Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm real time rt pcr định lượng hbv rna trong huyết thanh người

So sánh với các nghiên cứu đã kế thừaĐã bổ sung phần thảo luận so sánh kết quả khoảng định lượng và độ đặc hiệu của phản ứng Real-time RT-PCR và toàn bộ quy trình phân tích với các nghiê

LUẬ N VĂN TH ẠC SĨ Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm

trong huyết thanh người

ĐỖ THỊ PHƯỢNG

dothiphuong1224@gmail.com

Ngành Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm

trong huyết thanh người

ĐỖ THỊ PHƯỢNG

dothiphuong1224@gmail.com

Ngành Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

Chữ kí của GVHD

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập Tự do – – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn : Đỗ Thị Phượng

Đề tài luận văn: “Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm Real-time RT PCR định lượng HBV RNA trong huyết thanh người”.-

-Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số SV: CB170122

Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày28/10/2020 với các nội dung sau:

STT Nội dung Hội đồng yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi của học viên

- Mục 1.5.2; phần b; dòng 7-13 và 20 23 từ trên xuống; trang 28 với nội dung kế thừa quy trình sản xuất hai enzyme MMLV RTase và Hotstart TaqDNA polymerase

-2

Bổ sung phần tổng

quan các thông tin

liên quan đến quy

định về kiểm định

HBV của nhà nước

Đã bổ sung Quyết định số 3310/QĐ BYT về việc ban hành hướng dẫn chẩn đoán, điều trị bệnh viêm gan vi rút B, đối với bệnh nhân viêm gan

-B mãn tính trong Chương 1; mục 1.2; dòng thứ

19-25 từ trên xuống; trang 8

yêu cầu chỉnh sửa

68, 69, 70 và 81

4 C i thi n nh y củảa bộ sinh ph m ệ độ ẩạ

- Trong phần tổng quan của đề tài, h c viê ó ọ n c đề cập đến kết quả được tham khảo từ Bộ sinh phẩm HBV-SAT của Rendu, Thượng Hải, Trung Quốc công bố ngưỡng phát hiện (LOD) là 100 phiên bản/ mL

- Sản phẩm của luận văn là bộ sinh phẩm HBVRNALOAD có mục đích sử dụng để định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người có khoảng định lượng (LOQ) từ 10 phiên bản/µL trở lên Trong khuôn khổ của luận văn này học viên chỉ khảo sát hai chỉ tiêu: LOQ và độ đặc hiệu

Hai chỉ tiêu LOD và LOQ không so sánh đượcvới nhau do đó chưa thể kết luận được bộ sinh phẩm HBV-SAT là nhạy hơn so với bộ sinh phẩm HBV-RNALOAD

- Để cải thiện độ nhạy của bộ sinh phẩm có các cách tiếp cận sau:

+ Tăng lượng thể tích đầu vào của RNA khuôn trong phản ứng Real-time RT-PCR lên 20 µL; + Tăng lượng thể tích mẫu bệnh phẩm dùng cho quá trình tách chiết RNA (ví dụ: dùng 1 mL thay

vì 200 µL như trong quy trình hiện nay)

yêu cầu chỉnh sửa

thực hiệ được Do vậy, trong khuôn khổ của luận n văn này học viên chỉ xác định hoạt tính tương đối thông qua lượng thể tích của hai enzyme trong một phản ứng Real-time RT-PCR

Ngày tháng 11 15 năm 2020

TS Lê Quang Hòa Đỗ Thị Phượng

PGS TS Tô Kim Anh

Đề tài: “Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người”.

Giáo viên hướng dẫn

Ký và ghi rõ họ tên

Tôi là Đỗ Thị Phượng, học viên cao học khoá 2017B, mã số học viên: CB170122, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinhhọc, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Lê Quang Hòa

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Học viên

Đỗ Thị Phượng

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, người thầy đã hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Những nhận xét, đánh giá và gợi ý về hướng giải quyết vấn đề trong suốt thời gian nghiên cứu thực sự là những bài học quý giá đối với em không chỉ trong quá trình viết luận văn mà cả trong quá trình công tác sau này

Em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Phạm Tiến Dũng cùng các anh, chị, em sinh viên đang học tập và nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học Trường Đại học Bách – khoa Hà Nội đã tận tình chỉ dẫn, truyền đạt những ý kiến chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập

Tóm tắt nội dung luận văn

Viêm gan vi rút (VR) được xem như một nhóm bệnh truyền nhiễm phổ biến

và nguy hiểm Tải lượng HBV DNA là dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân VGBMT và làm cơ sở để đưa ra biện pháp chống VR hiệu quả Kock và cộng

-sự lần đầu tiên phát hiện HBV RNA trong huyết thanh vào năm 1996 Cho đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy HBV RNA được xem như dấu ấn tiềm -năng trong việc tối ưu hóa quá trình điều trị Với kết quả của các nhóm nghiên cứu

-đã công bố và vai trò tiềm năng trong việc định lượng HBV RNA, tôi đề xuất đề

-tài: “Hoàn thiện và kiểm định sinh phẩm real-time RT-PCR định lượng HBV

-RNA trong huyết thanh người” với hai mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình phân tích định lượng HBV RNA trong huyết thanh người dựa trên kỹ thuật real-time RT-PCR;

-2 Sản xuất thử nghiệm và kiểm định sinh phẩm real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người

Kết quả của luận văn đã hoàn thiện được quy trình phâm tích định lượng HBVRNA trong huyết thnah dựa trên kỹ thuật Real-time RT PCR Bộ sinh phẩm gồm 2 -hợp phần tách chiết và hợp phần Real-time RT-PCR đã được xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm với số lượng 10 kit (10 test/kit), với khoảng định lượng

-từ 10 phiên bản/µL trở lên và không có phản ứng chéo với vi rút viêm gan A và vi rút viêm gan C Bộ sinh phẩm có độ ổn định trong 1 tháng với hợp phần tách chiết được bảo quản ở nhiệt độ phòng và hợp phần Real time được bảo quản ở - -300C đến -180C Kết quả của luận văn phù hợp với mục tiêu ban đầu của đề tài Đề tài có tính khoa học thực tiễn cao

HỌC VIÊN

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi rút viêm gan B 3

1.1.1 Cấu tạo vi rút viêm gan B 3

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm và nhân bản của vi rút viêm gan B 5

1.2 Hiện trạng của bệnh VGB và phương pháp điều trị 6

1.3 Theo dõi kiểm soát nhiễm HBV mạn tính 9

1.3.1 Các dấu ấn vi rút học ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 9

1.3.2 Các xét nghiệm định lượng hiện nay về dấu ấn vi rút học 11

1.3.3 Vai trò của dấu ấn phân tử HBV-RNA trong huyết thanh 13

1.4 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA và ứng dụng trong đánh giá đáp ứng điều trị VGBMT 17

1.4.1 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA trên thế giới 17

1.4.2 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA tại Việt Nam 22

1.5 Kỹ thuật Real time RT-PCR 23

1.5.1 Nguyên lý chung thiết kế kỹ thuật Real-time PCR 23

1.5.2 Phản ứng Real-time RT-PCR một bước (one step RT-qPCR) 24

1.6 Phương pháp tách chiết axit nucleic 31

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 35

2.3 Vật liệu nghiên cứu 35

2.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ 35

2.3.2 Hóa chất 35

2.4 Phương pháp nghiên cứu 36

2.4.1 Phương pháp RT-qPCR một bước 36

2.4.3 Phương pháp tách chiết RNA từ huyết thanh 38

2.4.2 Phương pháp sản xuất enzyme Hotstar Taq DNA polymerase và MMLV reverse transcriptase 39

2.5 Thiết kế nghiên cứu 40

2.5.1 Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA với Hotstart Taq DNA polymerase và MMLV reverse transcriptase tự sản xuất 43 2.5.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết HBV-RNA từ huyết thanh 48 2.5.3 Xác định các đặc tính của bộ sinh phẩm định lượng HBV-RNA trong huyết thanh đã xây dựng 48 2.5.4 Xây dựng quy trình bảo quản kit Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 49 2.5.5 Thiết kế và xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 50 2.5.6 Ứng dụng quy trình đã xây dựng để chế tạo kit Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 50 2.5.7 Xác định độ ổn định của bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 51 2.5.8 Kiểm định thử nghiệm bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 52 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54

3.1 Thiết lập quy trình chế tạo bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng RNA trong huyết thanh người 54 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme Hotstart Taq DNA polymerase

HBV-và MMLV reverse transcriptase tự sản xuất đến hiệu quả khếch đại 54 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần phản ứng tới hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 56 3.1.3 Tối ưu hóa quy trình tách chiết HBV-RNA từ huyết thanh 64 3.1.4 Khảo sát các đặc tính của toàn bộ quy trình phân tích định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 68 3.1.5 Thử nghiệm khả năng bảo quản phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA ở dạng đông khô và dạng dung dịch 70 3.1.6 Quy trình chế tạo bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 72

3.2 Sản xuất bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 75 3.2.1 Sản xuất thử nghiệm sinh phẩm 75 3.2.2 Khảo sát độ ổn định của bộ sinh phẩm định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 80 3.3 Kiểm định thử nghiệm bộ sinh phẩm HBV-RNALOAD 82 3.3.1 Kiểm định thử nghiệm khoảng định lượng của sinh phẩm HBV-RNALOAD 82 3.3.2 Kiểm định thử nghiệm độ đặc hiệu của sinh phẩm HBV-RNALOAD 85

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

(Chu kỳ định lượng)

cccDNA Covalently closed circular DNA

(DNA mạch vòng khép kín công hóa trị)

MMLV RTase Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase

(RNA tiền thể gen)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần Real-time RT-PCR 37

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt RT-qPCR 37

Bảng 2.3 Mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 2.4 Tóm tắt nội dung và công việc thực hiện 41

Bảng 2.5 Thành phần Real-time PCR kiểm tra hoạt tính Hotstart Taq DNA polymerase tự sản xuất 43

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt Real-time PCR kiểm tra hoạt tính Hotstart Taq DNA polymerase tự sản xuất 44

Bảng 2.7 Thành phần Real-time RT-PCR kiểm tra hoạt tính MMLV reverse transcriptase tự sản xuất 44

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm Hotstart Taq DNA polymerase đến hiệu quả khếch đại của phản ứng Real-time PCR phát hiện DNA của HBV 54

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm MMLV reverse transcriptase đến hiệu quả khếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 55

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme Hotstart Taq DNA polymerase và MMLV reverse transcriptase đến hiệu quả khếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 57

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 58

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 59

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 59

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 59

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp và kéo dài mồi đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HBV 60

Bảng 3.9 So sánh giá trị R2 và hiệu quả khếch đại của Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA tại các nhiệt độ bắt cặp và kéo dài mồi khác nhau 62

Bảng 3.10 Độ tuyến tính và khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR

đã xây dựng so với kit thương mại SuperScriptTM III PlatinumTM

One-Step qRT-PCR kit 63

Bảng 3.11 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA HBV đã xây dựng 64

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của CH3COONa và xử lý DNase đến hiệu suất thu hồi HBV-RNA bằng phương pháp tinh sạch qua cột silica 65

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của CH3COONa và xử lý DNase đến hiệu suất loại HBV-DNA bằng phương pháp tinh sạch qua cột silica 66

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của Trizol đến hiệu suất thu hồi HBV-RNA 66

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của Trizol đến hiệu suất loại HBV-DNA 66

Bảng 3.16 Hiệu suất thu hồi HBV-RNA khi sử dụng sinh phẩm tách chiết thương mại và sinh phẩm tách chiết tự sản xuất 67

Bảng 3.17 Hiệu suất loại HBV-DNA khi sử dụng sinh phẩm tách chiết thương mại và sinh phẩm tách chiết tự sản xuất 67

Bảng 3.18 Khảo sát khoảng định lượng của toàn bộ quy trình định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người 68

Bảng 3.19 Độ đặc hiệu của toàn bộ quy trình phân tích định lượng HBV-RNA 69

Bảng 3.20 Khả năng bảo quản hỗn hợp phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA ở dạng đông khô qua các giai đoạn 70

Bảng 3.21 Khả năng bảo quản phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA ở dạng dung dịch qua các giai đoạn 71

Bảng 3.22 Thành phần sinh phẩm tách chiết HBV-RNA 72

Bảng 3.23 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 73

Bảng 3.24 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 73

Bảng 3.25 Thành phần của Mix 5X cho 100 bộ sinh phẩm 74

Bảng 3.26 Thành phần của hỗn hợp mồi và mẫu dò 25X cho 100 bộ sinh phẩm 74

Bảng 3.27 Khảo sát khoảng định lượng của bộ sinh phẩm định lượng HBV-RNA sau 1 tháng bảo quản bộ sinh phẩm 80

Bảng 3.28 độ đặc hiệu của toàn bộ quy trình phân tích sau 1 tháng 82

Bảng 3.29 Kết quả kiểm định khoảng định lượng của bộ sinh phẩm với 10 mẫu huyết thanh âm tính 83

Bảng 3.30 Kết quả kiểm định khoảng định lượng của bộ sinh phẩm với 10 mẫu

huyết thanh âm tính nhiễm chủ động 20 copies/µL 83Bảng 3.31 Kết quả kiểm định khoảng định lượng của bộ sinh phẩm với 10 mẫu

huyết thanh âm tính nhiễm chủ động 200 copies/µL 84Bảng 3.32 Kết quả kiểm định khoảng định lượng của bộ sinh phẩm với 10 mẫu

huyết thanh âm tính nhiễm chủ động 2000 copies/µL 85Bảng 3.33 Độ đặc hiệu của toàn bộ quy trình phân tích khi kiểm định 86

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hạt vi rút viêm gan B hoàn chỉnh 3

Hình 1.2 Hình dạng và cấu tạo bộ gen của vi rút viêm gan B 4

Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân bản của HBV 5

Hình 1.4 Phân bố của HBV trên toàn cầu 7

Hình 1.5 Cơ chế tác động của các thuốc điều trị VGBMT 9

Hình 1.6 Mô hình tạo ra các nucleocapsid chứa pgRNA và khả năng lây nhiễm 17

Hình 1.7 Nguyên lý của phản ứng Real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman 23

Hình 1.8 Nguyên tắc của kỹ thuật RT-qPCR một bước và hai bước 24

Hình 1.9 Quá trình phiên mã ngược dưới tác dụng của MMLV RTase 27

Hình 1.10 Ảnh hưởng của NH4+ và K+ đến quá trình bắt cặp mồi 30

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 36

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết RNA bằng phương pháp tinh sạch qua cột silica 38

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết RNA của vi rút bằng phương pháp sử dụng cột silica kết hợp với xử lý Trizol 39

Hình 2.4 Quy trình sản xuất Hotstart Taq DNA polymerase 40

Hình 2.5 Quy trình sản xuất MMLV reverse transcriptase 40

Hình 3.1 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị Cq của phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA đã xây dựng và log10 của nồng độ HBV-RNA ở nhiệt độ bắt cặp và kéo dài mồi là 56°C 61

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị Cq của phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA đã xây dựng và log10 của nồng độ HBV-RNA ở nhiệt độ bắt cặp và kéo dài mồi là 58°C 61

Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị Cq của phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA đã xây dựng và log10 của nồng độ HBV-RNA ở nhiệt độ bắt cặp và kéo dài mồi là 60°C 61

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa log10 lượng HBV-RNA đích và giá trị Cq khi sử dụng sinh phẩm tự sản xuất và sinh phẩm thương mại SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit 63 Hình 3.5 Đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa Lg[RNA] và Cq đối với

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình chế tạo bộ sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng

HBV-RNA trong huyết thanh người 75Hình 3.7 Bộ sinh phẩm HBV-RNALOAD dùng để định lượng HBV-RNA trong

huyết thanh người 75Hình 3.8 Đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa Lg[RNA] và Cq đối với

khoảng định lượng của bộ sinh phẩm định lượng HBV-RNA sau 1 tháng 81

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm vi rút viêm gan B là một vấn đề có tính chất toàn cầu Khoảng 30% dân số trên thế giới (tức 2 tỷ người) bị nhiễm VR viêm gan B, trong đó 350 triệu người mang vi rút VGBMT Hàng năm, ước tính trên thế giới có tới một triệu người mang vi rút VGBMT chết vì ung thư gan nguyên phát và xơ gan [1] VR viêm gan B là tác nhân gây ung thư đứng thứ hai sau thuốc lá [2] Việt Nam nằm

ở Châu Á là khu vực có sự lưu hành của HBsAg cao nhất thế giới Tỷ lệ lưu hành HBsAg ở nước ta nằm trong khoảng từ 10-25% [3], [4]

Tải lượng HBV-DNA là dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân VGBMT

và làm cơ sở để đưa ra biện pháp chống VR hiệu quả Việc chẩn đoán định lượng HBV-DNA đóng vai trò rất quan trọng để đưa ra phác đồ điều trị phù hợp, đồng thời đánh giá được hiệu quả điều trị với bệnh nhân VGBMT Phần lớn các xét nghiệm định lượng HBV-DNA được sử dụng trên lâm sàng đều dựa trên nguyên

lý khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR) Tuy nhiên, khó khăn trong việc

sử dụng chỉ số nồng độ HBV-DNA trong huyết tương để đánh giá là tìm ra giới hạn có ý nghĩa được sử dụng để xác định các chỉ định điều trị và sự đáp ứng Do HBV-DNA tồn tại trong cả huyết thanh của những người đã khỏi sau khi nhiễm HBV cấp tính [5] Do vậy, để đưa ra tiên lượng trong quá trình điều trị và đánh giá hiệu quả điều trị của bệnh nhân VGBMT cần có phương pháp tối ưu hơn

Kock và cộng sự lần đầu tiên phát hiện HBV-RNA trong huyết thanh vào năm 1996 [6] Cho đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy HBV-RNA được xem như dấu ấn tiềm năng trong việc tối ưu hóa quá trình điều trị, bao gồm: Thay đổi các thuốc kháng VR đường uống hoặc chuyển sang các tác nhân điều hòa miễn dịch Ngoài ra, HBV-RNA còn là một marker sinh học dự đoán cho việc ngừng điều trị an toàn các thuốc ức chế quá trình phiên mã ngược của HBV [7], [8], [9], [10] Bên cạnh đó, HBV-RNA còn được xem như yếu tố dự đoán sớm sự xuất hiện đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị bằng lamivudine, nguy cơ phát triển đột biến kháng thuốc cao ở các bệnh nhân có nồng độ HBV-RNA cao [9]

Hiện tại, chưa có các bộ sinh phẩm thương mại định lượng RNA của HBV

ở các bệnh nhân VGBMT Trên thế giới, nhiều nhóm nghiên cứu đã phát triển các quy trình định lượng này trong huyết thanh và trong mô gan của người bệnh

Tất cả các quy trình phân tích được phát triển dựa trên kỹ thuật Real-time PCR vốn có độ nhạy phát hiện cao và khả năng định lượng với khoảng tuyến tính rộng [7], [11] Tuy nhiên, các quy trình Real-time RT-PCR đã được nghiên cứu phát triển và áp dụng đều là các quy trình hai bước (phản ứng phiên mã ngược và PCR được thực hiện trong 2 ống phản ứng riêng rẽ), không phù hợp với phân tích trong môi trường bệnh viện cần giảm thiểu thao tác và loại bỏ triệt để các vấn đề nhiễm chéo Mặt khác, các nghiên cứu đều chưa xác định được độ đặc hiệu cũng như độ nhạy đối với các kiểu gen HBV khác nhau

RT-Năm 2019, Yayun Liu và đồng tác giả đã thực hiện định lượng RNA bằng phương pháp Real-time RT-PCR bằng cách sử dụng bộ sinh phẩm HBV-SAT (Rendu, Thượng Hải, Trung Quốc) [12]

HBV-Với kết quả của các nhóm nghiên cứu đã công bố và vai trò tiềm năng

trong việc định lượng HBV-RNA, tôi đề xuất đề tài: “Hoàn thiện và kiểm định

sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người” với hai mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình phân tích định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR;

2 Sản xuất thử nghiệm và kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA trong huyết thanh người

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi rút viêm gan B

1.1.1 Cấu tạo vi rút viêm gan B

Năm 1964, Blumberg đã phát hiện kháng nguyên liên quan đến bệnh viêm gan, truyền qua huyết thanh, với tên gọi kháng nguyên Châu Úc [13] Sau này, các nhà khoa học đã chứng minh đó là kháng nguyên bề mặt của VR viêm gan B (HBsAg - Hepatitis B surface antigen) Năm 1970, Dane đã phát hiện dưới kính hiển

vi điện tử các hạt nhỏ, đường kính khoảng 42 nm (Hạt Dane) [14] Các nghiên cứu sau này đã khẳng định hạt Dane là những hạt VR hoàn chỉnh [14], [15]

Hình 1.1 Cấu trúc hạt vi rút viêm gan B hoàn chỉnh [16]

(Nguồn: https://www.researchgate.net/)

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, DNA hai sợi không khép kín, được cấu tạo bởi 3.200 cặp acid nucleotid, trọng lượng phân tử 2 x 106 dalton Dưới kính hiển vi điện tử người ta tìm thấy 3 kiểu cấu trúc của HBV trong huyết thanh bệnh nhân:

Hạt Dane: Có đường kính khoảng 42 nm, bao gồm 3 lớp: Lớp vỏ bao ngoài chứa kháng nguyên HBsAg Vỏ capsid được cấu tạo từ kháng nguyên lõi (Hepatitis B core antigen - HBcAg) Lớp trong cùng có chứa ADN hai sợi không khép kín và các enzyme như ADN polymerase, protein kinase

Cấu trúc hình ống hay hình trụ có đường kính 20 nm, chiều dài từ 40 – 400 nm

Cấu trúc hình cầu có đường kính 17 – 25 nm Hai cấu trúc này chính là phần kháng nguyên bề mặt của HBV nên mang đặc tính như HBsAg [15]

a (Nguồn: http://thuoc.net.vn) b (Nguồn: https://www.researchgate.net/)

Hình 1.2 Hình dạng và cấu tạo bộ gen của vi rút viêm gan B

a Ba dạng cấu trúc của vi rút viêm gan B, quan sát bằng kính hển vi điện tử: Hạt Dane, hình ống hay trụ và các hạt hình cầu;

b Cấu tạo bộ gene HBV

Phân tử DNA của HBV gồm hai mạch đơn có chiều dài khác nhau: Một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định, bao gồm: Gene S, C, P và X, cụ thể:

 Gene S (Surface): Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm 3 vùng (pre S1, pre S2 và S) mã hóa ba loại protein của HBsAg; vùng S mã hóa protein nhỏ S-HBsAg (Small HBsAg) là protein chủ yếu; vùng S và pre S2 mã hóa protein trung bình M-HBsAg (Medium HBsAg); vùng S, pre S2 và pre S1 mã hóa protein lớn L-HBsAg (Large HBsAg);

 Gene C (Core) mã hóa cho các polypeptide ở phần lõi của vi rút, gồm kháng nguyên lõi HBcAg Trình tự pre C mã hóa HBeAg;

 Gene P (Polymerase): Chiếm ¾ bộ gene của vi rút, bao trùm toàn bộ gene

S, một phần đầu của gene C và phần cuối của gene X Gene P mã hóa một polypeptide cơ bản, có hoạt tính DNA polymerase và ribonuclease H;

 Gene X có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một polypeptide gồm 154 acid amin

Các kiểu gen HBV khác nhau dẫn đến sự không đồng nhất trong các biểu hiện lâm sàng và đáp ứng điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở các vùng khác nhau trên thế giới [17] Cho đến nay, đã xác định 10 kiểu gen HBV (A-J) và

một số phân tuyp khác nhau, được xác định bằng sự phân kỳ trong toàn bộ trình

tự bộ gen của HBV và sự phân bố địa lý riêng biệt Genotype A được tìm thấy như là một yếu tố nguy cơ độc lập cho sự tiến triển của nhiễm trùng mạn tính và

sự tồn tại lâu dài sau khi bị nhiễm HBV [18], [19] Nhiễm trùng cấp tính với các kiểu gen A và D dẫn đến tỉ lệ mạn tính cao hơn so với các kiểu gen B và C Bệnh nhân có kiểu gen C và D có tỷ lệ chuyển đổi huyết tương HBeAg thấp hơn so với genotype A và B [20]

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm và nhân bản của vi rút viêm gan B

Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân bản của HBV [21]

Quá trình sao chép HBV mở đầu bằng việc gắn virion vào thụ thể đặc hiệu của vi rút trên bề mặt tế bào gan được gọi là NTCP (Na+/taurocholate co-transporting polypeptide) qua các protein pre S Lớp vỏ của vi rút sau đó hòa với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsid vi rút vào bào tương Từ đây, HBV-DNA được vận chuyển vào trong nhân tế bào gan và chuyển thành dạng cccDNA nhờ các emzyme của tế bào chủ thể Trong quá trình nhiễm VGBMT với sự giảm nhân lên của vi rút và cccDNA trở thành dạng chủ yếu của HBV-DNA với các bể ổn định từ 5-50 phân tử cccDNA trong mỗi nhân tế bào gan nhiễm cccDNA được dùng làm khuôn để tổng hợp các loại RNA thông tin với

các kích thước khác nhau bao gồm: 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7kb Các RNA này được gắn đuôi và di chuyển ra ngoài tế bào chất thực hiện chức năng Sau khi pgRNA (pregenome RNA) được tổng hợp, nó được đóng gói trong vỏ nucleocapsid và chuyển vào bào tương, bắt đầu quá trình sao chép bộ gen

pgRNA là một bản sao dài hơn chiều dài của bộ gene, chứa các vùng lặp đồng hướng (DR-Direct Repeat), kích thước 10 bp (DR1 và DR2) đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép ngược Tín hiệu capsid hóa có mặt ở cả hai đầu 5’ và 3’ cho phép đóng gói RNA vào nucleocapsid vi rút Quá trình sao chép ngược xảy ra bên trong capsid này [22]

Polymerase vi rút gắn vào đầu 5’ của chuỗi pgRNA Sau quá trình gắn mồi ban đầu của ba nucleotide, polymerase di chuyển tới chuỗi DR1 gần đầu 3’,

sự tổng hợp của chuỗi âm nhờ hiện tượng sao chép ngược bắt đầu ngay sau khi chuỗi pgRNA phân huỷ Một trình tự RNA 18 bp sau đó được chuyển tới DR2 của chuỗi DNA âm tính để làm mồi cho quá trình tổng hợp chuỗi dương

Để hình thành các virion mới, hầu hết các capsid chứa HBV-DNA mới tổng hợp được vận chuyển đến lưới nội chất và được bọc vỏ gồm hai lớp lipid có chứa các protein bề mặt Các virion được tiếp tục xử lý thông qua bộ máy Golgi trước khi rời khỏi tế bào dưới dạng các virion hoàn chỉnh

1.2 Hiện trạng của bệnh VGB và phương pháp điều trị

Bệnh viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng và phổ biến nhất trên toàn cầu, dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh và tử vong đáng kể [23] Khoảng 1/3 dân số thế giới đã bị nhiễm HBV [24] Khoảng 5% dân số bị nhiễm

là người mắc VGBMT và 1/4 người bị nhiễm VGBMT mắc các bệnh gan nghiêm trọng như viêm gan mãn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan [24] Hàng năm, khoảng 780000 ca tử vong liên quan đến nhiễm HBV được ghi nhận trên toàn cầu [24]

Sự phân bố của HBV trên toàn cầu được thể hiện trong Hình 1.4:

Hình 1.4 Phân bố của HBV trên toàn cầu [25]

Tình hình nhiễm HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg dương tính mà phân chia thành 3 khu vực chính:

 Khu vực lưu hành thấp: Tỷ lệ người mang HBsAg dương tính chiếm khoảng 0,1 – 0,5% dân số như vùng Bắc Mỹ, Tây Âu và Úc Tỷ lệ dân số mang HBsAg cao nhất trong độ tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV

 Khu vực lưu hành trung bình: Tỷ lệ người mang HBsAg dương tính chiếm khoảng 2 – 7% dân số như ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ Độ tuổi bị lây nhiễm HBV cao nhất là từ 25 tuổi (Khoảng 50% dân số);

 Khu vực lưu hành cao: Tỷ lệ người mang HBsAg dương tính chiếm khoảng 8 – 15% dân số Đặc điểm dịch tễ học quan trọng ở khu vực này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường từ mẹ sang con Trung Quốc, Châu Phi và Đông Nam Á nằm trong khu vực này Ngoài ra,

sự lây nhiễm cũng xảy ra ở tuổi thiếu niên, do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình hoặc trong bạn bè Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có độ tuổi rất sớm, thường là sau 10 tuổi Tuy nhiên, bệnh lại được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như: Viêm gan mãn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan

Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ nhiễm HBV cao trên 8% [25] Đặc biệt, phần lớn bị nhiễm do lây truyền dọc từ mẹ sang con chiếm tỷ lệ 10% và 90% trong số đó chuyển sang VGBMT Tỷ lệ phụ nữ mang thai bị nhiễm viêm gan B chiếm từ 10-20% [26]

HBV lây bệnh cho người qua đường truyền máu bằng nhiều phương thức: Truyền máu, tiêm chích, quan hệ tình dục và mẹ truyền cho con; HBV không lây qua đường tiêu hóa Thời gian ủ bệnh trung bình 50 – 90 ngày Bệnh cảnh lâm sàng thường cấp tính nhưng không tạo dịch mà chỉ gây ra các ca bệnh đơn lẻ với các triệu chứng: Sốt, vàng da, vàng mắt và mệt mỏi Bệnh nhân diễn biến trở thành thể mạn tính chiếm 5 – 10% [15] HBV là nguyên nhân quan trọng gây viêm gan cấp, xơ gan và ung thư gan [27], [28], [29], [30]

Tiêm VX là biện pháp hiệu quả nhất để phòng bệnh viêm gan B WHO đưa ra chiến lược tiêm VX viêm gan B trong 24 giờ đầu sau sinh và tiêm đủ mũi

là cách phòng bệnh tốt nhất và có tính chất quyết định [28], [31], [30] Tính an toàn và hiệu quả bảo vệ phòng bệnh của VX viêm gan B đã được khẳng định trong vòng hơn 20 năm [1] Bên cạnh các biện pháp phòng bệnh bằng VX, thực hiện an toàn truyền máu ở các cơ sở y tế cũng rất quan trọng nhằm giảm thiểu tối

đa nguy cơ lây nhiễm HBV

Tại Việt Nam, theo Quyết định số 3310/QĐ-BYT về việc ban hành hướng dẫn chẩn đoán, điều trị bệnh viêm gan vi rút B, đối với bệnh nhân VGBMT chẩn đoán bằng các chỉ số HBsAg và/ hoặc DNA-HBV dương tính ≥ 6 tháng, hoặc HBsAg dương tính và anti-HBc IgM âm tính Trong Quyết định này cũng đưa ra chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút phù hợp cho từng giai đoạn của bệnh VGBMT căn cứ vào sự kết hợp 3 yếu tố: Nồng độ ALT, tải lượng DNA-HBV và mức độ xơ hóa gan

Khi mắc bệnh viêm gan B, bệnh nhân thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu

để tìm các dấu hiệu của bệnh gan Hai yếu tố được xem xét kĩ lưỡng là lượng siêu vi (tải lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu và các enzyme của gan để biết tình trạng tổn thương gan Bệnh viêm gan B không có thuốc điều trị đặc hiệu VGBMT thể tiến triển cần điều trị bằng thuốc kháng VR [32] Các loại thuốc có tác dụng chữa bệnh viêm gan B được chia thành 2 nhóm:

• Interferon (INF): Vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch, vừa có tác dụng kháng vi rút trực tiếp Loại thuốc của nhóm này là: Interferon alpha-2b và peginterferon alpha-2a [33]

• Thuốc kháng siêu vi: Bản chất là các đồng đẳng nucleoside/nucleotide (NAs), có tác dụng ức chế quá trình phiên mã ngược của HBV Tuy nhiên, điều trị lâu dài có thể dẫn tới xuất hiện các đột biến kháng thuốc Hiện có

5 loại thuốc nhóm này, bao gồm: Lamivudine (LMV), adefovir dipivoxil (ADV), telbivudine (LdT), tenofovir (TFV) và entecavir (EVT) [33]

Hình 1.5 Cơ chế tác động của các thuốc điều trị VGBMT [34]

1.3 Theo dõi kiểm soát nhiễm HBV mạn tính

1.3.1 Các dấu ấn vi rút học ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

a) Kháng nguyên bề mặt HBsAg

HBsAg là kháng nguyên bề mặt và là kháng nguyên đầu tiên phát hiện được sau khi nhiễm HBV, khoảng vài tuần trước khi có triệu chứng lâm sàng Trên thực tế, chỉ tiêu HBsAg là bằng chứng mang tính khẳng định cho tình trạng nhiễm HBV ở người bệnh

Trong viêm gan B cấp tính, HBsAg đạt nồng độ cao nhất tương ứng với thời kỳ vàng da trên lâm sàng sau đó có thể kéo dài 1-3 tháng và trở về âm tính sau khi men gan đã về giá trị bình thường HBsAg có thể dương tính trong nhiều tháng, nhiều năm ở người VGBMT, tuy nhiên tình trạng HBsAg âm tính vẫn không hoàn toàn loại trừ nhiễm HBV

b) Anti-HBs

Anti-HBs là kháng thể sinh ra do đáp ứng với kháng nguyên bề mặt của HBV Anti-HBs được xem như dấu ấn phản ánh tình trạng đã khỏi bệnh hoặc đã miễn nhiễm Anti-HBs xuất hiện khoảng 3 tháng sau khi bệnh khởi phát và thường khoảng 1-10 tuần sau khi người bệnh đạt trạng thái HBsAg âm tính

c) HBcAg

HBcAg là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapsid (kháng nguyên lõi), thường phát hiện trong nhân tế bào gan nhiễm HBV và không bao giờ xuất hiện trong máu

d) Anti-HBc

Anti-HBc là dấu ấn rất quan trọng để khẳng định bệnh nhân đã từng nhiễm HBV, do kháng thể này không được tạo ra trong tiêm chủng Đồng thời các lớp kháng thể (isotype) của anti-HBc còn có ý nghĩa trong chẩn đoán giai đoạn cấp hay mạn tính của nhiễm HBV Trong giai đoạn viêm gan B cấp tính, anti-HBc IgM dương tính ở nồng độ cao, sau đó sẽ giảm dần và biến mất trong giai đoạn mạn tính, lúc này chỉ còn anti-HBc IgG dương tính Tuy nhiên, anti-HBc IgM dương tính trong các đợt kịch phát cấp tính của viêm gan B mạn tính

h) HBV-DNA

HBV-DNA dương tính trong các giai đoạn VR đang hoạt động và nhân lên mạnh ở tế bào ký chủ Trong thực hành điều trị lâm sàng VGBMT, chỉ số nồng độ HBV-DNA có ý nghĩa quan trọng, là một trong các chỉ số quyết định liên quan đến quyết định điều trị, phác đồ điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị

i) HBV-RNA

Từ khi Kock và cộng sự lần đầu tiên phát hiện HBV-RNA trong huyết thanh vào năm 1996 [6] tới nay, dấu ấn HBV-RNA ngày càng được quan tâm nghiên cứu Hiện nay, quá trình điều trị cho bệnh nhân VGBMT vẫn dựa trên hai chỉ số HBsAg và HBeAg để quyết định thời điểm dừng điều trị Tuy nhiên, một

số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cần thiết phải định lượng HBV-RNA trong huyết thanh bên cạnh chỉ số HBV-DNA vì:

 HBV-RNA bùng phát trong huyết thanh là chỉ thị cho phép dự đoán sớm khả năng xuất hiện tính kháng thuốc ở HBV [9], [35];

 HBV-RNA giảm dần theo thời gian là chỉ thị cho phép đánh giá hiệu quả của liệu pháp điều trị đang sử dụng [7];

 HBV-RNA giảm dưới ngưỡng là chỉ thị cho phép dự đoán sớm khả năng chuyển đảo huyết thanh cũng như dừng điều trị ở người mắc VGBMT [36]

1.3.2 Các xét nghiệm định lượng hiện nay về dấu ấn vi rút học

a) Định lượng HBV- DNA

Phần lớn các xét nghiệm định lượng HBV-DNA được sử dụng trên lâm sàng đều dựa trên nguyên lý khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR) với ngưỡng phát hiện 50 – 200 IU/ml (250-1000 phiên bản/ml) [37] và giải đo lên tới 4-5 log10 IU/mL Gần đây, công nghệ PCR xét nghiệm HBV-DNA với độ nhạy cải thiện 5-10 IU/mL (25-50 phiên bản/ml), cho phép mở rộng giải đo lên tới 8-9 log10 IU/mL [38] Tải lượng HBV-DNA là một dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân VGBMT và làm cơ sở để đưa ra biện pháp điều trị chống VR hiệu quả

Như đã đề cập ở phần trên, khó khăn trong việc phát hiện nồng độ DNA trong huyết tương là tìm ra giới hạn có ý nghĩa, phản ánh đúng các chỉ định điều trị và sự đáp ứng Lượng HBV-DNA trong huyết tương > 20,000 IU/mL (tương đương > 105 phiên bản/mL) được lựa chọn như một tiêu chuẩn chẩn đoán VGBMT tại hội nghị của Viện Y tế quốc gia (National Institutes of Health-NIH)

HBV-tổ chức vào năm 2000 [39] Tuy nhiên, trong thực tế, VGBMT, xơ gan và HCC

đã gặp ở những bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA dao động lớn, từ không xác định được cho đến nồng độ > 2,000,000 IU/mL [40] Vậy nên, kiểm tra nồng độ HBV-DNA liên tục có vai trò quan trọng hơn là việc xác định một giá trị giới hạn

cụ thể trong việc tiên lượng và xác định sự cần thiết điều trị Hiện nay, cho rằng

nồng độ HBV-DNA thấp (3-5 log10 IU/mL) có thể liên quan đến sự tiến triển của bệnh gan và có thể cần điều trị, đặc biệt ở những bệnh nhân có HBeAg âm tính hoặc đã xơ gan tiến triển

b) Định lượng HBeAg và HBsAg

Ngoài nồng độ HBV-DNA, một số khảo sát lâm sàng đã cung cấp bằng chứng cho thấy mối quan hệ giữa các kháng nguyên khác tới sự tiến triển của VR trong người bệnh, ví dụ như kháng nguyên e (HBeAg) và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với quá trình tiến triển tự nhiên của bệnh cũng như bệnh nhân đáp ứng với điều trị kháng VR [5], [41] Theo đó, sự phát triển của những xét nghiệm định lượng các kháng nguyên quan trọng của VR (HBeAg và HBsAg) đã trở thành một trọng tâm trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng

Những phương pháp ban đầu cho việc định lượng HBeAg và HBsAg sử dụng một loạt các kỹ thuật, bao gồm: Miễn dịch phóng xạ, huỳnh quang, hóa phát quang (chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym) và điện di khuếch tán miễn dịch [42], [43] Một phương pháp miễn dịch hóa phát quang hoàn toàn tự động (Architect platform) được phát triển đầu tiên bởi Deguchi và CS [44] cho phép phát hiện và định lượng HBsAg với độ nhạy là 0.2ng/ml, phương pháp này

có tính hiệu quả tương đương hoặc cao hơn các phương pháp thương mại hóa khác Phương pháp Architect định lượng HBsAg dựa trên một đường chuẩn đã được chuẩn hóa bởi WHO, lượng HBsAg được định lượng theo đơn vị IU/ml với dải nồng độ 0.05 – 250 IU/ml Trong phương pháp này, HBeAg thường được bán định lượng và được báo cáo theo đơn vị mẫu/ngưỡng (S/N) Tuy nhiên, phương pháp này có một dải tuyến tính hợp lý cho phép đo trong phạm vi rộng của nồng

độ HBsAg dao động từ 0,05 đến 250 IU/ml, có thể biến đổi và tối ưu để trở thành phương pháp định lượng nhờ tham khảo phương pháp ngoại chuẩn Ngoài ra phương pháp này còn có thể định tính phát hiện các gen đột biến bề mặt Architect platform được sử dụng rộng rãi để định lượng HBeAg và HBsAg vì nó

là một xét nghiệm hoàn toàn tự động và có khả năng xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

Trong quá trình nhân lên của HBV, các sản phẩm protein như HBsAg có thể được tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy các tiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống Đây là một trong

những nguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu

ít có giá trị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn

1.3.3 Vai trò của dấu ấn phân tử HBV-RNA trong huyết thanh

a) Phát hiện dấu ấn phân tử HBV-RNA trong huyết thanh bệnh nhân VGBMT

Kock và cộng sự lần đầu tiên phát hiện HBV-RNA trong huyết thanh vào năm 1996 [6] Tuy nhiên, một vài năm gần đây vai trò của HB- RNA mới dần sáng tỏ và được ghi nhận Bên cạnh đó, bản chất của HBV-RNA trong huyết thanh cũng là một vấn đề được tranh cãi trong một thời gian dài Nhìn chung, người ta cho rằng sự trưởng thành của các nucleocapsid và sự đóng vỏ đòi hỏi quá trình tổng hợp HBV-DNA Tuy vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra sự trưởng thành của nucleocapsid có thể không phụ thuộc vào sự tổng hợp ADN với việc phát hiện các virion không chứa gen của HBV trong huyết thanh bệnh nhân VGBMT [45], [46], [47] Các pgRNA đã đóng gói cũng được bọc vỏ trong bào tương tế bào gan và giải phóng ra huyết thanh của bệnh nhân VGBMT, HBV-RNA được phát hiện trong huyết thanh chủ yếu là dạng pgRNA [35], [48] HBV-RNA xác định được ở các bệnh nhân VGBMT chưa được điều trị hoặc đã được điều trị thuốc kháng vi rút [49], [12]

Với các bệnh nhân VGBMT chưa qua điều trị kháng vi rút, HBV-RNA được xác định có trong huyết thanh và có xu hướng giảm theo các thời kỳ của nhiễm HBV mạn tính dựa trên phân tích cùng với sự giảm nồng độ HBeAg [12] Nồng độ HBV-RNA trong huyết thanh cũng được ghi nhận có mối tương quan rõ với các marker khác trong huyết thanh, bao gồm: HBV-DNA, HBsAg và HBeAg [35], [49], [36] M.J Van Campenhout thấy ở các bệnh nhân có HBeAg (+), nồng độ HBV-RNA huyết thanh có tương quan độc lập với genotype và đột biến Basal Core Promoter ở bệnh nhân chưa được điều trị kháng vi rút [50]

Yuhua Gao (2017) đặt ra giả thuyết liệu HBV-RNA có phải là marker

có giá trị nhất để phản ánh nồng độ cccDNA trong tế bào gan khi so sánh với HBV-DNA, HBsAg và HBeAg ở nhóm bệnh nhân VGBMT có HBeAg dương tính Nghiên cứu tiến hành trên 82 bệnh nhân ở thời điểm trước điều trị và 62 bệnh nhân sau điều trị NA 96 tuần Kết quả thu được có mối liên quan giữa

HBV-RNA, HBV-DNA, HBsAg, HBeAg huyết thanh và ccc DNA Tại thời điểm trước điều trị, cccDNA có mối liên quan chặt chẽ với HBV-DNA hơn

là với HBV-RNA Tuy nhiên không có sự liên quan nào giữa cccDNA và HBsAg

và HBeAg [51] Sau điều trị 96 tuần, cccDNA có tương quan tốt với HBsAg nhưng lại không tương quan với HBV-RNA, HBV-DNA và HBeAg

Tổng hợp HBV-RNA là một bước trung gian quan trọng trong chu trình của HBV HBV pgRNA sau khi tạo ra sẽ được đóng gói cùng với HBV-DNA polymerase và proteinkinase để tạo thành hạt lõi Trong hạt lõi, RNA tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp chuỗi AND trưởng thành theo cơ chế sao chép ngược [40]

Tải lượng các virion HBV-RNA giảm chậm hơn nhiều so với HBV-DNA

ở hầu hết các bệnh nhân VGBMT sau khi điều trị bằng các thuốc NA, đồng thời

tỷ lệ HBV-RNA virion/ HBV-DNA (HBV-RNA/DNA) tăng đáng kể cho thấy sự gia tăng tải lượng các virion HBV-RNA Ở các bệnh nhân được điều trị bằng các thuốc NA, quá trình sao chép ngược bị ức chế song không hoặc ít có tác dụng đối với sự sao mã của cccDNA, do đó các virion HBV-RNA vẫn được tiếp tục sản xuất kể cả khi HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện và được giải phóng vào trong huyết thanh làm tăng nồng độ các virion HBV-RNA [52]

Các nghiên cứu đã chỉ ra HBV-RNA huyết thanh phản ánh hoạt động sao mã của cccDNA trong tế bào gan của bệnh nhân VGBMT và hiệu quả của các thuốc

NA, đồng thời có khả năng dự đoán đáp ứng của VR trong quá trình điều trị và là yếu tố dự đoán chuyển đảo huyết thanh HBeAg sớm hơn ở các bệnh nhân được điều trị bằng thuốc NA, cũng như pegylated interferon α (pegylated interferon α 2a) HBV-RNA còn có vai trò trong dự đoán sự tái hoạt động HBV sau khi ngừng sử dụng các thuốc NA Chính vì vậy, định lượng HBV-RNA có thể giúp quyết định phác đồ điều trị ở bệnh nhân VGBMT, bao gồm thay đổi các thuốc kháng VR đường uống hoặc chuyển sang các tác nhân điều hòa miễn dịch Ngoài ra, HBV-RNA còn là một marker sinh học dự đoán cho việc ngừng điều trị an toàn các thuốc

NA [7]

HBV-RNA được cho là một yếu tố dự đoán sớm sự xuất hiện đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị bằng lamivudine, nguy cơ phát triển đột biến kháng

thuốc cao ở các bệnh nhân có nồng độ HBV-RNA cao Có thể theo dõi sự xuất hiện đột biến này bằng giải trình tự chuỗi HBV-RNA [9]

Sự tồn tại của các tiểu thể HBV-RNA trong huyết thanh mở ra giả thuyết chúng có thể gây tái nhiễm bệnh và góp phần gây nhiễm HBV kéo dài như trong

cơ chế gây bệnh của HBV, tuy nhiên còn chưa được khẳng định [52]

b) Vai trò của HBV-RNA trong theo dõi sau điều trị thuốc NAs

Hiện nay, có 2 sự lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân VGBMT là: sử dụng interferon (IFN) và các đồng đẳng nucleoside/nucleotide (NAs) [34] So với liệu pháp sử dụng các đồng đẳng nucleotide NAs, liệu pháp Peg-IFN có ưu điểm

là thời gian điều trị hữu hạn, không có hiện tượng kháng thuốc và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh kháng HBe cao hơn khi điều trị 12 tháng, vừa có tác dụng kháng

VR trực tiếp và tác dụng điều hòa miễn dịch nên nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV-DNA sau khi ngừng điều trị ở một nhóm bệnh nhân Liệu pháp Peg-IFN có nhược điểm là có nguy cơ xảy ra các tác dụng phụ do khả năng dung nạp kém [53] Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV-DNA và các biến chứng

ở hầu hết các bệnh nhân [54] Tuy nhiên, sự ức chế phiên mã ngược dưới tác dụng của NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự tổng hợp pgRNA của HBV ở bệnh nhân VGBMT hay tổng hợp protein VR như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ nguyên hoạt tính phiên mã [7], [55] Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời [56]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy các nucleocapsid chứa HBV pgRNA vẫn tiếp tục được đóng gói và chế tiết vào máu ngoại vi ngay cả khi sự tổng hợp HBV-DNA bị ức chế mạnh trong quá trình điều trị với NAs Điều này đã làm thay đổi quan niệm trước đây rằng sự đóng gói và chế tiết nucleocapsid vào máu ngoại vi cần sự có mặt của HBV-DNA để kích hoạt quá trình biến đổi cấu trúc của nucleocapsid Khi đó nucleocapsid được coi là trưởng thành và được chế tiết

ra ngoại bào nhưng cơ chế cho sự chọn lọc nucleocapsid trưởng thành vẫn chưa được biết rõ Quan điểm này chủ yếu dựa vào các nghiên cứu in-vitro cho thấy không phát hiện được các virion chứa RNA sợi đơn trong dịch nổi của tế bào ung thư gan được chuyển nạp HBV bị đột biến thiếu hoạt tính polymerase, do đó không tổng hợp được HBV-DNA [57] Luận điểm trên được củng cố thêm bằng

kết quả quan sát trên kính hiển vi điện tử lạnh (Cryo-EM) cho thấy sự khác biệt

có ý nghĩa về mặt cấu trúc giữa nucleocapsid chứa RNA và DNA [58]

Nghiên cứu gần đây của Jansen và CS đã cho thấy, nồng độ HBV-RNA xuất hiện trong máu ngoại vi ở bệnh nhân VGBMT điều trị bằng NAs cao hơn so với bệnh nhân điều trị bằng Peg-IFN và Adefovir, và mức độ giảm HBV-RNA có liên quan đến đáp ứng điều trị sau đó [7]

Trong phác đồ điều trị bằng NA, nồng độ HBV-DNA cho thấy giảm mạnh hơn so với HBV-RNA, kết quả là giá trị nồng độ HBV-RNA trung bình luôn cao hơn đáng kể so với nồng độ HBV-DNA trong suốt quá trình điều trị

ETV và TFV là những chất ức chế HBV mạnh, với hàng rào kháng thuốc cao Do đó, chúng được sử dụng như liệu pháp điều trị đầu tiên [59], [60] Ba loại thuốc NAs còn lại chỉ được sử dụng trong điều trị VGBMT nếu không có các loại thuốc mạnh hơn với hàng rào kháng thuốc cao LMV là một loại thuốc

có giá thành rẻ, nhưng gây ra tỷ lệ kháng thuốc rất cao khi điều trị dài hạn ADV kém hiệu quả hơn và đắt hơn TFV, dẫn đến tỷ lệ kháng thuốc cao hơn [34] LdT

là một chất ức chế mạnh đối với HBV [61] nhưng do hàng rào đề kháng thuốc thấp hơn nên tỷ lệ đề kháng cao đã thấy ở những bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA ban đầu cao và ở những người có HBV-DNA có thể phát hiện được sau 6 tháng của liệu pháp [62]

Câu hỏi đặt ra là, làm thế nào và khi nào thì điều chỉnh phác đồ trong quá trình điều trị VGBMT Liên quan đến vấn đề này, HBV-RNA huyết thanh được xem như một nhân tố dự báo tiềm năng cho hiệu quả và tiên lượng điều trị VGBMT [52] Nồng độ HBV-RNA huyết tương có thể dùng như một dấu ấn tiềm năng để dừng trị liệu với NAs một cách an toàn [35]

Tác giả Tsuge và cộng sự trong một nghiên cứu trên 36 bệnh nhân kết thúc điều trị NAs năm 2013 đã cho thấy rằng nồng độ HBV-DNA và RNA ở tháng thứ 3 của quá trình điều trị có liên quan đáng kể với sự phục hồi của HBV-DNA và ALT sau kết thúc điều trị 24 tuần Tuy nhiên, nồng độ HBV-DNA, HBsAg, HBcAg trong suốt quá trình điều trị và tại thời điểm kết thúc điều trị không phải là một yếu tố dự báo có ý nghĩa [63]

Jie Wang và CS trong một nghiên cứu công bố năm 2016 ở 33 bệnh nhân Viêm gan B mạn tính được trị liệu bằng NA trong hơn 3 năm tại bệnh viện Third

Affiliated của trường đại học Sun Yat-Sen, sau đó đã ngừng điều trị nhận thấy HBV pgRNA đều phát hiện được ở 33/33 bệnh nhân trong quá trình điều trị Tại thời điểm ngừng điều trị, tất cả 33 bệnh nhân đều không phát hiện được HBV-DNA trong huyết tương, 21/33 bệnh nhân này có HBV pgRNA dương tính và sự phục hồi của VR đã xảy ra ở 21/21 bệnh nhân này sau 24 tuần theo dõi Trái lại trong số 12 bệnh nhân viêm gan B mạn tính mà HBV pgRNA không phát hiện được, chỉ có 3 bệnh nhân xảy ra sự phục hồi của VR sau 24 tuần theo dõi [35] Tác giả cũng đề nghị một mô hình tạo ra các nucleocapsid chứa pgRNA và sự tái

nhiễm của chúng vào nhân các tế bào gan nhằm tạo cccDNA, giải thích sự dai dẳng của nguồn cccDNA trong gan (Hình 1.6)

Hình 1.6 Mô hình tạo ra các nucleocapsid chứa pgRNA và khả năng lây nhiễm [35]

Với các liệu trình điều trị đang được áp dụng cho bệnh nhân VGBMT hiện nay, việc loại bỏ hoàn toàn HBV là rất hiếm, và sự tái phát của bệnh thường xảy

ra sau khi điều trị Vì vậy, những dấu ấn của VR có khả năng phản ánh mức độ hoạt động của cccDNA trong gan là rất cần thiết, để có thể theo dõi bệnh nhân hoặc tiên lượng đáp ứng điều trị chuẩn xác hơn Những kết quả trên cho thấy HBV pgRNA có thể là một dấu ấn tiềm năng trong việc quyết định ngừng điều trị thuốc NAs một cách an toàn hay dự báo đáp ứng VR bền vững

1.4 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA và ứng dụng trong đánh giá đáp ứng điều trị VGBMT

1.4.1 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA trên thế giới

Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh có sự hiện diện phổ biến của HBV-RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân nhiễm HBV [49], [64], [65] và nó vẫn còn sau khi mất HBsAg trong huyết thanh [66]

Tải lượng RNA của HBV là một trong những chỉ dấu quan trọng trong quá trình điều trị VGBMT, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã phát triển các quy trình định lượng RNA của HBV trong huyết thanh và trong mô gan của người bệnh Tất cả các quy trình phân tích được phát triển đều dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR vốn có độ nhạy phát hiện cao và khả năng định lượng với khoảng tuyến tính rộng

Năm 1996, Kock và cộng sự phát hiện ra HBV-RNA polyadenyl hóa trong huyết thanh của bệnh nhân VGBMT bằng cách sử dụng khuếch đại nhanh các đầu DNA bổ sung (cDNA) (RACE - rapid amplification of cDNA ends) [6] Sau khi tách chiết HBV-RNA từ huyết thanh bệnh nhân, một đoạn mồi đặc biệt bao gồm đoạn oligo (dT) và trình tự đích nhân tạo duy nhất được sử dụng để tạo cDNA cDNA được khuếch đại PCR với mồi đặc hiệu HBV giống với trình tự gen đích, do đó đảm bảo độ đặc hiệu cao cho sự khuếch đại HBV-RNA [67] Sau

đó, một phương pháp tương tự đã được sử dụng để phát hiện HBV-RNA huyết thanh ở bệnh nhân VGBMT [68], [69]

Real-time PCR định lượng dựa trên RACE sử dụng mồi được thiết kế để phiên mã ngược, theo Kairat và cộng sự [70], sau đó đã được phát triển để định lượng chọn lọc huyết thanh HBV-RNA gồm đoạn 3′ full-leng polyadenyl hóa (flRNA – RNA toàn chiều dài) và đoạn 3′ polyadenylated nội bộ bị cắt ngắn (trRNA- truncated RNA – RNA bị phân cắt) Việc định lượng flRNA dựa trên PCR định lượng RACE đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu gần đây [71], [72], [73]

Ngoài PCR định lượng RACE, các phương pháp RT-PCR định lượng thông thường với các mồi đặc hiệu của HBV mục tiêu nhắm vào vùng X, C hoặc

S của bộ gen HBV đã được phát triển để định lượng HBV-RNA trong huyết thanh [7], [35], [74], [75] Tuy nhiên, để tránh nhiễm bẩn DNA trong quá trình định lượng RT ‐ PCR, cần phải xử lý deoxyribonuclease đối với axit nucleic tách chiết từ huyết thanh

Định lượng HBV-RNA trong huyết thanh đã được tiến hành thông qua phép đo tổng số axit nucleic của HBV bằng định lượng Real-time RT-PCR mà không loại bỏ HBV-DNA, sau đó trừ đi số lượng bản sao HBV-DNA được xác định bằng PCR định lượng [9], [63], [76]

Thử nghiệm QuantiGene được phát triển bởi Lam và cộng sự đã sử dụng các đầu dò đặc hiệu của HBV, được thiết kế để lai với khung đọc mở X (ORF), cho phép định lượng trực tiếp RNA mà không cần tổng hợp cDNA hoặc khuếch đại PCR [77]

Gần đây, Butler và cộng sự đã phát triển một phương pháp tự động để định lượng HBV-RNA trong huyết thanh RNA được tách chiết bằng cách sử dụng kit tách chiết mSample của Abbott, sau đó quy trình RT-PCR định lượng nhiều lần để phát hiện vùng gen X và vũng lõi của HBV [48] Để đánh giá thêm hiệu suất xét nghiệm nguyên mẫu tự động, Butler và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm so sánh flRNA và nhận thấy mối tương quan tốt giữa hai phương pháp này

Laras và đồng tác giả đã sử dụng Real-time RT-PCR hai bước (phản ứng phiên mã ngược và PCR được thựchiện trong hai ống phản ứng riêng rẽ) với sinh phẩm LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes kit (Roche) [11] Sau khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược bằng MMLV reverse transcriptase, pgRNA được định lượng bằng kỹ thuật Real-time PCR với các mẫu dò FRET (Fluorescence resonance energy transfer) Một cách cụ thể, ngoài 2 mồi khuếch đại, các tác giả còn sử dụng thêm 2 mẫu dò oligonucleotid có gắn các chất phát huỳnh quang cho và nhận lần lượt ở đầu 3’ và 5’ của hai mẫu dò này Trong bước bắt cặp mồi ở mỗi chu kỳ, hai mẫu dò bắt cặp vào các trình tự đích nối tiếp nhau, kết quả là đưa hai chất phát huỳnh quang nằm sát nhau Lúc này, ánh sáng phát

ra bởi chất huỳnh quang cho (fluorescein) sẽ kích thích chất huỳnh quang nhận

để phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn Lượng huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ sẽ tỷ lệ thuận với lượng DNA đích thu được sau mỗi chu kỳ khuếch đại Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngưỡng phát hiện của Real-time PCR này là 10 phiên bản/phản ứng Khi ứng dụng quy trình định lượng này trên các mẫu mô gan của các bệnh nhân mắc VGBMT, các tác giả nhận thấy số lượng bản sao trung bình pgRNA trong một tế bào gan là 6,5 phiên bản

Trong một nghiên cứu khác, van Bömmel và đồng tác giả lại kết hợp kỹ thuật RACE với TaqMan Real-time PCR để định lượng flRNA (RNA toàn chiều dài) và trRNA (RNA bị phân cắt) của HBV trong huyết thanh của người mắc HBV mãn tính [71] Độ nhạy của toàn bộ quy trình Real-time RT-PCR hai bước

này là 450 phiên bản/ml đối với flRNA và 600 phiên bản/ml đối với trRNA Khoảng định lượng của Real-time RT-PCR là từ 450 đến 106 phiên bản/ml đối với flRNA và từ 600 đến 106 phiên bản/ml đối với trRNA Khi ứng dụng quy trình định lượng này trên các mẫu huyết thanh của các bệnh nhân mắc VGBMT điều trị bằng thuốc NAs, các tác giả nhận thấy lượng HBV-RNA trong huyết thanh giảm mạnh (đặc biệt là vào tháng thứ sáu sau khi bắt đầu điều trị) ở những bệnh nhân có hiện tượng chuyển đảo huyết thanh HBeAg Từ các kết quả nghiên cứu này, các tác giả nhận định rằng tải lượng RNA của HBV trong huyết thanh là chỉ dấu sớm cho việc chuyển đảo huyết thanh ở những người mắc VGBMT được điều trị bằng NAs

Gần đây, Jansen và đồng tác giả lại sử dụng kỹ thuật SYBR Green time RT-PCR hai bước để định lượng pgRNA của HBV trong huyết tương của người bệnh HBV mãn tính [7] Trong nghiên cứu này, các tác giả không đề cập đến ngưỡng phát hiện cũng như khoảng định lượng của quy trình Real-time RT-PCR Tuy nhiên, khi ứng dụng quy trình định lượng này trên các mẫu huyết thanh của các bệnh nhân mắc VGBMT điều trị bằng thuốc NA và/hoặc Peg-IFN, các tác giả nhận thấy ở những bệnh nhân có phản ứng với Peg-IFN, lượng RNA của HBV trong huyết thanh giảm mạnh so với những bệnh nhân không có phản ứng Các kết quả này một lần nữa cho thấy ý nghĩa chỉ dấu tải lượng RNA của HBV trong việc đánh giá hiệu quả điều trị VGBMT

Real-Mục tiêu của việc định lượng HBV-RNA trong huyết thanh của bệnh nhân đang điều trị VGBMT giúp cho việc tiên lượng thời điểm phù hợp để dừng thuốc

ức chế quá trình phiên mã ngược của HBV khi tải lượng HBV-DNA ở mức thấp

Do vậy, hoàn toàn có thể dùng kết quả của các nghiên cứu liên quan đến định lượng HBV-DNA để định lượng HBV-RNA miễn là lượng DNA trong mẫu không ảnh hưởng đến lượng RNA

Theo Liu và cộng sự trong nghiên cứu về “Thử nghiệm Real-time PCR độc lập với kiểu gen A để định lượng HBV-DNA” đã cho thấy plasmid kiểu gen

A có thể được sử dụng làm tiêu chuẩn để xét nghiệm các mẫu bệnh nhân có kiểu gen HBV khác Trong nghiên cứu này, Liu và cộng sự đã sử dụng bộ mồi và mẫu

dò có khả năng phát hiện được các kiểu gen khác nhau của HBV (từ A – H) Khi pha loãng với các độ pha khác nhau để so sánh hiệu quả khếch đại với kiểu gen

A chuẩn do Tổ chức Y tế thế giới cung cấp cho thấy hiệu quả khếch đại là tương đương nhau giữa các nhóm plasmid A – H và plasmid A chuẩn Tiếp theo, nhóm nghiên cứu đã kiểm tra và so sánh 49 mẫu bệnh phẩm đã thực hiện kiểm tra bằng

bộ sinh phẩm xét nghiệm HBV Cobas TaqMan bằng bộ mồi và mẫu dò trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy hiệu quả khếch đại với các kiểu gen của các mẫu là tương đương nhau Sau đó, thí nghiệm được tiến hành thực hiện với 169 mẫu có các kiểu gen từ A-H (Bao gồm: gen A: 38 mẫu, gen B: 20 mẫu, gen C: 35 mẫu; gen D: 25 mẫu; gen E: 8 mẫu; gen F: 7 mẫu; gen G: 6 mẫu; gen H: 1 mẫu; không phát hiện: 29 mẫu) đã sử dụng bộ sinh phẩm Cobas Amplicor Monitor để định lượng HBV-RNA trước đó Kết quả khi sử dụng bộ mồi và mẫu dò trong nghiên cứu này để thực hiện định lượng HBV-DNA trong 169 mẫu cho thấy hiệu quả khếch đại là tốt hơn so với bộ sinh phẩm Cobas Amplicor Monitor Sáu trong

số 13 mẫu có HBV-DNA không thể phát hiện theo xét nghiệm Cobas Amplicor Monitor có thể phát hiện được HBV-DNA với bộ xét nghiệm của nhóm nghiên cứu, với các giá trị từ 60 đến 70 IU / ml Tất cả 8 mẫu có kết quả có thể phát hiện nhưng không thể định lượng được với thử nghiệm Cobas Amplicor Monitor có kết quả định lượng được với bộ sinh phẩm của nhóm nghiên cứu, với giá trị từ 25 đến 60 IU / ml [78]

Năm 2019, Yayun Liu và đồng tác giả đã thực hiện định lượng RNA bằng phương pháp Real-time RT-PCR khi sử dụng bộ HBV-SAT (Rendu, Thượng Hải, Trung Quốc) [12] Mồi và đầu dò được thiết kế để khuếch đại vùng bảo thủ pgRNA của HBV [79] Một đoạn mồi bổ sung cho khuôn mẫu ARN đích bao gồm trình tự promoter T7 ở đầu 5 ′ Đầu dò tín hiệu RNA được đánh dấu FAM ở đầu 5 'và DABCYL ở đầu 3' RNA từ 250 μl huyết thanh được tách chiết bằng cách sử dụng các vi hạt từ tính với các oligonucleotide đặc hiệu của pgRNA HBV Các vi hạt từ tính với RNA mục tiêu được chiết tách được thêm vào hệ thống phản ứng với enzyme phiên mã ngược MMLV cũng như các mồi và đầu

HBV-dò RNA polymerase T7 trong một hỗn hợp phản ứng Việc tách chiết, khuếch đại

và phát hiện RNA được xử lý trên hệ thống Auto SAT tự động (Công nghệ sinh học Rendu, Thượng Hải, Trung Quốc) Khi đầu dò liên kết với amplicon, đầu dò phát ra tín hiệu huỳnh quang ở một độ dài sóng cụ thể khi được kích thích bởi nguồn sáng Khi nhiều đầu dò lai với amplicon, một tín hiệu huỳnh quang cao

hơn được tạo ra Thời gian để tín hiệu huỳnh quang đạt đến một ngưỡng xác định

tỷ lệ với nồng độ HBV-RNA ban đầu Hiệu quả của tách chiết và khuếch đại RNA đối với mỗi mẫu đã được xác nhận bằng cách phát hiện một lượng RNA kiểm soát được thêm vào trong quá trình ly giải mẫu Việc hiệu chuẩn xét nghiệm HBV-RNA được thực hiện bằng cách sử dụng một chuẩn lượng HBV-RNA chuẩn có thể theo dõi thành bản sao HBV-RNA chuẩn trong ống nghiệm

Theo hướng dẫn của bộ HBV-SAT, giới hạn phát hiện (LOD) pgRNA của HBV là 100 phiên bản / mL Độ nhạy và độ tuyến tính của xét nghiệm được đánh giá trên mẫu huyết thanh lâm sàng có nồng độ pgRNA cao (8,04 ± 0,12 bản sao / mL) được phát hiện bằng phương pháp đã mô tả trước đây [35] Độ nhạy của xét nghiệm được xác định bằng cách pha loãng mẫu huyết thanh lâm sàng thành 50 phiên bản / mL, và sau đó định lượng với các độ pha loãng 10 lần Mỗi độ pha loãng được thử nghiệm trong ba lần Độ đặc hiệu của xét nghiệm được đánh giá bằng cách sử dụng huyết thanh của 30 người hiến máu âm tính với HBV

Phương pháp HBV-SAT kết hợp với hệ thống Auto SAT tự động được sử dụng để hoàn thành một loạt các công việc, bao gồm: Tách chiết, khuếch đại và định lượng RNA mà không cần mở nắp ống phản ứng, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo và có độ đặc hiệu cao

Các quy trình Real-time RT-PCR đã được nghiên cứu phát triển hầu hết đều là các quy trình hai bước, không phù hợp với phân tích trong môi trường bệnh viện cần giảm thiểu thao tác và loại bỏ triệt để các vấn đề nhiễm chéo Mặt khác, cả ba quy trình nói trên đều chưa xác định được tính đặc hiệu cũng như độ nhạy đối với các kiểu gen HBV khác nhau Bộ sinh phẩm HBV-SAT đã giải quyết được các vấn đề trên Do vậy, việc sản xuất bộ sinh phẩm để đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước cho quá trình điều trị bệnh nhân VGBMT là rất cần thiết, bên cạnh đó, có thể tiến tới xuất khẩu bộ sinh phẩm khi bộ sinh phẩm được hoàn thiện mang tới nguồn thu kinh tế cho Việt Nam

1.4.2 Các nghiên cứu về quy trình định lượng HBV-RNA tại Việt Nam

Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về quy trình định lượng HBV-RNA bằng phương pháp Real-time RT-PCR một bước được công bố đến thời điểm hiện tại mà chỉ có các nghiên cứu về dịch tễ, đặc điểm lâm sàng, đáp ứng điều trị bệnh…