhất định tới quá trình chiết Nếu hàm lượng các chất này trong nguyên liệu chiết cao thì cần có biện pháp xử lý để hạn chế ảnh hưởng xấu

1.4.2.2 Dung môi chiết

Độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt và độ hòa tan chất chiết của dung môi sẽ là cơ sở chọn loại dung môi nào để chiết cấu tử từ nguyên liệu

1.4.2.3 Yếu tố kỹ thuật

Nhiệt độ: Từ định luật Fick, khi nhiết độ chiết tăng thì lượng chất

khuếch tán cũng tăng Tuy nhiên, nhiệt độ cao cũng có bất lợi do làm trương

nở tinh bột, tăng độ tan không chỉ của chất cần chiết mà cả các tạp chất Bên cạnh đó, chiết ở nhiệt độ cao cũng làm tăng lượng dung môi thất thoát

Thời gian: thời gian đầu của quá trình chiết, các chất có phân tử lượng thấp khuếch tán trước tiếp đó mới đến các chất có phân tử lượng cao như nhựa, keo…Vì vậy, cần chọn thời gian chiết phù hợp để giảm tạp chất vào dịch chiết

Khuấy trộn: việc khuấy trộn là cần thiết để tạo ra chênh lệch nông độ ở màng tế bào, tăng cường tốc độ khuếch tán Bên cạnh đó còn tránh được hiện tượng nhiệt cục bộ có thể gây cháy khét.

Ngoài ra, các yếu tố về áp suất, pH, dùng sóng siêu âm hay vi sóng…cũng có những tác động lên quá trình chiết

1.4.3 Phân loại phương pháp chiết xuất

Không có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dạng nguyên liệu Để chọn một phương pháp chiết xuất riêng cần thiết phải biết được thành phần của chất định chiết từ đó nghiên cứu chọn dung môi, quy trình và thiết bị cho phù hợp

Có rất nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau nhưng có thể tóm tắt như sau trên cơ sở các căn cứ Theo nhiệt độ chiết có phương pháp chiết nóng và phương pháp chiết ở nhiệt độ thường Căn cứ vào chế độ làm việc có phương pháp chiết gián đoạn, bán liên tục hay liên tục Căn cứ là chuyển động tương

hỗ giữa hai pha thì có phương pháp chiết ngược dòng, xuôi dòng và phương pháp chéo dòng Dựa trên áp suất làm việc thì có phương pháp chiết ở không

áp lực, phương pháp chiết chân không và phương pháp chiết có áp lực Cũng

có người phân loại theo những biện pháp đặc biệt được sử dụng thì có các phương pháp như dùng siêu âm, khí hóa lỏng, mạch nhịp hay phương pháp tạo dòng xoáy

Mỗi phương pháp có những mặt mạnh khác nhau và những nhược điểm nhất định Do đó, để hạn chế các ảnh hưởng không có lợi, khai thác tính ưu việt cua mỗi phương pháp, thông thường, một phương pháp chiết được lựa chọn sẽ bao gồm các yếu tố của một số phương pháp kể trên

1.4.4 Một số lưu ý về chiết xuất hợp chất saponin

Một phương diện quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng của các thành phần chiết tách từ thực vật vào các chế phẩm y dược là mô tả đặc trưng và xác định hoạt tính của từng thành phần riêng Cũng như vậy đối với chế phẩm triterpene saponin, đòi hỏi có kỹ thuật phức tạp trong việc tách, xác minh cấu trúc và phân tích các thành phần của nó và các glycoside Khi các thí nghiệm

test về hoạt tính sinh học được khảo nghiệm, cần thiết phải tách chúng sao cho đủ liều và đủ độ tinh sạch.

Do các triterpene và các thành phần liên quan tới saponin có khối lượng phân tử tương đối lớn và có độ phân cực cao, việc tách chúng là một thách thức không nhỏ Một vấn đề đòi hỏi trong phân tách saponin tinh khiết là sự

có mặt của các phức chất rất gần với hợp chất cần phân tách, không giống sự khó nhận biết trong bản chất của aglycone và phần đường (bản chất, số, vị trí

và đồng phân lập thể của phần gắn với monosaccharide) Các khó khăn khác

saponin đậu tương chủ yếu nhất, một dẫn xuất của γ pyrone (BOA), chỉ đượ- c tách ra bằng dung môi hỗn hợp cồn : nước ở nhiệt độ thường Việc chiết ở nhiệt độ cao (80oC) dẫn đến bị phân hủy thành 2 phần của ester và hình thành soyasaponin I (Bb) Trong thực vật, các saponin đi cùng với rất nhiều hợp chất phân cực như các đường saccharide và chất màu, gồm cả các hợp chất phenolic và các chất tương tự khác, do đó không dễ để kết tinh và càng khó thu được tinh thể

Việc mô tả đặc trưng của các saponin tinh khiết cũng gặp nhiều thách thức do không có đủ lượng tinh thể cần thiết (thường chỉ thu được các saponin ở dạng vô định hình) Điểm nóng chảy không rõ ràng và thường xảy

ra sự phân hủy Do đó, việc xác định các tính chất của mẫu tinh khiết không chỉ dành cho giá trị điểm nóng chảy, góc quay quang mà cần cả các hằng số vật lý khác Để thu được kết quả tốt hơn, cần tiến hành phân tách saponin bằng sắc ký lớp mỏng TLC hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Song, việc làm này cũng gặp nhiều khó khăn do chưa rõ thời gian lưu của từng saponin

[27]

Quy trình chiết tách cần được tiến hành càng nhẹ nhàng càng tốt bởi một

số saponin có thể chuyển hóa bao gồm thủy phân enzyme trong dịch chiết nước, ester hóa đối với nhóm acid của saponin trong xử lý cồn nhiệt, thủy phân nhóm ester linh động và chuyển acyl hóa

Dù một số biến đổi có thể xảy ra, quy trình chung hiện nay để thu được hỗn hợp saponin thô điển hình gồm chiết bằng rượu methylic, cồn, nước hay dung dịch cồn; một công đoạn loại bỏ chất béo, thường dùng với ether dầu tách béo trước khi thực hiện hoặc ngay trong quá trình chiết xuất; hòa tan

hoặc tạo huyền phù của cao chiết trong nước; và kết tủa saponin bằng acetone hay diethyl ether Một công đoạn thẩm tách có thể tiến hành để loại bỏ cá phân tử nhỏ tan trong nước như đường.

Quá trình chiết hiệu quả nhất đối với nguyên liệu khô đạt được khi sử dụng dung môi methanol hay dung dịch methanol Rượu methylic này cũng được sử dụng đối với nguyên liệu tươi Mặc dù nước được cho là dung môi chiết kém hiệu quả nhất để thu được saponin (trừ ra đối với các glycoside tan trong nước được mong muốn), nó vẫn có những lợi thế rõ ràng như dễ dàng làm lạnh khô và cho cao chiết sạch hơn, ít tạp hơn rất nhiều [27] Phương

trao đổi ion là rất hữu ích để tách saponin khỏi một số thành phần tạp khác trong dung dịch nhưng nó không cho phép tách riêng nhóm saponin do các saponin có xu hướng tạo micelle Vì vậy, việc tách loại có lợi nhất là sử dụng các dung môi hữu cơ và nước để hòa tan saponin với đầu ưa nước và đầu kị

đến quá trình tách loại

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Khô dầu hạt Camellia sp (trong nghiên cứu này được gọi tên là khô Du trà) được thu nhận tại cơ sở chế biến dầu Du trà thuộc huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An vào tháng 12 năm 2005 Nguyên liệu này có nguồn gốc từ hạt

Camellia sp được phơi khô, cho vào máy ép để lấy dầu, còn lại bã đem phơi

hay sấy khô ở nhiệt độ 50-60oC, để đạt được độ ẩm bảo quản phù hợp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tổng hợp tư liệu

Tham khảo tài liệu c liên quan trong và ngoài nước: tạp chó í, giáo trình,

dự án, báo cáo khoa học, thông tin từ các trang web có uy tín v.v để tổng hợp tư liệu định hướng việc nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất Nguồn gốc các tài liệu tham khảo được trình bày trong phần Tài liệu tham khảo

2.2.2 P hương pháp hóa lý, hóa học khảo sát nguyên liệu và chiết tách

2.2.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu (theo TCVN 4801:89)

Theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ xác định Cân khoảng 10g nguyên liệu khô Du trà cho vào chén cân đã được sấy cùng với nắp đến khối lượng không đổi, cho chén cân và nắp vào tủ sấy (số lượng chén cân là 2), nâng nhiệt độ lên 105 ± 20C Sấy mẫu trong 6h, sau đó đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân Sau khi cân lần thứ nhất sấy lại mẫu ở nhiệt độ trên trong 1h ặp lại các thao tác này cho đến khi chênh , llệch các kết quả giữa 2 lần cân kế tiếp nhau không vượt quá 0,05g [12]

Độ ẩm (W) tính theo phần trăm khối lượng xác định theo công thức:

Trong đó: m khối lượng mẫu trước khi sấy, - g;

m1 - khối lượng mẫu au khi sấy, g.sKết quả thử là trung bình số học của 2 phép xác định song song, mà sai lệch giữa chúng không được vượt quá 0,2%

2.2.1.2 Xác định hàm lượng tinh bột

Tinh bột có ảnh hưởng nhất định tới khả năng xử lý nguyên liệu trong quá trình chiết tách Để xác định hàm lượng tinh bột trong khô Du trà, sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng amyloglucosidase (AMG) là enzyme phân cắt dịch tinh bột thành các đơn vị glucose, sau đó xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Gracianov [10] Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với Fe rixianua sẽ khử Ferr rixianua thành Ferroxianua và đư ng khử chuyển thành axít đường Dùng xanh methylen ờlàm chỉ thị, màu xanh sẽ mất khi phản ứng kết thúc

2K 3 Fe(CN) 6 + 2KOH + CH 2 OH(CHOH) 4 CHO  2K 4 Fe(CN) 6 + HOOC(CHOH) 4 COOH + 2H 2 O

Cân khoảng 5 (g) bột nguyên liệu, đem thủy phân bằng chế phẩm AMG, trong thời gian khoảng 60 phút ở nhiệt độ 50oC Sau đó, ly tâm loại phần bã, thu được dịch thủy phân Đưa toàn bộ dịch thủy phân cùng với nước rửa bã vào bình, định mức tới 250 ml bằng nước cất

Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch Ferrixianua Kali cho vào bình tam giác

và đặt trên bếp đun nóng tới sôi

Dùng buret với dung dịch thủy phân để chuẩn tới mất màu của Xanh Methylen

Công thức tính hàm lượng đường khử:

Cd = × 100

x a

Trong đó: – a là chỉ số của 20 dung dịch K3Fe(CN)6

250

k

m V, với là số ml dung dịch thủy phân chuẩn hết.V

mk – khối lượng bột nguyên liệu tính theo độ khô tuyệt đối (g)

m – khối lượng bột nguyên liệu ẩm (g)

Để xác định chỉ số a, tiến hành chuẩn dung dịch Ferrixianua Kali như trên nhưng dung dịch chuẩn là dung dịch glucose đã biết trước nồng độ

Hàm lượng tinh bột: Tb = 0,9.Cd (% khối lượng khô tuyệt đối)

2.2.1.3 Xác định hàm lượng dầu trong khô Du trà (TCVN 4331:2001)

Cân chính xác 10 g mẫu bột khô Du trà, cho vào trong ống soxhlet sạch 0 được phủ bằng bông thuỷ tinh Chiết mẫu với 250 ml hexane trong n- 6 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet Cô đặc dịch chiết trên máy cô quay chân

khối lượng, dùng giấy nhôm phủ lên chén cân rồi để nguội qua trong tủ hút Sau đó, chén cân được làm khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70oC trong tủ sấy rồi để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm Phần thu được đem cân là lượng chất béo có trong mẫu [14]

2.2.1.4 Định lượng saponin, flavonoid trong dầu thu được từ khô Du trà

Lấy 10g dầu béo thêm 20 ml MeOH lắc nhiều lần Hỗn hợp chia thành hai lớp, trích ly lấy lớp trên rồi xử lý bằng nước muối sinh lý tạo lớp màu đục, tiếp tục thêm acetone:ether (5:1) thì saponin sẽ tủa dưới dạng bông, để lắng xuống và gạn bỏ phần dịch Cô cạn dung môi thu được cao toàn phần saponin Đưa vào chén cân và sấy đến khối lượng không đổi [15]