Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn trong quy trình sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ ủa kỹ thuật pcr

Bởi vậy, việc xác định nhóm các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp cao gây hại lớn trong qui trình sản xuất sữa, từ đó thiết lập các phơng pháp, qui trình xác định nhanh các vi sinh vật

1.3.1 Các nhóm VSV thờng gặp

5

5 1.3.2 Một số vi sinh vật gây bệnh có thể gặp trong sữa 7 1.4 Một số yếu tố ảnh hởng đến mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa

tơi nguyên liệu

11

1.4.1 ảnh hởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp từ trong vú bò 11 1.4.2 ảnh hởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp ngoài vú bò 12 1.4.3 ảnh hởng của quá trình vệ sinh thiết bị 13

1.4.4 ảnh hởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản 13 1.5 Một số nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong qui trình sản xuất

KÕt qu¶ vµ th¶o luËn

3.1 Kh¶o s¸t qui tr×nh chÕ biÕn s÷a tiÖt trïng t¹i c¬ së s¶n xuÊt

3.1.1 Qui tr×nh chÕ biÕn s÷a tiÖt trïng

36

36

36

3.2 Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng nhiÔm vi khuÈn hiÕu khÝ tæng sè

3.2.1 KiÓm tra nguyªn liÖu s¶n xuÊt

3.3 X©y dùng qui tr×nh ph¸t hiÖn mét sè vi sinh vËt trong s÷a tiÖt trïng dùa

3.2.5 Nghiªn cøu kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn B.ceures vµ Salmonella ssp Trong s÷a

tiÖt trïng khi cã sù xuÊt hiÖn cña c¸c vi sinh vËt kh¸c

Lời cảm ơn

Trớc hết tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, ngời đã tận tình hớng dẫn tôi trong suốt qúa trình học tập, nghiên cứu để hoàn thiện bản luận văn này Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Lê Quang Hoà đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

“Công nghệ Protein enzym và kỹ thuệt gen”

Qua đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến toàn thể cán bộ Viện CNSH và CNTP Trờng ĐHBK đặc biệt là Phòng Hoá sinh nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện cho tôi đợc học tập và nghiên cứu để hoàn thiện đề tài này

Xin đợc Chân thành cảm ơn đến những ngời thân và gia đình đã động viên giúp

đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Lêi cam ®oan

T«i xin cam ®oan nh÷ng kÕt qu¶ ®îc tr×nh bÇy trong b¶n luËn

v¨n nµy lµ hoµn toµn chÝnh x¸c vµ do t«i tiÕn hµnh NÕu cã bÊt

cø sai sãt vµ tranh chÊp vÒ b¶n quyÒn t«i xin hoµn toµn chÞu

tr¸ch nhiÖm tríc ph¸p luËt

Hµ Néi ngµy 20/11/06

Ngêi viÕt cam ®oan

Phïng thÞ Thuû

-xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và nhà sản xuất phải huỷ bỏ các lô hàng bị nhiễm gây lãng phí rất lớn về mặt kinh tế Bởi vậy, việc xác định nhóm các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp cao gây hại lớn trong qui trình sản xuất sữa, từ đó thiết lập các phơng pháp, qui trình xác định nhanh các vi sinh vật gây hại đó có khả năng ứng dụng trong thực tiễn sản xuất sữa là rất cần thiết để giảm tổn thất cho nhà sản xuất

và bảo đảm sức khỏe cho ngời tiêu dùng Thực hiện đề tài luận văn thạc sỹ “Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng ” với mong muốn giảm thiểu các tổn thất do vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa gây ra Nội dung của luận văn bao gồm những vấn đề chính sau:

- Khảo sát vi sinh vật tổng số và chúng loại một số vi sinh vật nhiễm tạp trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng từ đó xác định đợc nguồn nhiễm tạp và chủng loại

Chơng I

Tổng Quan

1 1 Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt Nam

Theo đánh giá của các nhà maketing ngành công nghiệp sữa Việt Nam có rất nhiều triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nớc mới chỉ đáp ứng đợc 11% nhu cầu tiêu thụ Nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trờng cũng tăng không ngừng, năm 1990 tính bình quân trên đầu ngời mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 con số này tăng lên đén 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/năm Cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lợng sữa sản xuất trong nớc cũng tăng lên đáng kể Theo

số liệu thống kê, năm 2000 sản lợng sữa trong nớc đạt 54 000 tấn, năm 2003 tăng gấp hơn hai lần (112 000 tấn) và đến năm 2004 con số này đã tăng lên thành xấp xỉ

198 000 tấn Sản lợng sữa đợc dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn tới Mặc dù có sự tăng trởng tốt về sản lợng tiêu thụ và sản xuất nhng ngành sữa Việt nam vẫn còn có rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân các nhà máy cũng nh cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lợng sản phẩm và quyền lợi ngời tiêu dùng Đã có nhiều chơng trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền tuy nhiên vẫn cha đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân nh mức đầu t cha lớn, kỹ thuật cha đủ đáp ứng và quản lý cha hiệu quả Chính vì những nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa nhiều khi vấp phải vòng luẩn quẩn đó

là nguồn thu từ bán sữa tơi cha đủ để đầu t cơ sở vật chất và kỹ thuật tốt, vì đầu t cha tốt nên chất và lợng sữa không đủ đáp ứng yêu cầu và điều này lại là nguyên nhân làm cho thu nhập từ chăn nuôi bò sữa không cao Tại các nhà máy chế biến sữa hiện nay cũng gặp phải một số vấn đề Vào mùa hè khi lợng sữa tiêu thụ mạnh thì hầu nh các nhà máy phải sản xuất hết công xuất, mặc dù đa số các nhà máy đã áp dụng hệ thống phòng ngừa HACCP tuy nhiên vẫn gặp phải những sự cố

do nhiễm tạp vi sinh vật gây tổn thất lớn cho nhà sản xuất và có thể còn gây hại đến cả ngời tiêu dùng Về nguyên liệu, hiện nay nguồn sữa tơi nguyên liệu sử dụng cho sản xuất sữa tiệt trùng của các nhà máy ở Việt Nam không đáp ứng đủ nhu cầu

về số lợng và chất lợng nên các nhà máy phải sử dụng một lợng lớn sữa bột nhập khẩu Về đầu t do các nhà máy hoạt động theo cơ chế thị trờng nên luôn phải tối đa lợi nhuận do đó đầu t về con ngời và cơ sở vật chất cho kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm và chất lợng sản phẩm (ví dụ nh các phòng QA, QC, …) còn nhiều hạn chế Trong khi đó cha có một cơ chế thoả đáng khuyến khích sự hợp tác của các cơ sở nghiên cứu khoa học, cơ quan quản lý chất lợng với các nhà máy nhằm hỗ trợ về mặt kỹ thuật cho các nhà sản xuất để nâng cao chất lợng sản phẩm Tuy nhiên những hạn chế này sẽ sớm đợc giải quyết khi nớc ta gia nhập WTO Khi ấy nếu sản phẩm sữa của Việt Nam muốn bán đợc trên thị trờng các nớc và cạnh tranh đợc với các sản phẩm nhập khẩu cùng loại trên thị trờng trong nớc thì bắt buộc các nhà sản xuất phải đầu t để đảm bảo và nâng cao chất lợng

và cạnh tranh về giá cả

1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa

Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa khác nhau là khác nhau Trong cùng một sản phẩm nhng ở mỗi quốc gia khác nhau thì giới hạn này cũng khác nhau

Tiêu chuẩn Việt nam

Hiện nay ở Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật trong các sản phẩm sữa cụ thể nh bảng sau (theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 thỏng 08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế) :

B¶ng 1.1 Giíi h¹n « nhiÔm vi sinh vËt trong c¸c s¶n phÈm s÷a

cña ViÖt Nam

d Sản phẩm chế biến của của sữa :

bơ, sữa chua, pho- mat, (dùng trực

Tổng số vi khuẩn hiếu khí 104

tiếp, khụng qua xử lý nhiệt trước khi

Trong qui định trên, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí (VKHKTS) và Coliforms

luôn có trong các sản phẩm sữa Chỉ tiêu E.coli, S aures, Salmonella có trong hầu

hết các loại sản phẩm Salmonella còn đợc qui định rõ ràng là không có trong 25 g

sản phẩm Sản phẩm sữa tơi tiệt trùng theo phơng pháp UHT trong qui định cho phép có 10 tế bào VKHKTS, tuy nhiên tiêu chuẩn của đa số các nhà máy chỉ số này

là bằng khụng Trong qui định trên ở tất cả các sản phẩm sữa đều không có chỉ tiêu

cho B.ceures Tuy nhiên trong các sản phẩm khác nh thịt, và sản phẩm ngũ cốc

đều có loài này

Tiêu chuẩn của một số khu vực khác

Bảng 1.2 Giới hạn vi sinh vật cho phép có trong các sản phẩm sữa

Loại thực

phẩm

Chỉ tiêu

vi sinh vật

Giới hạn cho phép Ghi chú

Sữa tơi chuẩn bị

cho sản xuất Vi sinh vật tổng số ở 30 o C

10 5 CFU/ml Sữa bò 5.10 5 hoặc 1,5.10 6

CFU/ml Sữa trâu, dê, cừu

S.aureus 500- 2000 CFU/ml

Sữa tơi sử dụng

ngay cho con ngời

Coliforms 0- 5 CFU/ml VSV tổng số ở 21 o C 5.10 4

–5.10 5 CFU/g

Sau khi ủ sữa ở

VSV tổng số ở 30 o C 10 CFU/0,1ml 30oC - 15 ngày Sữa bột Salmonella

Listeria monocytogenes S.aureus

Coliforms

Không có mặt trong 1g Vắng mặt trong 1g 10- 100 CFU/g 0- 10 CFU/g

Bột sữa Sản phẩm của bột sữa

Theo qui định số 94/46/EEC

Theo qui định của khối cộng đồng châu âu (số 94/46/EEC) về tiêu chuẩn các vi sinh vật trong các sản phẩm sữa thì Salmonella không đợc có mặt trong 25g sản phẩm của đa số các sản phẩm sữa, trừ sữa bột cho phép không có trong 1 g Với

S.aureus cho phép có ở khoảng 102CFU/ml với các sản phẩm sữa cha xử lý nhiệt, còn với sản phẩm sữa đã qua xử lý nhiệt cha thấy có qui định Chỉ tiêu vi sinh vật tổng số đợc đa ra cho hầu hết các sản phẩm sữa (trừ sữa bột) dao động trong khoảng 104 đến 106 CFU/ml tùy theo từng loại sữa (bảng1.2)

Tiêu chuẩn của Israeli [ ] về vi sinh vật trong một số nhóm sản phẩm sữa có thể tóm tắt theo bảng sau:

Bảng 1.3 Tiêu chuẩn vi sinh vật trong một số sản phẩm sữa của Israeli

(vi khuẩn tổng số trong 1g, Salmonella trong 20g, Listeria trong 25g)

Tên sản

phẩm

Tiêu chuẩn số

monocytogenes

Trong các tiêu chuẩn và qui định trên cho thấy một số chỉ tiêu nh vi sinh vật tổng

số, Salmonella, Staphylococcus, Coliform là những chỉ số mà đa số các qui định và

các sản phẩm đều yêu cầu có Còn tuỳ theo điều kiện sản xuất cũng nh điều kiện

tự nhiên của mỗi nớc mà các giới hạn hoặc các chỉ tiêu có thể nhiều hoặc ít hơn các khu vực khác một chút để sản phẩm sản xuất ra có thể đợc người tiêu dùng chấp nhận đợc

1.3 Vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa

1.3.1 Các nhóm VSV thờng gặp

Trong sữa luôn chứa một lợng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa đợc thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất đa dạng bao gồm nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn Trong các đối tợng trên thì vi khuẩn đợc quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thờng phát triển vợt trội hơn Vi

khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn lactic nh Streptococcus lactic,

S diaxetylactic, S paracitrovorus, Lactobacillus bulgaricum, L.acidophilum, L lactic, L helveticum Nhóm vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các

sản phẩm lên men từ sữa nh sữa chua, phomát Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tơi tiệt trùng hoặc sữa tơi thanh trùng thì sẽ là các tác nhân làm hỏng sản phẩm dới dạng tạo kết tụ protein

Dựa vào khả năng chịu nhiệt ngời ta có thể chia các vi sinh vật thờng nhiễm trong sữa thành các nhóm chính sau:

Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs) là những vi sinh vật có khả năng phát triển

đợc ở nhiệt độ dới 7°C.Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong các mẫu sữa hỏng nhất là nhóm trực khuẩn Gram (-), thờng đợc

xác định thuộc loài Pseudomonas hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh

chóng làm hỏng sữa khi đợc bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10oC Tuy nhiên

nó lại bị tiêu diệt dễ dàng trong quá trình gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua gia nhiệt thì thờng hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không đảm bảo

Nhóm a ấm (Mesophilic) những vi khuẩn a ấm quan trọng nhất đó là

streptococci, lactobacilli và coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí

và làm mất mùi của sữa Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur

Nhóm chịu nhiệt (Thermoduric) là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình

gia nhiệt pasteur hoặc các xử lý nhiệt khác Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở

nhiệt độ xử lý pasteur Giống chịu nhiệt hay gặp nhất đó là Microbacterium, Corynebacterium Micrococcus Streptococcus, , và Bacillus

Nhóm a nhiệt (Thermophilic) là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện

nhiệt độ xử lý paster Loài a nhiệt thờng thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium

Nhóm a nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu nhiệt

nên vẫn có thể sống sót sau khi gia nhiệt nhng chúng cũng có khả năng phát triển

đợc trong điều kiện lạnh Nhóm này đôi khi làm hỏng sữa trong điều kiện không bị tái nhiễm các trực khuẩn gram (-) sau gia nhiệt Nhóm này thòng phát triển chậm sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lu thông sản phẩm Nhóm thermoduric psychrotrophs hay gặp nhất là nhóm vi sinh vật tạo bào tử nh Bacillus [The Evaluation of Shelf- Life]

1.3.2 Một số vi sinh vật gây bệnh có thể gặp trong sữa

Sữa là một sản phẩm giầu dinh dỡng nên khi vi sinh vật có mặt trong đó là chúng tăng sinh rất nhanh Sẽ rất nguy hiểm nếu các loài nhiễm tạp lại là những vi sinh vật gây bệnh hoặc gây độc nớc ta do mức tiêu thụ sữa cha cao và sản phẩm sữa ở cha phong phú đa dạng nên rất may mắn là cha có vụ ngộ độc lớn nào gây ra bởi sản phẩm sữa ở các nớc khác mặc dù điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm đợc

quản lý chặt chẽ nhng vẫn thờng xuyên xảy ra các vụ ngộ độc thực phẩm do sản phẩm sữa gây ra Cụ thể về các vụ ngộ độc từ sản phẩm sữa ở Mỹ từ 1990-1995 do CDC thống kê đợc trình bày trong bảng sau

http://www2.cdc.gov/ncidod/foodborne/OutbreaksReport.asp

Bảng 1.4 Một số vụ ngộ độc do sử dụng sữa

Nguyên nhân Bang Tháng Năm Số ngời

bowling

Không biết OH 11 90 7 Sữa Nhà hàng

Dới đây là một số loài VSV gây bệnh có khả năng gây nhiễm vào sữa

Bacillus cereus: là một nhóm vi khuẩn hô hấp hiếu khí và hô hấp tùy tiện, có khả

năng sinh bào tử và đợc tìm thấy trong đất, bụi và không khí Sự có mặt của B cereus với liều lợng vợt quá mức kiểm soát là nguyên nhân gây nên nôn, buồn nôn và tiêu chảy Khi thức ăn bị nhiễm B cereusđợc tiêu thụ, vi khuẩn sẽ tạo ra chất độc trong đờng ruột Sau khoảng 8 đến 10 giờ, ngời bị ngộ độc sẽ nôn

mửa, đau bụng quặn và tiêu chảy Cả hai biểu hiện ngộ độc gây ra bởi B.cereus

đều ở mức độ không trầm trọng và có thể hồi phục sau 24 giờ Tuy nhiên, đã có

trờng hợp tử vong do ngộ độc B.cereus do sự gia tăng về mặt số lợng của các

độc tố [ ]

Salmonella spp: có trong dạ dày, ruột ngời và động vật Có nhiều trong các loại thực phẩm có hàm lợng protein cao nh trứng, sữa, cá, thịt gia cầm nấu cha chín Có khả năng gây bệnh thơng hàn Khi vi khuẩn này xâm nhập vào cơ thể

sẽ gây nên triệu chứng tiêu chảy, co thắt bụng, sốt, buồn nôn, nhức đầu [ ]

Campylobate jejuni: đợc phân lập từ chất thải của ngời vào năm 1971[30], có trong sữa tơi, nớc cha khử trùng hoặc đun sôi, thịt gia cầm nấu cha chín Các triệu chứng ngộ độc là buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy và phân có lẫn máu

Clostridium botulinum: có trong thực phẩm đóng hộp bị ô nhiễm trong quá trình chế biến: cá, thịt, các loại rau làm giảm lực cơ, đặc biệt là ở mắt (gây mờ mắt)

và ở phổi (làm khó thở)

Escherichia coli: các độc tố E coli sinh ra chủ yếu là hai loại độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt Vi khuẩn này gây rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, tiêu chảy, đau bụng, mất nớc; có loại gây triệu chứng giống hội chứng lị hoặc phân có máu, bệnh tả

Staphylococcus aureus: phát tán qua đuờng hô hấp, trên da hay bề mặt vết thơng Khi xâm nhiễm vào thực phẩm chúng sẽ sản sinh ra các độc tố ngoại bào bao gồm nhiều loại độc tố ruột bền nhiệt và các enzym có khả năng hỗ trợ cho độc tố gây độc cho ngời [ Vi khuẩn này khi xâm nhiễm gây buồn nôn, nôn, tiêu ]chảy, đau bụng, mất nớc nặng

Shigella spp: có hai loại độc tố điển hình là độc tố đờng ruột và độc tố thần kinh gây tiêu chảy, nôn, mất nớc và nặng nhất là lị Vi khuẩn này có trong sữa và các thực phẩm bị ẩm ớt, nhiễm phân

Clostridium butulinum: là vi khuẩn gây ngộ độc týp A, B Nó là trực khẩn kị khí

tuyệt đối, tồn tại trong đất, phân động vật, ruột cá, từ đó vi khuẩn đột nhập vào thực phẩm, dới ảnh hởng của nhiệt độ cao vi khuẩn hình thành các bào tử rất bền vững Dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thần kinh do tổn thơng thần kinh trung ơng và hành tủy

Vibrio spp: gây ra các vụ dịch tả lớn do tạo các độc tố tả cholerae toxin rất mạnh Ngoài ra còn có độc tố nh hemolysin bền nhiệt triệu chứng ngộ độc Vibrio là

-đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đờng ruột, tiêu chảy mạnh và nôn mửa

Yersinia enterocolitica: sản sinh độc tố bền với quá trình thanh trùng, gây sốt, đau quặn bụng và tiêu chảy Đôi khi gây nhiễm độc thần kinh, nhiễm độc máu và các

bộ phận khác

Listeria: có mặt trong các thực phẩm cha qua xử lí nhiệt, bảo quản lạnh trong thời gian dài Khi bị nhiễm độc, ngời bệnh có thể bị nhiễm trùng máu, viêm

màng não Phụ nữ có thai có thể bị sảy thai hoặc sinh non

1.4 Một số yếu tố ảnh hởng đến mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa tơi nguyên liệu

Vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa tơi có thể gồm nhiều loài khác nhau và từ nhiều nguồn khác nhau Mật độ vi sinh vật trong sữa cao thờng là hậu quả của sự kết

hợp của một vài nguyên nhân ví nh điều kiện vệ sinh không đảm bảo và điều kiện lạnh không đảm bảo

Sữa đợc tổng hợp từ những tế bào đặc biệt của tuyến vú vì vậy nó hoàn toàn vô trùng khi đợc tiết vào các tia sữa của tuyến vú (Tolle, 1980) Do đó khi đợc vắt

ra khỏi bò thì sữa có thể bị nhiễm theo 3 nguồn chính (Bramley ADN McKinnon, 1990); từ vú bò bị bệnh, từ bề mặt kém vệ sinh của vú bò, từ tay ngời vắt sữa và dụng cụ chứa sữa Chính vì vậy để kiểm soát mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa thì các yếu tố nh sức khoẻ và độ vệ sinh của bò, môi trờng nuôi, vắt sữa, qui trình vệ sinh thiết bị vắt sữa và thiết bị bảo quản sữa chính là những yếu tố quyết định Bên cạnh đó còn có yếu tố nhiệt độ và thời gian bảo quản là những

điều kiện ảnh hởng đến sự tăng sinh cuả vi sinh vật trong sữa Tất cả các yếu tố trên sẽ ảnh hởng đến số lợng cũng nh chủng loại vi sinh vật trong sữa

1.4.1 ảnh hởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp từ trong vú bò

Sữa tơi nguyên liệu đợc lấy từ những con bò khoẻ mạnh có chứa lợng vi sinh vật khá thấp khoảng 1000 CFU/ml (Kurweil, 1973) Nói chung trong vú những con bò khoẻ mạnh cũng có nhiều loại vi sinh vật, tuy nhiên những vi sinh vật này lại không đợc coi là nguồn vi sinh vật chính trong tổng số vi sinh vật của sữa và

nó cũng không phải là nguồn vi sinh vật tiềm tàng làm tăng nhiều chỉ số vi sinh vật tổng số trong sữa qua quá trình bảo quản lạnh Ngợc lại với những con bò bị viêm vú thì hệ vi sinh vật từ vú bò là nguồn vi sinh vật tiềm tàng làm tăng mạnh chỉ số vi sinh vật tổng số trong sữa Tuy nhiên mức độ tăng chỉ số này cũng phụ thuộc nhiều vào chủng loại vi sinh vật gây viêm vú và tình trạng bệnh viêm vú cũng nh tỷ lệ bò bị bệnh Sữa từ những con bò bị bệnh này có thể chứa lợng vi sinh vật nhiều hơn 107CFU/ml Nếu có khoảng 1% sữa đợc lấy từ bò bị bệnh thì

có thể làm chỉ số vi sinh vật tổng số trong cả thùng sữa lên đến 105CFU/ml (Bramley ADN McKinnon, 1990) Nhóm vi sinh vật gây viêm vú bò thờng làm

agalactiae và S uberis (Bramley và McKinnon, 1990; Bramley et al., 1984;

Gonzalez et al., 1986; Jeffrey và Wilson, 1987 Staphylococcus aureus không

đợc cho là nhóm làm tăng chỉ số vi khuẩn tổng số trong sữa lên cao nhng cũng

có nghiên cú cho thấy mật độ của chúng trong sữa có thể lên đến 60 000CFU/ml (Gonzalez et al., 1986) Việc phát hiện thấy vi sinh vật gây bệnh trong sữa cũng không hẳn đều là do bò bị viêm vú mà có thể còn do các nguyên nhân khác nh mức độ vệ sinh của bò, dụng cụ vắt và chứa sữa kém

1.4.2 ảnh hởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp ngoài vú bò

Những vi sinh vật ở bề ngoài của vú bò chính là ở trên lớp da bò Những vi sinh vật này thờng từ môi trờng sống, môi trờng vắt sữa bám trên da bò sau đó đi vào sữa trong quá trình vắt Thờng thì vú bò bao giờ cũng đợc vệ sinh trớc khi vắt sữa vì vậy nhóm vi sinh vật này không làm tăng nhiều chỉ só vi sinh vật tổng số trong sữa

và chúng cũng thờng không có tính cạnh tranh trong quá trình phát triển trong sữa Nhng nếu vú bò còn vơng lại bẩn do phân, bùn, thức ăn hoặc ổ rơm nằm thì số lợng và chủng loại vi sinh vật nguy hiểm sẽ tăng nhanh Vi sinh vật tổng số trong các ổ nằm của bò thờng rất cao khoảng 108-1010 CFU/g (Bramley, 1982; Bramley

và McKinnon, 1990; Hogan et al., 1989; Zehner et al., 1986) Vi sinh vật có liên quan đến ổ nằm của bò và nhiễm tạp trên bề mặt của vú bò bao gồm các loại

streptococci, staphylococci, các chủng tạo bào tử, coliforms và các vi khuẩn gram âm khác Trên bề mặt vú bò có xuất hiện cả những loài chịu nhiệt và những loài chịu lạnh (Bramley ADN McKinnon, 1990) Điều đó cho thấy sự nhiễm tạp

ở ngoài vú bò sẽ ảnh hởng đến chỉ số Lab Pasteurization Counts (LPCs), Preliminary Incubation Counts (PICs)

1.4.3 ảnh hởng của quá trình vệ sinh thiết bị

Quá trình vệ sinh thiết bị có thể ảnh hởng đến mức độ cũng nh chủng loại vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa Mỗi qui trình vệ sinh khác nhau cũng có thể không

hiệu quả đối với một loài đặc biệt nào đó Ví dụ khi vệ sinh bằng nớc nóng thì vẫn có thể còn một số loài chịu nhiệt cao còn sống sót Ngợc lại nếu vệ sinh không tốt bằng nớc ở nhiệt độ thấp và không sử dụng muối thì sẽ làm cho các trực khuẩn gram âm (coliforms và Pseudomonads) và lactic streptococci phát triển nhanh hơn và làm tăng chỉ số PICs Sử dụng clo và iod để vệ sinh sẽ làm giảm các loài a lạnh và làm giảm chỉ số PICs (Jackson ADN Clegg, 1965) Sự xuất hiện nhiều các vi khuẩn a lạnh thờng liên quan đến quá trình vệ sinh thiết

bị không tốt và không thờng xuyên (Olson và Mocquat, 1980; Thomas et al.,

1966, MacKenzie, 1973; Thomas, 1974) Sữa còn dính trên bề mặt thiết bị nếu không đuợc làm vệ sinh tốt sẽ là điều kiện lý tởng cho nhiều loại vi sinh vật phát triển Nớc dùng trong các nông trại cũng có thể là một nguồn chứa vi sinh vật (Bramley và McKinnon, 1990)

1.4.4 ảnh hởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản

Nhiệt độ và thời gian bảo quản có ảnh hởng rất lớn đến chỉ số và chủng loại vi sinh vật trong sữa Việc bảo quản lạnh chỉ ức chế đựoc những vi sinh vật thuộc nhóm a ấm, trong khi đó nhóm vi khuẩn a lạnh nhiễm tạp vào sữa vẫn có khả năng phát triển Thời gian bảo quản sữa tơi nguyên liệu trớc khi vào sản xuất càng lâu (đợc phép đến 5 ngày) càng có cơ hội cho nhóm vi khuẩn này tăng sinh

Nhiệt độ bảo quản cũng rất quan trọng, nhiệt độ bảo quản càng gần với giới hạn trên cho phép bảo quản (7.2°C) thì vi sinh vật sẽ phát triển rất nhanh so với bảo quản ở nhiệt độ thấp dới 4.4 C Mặc dù sữa đợc sản xuất trong điều kiện lý °tởng với mật độ vi khuẩn a lạnh nhỏ hơn 10% vi khuẩn tổng số nhng sau 2-3 ngày bảo quản ở nhiệt độ 4.4 C thì mật độ vi khuẩn chịu lạnh này có thể chiếm °

đa số (Gehringer, 1980), và hậu quả là làm tăng chỉ số PICs Nếu nhiệt độ bảo quản thấp hơn, khoảng 1-2°C thì có thể hạn chế hiện tợng này

Trong điều kiện lạnh kém, nhiệt độ lớn hơn 7,2°C, ngoài nhóm vi sinh vật a lạnh thì các nhóm vi khuẩn khác cũng có thể phát triển rất nhanh và có thể chiếm đa số

trong sữa tơi nguyên liệu Streptococci đợc coi là loài thờng có liên quan đến sự

tăng chỉ số vi sinh vật tổng số trong sữa khi điều kiện lạnh của sữa không đảm bảo, loài này khi soi trên kính hiển vi thờng có dạng hình cầu và 2 tế bào dính lại nhau (Phụ lục 2) Những vi khuẩn này sẽ nhanh chóng làm tăng độ axit của sữa Một số loài khác lại có thể gây cho sữa có mùi mạch nha (malt) mùi này rất dễ nhận thấy bởi tính chất đặc trng của nó Nguyên nhân là do nhiệt độ bảo quản lớn hơn 15°C

do đó u tiên cho nhóm vi sinh vật tạo mùi này phát triển (Gehringer, 1980) điều ở kiện lạnh kém các vi sinh vật không chịu lạnh có thể phát triển, tuy nhiên sự phát triển cuả nhóm vi sinh vật này cũng không ngăn cản sự phát triển của nhóm vi sinh vật chịu lạnh Kết quả loài nào sẽ chiếm u thế phụ thuộc vào mật độ nhiễm ban

đầu của loài đó trong sữa (Bramley ADN McKinnon, 1990)

1.5 Một số nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng

Tại các cơ sở sản xuất, mặc dù luôn áp dụng các qui định về vệ sinh an toàn thực phẩm cũng nh các hệ thống quản lý chất lợng HACCP hoặc CIP nhng trên cả dây truyền sản xuất có rất nhiều điểm có nguy cơ nhiễm tạp cao và nhiều nguyên nhân ảnh hởng đến mật độ vi sinh vật này trong nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm Việc phân tích và hiểu rõ nguyên nhân nhiễm tạp sẽ giúp nhà máy giảm thiểu các tổn thất không đáng có bằng cách đơn giản đó là loại trừ hoặc hạn chế nguyên nhân đó

Nguyên nhân do nguyên liệu ban đầu

Nguyên nhân đầu tiên gây nhiễm tạp trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng chính là

ở nguyên liệu và đặc biệt là sữa tơi Nh phần trên đã phân tích có rất nhiều nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa tơi Việc hạn chế các nguyên

nhân gây nhiễm từ nông trại sẽ làm giảm số lợng vi sinh vật trong sữa tơi sử dụng trong nhà máy Sữa tơi là một loại nguyên liệu chính với thành phần dinh dỡng và

điều kiện ẩm độ thích hợp cho rất nhiều vi sinh vật phát triển Việc kiểm soát sự nhiễm tạp trong sữa tơi sẽ giúp nhà máy vừa giảm đợc tổn thất do sản phẩm hỏng vừa nâng cao đợc chất lọng của sữa thành phẩm

Sữa bột thờng đợc nhập khẩu từ các nớc tiên tiến với qui định về vệ sinh an toàn thực phẩm khắt khe do đó tổng số vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa bột thờng không cao Mặt khác độ ẩm của sữa bột thấp, không thuận lợi cho sự phát triển của VSV nên mật độ vi sinh vật trong sữa bột không biến động nhiều Sữa bột là sữa đã đợc gia nhiệt trong chế biến nên nếu có vi sinh vật trong đó thì chủ yếu là các loài tơng

đối chịu nhiệt nh Bacillus Thậm chí có loài còn tồn tại sau khi tiệt trùng ở 130

-140 oC [M.C te Giffel và cộng sự, 2002; BERTIL PETTERSSON, 1996 ]

Các nguyên liệu khác nh đờng, bơ, hơng liệu, vitamin cũng có thể có một …lợng vi sinh vật nhất định, tuy nhiên về số lợng cũng không nhiều vì đây không phải là môi trờng dinh dỡng tốt cho sự phát triển của vi sinh vật, mặt khác các thành phần này cũng là những thành phần dễ kiểm soát về mặt vi sinh vật nên hầu nh các cơ sở sản xuất ít chú ý đến nhóm nguyên liệu này

Nớc là một nguyên liệu đuợc sử dụng tơng đối nhiều Chất lợng nớc ở mỗi cơ

sở sản xuất có thể khác nhau do công nghệ xử lý nớc khác nhau Nớc sản xuất bình thờng cũng chứa một lợng lớn vi sinh vật tuy nhiên để xử lý loại bỏ hoặc tiêu diệt lợng vi sinh vật này thì cũng không mấy khó khăn

Hộp chứa đôi khi cũng là nguy cơ tiềm ẩn cho sự nhiễm VSV của sữa Mặc dù nguồn hộp này thòng có độ sạch về hoá học và vi sinh vật khá cao và đợc khử trùng bằng tia tử ngoại trớc khi giót hộp nhng vẫn có thể có vi sinh vật còn sót lại Theo thống kê của trung tâm đào tạo kỹ thuật Lund của Thuỵ sỹ thì nhóm hay

nhiễm trong hộp là Bacillus, Actinomyces, micrococcus, staphylococcus và sarcina

(phụ lục 2 Tuy nhiên sự nhiễm tạp gây ra trong túi cũng ít xảy ra và thờng không )

xảy ra trên diện rộng

Nguyên nhân do thời gian và nhiệt độ tàng trữ các bán thành phẩm

Trong các bán thành phẩm trớc khi vào tiệt trùng luôn có sẵn một lợng vi sinh vật nhất định Cũng giống nh sữa tơi nguyên liệu nếu nhiệt độ bảo quản cao và thời gian bảo quản dài sẽ làm tăng số lợng vi sinh vật trong các bản thành phẩm này Trong điều kiện sản xuất bình thờng thời gian lu của mỗi bán thành phẩm

sẽ hầu nh cố định

Phần lớn các cơ sở sản xuất sữa luôn duy trì nhiệt độ dới 10oC cho các bán thành phẩm Tại nhiệt độ này một số vi sinh vật a lạnh vẫn có thể phát triển

đợc

Nguyên nhân do quá trình làm sạch thiết bị không tốt

Các bán thành phẩm luôn tiếp xúc với hệ thống đờng ống và thùng chứa, nếu quá trình vệ sinh trớc và sau sản xuất không tốt sẽ dễ dàng làm nhiễm tạp vào

sản phẩm Bacillus và Lactobacillus là hai loài chịu nhiệt và chịu axit tốt thờng nhiễm vào sữa từ đờng ống và thùng chứa khi vệ sinh không tốt Một số loài nh Micrococcus, Staphylococcus và Sarcina cũng hay nhiễm vào sữa từ phin lọc

vệ sinh không tốt (phụ lục 2)

Nguyên nhân do chế độ tiệt trùng không đảm bảo

Nếu chế độ tiệt trùng không đảm bảo nguy cơ sữa thành phẩm không đạt chỉ tiêu vi sinh vật là khá cao Quá trình rót vẫn diễn ra bình thờng đến khi lấy mẫu sản phẩm kiểm tra phải mất 24h mới có kết qủa và nh vậy lô sản phẩm không

đợc bảo quản lạnh đã bị hỏng Sự cố này rất nguy hiểm vì cả lô hàng này sẽ bị loại bỏ gây thiệt hại về kinh tế rất lớn Hiện tợng này cũng ít xảy ra chỉ khi thiết

bị tiệt trùng có sự cố

Trờng hợp chế độ tiệt trùng vẫn đảm bảo nhng trong bán thành phẩm có những

vi sinh vật tạo bào tử chịu nhiệt cao nh Bacillus sporothermoduran thì ở sản phẩm cuối cũng vẫn có thể có vi sinh vật Tuy nhiên, loài này phát triển chậm, không gây độc tố và không làm thay đổi cảm quan của sữa nên thiệt hại gây ra bởi loài này cũng không lớn

Nguyên nhân do quá trình rót hộp không đảm bảo vô trùng

Sau tiệt trùng sữa không còn chứa vi sinh vật nhng trong quá trình rót hộp nếu

điều kiện vệ sinh môi trờng làm việc kém, chế độ vô trùng phòng rót hộp không

đảm bảo thì sản phẩm sẽ bị tái nhiễm Sự tái nhiễm này thờng ở mật độ vi sinh vật ban đầu thấp nên nếu lấy mẫu phân tích ngay có thể cho kết quả âm tính giả Sau một thời gian lu kho sản phẩm, mật độ vi sinh vật tăng dần và làm hỏng sữa

2.6 Các phơng pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

Trong tất cả các nhà máy về thực phẩm đều có bộ phận kiểm soát về mặt vi sinh vật

Bộ phận này có nhiệm vụ kiểm soát vi sinh vật trong nguyên liệu xem khi nhập có

đủ chất lợng để nhập không? Trong quá trình bảo quản nguyên liệu phải kiểm soát sao cho không bị h hỏng Trong quá trình chế biến bộ phận này có nhiệm vụ kiểm soát sự nhiễm tạp trong cả dây truyền sản xuất để đảm bảo sản phẩm cuối cùng có chất lợng đạt yêu cầu đề ra Tiếp đến sẽ phải kiểm soát chất lợng của sản phẩm cuối xem có đủ điều kiện xuất hàng không? điều kiện bảo quản sản phẩm trớc khi

đến tay ngơì tiêu dùng

Để kiểm soát vi sinh vật thì có rất nhiều các phơng pháp Dựa vào thời gian cho kết quả, ngời ta có thể chia thành hai nhóm phơng pháp đó là phơng pháp truyền thống và phơng pháp nhanh Từ trớc đến nay đa số các nhà máy về thực phẩm thờng sử dụng nhóm phơng pháp truyền thống Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các thiết bị phân tích hiện đại và các phơng pháp phân tích nhanh

cũng ra đời Hiện giờ các nhà máy thực phẩm Việt Nam vẫn cha sử dụng các kỹ thuật hiện đại này nhiều nhng chắc chắn trong tơng lai không xa những phân tích nhanh này sẽ trở thành thông dụng trong các cơ sở sản xuất vì chính tính u việt của

nó

1.6.1 Các phơng pháp truyền thống

Nhóm các phơng pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trờng đặc trng và đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng, loài vi sinh vật khác nhau nh khả năng đồng hoá các loại đờng, khả năng bắt màu với các loại thuốc thử khi nhuộm tế bào; khả năng sinh các loại enzym catalase, oxydase,…… trong nhóm phơng pháp này có thể sử dụng hai kỹ thuật đó là kỹ thuật trải đĩa và

kỹ thuật pha loãng tới hạn trong các ống môi trờng

Ưu điểm: Các phơng phá này có u điểm thao tác đơn giản dễ làm, không phải

đầu t dụng cụ thiết bị đắt tiền;

Nhựơc điểm: Độ nhậy không cao; tốn nhiều nhân công và thời gian do đó rất hạn

chế trong công tác phòng ngừa

Phạm vi áp dụng: áp dụng cho các cơ sở sản xuất nhỏ; kiểm tra các loại sản phẩm

đang đợc bảo quản tốt về nhiệt độ và độ ẩm; các mẫu sản phẩm thờng chỉ nhiễm một vài loài nào đó Đối với những mẫu có nhiều loài vi sinh vật với tốc độ phát triển khác nhau thì đôi khi những loaì có tốc độ phát triển chậm, mật độ không chiếm u thế thì sẽ xảy ra hiện tợng âm tính giả Để khắc phục hiện tợng này cần phải tìm đợc nhiệt độ tối u, môi trờng chọn lọc thích hợp cho loại vi sinh vật đó phát triển mà các loài khác bị ức chế

1.8.2 Các phơng pháp phát hiện nhanh

Các phơng pháp nhanh này đợc áp dụng rất nhiều trên thế giới trong các lĩnh vực

y tế, sinh học, nông nghiệp, thuỷ sản, ở Việt Nam mới chỉ áp dụng một số …phơng pháp nhanh trong y tế và nghiên cứu khoa học Các phơng pháp nhanh này

ban đầu du nhập vào Việt Nam theo hình thức các kít thử Giai đoạn sau đó ngoài các kít thử còn có các loại sản phẩm khác nh các thiết bị phân tích nhanh Các phơng pháp nhanh này có thể chia làm hai nhóm phơng pháp sau:

Nhóm phơng pháp miễn dịch

Nhóm phơng pháp này dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật

Phơng pháp Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

-Nguyên tắc của phơng pháp này là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate) để giữ lại các kháng nguyên mục tiêu Khi tiến hành phân tích, nếu có mặt kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này

sẽ bắt cặp với kháng thể và đợc giữ lại trên bề mặt giếng Sử dụng các kháng thể

có gắn enzym để phát hiện các kháng thể đơn dòng đã gắn kết với kháng nguyên mục tiêu Các enzym thờng đợc dùng là peroxidase, phosphatase kiềm và một số loại khác Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất tạo ra các sản phẩm làm thay đổi mầu của dung dịch Tốc độ thủy phân của enzyme tỷ lệ thuận với lợng kháng thể đã gắn enzyme và tỷ

lệ thuận với lợng kháng nguyên mục tiêu Dựa vào sự thay đổi màu mà ta biết

đợc sự có mặt và mật độ kháng nguyên mục tiêu

Phơng pháp này khá nhạy, có thể phát hiện đợc nhiều loài vi sinh vật khác nhau Hiện nay ngời ta đã ứng dụng rất nhiều phơng pháp này trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh cho ngời, và cho thực phẩm dới các dụng kít thử nhanh

Phơng pháp lai phân tử (DNA - Hybridization)

Phơng pháp này còn đợc gọi là phơng pháp sử dụng mẫu dò (probe) Có ba kỹ thuật lai hay sử dụng theo phơng pháp này:

Kỹ thuật Southern bloting: do Edward Southern phát minh năm 1975 Đây là

- Sử dụng enzym giới hạn cắt ADN thành từng đoạn nhỏ

- Điện di trên gel agarose để tách các đoạn có kích thớc khác nhau

- Biến tính các đoạn ADN trên bản gel bằng dung dịch kiềm

- Chuyển bản gel lên màng lai (màng nitrocellulose hoặc nylon)

- Thực hiện phản ứng lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ

- Hiện hình bằng phim nhạy phóng xạ

Kỹ thuật Northern bloting

Đây là kỹ thuật cải tiến từ kỹ thuật Southern blotting để lai ARN với các mẫu dò ADN Phơng pháp này chỉ khác phơng pháp trên ở chỗ sử dụng ARN của mẫu chứ không sử dụng ADN Phơng pháp này có u điểm hơn phơng pháp Southern blotting là xác định đợc những đoạn ADN gen có biểu hiện thành tính trạng

Kỹ thuật lai tại chỗ

Trong kỹ thuật này ngời ta không phải tách chiết ADN hay ARN mà thực hiện phản ứng lai ngay trên nhiễm sắc thể hoặc trên tế bào Các mô hoặc tế bào đợc xử

lý để loại bỏ protein và ARN để lộ ra các phân tử ADN Sau đó cho lai tại chỗ với mẫu dò đánh dấu phóng xạ và quan sát dới kính hiển vi để xác định vị trí lai trên nhiễm sắc thể Còn lai trên tế bào thì chỉ cần quan sát qua một phim Rơnghen xem

vị trí nào có vết đen trên giâý lọc thì tơng ứng với tế bào tại đó có gen mục tiêu Các kỹ thuật lai phân tử này cho phép phát hiện đợc sự có mặt của vi sinh vật trong thực phẩm khá nhanh và hiệu quả, tính chính xác cao

 Phơng pháp ADN microarray

Là kỹ thuật dựa trên phản ứng lai giữa các ADN đã biết trình tự trên Genchip với các đoạn cARN –biotin> sau phản ứng lai nhuộm màu bằng strepavidin-phycoerythrin và rửa, hiện hình và phân tích bằng thiết bị laser scaner để biết

trong mẫu có chứa các đoạn ADN đích nào Phơng pháp này cho phép xác định

đợc nhiều gen đích (vi sinh vật) trong cùng một thời điểm, nhanh và chính xác Vì vậy đây là phuơng pháp hữu hiệu cho các cơ sở sản xuất trong công tác phòng ngừa sự nhiễm tạp vi sinh vật trong thực phẩm Tuy nhiên phơng pháp này cũng cần đầu t thiết bị lớn mà không phải nhà máy nào cũng thực hiện

có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, mỗi phản ứng PCR cần một cặp gồm hai đoạn mồi gọi là mồi xuôi (sense) và mồi ngợc (antisense) Hai mồi này phải không bắt cặp với nhau tạo sản phẩm phụ DNA polymerase nối dài -mồi để hình thành mạch mới, quá trình tổng hợp sẽ bắt đầu từ đầu 5' đến đầu 3' Các

đoạn DNA mới đợc hình thành sẽ tiếp tục trở thành mạch khuôn

 u điểm của phơng pháp PCR

PCR đã trở thành công cụ hữu hiệu trong việc phân tích, đánh giá và phát hiện vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm vì những u điểm sau:

• Có thể phát hiện đợc sự có mặt của vi sinh vật ở mật độ thấp, không mất nhiều thời gian tăng sinh

• Thời gian cho kết quả nhanh, chính xác bởi tính đặc hiệu của phản ứng

• Có thể ứng dụng tự động hóa, không tốn nhiều nhân lực và tiền bạc

 Nhợc điểm

• Phải đầu t thiết bị ban đầu cao

• Đối với những mẫu thực phẩm yêu cầu phải xử lý mẫu phức tạp

• Không phân biệt đợc tế bào sống và tế bào chết

Một số yếu tố ảnh hởng đến phản ứng PCR

Một phản ứng PCR yêu cầu bắt buộc phải có:

 Dung dịch đệm PCR: 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl- 2

 ADN khuôn: 1 100 ng ADN thể gen, 2 10 ng ADN plasmit.-

- Nucleotit: 0,2 mM dNTP (mix dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

 Mồi xuôi, mồi ngợc: 0,1-1 àM

 Taq polymerase: 0,04 0,08 U/- àl

Thể tích phản ứng: 10-100 à l

3 Måi b¾t cÆp víi ADN khu«n: 37-72°C, 30-60 gi©y

4 Tæng hîp ®o¹n ADN môc tiªu: 72 C, 30 gi©y 3 phót.°

-5 LÆp l¹i chu tr×nh (2-4) tõ 25 40 lÇn

-6 Hoµn thiÖn ®o¹n ADN môc tiªu: 7 C, 5 phót.2°

7 B¶o qu¶n s¶n phÈm PCR: 4-10°C

Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm đợc tiến hành chạy điện di, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dới tia UV

Nồng độ Mg 2+: Mg2+ ảnh hởng mạnh đến hoạt động của enzym Taq polymerase Nồng độ Mg2+ thấp làm giảm hoạt tính của enzym xúc tác dẫn đến làm giảm khả năng tổng hợp các bản sao ADN Nồng độ Mg2+ sẽ làm hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ.Tuy nhiên nghiên cứu về ảnh hởng của nồng độ Mg2+ đến phản ứng PCR đối với Listeria monocytogenes cho thấy với nồng độ Mg2+ từ 1,5 4,0mM thì không ảnh hởng đến phản ứng PCR[ -Nguyễn Thị Kim Hoa ]

Hàm lợng các loại nucleotit tự do: dNTP là nguyên liệu để tổng hợp lên ADN

vì vậy nếu bốn laọi dNTP đủ và cân đối thì phản ứng PCR sẽ đạt đợc tốc độ tối

đa

Các thành phần khác của dung dịch đệm; các thành phần nh ion Na+ cũng

có ảnh hởng đến phản ứng PCR tuy nhiên đệm này thòng đợc mua sẵn ở các hãng hoá chất có uy tín nên độ tinh khiết cao và thành phần ổn định và tối u

Hàm lợng enzym Taq: Đây là một phản ứng xúc tác của enzym vì vậy nó cũng tuân theo qui luật của một phản ứng enzym Nếu hàm lợng enzym quá thấp khả năng xúc tác sẽ giảm đặc biệt là giai đoạn cuối khi mà một phần Taq đã

bị vô hoạt bởi nhiệt độ cao Ngợc lại, nếu nhiều emzym sẽ xảy ra hiện tợng ức chế do án ngữ không gian làm giảm sự tiếp xúc của dNTP với mạch khuôn trong quá trình tổng hợp, kết quả cũng sẽ làm giảm hiệu quả phản ứng PCR

Kích thớc mồi , hàm lợng mồi: Những mồi ngắn thì khả năng bắt cặp với

khuôn dễ dàng hơn nhng ngợc lại lại dễ xảy ra sai sót trong quá trình tổng hợp

do xác suất đặc hiệu cho gen đích thấp Mồi dài thì tính đặc hiệu cao hơn tuy nhiên cũng tốn kém hơn cho quá trình tổng hợp mồi Hàm lợng mồi ít quá sẽ

hạn chế số mạch đơn đợc tổng hợp trong một chu trình nhiệt Ngợc lại lợng mồi quá nhiều cũng gây ra hiện tợng ức chế do án ngữ không gian

Chế độ nhiệt: Với mỗi loại mồi có nhiệt độ bắt cặp khác nhau Nhiệt độ bắt cặp

và thời gian bắt cặp phụ thuộc vào trình tự đọan cần khuyếch đại Taq có hoạt tính cao ở nhiệt độ 75-80oC vì vậy nếu nhiệt độ giai đoạn kéo dài không thích hợp thì cũng không phát huy tối đa hoạt động của Taq

ảnh hởng của kích thớc khuôn ADN và độ tinh sạch của khuôn: PCR có

hiệu quả cao nhất khi nhân các đoạn khuôn khoảng 1kb Độ tinh sạch của khuôn

ảnh hởng rất lớn đến hiệu quả phản ứng PCR nh hởng này chủ yếu là do án ảngữ không gian, ngoài ra một số tạp chất còn có thể liên kết cạnh tranh với các thành phần của phản ứng PCR nh proein có thể liên kết với dNTP thông qua các liên kết H; lipít có thể bị thuỷ phân bởi ion Na+ trong môi trờng kiềm ; Mg+

có thể tạo cầu liên kết cho đờng; Chính vì vậy độ tinh sạch của ADN khuôn …càng cao thì hiệu quả phản ứng PCR càng cao

Ch¬ng II VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.1 VËt liÖu vµ thiÕt bÞ

Chñng vi sinh vËt

C¸c vi khuÈn chuÈn sö dông trong nghiªn cøu ®îc liÖt kª trong b¶ng sau:

2 Staphylococcus aureus ATCC 25923

3 Salmonella ssp ViÖn vÖ sinh dich tÔ TW

MÉu s÷a thÝ nghiÖm

MÉu s÷a t¬i nguyªn liÖu, s÷a b¸n thµnh phÈm vµ thµnh phÈm ®îc l¸y tõ mét c¬ së s¶n xuÊt s÷a tiÖt trïng t¹i Hµ Néi (v× lý do tÕ nhÞ xin ®îc kh«ng nªu tªn c¬ së s¶n xuÊt ra ë ®©y)

Ho¸ chÊt

- Ho¸ chÊt sö dông cho t¸ch chiÕt ADN tæng sè, cho ph¶n øng PCR ®îc cung cÊp bëi Amersham Pharmacia Biotech

- C¸c ho¸ chÊt ph©n tÝch ADN do Invitrogen vµ Applied Biosystem cung cÊp

- Taq polymerase do Trung t©m CNSH, §¹i häc quèc gia Hµ néi cung cÊp

- Ho¸ chÊt m«i trêng cho nu«i cÊy vi sinh vËt do Merck vµ Difco cung cÊp

- Và các hoá chất khác có độ tinh khiết phân tích

Môi trờng

 Mụi trường plate count agar (PCA): phõn lập vi sinh vật tổng số (g/l):

Triptone: 5; cao nấm men: 2,5; Dextrose: 1; agar: 15; pH: 7,0

Hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút

Dung dịch Polymyxin B 0.1%: Hoà tan 500,000 đơn vị polymyxin B sulfate trong

50 ml nớc cất vô trùng Lọc qua màng lọc vô trùng và bảo quản trong tối ở 4 o C

đến khi dùng (dùng đợc trong 1 tuần)

Huyền phù trứng (Egg yolk emulsion) 50%: Rửa sạch trứng, ngâm trong cồn 70% trong 1h, đập vỡ vô trứng và loại bỏ lòng trắng, Lòng đỏ đợc lấy trộn đều với nớc muối 0,85% vô trùng với khối lợng bằng nhau, bảo quản ở 4 o C đến khi dùng

Môi trờng MYP để đổ đĩa: Cho 2.5 ml polymyxin B và 12.5 ml nhũ hoá trứng vào

225 ml môi trờng Mossel nóng chảy trộn đều và đổ vào các đĩa petri vô trùng để nguội và sau 24 h dùng trong thí nghiệm

 Môi trờng Bismuth Sulfite Agar: Môi trờng phân lập Salmonella(g/l)

Polypeptone(hoặc peptone):10; cao thịt bò:5; Dextrose5 ; Na2HPO4 khan: 4; FeSO4khan: 0.3; Bismuth sulfite (chỉ thị): 8; Brilliant green: 0.025; Agar: 20;pH7.7

Trộn đều trên máy khuấy từ gia nhiệt Đun sôi khoảng 1 phút để cho môi trờng

đồng nhất (có thể có kết tủa vẫn không hoà tan) làm nguội đến nhiệt độ 50°C Đổ đĩa petri, vừa đổ vừa lắc sao cho các kết tủa phân bố đều trong dung dịch Mở nắp đĩa để cho môi trờng khô trong khoảng 2 h sau đó đóng đĩa và có thể sử dụng ngay Chuẩn bị môi trờng này không có bớc hấp tiệt trùng Môi trờng chỉ có giá trị chọn lọc trong 48h vì vậy chỉ khi nào sử dụng mới chuẩn bị môi trờng Môi trờng cần để ở nơi không có ánh sáng

45- Môi trờng Staphylococcus 110 (g/lít): Sử dụng để phân lập Staphylococcus

 Môi trờng Violet Red Bile Agar (VRBA): dùng trong phân lập E.coli

Peptone hoặc gelysate 7.0 g

Hoà tan môi trờng trong nớc ngâm trong vài phút Lắc đều và chỉnh pH đến 7,4 0.2 Khuấy trên máy khuấy từ gia nhiệt, đun sôi trong 2 phút (không phải ± hấp tiệt trùng) Trớc khi dùng, làm nguội đến 45 C và đổ trên đĩa petri °

 Môi trờng TSBYE Trypticase Soy broth yeast extract : Dùng trong tăng

sinh vi khuẩn (g/l): Trypticase soy broth: 30 ; cao nấm men: 6 g; pH, 7.3 ± 0.2 Hấp vô trùng ở 121°C trong 15 phút

Định tờn sơ bộ một số loài vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa

Cỏc ống dương tớnh ở phần trờn được xỏc định bằng cỏch cấy vạch trờn đĩa petri cú chứa mụi trường PCA Tiếp đú, cỏc khuẩn lạc được đặc tớnh húa bằng cỏc phộp thử sinh hoỏ như nhuộm gram, kiểm tra catalase, oxydase và định tờn sơ bộ theo cõy truy tỡm dấu vết sản phẩm khụng phự hợp trong sản xuất sữa của Tetra brik.[phụ lục 1]

Phát hiện B cereus và Salmollena trong sữa

Gây nhiễm mẫu

- Lấy 200ml các mẫu sữa tiệt trùng không chứa vi sinh vật Gây nhiễm

B.ceures và Salmollena sao cho mật độ vi sinh vật đạt khoảng 1CFU/25ml

- Bổ sung dung dịch EDTA để đạt nồng độ 20-25àM

- Ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút

- Đổ dịch nổi trong điều kiện vô trùng

- Cho vào mỗi bình 50ml dung dịch đệm phosphat pH…

- Ly tâm 10 000 vòng/phút trong 5 phút

- Đổ dịch nổi trong điều kiện vô trùng

- Bổ sung 30ml môi trờng TSBYE vào mỗi bình nuôi tăng sinh,

Thu nhận DNA và tiến hành phản ứng PCR

- Dịch nuôi tăng sinh sau mỗi giờ lấy ra một bình xác định mật độ tế bào bằng phơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa môi trờng đặc hiệu, đồng thời ly tâm ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 10 phút

- Đổ dịch nổi, cho 700 l TE vào hoà tan cặn tế bàoà

- Chuyển dịch huyền phù tế bào sang ống eppendorf 1,5ml

- Dùng thêm 500àl TE tráng thu hết cặn tế bào và chuyển sang eppendorf

Một số phép thử sinh hóa đối với vi sinh vật

• Nhuộm gram http://www-micro.msb.le.ac.uk/video/Gram.html

• Thử Catalase

 Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch bôi lên phiến kính sạch

 Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên vết bôi

 Quan sát nếu thấy có sủi bọt là phản ứng catalase dơng tính, nếu không sủi bọt là âm tính

 Song song làm mẫu kiểm chứng âm là chủng Lactobacillus, kiểm chứng dơng là Bacillus ceures

• Thử oxydase

• Xác định hàm lợng protein theo Lowry [ ]

Xác định nồng độ EDTA thích hợp bổ sung vào sữa để loại tối đa protein

• Lấy 200ml mẫu sữa

• Nhiễm chủ động vi sinh vật

• Bổ sung EDTA theo các nồng độ khác nhau

• Ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

• Hòa tan cặn bằng 5ml NaOH 0,1N

• Gia nhiệt dung dịch trên ở 100oC trong 15 phút

• Lọc loại bỏ cặn

• Dịch lọc đợc xác định hàm lợng protein theo phơng pháp Lowry

• Tại nồng độ EDTA bổ sung vào mẫu cho giá trị OD tại bớc sóng 750nm nhỏ nhất đợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Nghiên cứu loại bỏ protein phản ứng PCR trong sữa

Sử dụng EDTA với các nồng độ khác nhau bổ sung vào quá trình ly tâm thu cặn tế bào từ sữa Xác định lợng protein lắng xuống tạo cặn bằng phơng pháp Lowry, từ

đó tìm đợc nồng độ EDTA thích hợp cho tạo cặn protein ít nhất

Xác định khả năng ảnh hởng của nồng độ EDTA bổ sung đến khả năng lắng

tế bào vi sinh vật trong ly tâm

Tiến hành ly tâm song song 2 mẫu sữa đã đợc nhiễm chủ động cùng một mật độ vi

sinh vật và cùng một loại vi sinh vật nhất định trong 4 loại sau: Baccillus ceures, Salmollena, Staphylococcus aures, E.coli

2.2.3 Phơng pháp sinh học phân tử

Tách chiết DNA tổng số trong canh trờng thuần

• Nuôi cấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ trong môi trờng TSBYE lỏng, nuôi lắc 4 6h ở

• Thêm 100 l H2O, hòa tan bằng Voltex à

• Cho vào tủ lạnh –20o trong 10 phút

• Lấy ra xử lý tế bào ở nhiệt độ 960C trong 15 phút, cứ 5 phút voltex 1 lần

Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu ADN tổng số ở phần dịch trong vào một eppendorf mới, giữ ở -200C để sử dụng cho phản ứng PCR

Phản ứng PCR