Đang tải... (xem toàn văn)
i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MẬN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN SỬ DỤNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS CHO ĐỐI TƢỢNG CÂY[.]
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MẬN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN SỬ DỤNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS CHO ĐỐI TƢỢNG CÂY BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hồng Hà - Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Văn Thắng - Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp - Trường đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện, bảo hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc toàn thể cán bộ, chuyên viên nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện đóng góp ý kiến q báu cho tơi thời gian thực tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thị Đỗ Loan - Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi suốt trình học tập, thực luận văn Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Đề tài luận văn thực từ nguồn kinh phí đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh công nghệ chuyển gen” ThS Bùi Văn Thắng làm chủ nhiệm, thuộc Chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020 Xin trân trọng cảm ơn Hà Nội, ngày 12 tháng 11 năm 2013 Học viên Lê Thị Mận ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu Ý nghĩa đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn nói chung bạch đàn Urơ nói riêng 1.2 Tình hình trồng suất bạch đàn Urơ Việt Nam 1.2.1 Tình hình phát triển diện tích trồng bạch đàn Urô Việt Nam 1.2.1 Năng suất bạch đàn Urô Việt Nam 1.3 Các hướng cải thiện giống bạch đàn ứng dụng Công nghệ sinh học 10 1.3.1 Nhân giống vơ tính in vitro bạch đàn 10 1.3.2 Nghiên cứu phát triển sử dụng thị phân tử chọn tạo lai giống 11 1.3.3 Nghiên cứu tạo giống bạch đàn chuyển gen 12 1.4 Gen GA20 chu trình sinh tổng hợp gibberellin ứng dụng cải tiến giống trồng sinh trưởng nhanh 18 1.4.1 Vai trò gibberellin đời sống thực vật 18 1.4.2 Sinh tổng hợp gibberellin vai trò gen GA20 sinh tổng hợp gibberellin 19 1.4.3 Ứng dụng chuyển gen GA20 việc cải tiến giống trồng sinh trưởng nhanh 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Vật liệu thực vật 24 2.1.2 Vật liệu di truyền chủng vi khuẩn 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Nuôi cấy mô 25 2.3.2 Chuyển gen vào bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 27 2.3.3 Phân tích thể nhận gen, mô sẹo, chồi chuyển gen phương pháp hóa sinh 29 2.3.4 Phân tích chuyển gen phương pháp phân tử 29 2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 2.3.6 Các tiêu theo dõi 31 2.3.7 Xử lý số liệu .32 iii Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urơ thơng qua mô sẹo 33 3.1.1 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tạo mô sẹo 33 3.1.2 Ảnh hưởng BAP, NAA Kinetin đến khả tạo chồi từ mô sẹo 36 3.1.3 Ảnh hưởng NAA IBA đến khả rễ .39 3.2 Xây dựng quy trình chuyển gen vào bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 43 3.2.1 Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc kanamycin 43 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy tới khả biến nạp gen .47 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới khả biến nạp gen 49 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy tới khả biến nạp gen 51 3.2.5 Ảnh hưởng chủng Agrobacterium tumefaciens đến khả biến nạp gen 53 3.2.6 Ảnh hưởng nguồn mẫu tới khả biến nạp gen 54 3.3 Chuyển gen GA20 vào bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 59 3.3.1 Đánh giá khả tái sinh chồi sau chuyển gen 59 3.3.2 Đánh giá khả rễ kiểm tra PCR cho chồi sau chuyển gen .61 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO .65 PHỤ LỤC .72 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : - Benzylaminopurine cs : Cộng ĐC : Đối chứng GA : Gibberellin GA20 : Gen mã hóa cho enzym GA20 - oxidase gus : Gen mã hóa cho enzym β - glucuronidase IAA : Indole - acetic acid IBA : Indole - butyric acid Km : Kanamycin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : - naphthaleneacetic acid ND : Nước dừa TNC : Tiền nuôi cấy v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách nghiên cứu chuyển gen đối tượng Eucalyptus 14 Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A tumefaciens 28 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nhân gen GA20 31 Bảng 3.1 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tạo mô sẹo 35 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP, NAA Kinetin 37 Hình 3.2 Chồi tái sinh từ mô sẹo môi trường C1 38 Bảng 3.3 Ảnh hưởng NAA IBA tới hiệu rễ 40 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kanamycin tới khả sống thân mầm .44 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kanacycin đến khả rễ 46 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy đến khả biến nạp gen 48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến khả biến nạp gen .50 Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp gen 52 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng A tumefaciens đến khả biến nạp gen .54 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến hiệu chuyển gen 55 Bảng 3.11 Khả tái sinh mẫu chuyển gen .60 Bảng 3.12 Kết kiểm tra khả rễ chồi sau chuyển gen 62 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Rừng bạch đàn Urơ Brazil Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp GA vị trí hoạt động enzym 21 Hình 2.1 Vectơ pBI121 24 Hình 3.1 Hình thái loại mơ sẹo 36 Hình 3.2 Chồi tái sinh từ mô sẹo môi trường C1 38 Hình 3.3 Chồi tái sinh công thức môi trường sau tuần ni cấy .38 Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo môi trường C1 môi trường C4 sau tuần ni cấy 39 Hình 3.5 Chồi rễ môi trường sau tuần ni cấy 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến sức sống 46 Hình 3.7 Biểu gen gus mẫu thí nghiệm 57 Hình 3.8 Chồi chuyển gen gus tái sinh 57 Hình 3.9 Chồi chuyển gen GA20 tái sinh môi trường chứa Km 150 mg/l .61 Hình 3.10 Cây chuyển gen GA20 môi trường rễ 62 Hình 3.11 Cây chuyển gen trồng ngồi nhà lưới 63 Hình 3.12 Kết kiểm tra có mặt gen GA20 63 vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) lồi bạch đàn trồng chủ yếu Việt Nam Đây loài chủ lực dự án trồng triệu hecta rừng triển khai nước giai đoạn 1998 - 2010 Các nghiên cứu tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozơ, chiều dài sợi gỗ, thực hiện, kết thu cho thấy tính trạng sinh trưởng chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy Các đánh giá sinh trưởng bạch đàn Urô Việt Nam cho thấy tỷ lệ sinh trưởng bạch đàn Urô Việt Nam chậm so với nước khác Trung Quốc, Brazil Vì vậy, chương trình chọn giống bạch đàn Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày bị thu hẹp nạn khai thác bừa bãi, đất đai bị hoang hóa tác động tiêu cực gây biến đổi khí hậu Trong nhu cầu nguyên liệu cho ngành chế biến gỗ công nghệ bột giấy dần gia tăng tương lai thiếu hụt trầm trọng khơng có giải pháp cụ thể tích cực Do đó, vấn đề cải thiện giống trồng lấy gỗ phục vụ ngành chế biến gỗ công nghệ bột giấy vấn đề cấp bách Công nghệ gen giải pháp quan trọng hữu hiệu trường hợp Thông qua việc sử dụng kĩ thuật công nghệ gen cho phép tạo giống trồng mới; đột phá suất, chất lượng khả chống chịu Không trồng tạo từ cơng nghệ gen có nhiều đặc tính ưu việt mà trồng hoang dại ban đầu khơng có Để chuyển thành cơng gen có giá trị vào bạch đàn Urơ cần phải có quy trình tái sinh hiệu cao từ mô sẹo thông qua tạo đa chồi trực tiếp tạo phơi soma Quy trình tái sinh số loài bạch đàn phục vụ chuyển gen nhà khoa học đầu tư nghiên cứu: Bandyopadhyay cs (1999) tiến hành tái sinh thành cơng hai lồi bạch đàn E nitens E globules từ vật liệu mảnh cấy mầm [26]; Cid cs (1999) tiến hành tái sinh loài bạch đàn lai E grandis x E urophylla từ vật liệu cuống mầm [36]; nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E tereticornis thông qua phôi soma Parakash cs (2005) công bố Dibax cs (2010) tái sinh loài bạch đàn E cammaldulensis; Huang cs (2010) xây dựng thành cơng quy trình tái sinh cho loài bạch đàn E urophylla từ đỉnh thân mầm [41], [52] Cho đến nay, nhiều loài bạch đàn nghiên cứu tái sinh thành công thông qua tạo đa chồi phôi soma từ vật liệu mảnh lá, thân mầm Tuy nhiên, kết nghiên cứu thu cho thấy loài bạch đàn, chí dịng lồi khả tái sinh khác (Ho cs, 1998; Dibax cs, 2005; Gonzales cs, 2002; Tournier cs, 2003) [40], [84] Trên sở quy trình tái sinh xây dựng, số quy trình chuyển gen vào nhiều lồi bạch đàn nhà khoa học thực thành công việc chuyển gen thị, gen chọn lọc áp dụng hiệu để chuyển gen có giá trị Tetsukawazu cs (2003) cấp sáng chế quy trình chuyển gen gus vào lồi bạch đàn E camaldulensis, E globulus, E grandis, E grandis x E urophylla E urophylla từ mẫu cấy sinh dưỡng lấy từ bạch đàn trưởng thành; Cheng cs (2006) cấp sáng chế quy trình chuyển gen chọn lọc chuyển gen cho loài bạch đàn E urophylla Các kết nghiên cứu cho thấy sử dụng loài bạch đàn, dịng bạch đàn khác cho hiệu suất chuyển gen khác Do để chuyển gen hiệu vào lồi bạch đàn dịng bạch đàn cụ thể cần có quy trình thích hợp Xuất phát từ sở thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla)” nhằm cung cấp sở cho việc tạo giống bạch đàn Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh Mục tiêu - Xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urô thông qua mô sẹo - Xây dựng quy trình chuyển gen vào bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Tạo bạch đàn Urô chuyển gen mang gen GA20 Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị khả tạo bạch đàn Urô biến đổi gen, sinh trưởng nhanh Việt Nam Kết nghiên cứu đề tài tài liệu tham khảo cho việc giảng dạy phương pháp chuyển gen gián tiếp bạch đàn Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng thành công quy trình chuyển gen bạch đàn thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm sở cho việc tạo giống bạch đàn biến đổi gen sinh trưởng nhanh 80 Thamarus K.A., Groom K., Murrell J., Byrne M., Moran G.F (2002) A genetic linkage map for Eucalyptus globulus with candidate loci for wood, fibre, and floral traits Theor Appl Genet 104(2-3):379-387 81 Thumma B.R., Nolan M.F., Evans R., Moran G.F (2005) Polymorphisms in Cinnamoyl CoA Reductase (CCR) are associated with variation in microfibril angle in Eucalyptus spp Genetics 171(3): 1257 - 1265 82 Tibok A (1990) Micropropagation, Regeneration and Transformation Studies on Eucalyptus urophylla and E nitens M.Sc Thesis, Wye College, University of London 83 Tibok’ A., Blackhall N.W., Power J.B., Davey M.R (1995) Optimized plant regeneration from callus derived from seedling hypocotyls of Eucalyptus urophylla Plant Science 110: 139 - 145 84 Tournier V., Grat S., Marque C., Kayal W., Penchel R., Andrade D.G., Boudet A.M., Teulieres C (2003) An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree (Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla) Trans Res 12: 403 – 411 85 Wihelm R (2000) Growth retardants: Effects on gibberellin Biosynthesis and Other metabolic pathways Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51: 501 - 504 86 Xiao Y H., Ye Y.F., Feng Y., Li X.B., Hou L., Luo X.Y., Li D.M., Pei Y (2006) Functional expression of the cotton gibberellic acid oxidase homologous gene GhGA20ox1 in tobacco Plant physiol Mol Bio 32(5): 563 - 569 87 Yamada-Watanabe K., Kawaoka A., Matsunaga K., Nanto K., Sugita K., Endo S., Ebinuma H., Murata N (2003) Molecular breeding of Eucalyptus: analysis of salt stress tolerance in transgenic Eucalyptus camaldulensis that overexpressed choline oxidase gene (codA) IUFRO tree biotechnology Umea Plant Science Centre, Umea: S7 – S9 88 Yun L.X , Li L., Keqiang W., Anton J M P., Douglas A G., Jan A D Z (1995) The GA5 locus of Arabidopsis thaliana encodes a multifunctinal gibberellin 20-oxidase: Molecular cloning and functinal expression Proc Natl Acad Sci USA 92: 6640 - 6644 Tài liệu tham khảo trang Web 89 http://www.tchdkh.org.vn/tin-tuc-su-kien/cong-nghe-moi-san-phammoi/3347-giong-bach-dan-uro-262.html 90 http://vafs.gov.vn/vn/2013/09/giong-moi-duoc-cong-nhan/ 71 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) Thành phần Hàm lƣợng (mg/l) 1900 KNO3 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2 332 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,3 ZnSO4 8,6 Na2MO4 0,25 CuSO4.7H2O 0,025 CoCl2 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Glycin Myo-inositol 100 Nicotimic acid 0,5 Thiamin.HCl 0,1 Pyrdoxin HCl 0,5 72 Phụ lục 2: Kết xử lí thống kê Thí nghiệm tạo mơ sẹo Thân mầm Anova: Two-Factor With Replication (tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY 0,2NAA 0,5NAA 1,0NAA Total 285.0945 95.03151 3.15424 265.3805 88.46017 3.688189 272.205 90.735 10.4153 822.6800957 91.40889952 12.66660306 186.5414 62.18045 2.074736 243.4548 81.15161 0.402287 260.945 86.9818 71.9901 690.9414884 76.77127649 144.7419235 Count Sum Average Variance 471.6359 78.60598 325.8493 508.8353 84.80589 17.6607 533.15 88.8584 37.1882 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 964.17 319.9473 755.8712 183.4497 df MS 964.17 159.974 377.936 15.2875 Total 2223.438 0,5BAP Count Sum Average Variance 1,0BAP Count Sum Average Variance Total 2 12 F 63.06927593 10.46436029 24.7219094 17 Lá mầm Anova: Two-Factor With Replication (tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY 0,2NAA 0,5NAA 1,0NAA Total 189.7357 63.24523 25.51348 226.1499 75.3833 5.047639 219.6464 73.21546 23.31415 635.532 70.61466 44.89854 264.4361 88.14536 22.70526 282.0833 94.02778 6.30787 280.8311 93.61038 10.30951 827.3506 91.92784 17.91109 454.1718 508.2332 500.4775 0,5BAP Count Sum Average Variance 1,0BAP Count Sum Average Variance Total Count Sum 73 P-value 4.05236E-06 0.002342277 5.54905E-05 F crit 4.747225336 3.885293835 3.885293835 Average Variance 75.6953 205.2925 84.70554 108.8272 83.41292 138.2352 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 2044.131 284.8341 31.24713 186.3958 df MS 2044.131 142.417 15.62356 15.53299 Total 2546.608 2 12 F 131.5994 9.168684 10.00583 P-value 7.97E-08 0.00383 0.394593 F crit 4.747225 3.885294 3.885294 17 Thân thật Anova: Two-Factor With Replication (tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY 0,2NAA 0,5NAA 1,0NAA Total 94.67962 31.55987 23.79122 66.38187 22.12729 18.10964 74.9592 24.9864 6.38194 236.0207325 26.22452584 29.61552612 45.6391 15.21303 12.47291 56.21758 18.73919 10.8386 73.6674 24.5558 12.3437 175.5240931 19.50267702 25.60807376 Count Sum Average Variance 140.3187 23.38645 94.67142 122.5994 20.43324 15.02305 148.627 24.7711 7.54588 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 203.3246 58.91168 215.0011 167.876 df MS 203.325 29.4558 107.501 13.9897 Total 645.1134 0,5BAP Count Sum Average Variance 1,0BAP Count Sum Average Variance Total 2 12 F 14.53391556 2.105542714 7.684283218 17 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo Anova: Single Factor (tỷ lệ mô sẹo tạo chồi) SUMMARY Groups C4 C5 C6 Count 3 Sum 200.3892 258.9548 256.8979 Average 66.7964 86.31828 85.63264 74 Variance 146.667 12.3092 74.34 P-value 0.002473692 0.164518564 0.007105182 F crit 4.747225336 3.885293835 3.885293835 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 736.377831 466.632456 Total 1203.01029 SS df MS F P-value F crit 368.1889 77.77208 4.734205 0.05836 5.143253 Sum 17.08806 21.16132 12.56207 Average 5.696019 7.053772 4.187356 Variance 0.12896 0.317675 0.061757 df MS F P-value F crit 6.16795 0.169464 36.3968 0.000442 5.143253 Anova: Single Factor (Số chồi/mẫu) SUMMARY Groups C4 C5 C6 Count 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 12.3359 1.01678453 Total 13.3526846 SS Anova: Single Factor (tỷ lệ mô sẹo tạo chồi) SUMMARY Groups C1 C2 C3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count 3 Sum 263 265.7 259.7 Average 87.67 88.56 86.58 Variance 6.78176 30.7843 23.0961 SS df MS F 5.92 121 127 2.962 20.22 0.1465 P-value F crit 0.86673105 5.14325285 P-value 1.2437E06 F crit Anova: Single Factor (số chồi/mẫu) SUMMARY Groups C1 C2 C3 ANOVA Source of Variation Between Groups Count 3 Sum 25.21 18.34 10.48 Average 8.402 6.112 3.494 Variance 0.09126 0.05189 0.05355 SS df MS F 18.09 276.0 36.2 75 5.14325285 Within Groups 0.39 Total 36.6 0.066 Thí nghiệm rễ Anova: Two-Factor With Replication (tỷ lệ chồi rễ) SUMMARY 0,1 IBA 0,2 IBA 0,3 IBA Total 112.7273 37.57576 25.06887 130.197 43.39899 38.29576 161.3095 53.76984 12.8732 404.23377 44.914863 69.523576 191.3939 63.79798 113.577 273.6472 91.21573 15.04005 215.0356 71.67852 79.04522 680.0767 75.564078 201.35785 Count Sum Average Variance 304.1212 50.68687 261.7398 403.8442 67.30736 707.2665 376.3451 62.72418 132.9836 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 4227.185 884.2863 714.9649 567.8002 df MS 4227.185 442.1431 357.4825 47.31668 Total 6394.236 0,2 NAA Count Sum Average Variance 0,5 NAA Count Sum Average Variance Total 2 12 F 89.338148 9.3443399 7.5551045 P-value 6.56E-07 0.003575 0.007521 17 Anova: Two-Factor With Replication (Số rễ/chồi) SUMMARY 0,1 IBA 0,2 IBA 0,3 IBA Total 6.050909091 2.016969697 0.010698623 7.535909 2.51197 0.02793 8.082143 2.694048 0.020106 21.66896 2.407662 0.10676 9.548030303 3.182676768 0.008976041 14.75758 4.919192 0.143327 10.68308 3.561028 0.011924 34.98869 3.887632 0.666462 15.59893939 22.29348 18.76523 0,2 NAA Count Sum Average Variance 0,5 NAA Count Sum Average Variance Total Count Sum 76 F crit 4.74723 3.88529 3.88529 Average Variance 2.599823232 0.415531758 3.715581 1.806918 3.127538 0.238308 SS df MS F ANOVA Source of Variation Sample 9.856397482 9.856397 265.2396 Columns 3.738384462 1.869192 50.30072 Interaction Within 2.001471829 0.44592421 12 1.000736 0.03716 26.93021 Total 16.04217798 17 P-value 1.51E09 1.46E06 3.66E05 F crit 4.747225 3.885294 3.885294 Thí nghiệm xác định nồng độ chất chọn lọc Sau tuần Anova: Single Factor SUMMARY Groups ?C CTTN1 CTTN2 CTTN3 CTTN4 CTTN5 CTTN6 Count 3 3 3 Sum 300 291.3 266.47 258.7 210.75 151.02 Average 100 97.09935 88.82296 86.23168 70.25143 50.34014 Variance 1.378781 0.906514 9.125564 3.417579 0.347078 SS df MS F P-value F crit 3768.821 2.167931 1738.442 2.79E-19 2.847726 P-value F crit ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 22613 30.351 14 Total 22643 20 Sau tuần Anova: Single Factor SUMMARY Groups ?C CTTN1 CTTN2 CTTN3 CTTN4 CTTN5 CTTN6 Count 3 3 3 Sum 300 260.41 211.83 192.46 61.232 46.037 Average 100 86.80304 70.60904 64.15248 20.41063 15.34556 Variance 6.962981 0.905752 3.005923 17.89715 4.003603 ANOVA Source of Variation SS df MS F 77 Between Groups Within Groups 27145 65.551 14 Total 27210 20 4524.147 4.682201 1.69E17 966.2436 2.847726 Sau tuần Anova: Single Factor SUMMARY Groups ?C CTTN1 CTTN2 CTTN3 CTTN4 CTTN5 CTTN6 ANOVA Source of Variation Count 3 3 3 Sum 300 225.5088 163.526 132.6862 34.64262 0 Average 100 75.1696 54.50865 44.22872 11.54754 0 Variance df MS F SS Between Groups Within Groups 27211.73 70.13146 14 Total 27281.86 20 4535.288 5.00939 1.820794 4.417705 20.13567 8.691563 0 905.3574 Pvalue 3E17 F crit 2.8477 Sau tuần Anova: Single Factor (tỷ lệ rễ) SUMMARY Groups ?C 10 mg/l 50 mg/l 75 mg/l 100 mg/l Count 3 3 Sum 86.15978 43.94692 21.24409 0 Average 28.71993 14.64897 7.081363 0 Variance 11.0067 27.50807 9.282665 0 df MS F 435.3949 9.559487 45.54584 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 1741.58 95.59487 10 Total 1837.174 14 SS Sau tuần Anova: Single Factor (tỷ lệ rễ) SUMMARY Groups ?C 10 mg/l Count 3 Sum 149.9166 105.577 Average 49.9722 35.1923 78 Variance 1.0453 21.114 P-value 2.19E06 F crit 3.47805 50 mg/l 75 mg/l 100 mg/l 3 36.33274 0 12.1109 0 df MS ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 5969.678 53.59879 10 Total 6023.276 14 SS 4.6405 0 F Pvalue F crit 3E-10 3.478 1492.42 5.35988 278.44 Sum 272.5727 156.5753 55.53783 2.173913 Average 90.85757 52.19178 18.51261 0.724638 Variance 10.11012 1.086908 7.267419 1.575299 df MS F P-value F crit 4541.201 4.00795 1133.048 3.1E-13 3.47805 Sau tuần Anova: Single Factor (tỷ lệ rễ) SUMMARY Groups ?C 10 mg/l 50 mg/l 75 mg/l 100 mg/l ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count 3 3 SS 18164.8 40.0795 10 18204.88 14 Thí nghiệm thời gian tiền ni cấy Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu thân biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups gi? 24 gi? 48 gi? 72 gi? 96 gi? ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count 3 3 SS Sum 47.74796999 73.35992908 138.2006063 116.6304348 85.90838509 Average 15.91599 24.45330969 46.06686878 38.87681159 28.63612836 Variance 9.41658881 17.33425863 17.29365683 1.610743541 6.667394037 df MS F P-value F crit 423.6061664 10.46452837 40.48019667 3.8E-06 3.47805 1694.425 104.6453 10 1799.07 14 79 Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups gi? 24 gi? 48 gi? 72 gi? 96 gi? Count 3 3 Sum 48.58156 81.03054 142.3248 116.0922 85.57317 Average 16.19385 27.01018 47.44159 38.6974 28.52439 Variance 10.35327 22.48938 28.50957 16.93428 23.4233 df MS F 426.9004 20.34196 20.9862 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 1707.602 203.4196 10 Total 1911.021 14 SS P-value 7.47E05 F crit 3.4780 Thí nghiệm xác định thời gian biến nạp Thân mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu sống) SUMMARY Groups ko nhi?m khu?n phút 10 phút 15 phút 20 phút Count 3 3 Sum 287.2321 270.9007 264.2099 252.6786 237.3191 Average 95.744038 90.300236 88.069974 84.22619 79.106383 Variance 13.57876 7.078936 11.23415 6.643282 7.411498 df MS F P-value F crit 117.97533 9.189325 12.8383 0.000596 3.47805 P-value F crit ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 471.9013 91.89325 10 Total 563.7946 14 SS Thân mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus SUMMARY Groups ko nhi?m khu?n phút 10 phút 15 phút 20 phút ANOVA Source of Variation Count Sum 3 3 SS 115.6259 138.1581 98.68197 87.19149 Average 38.541962 46.052696 32.893991 29.06383 Variance 16.64358 23.63655 5.814152 28.45994 df MS F 80 Between Groups Within Groups 3712.586 149.1084 10 Total 3861.695 14 928.14652 14.910843 4.98E07 62.24641 3.47805 Lá mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu sống) SUMMARY Groups ko nhi?m khu?n phút 10 phút 15 phút 20 phút Count 3 3 Sum 283.5442 266.3048 263.2492 253.8302 240.6115 Average 94.51474 88.76827 87.74972 84.61008 80.20383 Variance 10.33228 11.58853 1.913815 1.439559 14.70298 df MS F P-value F crit 83.93737 7.995433 10.49816 0.001326 3.47805 P-value 1.57E07 F crit ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 335.7495 79.95433 10 Total 415.7038 14 SS Lá mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups ko nhi?m khu?n phút 10 phút 15 phút 20 phút Count Sum 3 3 123.6214 142.0928 102.6287 90.70116 Average 41.20712 47.36428 34.20955 30.23372 Variance 11.34845 34.65486 12.65525 4.97235 df MS F 1007.306 12.72618 79.15228 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 4029.225 127.2618 10 Total 4156.487 14 SS Thí nghiệm xác định thời gian đồng nuôi cấy Thân mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu sống) SUMMARY Groups ?C ngày Count 3 Sum 286.5566 273.3751 Average 95.51886 91.12502 81 Variance 0.024013 4.63143 3.47805 ngày ngày 3 3 3 264.2524 263.484 217.2631 181.5354 156.2943 99.27721 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 10402.3 59.94875 16 Total 10462.25 23 SS df 88.08415 87.82801 72.42102 60.51181 52.09811 33.09240 2.271464 2.391338 4.031997 5.87939 7.736134 3.008608 MS F P-value F crit 1486.04304 3.74679677 396.6169 1.02E-16 2.657197 Thân mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus SUMMARY Groups ?C ngày ngày ngày Count Sum 3 3 3 3 71.03426 138.2006 145.4639 136.6538 101.212 80.2305 52.63039 Average 0.00000 23.67809 46.06687 48.48798 45.55126 33.73734 26.74350 17.54346 Variance 9.689017 17.29366 14.73881 17.29402 9.992085 8.930742 6.463528 df MS F P-value F crit 840.4659 10.55023 79.66326 3.05E-11 2.657197 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 5883.261 168.8037 16 Total 6052.065 23 SS Lá mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu sồng) SUMMARY Groups ?C ngày ngày ngày ANOVA Source of Count 3 3 3 3 SS Sum 283.0423 267.03 263.2149 262.5621 225.0236 185.0044 162.5595 101.3298 df Average 94.3474 89.0100 87.7383 87.5207 75.0079 61.6681 54.1865 33.7766 MS 82 Variance 9.241191 2.375896 6.888211 15.51547 0.295695 6.639089 6.945625 10.3978 F P-value F crit Variation Between Groups Within Groups 9494.688 116.598 16 Total 9611.286 23 1356.384 7.28737262 186.128 4.05E-14 2.657197 Lá mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups ?C ngày ngày ngày Count Sum 3 3 3 3 75.80721 142.2602 148.8085 138.9362 102.0852 82.14002 54.83156 Average 0.00000 25.26907 47.42007 49.60284 46.31206 34.02839 27.38001 18.27719 Variance 12.49466 3.230122 6.856194 30.16448 10.96542 9.576452 17.27531 df MS F P-value F crit 869.1952 11.32033 76.78178 4.06E-11 2.657197 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 6084.366 181.1253 16 Total 6265.491 23 SS Thí nghiệm xác định chủng vi khuẩn A tumefaciens Thân mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups ?C C58 EHA 101 LBA 4404 Count Sum 3 3 144.6798 144.5328 41.93262 Average 48.22661 48.17761 13.97754 Variance 6.84675 0.388406 18.46206 df MS F 1796.226 6.424305 279.5986 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 5388.679 51.39444 Total 5440.073 11 SS Lá mầm Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY 83 P-value 1.95E08 F crit 4.066181 Groups ?C C58 EHA 101 LBA 4404 Count Sum 3 3 147.8723 144.9388 52.39362 Average 49.29078 48.31293 17.46454 Variance 18.48499 2.416215 9.297508 df MS F 1758.555 7.549677 232.9311 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 5275.664 60.39742 Total 5336.061 11 SS P-value 4.02E08 F crit 4.066181 Thí nghiệm xác định nguồn mẫu Anova: Single Factor (tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus) SUMMARY Groups Thân m?m Lá m?m Thân th?t Count 3 Sum 144.3293 147.3382 67.99595 Average 48.10978 49.11272 22.66532 Variance 0.804592 9.923783 47.87098 df MS F P-value F crit 673.9459 19.53312 34.50273 0.0005119 5.1432528 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 1347.892 117.1987 Total 1465.091 SS Anova: Single Factor (tỷ lệ chồi biểu tạm thời gen gus/chồi tái sinh) SUMMARY Groups Thân m?m Lá m?m Thân th?t Count 3 Sum 39.29292929 73.80952381 25 Average 13.097643 24.603175 8.3333333 Variance 19.695269 47.241119 208.33333 df MS F P-value F crit 209.89182 91.756574 2.2874854 0.182649 5.143253 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 419.78364 550.53944 Total 970.32308 SS Anova: Single Factor (tỷ lệ chồi dương tính gus/mẫu thí nghiệm) SUMMARY Groups Count Sum Average 84 Variance Thân m?m Lá m?m Thân th?t ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 3 7.523156 8.650938 1.694915 2.507719 2.883646 0.564972 0.958584 0.956421 0.957579 df MS F P-value F crit 4.645918 0.957528 4.851993 0.055773 5.143253 SS 9.291837 5.745168 15.037 Total 10 Thí nghiệm chuyển gen GA20 Vật liệu Thân mầm Lá mầm Vật liệu Thân mầm Lá mầm Số lần lặp TB TB Số mẫu TN 275 256 264 795 262 267 283 812 Số mẫu sống tái sinh chồi /Km 150 15 13 14 14 11 14 Số lần lặp Tổng chồi Số chồi rễ/Km75 lần 1 TB TB 54 46 51 151 58 49 57 164 3 2 85 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 5.5 5.1 5.3 5.3 5.3 4.1 4.9 4.8 Số chồi rễ/Km75 lần 10 12 Số chồi tái sinh/ Km 150 54 46 51 151 58 49 57 164 Số chồi (+) PCR 1 2 Tỷ lệ chồi (+) PCR/Tổng chồi (%) 1.9 2.2 2.0 2.0 3.4 2.0 3.5 3.0