Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh một số giống đậu tương việt nam phục vụ cho chỉnh sửa gen bằng crispr cas9

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG VIỆT NAM PHỤC VỤ CHO CHỈNH SỬA GEN BẰNG CRISPR/CAS9” HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG VIỆT NAM PHỤC VỤ CHO CHỈNH SỬA GEN BẰNG CRISPR/CAS9” Sinh viên thực : HOÀNG THẢO NGUYÊN Mã sinh viên : 637159 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn : TS NGUYỄN THÀNH ĐỨC Ngƣời hƣớng dẫn : TS ĐINH TRƢỜNG SƠN HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tài liệu, thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Hoàng Thảo Nguyên i LỜI CẢM ƠN Trang khoá luận em xin gửi lời cảm n tới thầy cô giáo ộ môn Công nghệ sinh học Thực vật t o điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu c iệt em xin ày t l ng iết n s u sắc gửi lời cảm n ch n thành tới thầy giáo TS inh Trường S n giảng viên ộ môn Công nghệ sinh học Thực vật - khoa Công nghệ Sinh học nhiệt tình hỗ trợ đưa lời khuyên ổ ích giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên c nh em xin gửi lời cảm n ch n thành TS Nguyễn Thành ức ph ng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế Thực vật Viện Di truyền Nơng nghiệp ln tận tình ảo động viên t o điều kiện thuận lợi suốt q trình nghiên cứu Ngồi em vơ iết n giúp đỡ ln sẵn sàng truyền đ t kiến thức kinh nghiệm quý áu cán ộ anh chị n è t i ph ng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Cuối lời cảm n tới gia đình n è đồng hành giúp đỡ sẻ chia khích lệ em học tập nghiên cứu sống Trong trình thực tập c ng q trình làm áo cáo thực tập thời gian có h n trình độ k n ng ản th n c n nhiều h n chế nên đề tài khơng thể tránh kh i sai sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô n để đề tài em hoàn thiện h n Hà Nội ngày tháng n m 2022 Sinh viên Hoàng Thảo Nguyên ii MỤC LỤC LỜI CAM OAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP x CHƯƠNG I: MỞ ẦU 1.1 t vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu c y đậu tư ng 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân lo i 2.1.3 Giá trị c y đậu tư ng 2.1.4 c tính sinh học giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 2.2 Tổng quan tình hình sản xuất đậu tư ng nước giới 2.2.1 Tình hình sản xuất đậu tư ng giới 2.2.2 Tình hình sản xuất đậu tư ng nước 10 2.3 Khả n ng tái sinh in vitro c y đậu tư ng 11 2.3.1 Ảnh hưởng vật liệu nuôi cấy đến khả n ng tái sinh in vitro 11 2.3.2 Ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy đến khả n ng tái sinh in vitro 12 iii 2.4 Những nghiên cứu chọn t o giống đậu tư ng 16 2.4.1 Trên giới 16 2.4.2 T i Việt Nam 17 2.5 Tiềm n ng ứng dụng công nghệ chuyển gen CRISPR/Cas9 19 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU21 3.1 ối tượng vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 ối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2 Hóa chất, thiết bị, thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2.1 Hóa chất 21 3.2.2 Dụng cụ, thiết bị 22 3.2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nội dung phư ng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả n ng cảm ứng t o đa chồi giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 23 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu môi trường kéo dài chồi cho giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 25 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu khả n ng rễ giống đậu tư ng DT2010, T37 T51 26 3.3.4 Nội dung 4: Thử nghiệm chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 vào giống đậu tư ng tối ưu khả n ng tái sinh 27 3.4 Các phư ng pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết đánh giá khả n ng nảy mầm giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 điều kiện in vitro 28 4.2 Kết đánh giá ảnh hưởng BAP đến khả n ng cảm ứng t o đa chồi giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 31 4.3 Kết đánh giá ảnh hưởng nước dừa đến khả n ng kéo dài chồi 37 iv 4.4 Kết đánh giá khả n ng rễ t o hoàn chỉnh giống đậu tư ng môi trường RM 41 4.5 Áp dụng quy trình tái sinh cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 44 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 54 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 58 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine CCM : Môi trường đồng nuôi cấy (Co-cultivation medium) CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cs : Cộng CT : Công thức FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations GA3 : Gibberellic Acid GM : Môi trường nảy mầm (Germination medium) GSO : Tổng cục thống kê (General Statistics Office) IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid Kinetin : Furfurylaminopurine MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : α-Naphthalene acetic acid RM : Môi trường rễ (Rooting medium) SEM : Môi trường kéo dài chồi (Shoot elongation medium) SIM : Môi trường cảm ứng t o chồi (Shoot induction medium) YEB : Dịch chiết nấm men nuôi khuẩn Agrobaceria (Yeast Extract Broth) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng đậu tư ng nước hàng đầu giới (nghìn tấn) Bảng 2.2: N ng suất đậu tư ng nước hàng đầu giới (t /ha) Bảng 2.3: Diện tích trồng đậu tư ng nước hàng đầu giới (triệu ha) Bảng 2.4: Tình hình sản xuất đậu tư ng Việt Nam n m gần đ y 10 Bảng 4.1: Tỷ lệ nảy mầm mẫu xanh giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 sau nảy mầm môi trường GM 28 Bảng 4.2: Số lượng rễ trung bình chiều dài rễ trung bình giống đậu tư ng thời điểm 7, 14 21 ngày 41 Bảng 4.3: Tỷ lệ mẫu sống mẫu chết bổ sung hàm lượng glufosinate khác 45 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Hình ảnh nảy mầm giống đậu tư ng DT2010 T37 T51 thời điểm 0, ngày sau cấy vào môi trường GM 31 Hình 4.2: Ảnh hưởng BAP đến khả n ng t o chồi giống đậu tư ng DT2010 32 Hình 4.3: Hình ảnh cảm ứng t o chồi giống đậu tư ng DT2010 môi trường SIM có bổ sung nồng độ BAP khác thời điểm 7, 14 21 ngày 33 Hình 4.4: Ảnh hưởng BAP đến khả n ng t o chồi giống đậu tư ng T37 34 Hình 4.5: Hình ảnh cảm ứng t o chồi giống đậu tư ng T37 môi trường SIM có bổ sung nồng độ BAP khác thời điểm 7, 14 21 ngày 35 Hình 4.6: Ảnh hưởng BAP đến khả n ng t o chồi giống đậu tư ng T51 35 Hình 4.7: Hình ảnh cảm ứng t o chồi giống đậu tư ng T51 mơi trường SIM có bổ sung nồng độ BAP khác thời điểm 7, 14 21 ngày 36 Hình 4.8: Ảnh hưởng nước dừa đến khả n ng kéo dài chồi giống đậu tư ng DT2010 38 Hình 4.9: Hình ảnh kéo dài chồi giống đậu tư ng DT2010 mơi trường SEM có bổ sung lượng nước dừa khác thời điểm 7, 14 21 ngày 38 Hình 4.10: Ảnh hưởng nước dừa đến khả n ng kéo dài chồi giống đậu tư ng T37 39 Hình 4.11: Hình ảnh kéo dài chồi giống đậu tư ng T37 mơi trường SEM có bổ sung lượng nước dừa khác thời điểm 7, 14 21 ngày 39 Hình 4.12: Ảnh hưởng nước dừa đến khả n ng kéo dài chồi giống đậu tư ng T51 40 viii BAP0-14 99.405 A BAP0-7 36.905 BAP0.5-21 22.024 BAP0.5-14 14.881 D BAP2-21 10.119 D E BAP1-21 9.524 D E BAP1.5-21 8.333 D E BAP2-14 7.143 E F BAP1.5-14 5.357 E F G BAP1-14 4.167 E F G BAP0.5-7 0.595 F G BAP1-7 0.595 F G BAP2.5-14 0.595 F G BAP2.5-21 0.595 F G BAP1.5-7 0.000 G BAP2-7 0.000 G BAP2.5-7 0.000 G B C Summary (LS means) - Media: % chồi có rễ BAP0-7 36.905 b BAP0-21 100.000 a BAP0-14 99.405 a BAP0.5-7 0.595 fg BAP0.5-14 14.881 d BAP0.5-21 22.024 c BAP1-7 0.595 fg BAP1-14 4.167 efg BAP1-21 9.524 de BAP1.5-7 0.000 g BAP1.5-14 5.357 efg BAP1.5-21 8.333 de BAP2-7 0.000 g BAP2-14 7.143 ef BAP2-21 10.119 de BAP2.5-7 0.000 g BAP2.5-14 0.595 fg BAP2.5-21 0.595 fg Pr > F(Model) F(Model) F(Model) F(Model) Significant F(Model) F(Model) F(Model) Significant C E E F F chiều dài rễ