Đặ điểm dịh tễ họ phân tử virus ev a71 phân nhóm b5 gây bệnh tay hân miệng tại miền bắ việt nam

ụ ụ ạ Định nghĩa bệnh tay chân miệng 1.1.1Theo định nghĩa của Tổ chức y tế thế giới, bệnh TCM là bệnh truyền nhiễm do virus gây ra, với các biểu hiện đặc trƣng là sốt trên 37.5oC, đau họ

TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

ĐÀO THỊ Ả H I ANH Ngành: Công nghệ sinh học

TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

ĐÀO THỊ Ả H I ANH Ngành: Công nghệ sinh học

TS Trần Thị Nguyễn Hòa

HÀ NỘI, 2020

C Ộ NG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độ ậ c l p - T - H ự do ạ nh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬ N VĂN TH Ạ C SỸ

-B5 gây bệnh tay chân mi ng tệ ại miền Bắc Việt Nam

2 Chỉnh sửa các thu t ng ậ ữdùng th ng nhố ất trong lu n văn ậ

3 Chỉnh sửa tài li u tham khảệ o theo m t độ ịnh dạng chung

L Ờ I CẢM ƠN

Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính tr ng và biọ ết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tr n Liên Hà, TS ầ Trần Thị Nguyễn Hòa đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và chia s nh ng khó khăn cùng em trong su t quá trình học tập và ẻ ữ ốnghiên cứu để th c hiự ện đềtài này Sự hư ng dẫ ậớ n t n tình và nh ng kiữ ến thức quý báu của các cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình họ ậc t p, nghiên cứu khoa họ ểc đ em hoàn thành luận văn này

Em xin gửi cám ơn toàn thể các anh ch nhân viên tại phòng thí nghiệm Virus ịđường ru t - Vi n V sinh dịch tễộ ệ ệ Trung Ương đã giúp đ nhi t tình, tạo điều kiện ỡ ệ

về mọ ặi m t trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tập th th y cô, các ch ng nghi p đã luôn giúp đ , t o ể ầ ị đồ ệ ỡ ạ

điều kiện, và động viên em trong quá trình h c t p và th c hi n luọ ậ ự ệ ận văn

Em xin cảm ơn Ban Giám Hi u, phòng Đào t o Sau đệ ạ ại h c, các phòng ban ọchức năng c a Trườủ ng đại h c Bách Khoa Hà Nọ ội đã giúp đỡ ạ t o đi u kiện thuận ềlợi cho em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng bi t ơn sâu sắ ếế c đ n ngư i thân trong gia đình ờ

và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong su t quá trình làm đ tài ố ề

Hà Nội , ngày tháng năm 2020

Tác giả

Đào Thị Hải Anh

i

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

T NG QUAN TÀI LI U 3Ổ ỆCHƯƠNG 1

1.1.Đại cương về ệ b nh tay chân mi ng 3ệ

Định nghĩa bệnh tay chân mi ng 3ệ1.1.1

Tác nhân gây bệnh tay chân mi ng 4ệ1.1.2

1.2 Virus đường ru t type 71 gây b nh tay chân mi ng 5ộ ệ ệ

Đặc đi m hình thái c u trúc và v t li u di truy n 5ể ấ ậ ệ ề1.2.1

Đặc đi m lý hóa 7ể1.2.2

Quá trình nhân lên trong tế bào v t ch 8ậ ủ1.2.3

Đặc đi m sinh b nh h c 9ể ệ ọ1.2.4

Phân lo i virus EV-A71 10ạ1.2.5

Các k ỹ thuật phát hiện EV-A71 trong phòng thí nghi m 12ệ1.2.6

Đặc đi m d ch t và gánh n ng b nh t t TCM do EV-A71 16ể ị ễ ặ ệ ậ1.2.7

Phòng bệnh và điều tr 19ị1.2.8

1.3 Tình hình nghiên c u d ch t h c phân t và s phân b ki u gen, phân nhóm ứ ị ễ ọ ử ự ố ểgen virus EV-A71 gây b nh TCM 20ệ

Tình hình nghiên c u trên th gi i 20ứ ế ớ1.3.1

Tình hình nghiên cứ ởu Vi t Nam 24ệ1.3.2

Một số nghiên c u di truy n trên vùng gen VP1 cứ ề ủa EV-A71 261.3.3

U 28PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ

CHƯƠNG 2

2.1 Đối tượng nghiên c u 28ứ2.2 Thời gian và địa điểm nghiên c u 28ứ2.3 Vật liệu và trang thi t b 28ế ị2.4 Phương pháp nghiên c u 29ứ

Thiết kế nghiên c u 29ứ2.4.1

Quy trình nghiên c u 29ứ2.4.2

Các ch s nghiên c u 31ỉ ố ứ2.4.3

Các bước th c hi n gi i trình t toàn b vùng gen VP1 32ự ệ ả ự ộ2.4.4

K T QU Ế Ả VÀ THẢO LUẬN 37CHƯƠNG 3

3.1 Đặc điểm dịch tễ ệ b nh TCM t i mi n B c Viạ ề ắ ệt Nam, năm 2012-2017 37

3.3 Đặc điểm di truy n vùng gen VP1 c a m t s ề ủ ộ ố chủng EV-A71_B5 lưu hành

t i mi n Bạ ề ắc Việt Nam, năm 2012-2017 55

K qu gi i trình t gen VP1 các ch ng EV-ết ả ả ự ủ A71_B5 lưu hành tại miền 3.3.1

Bắc Việt Nam, năm 2012-2017 55Đặc điểm di truy n EV-ề A71_B5 lưu hành tại mi n B c Viề ắ ệt Nam, năm 3.3.2

2012 - 2017 57Đặc điểm di truy n vùng gen VP1 virus EV-ề A71_B5 lưu hành tại Vi t ệ3.3.3

Nam và th gi i 61ế ớ3.4 S biự ến đổi axit amin trên vùng VP1 68

S biự ến đổi aa vùng VP1 gi a các ch ng EV-ữ ủ A71_B5 lưu hành t i Viạ ệt 3.4.1

iii

CÁC CH VI T TT

RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

rRT-PCR Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SHPT Sinh học phân t ử

DANH MC HÌNH V 

Hình 1.1 Hình ảnh b nh tay chân mi ng 4ệ ệ

Hình 1.2 Cấu trúc c a EV-ủ A71 6

Hình 1.3 Quá trình nhân lên c a virus EV-A71 9ủ Hình 1.4 Cây phát sinh loài EV-A71 d a trên phân tích di truy n vùng VP1 11ự ề Hình 2.1 Sơ đồ nghiên c u 31ứ Hình 3.1 Phân bố ca m c TCM t i mi n B c Vi t Nam theo tháng, 2012-2017 38ắ ạ ề ắ ệ Hình 3.2 T l ỷ ệ các týp VRĐR gây bệnh tay chân mi ng t i mi n B c Vi t Nam, ệ ạ ề ắ ệ 2012-2017 44

Hình 3.3 Tỷ ệ các týp VRĐR theo năm, 2012 l -2017 44

Hình 3.4 Sự phân b c a EV-A71 và các kiố ủ ểu VRĐR khác theo thời gian 46

Hình 3.5 Sự phân b ốEV A71 và các VRĐR khác theo đ- ịa dư 47

Hình 3.6 Sự phân b ốEV-A71 và VRĐR khác theo độ ổ tu i 48

Hình 3.7 Sự phân b ca bố ệnh theo độ lâm sàng d a trên tác nhân gây b nh 49ự ệ Hình 3.8 Tỷ ệ l phân b ốcác phân nhóm gen EV-A71 theo năm, 2012-2017 51

Hình 3.9 Sự phân b phân nhóm gen EV-ố A71 theo địa dư, 2012-2017 53

Hình 3.10 Sự phân b ốcác phân nhóm gen EV A71 theo phân đ lâm sàng 55- ộ Hình 3.11 Kết quả điện di s n phả ẩm RT-PCR trên gel agarose 1.5% 56

Hình 3.12 Cây di truy n ph h vùng gen VP1 c a các ch ng EV-ề ả ệ ủ ủ A71 lưu hành t i mi n Bạ ề ắc Việt Nam, năm 2012-2017 58

Hình 3.13 Cây di truy n ph h các ch ng EV-ề ả ệ ủ A71_B5 lưu hành 61 Hình 3.14 Cây ph (subtree) phân nhánh 1 và phân nhánh 4 các ch ng EV-ụ ủ A71_B5 lưu hành tại Vi t Nam và th gi i 64ệ ế ớ Hình 3.15 Cây ph ụ (subtree) phân nhánh 2 các ch ng EV-ủ A71_B5 lưu hành tại Việt nam và th gi i 65ế ớ Hình 3.17 Cây ph (subtree) phân nhánh 5 các ch ng EV-ụ ủ A71_B5 lưu hành tại Việt Nam và th gi i 66ế ớ Hình 3.16 Cây ph (subtree) phân nhánh 3 các ch ng EV-ụ ủ A71_B5 lưu hành tại Việt Nam và th gi i 66ế ớ

v

DANH M C B NG 

B ng 1.1 S ả ự thay đổi phân nhóm gen EV-A71 ở các quốc gia, 1997 - 2018 23

B ng 1.2 Các phân nhóm gen EV-ả A71 lưu hành tại Việt Nam, 2003-2016 25

B ng 3.1 S phân b ca nhi m TCM theo t nh 39ả ự ố ễ ỉ

B ng 3.2 Phân b ả ố ca bệnh theo giới tính 42

B ng 3.3 Phân b s ca mả ố ố ắc bệnh tay chân mi ng t i mi n Bệ ạ ề ắc Việt Nam, 43

B ng 3.4 S phân b m u EV-A71_B5 t i mi n Bả ự ố ẫ ạ ề ắc Việt Nam 57

B ng 3.5 Giá tr trung bình và khoả ị ảng tương đồng nucleotide các ch ng EV-ủA71_B5 tại mi n B c Vi t Nam, 2012-2017 59ề ắ ệ

B ng 3.6 K t qu ả ế ả phân tích đột bi n axit amin các ch ng Vi t Nam, 2012-2017ế ủ ệ 69

B ng 3.7 Kả ết quả phân tích đột biến axit amin các ch ng Vi t Nam và th gi i 74ủ ệ ế ớ

Bảng 3.8 Độ tương đồng axit amin giữa các chủng Vi t Nam và th gi i 75ệ ế ớ

1

 T V   

Bệnh tay chân miệng (TCM) là bệnh truyền nhiễm thường gặp ở người, gây

ra bởi virus đường ruột (VRĐR) Các tác nhân VRĐR phổ biến gây bệnh TCM

là virus coxsackie A16 (CV-A16), coxsackie A6 (CV-A6) và VRĐR type 71 (EV-A71) [1] Bệnh do căn nguyên EV A71 có thể - kèm các biến chứng nặng, liên quan đến hệ thống thần kinh, tim, phổi, có thể dẫn đến tử vong [2] Vì vậy, các nghiên cứu về EV A71 luôn được đặc biệt chú trọng, bao gồm các nghiên -cứu dịch tễ học phân tử, di truyền tiến hóa, phát triển vaccine

Dựa vào sự đa dạng di truyền vùng gen VP1, EV A71 tiếp tục được chia thành các nhóm gen/kiểu gen (genogroup/genotype) (ví dụ A, B và C…) và phân nhóm gen (sub-genogroup) (ví dụ, B0, B1 đến B5, C1 đến C5), đôi khi gọi chung

-là kiểu gen Sự lưu hành của mỗi nhóm gen/phân nhóm gen ở các thời điểm khác nhau có thể liên quan đến quy mô dịch bệnh, với cá c mức độ lâm sàng khác nhau Sự lưu hành của chúng còn có tính khác biệt về mặt không gian và thời gian Một vài phân nhóm gen chỉ lưu hành ở một số khu vực địa lý nhất định, như EV-A71_C1 và C2 chỉ tìm thấy ở các nước Châu Âu, EV A71_C4 và B5 ở -các nước Châu Á Một số khu vực địa lý nhất định gần như chỉ có duy nhất một phân nhóm gen EV A71 lưu hành, ví dụ, ở Trung Quốc gần như chỉ có EV- -A71_C4 Ngược lại, trong một số khu vực địa lý nhất định lại có nhiều phân nhóm gen lưu hành luân phiên nhau

T i Vi t Nam, EV-A71 lạ ệ ần đầu tiên được xác định vào năm 2003 và kể ừ t

đó các vụ ị d ch TCM liên quan đến EV-A71 gây ra đã được báo cáo hàng năm tại các t nh thành trên c ỉ ả nướ EV A71 được - c xác định là tác nhân lưu hành gây

b nh n i tr i nhệ ổ ộ ất trong vòng 10 năm trở ại đây l [3] và có ít nh t 3 phân nhóm ấEV-A71 lần lượt được phát hiện Trước năm 2011, EV A71_C5 lưu hành chính-[4, 5] Đến năm 2011, EV-A71_C4 xu t hi n, thay th s ấ ệ ế ự lưu hành nổi tr i cộ ủa

EV-A71_C5 Ch ỉ trong vòng 2 năm (2011-2012) EV-A71_C4 gây ra v dụ ịch TCM quy mô toàn quốc ớl n nh t t ấ ừ trước đến nay với hơn 300.000 ca m c ắ TCM

và hơn 200 trư ng h p t vong Tuy nhiên, rờ ợ ử ất nhanh sau đó, sự xu t hi n c a ấ ệ ủphân nhóm m i, EV-ớ A71_B5 vào cuối năm 2012, đã thay thế hoàn toàn EV-A71_C4 t ừ năm 2013 Tuy các v d ch do ụ ị EV-A71_B5 không có quy mô v s ề ố

ca m c và ca b nh n ng nhiắ ệ ặ ều như EV A71_C4 giai đoạ- n 2012-2013, A71_B5 này được tìm th y nhi u t nh thành và là phân nhóm EV-ấ ở ề ỉ A71 gần như duy nhất lưu hành trong giai đoạn 2013-2017 (tr ừ năm 2016 có mộ ỷ ệt t l nh ỏ

EV-EV-A71_C4 được phát hi n và khu trú t i hai t nh Thái Bình và Thanh Hóa) -ệ ạ ỉ [68]

S ự lưu hành n i trổ ội trong th i gian dài c a EV-A71_B5 t i Vi t Nam t o ờ ủ ạ ệ ạ

cơ hội cho chúng tôi th c hi n nghiên c u v ự ệ ứ ề đặc điểm d ch t h c phân t và di ị ễ ọ ửtruy n nh m tìm hi u v ề ằ ể ề cơ chế di truy n phân t ề ử liên quan đến s t n tự ồ ại, lưu

khi hi n t i trên th ệ ạ ế giớ chỉi có duy nh t m t lo i vaccine giấ ộ ạ ảm động l c kháng ự

tính hi u qu c a mệ ả ủ ột vaccine “nội địa” [9], nh ng nghiên c u bài b n v c ữ ứ ả ề đặđiểm d ch t h c/di truy n phân t c a EV-A71_B5 là c n thiị ễ ọ ề ử ủ ầ ết và có ý nghĩa

t d phòng vàế ự hoàn thi n n n t ng khoa h cđể ệ ề ả ọ xây d ng ự phát tri n vaccine EV-ểA71 tại Việt Nam

Vì v y chúng tôi tiậ ến hành đề tài “Đặc điểm d ch t h c phân t virus ị ễ ọ ử

EV-A71 phân nhóm B5 gây b nh tay chân mi ng t i mi n Bệ ệ ạ ề ắc Việt Nam” giai , đoạn 2012-2017 v i ớ 4 mục tiêu cụ thể như sau:

(1) Mô tả một vài đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng tại miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2012 2017 –

(2) Mô tả sự phân bố của EV A71 phân nhóm B5 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn , 2012 2017 –

-(3) Nghiên cứu đặc điểm di truyền vùng gen VP1 của virus EV-A71_B5 (4) Phân tích s biự ến đổi axit amin vùng gen VP1 ủa EVc -A71_B5

t ừ nước b t, d ch c a n t ph ng và phân c a tr nhi m b nh M t s y u t có ọ ị ủ ố ỏ ủ ẻ ễ ệ ộ ố ế ốthể làm gia tăng sự lây truy n và bùng phát d ch bao g m: mề ị ồ ật độ dân s cao, ố

s ng ch t chố ậ ội; điều ki n v sinh kém; thi u nhà v sinh; thi u ho c không có ệ ệ ế ệ ế ặnướ ạc s ch ph c v cho sinh ho t hàng ngày [12] ụ ụ ạ

Định nghĩa bệnh tay chân miệng

1.1.1

Theo định nghĩa của Tổ chức y tế thế giới, bệnh TCM là bệnh truyền nhiễm

do virus gây ra, với các biểu hiện đặc trưng là sốt (trên 37.5oC), đau họng, kèm tổn thương da, niêm mạc chủ yếu dưới dạng phỏng nước ở các vị trí đặc biệt như miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Ph n lầ ớn các trường h p b nh ợ ệTCM di n bi n t ễ ế ự khỏi, tuy nhiên có th xu t hi n m t s bi n ch ng nguy hiể ấ ệ ộ ố ế ứ ểm như viêm não màng não, viêm cơ tim, phù phổ ấ- i c p dẫn đế ửn t vong n u không ếđược phát hi n s m và x trí k p th i [1, 12, 13] ệ ớ ử ị ờ

+ Độ 1: Ch loét mi ng và/ho c tỉ ệ ặ ổn thương da.

+ Độ 2a: Có m t trong các d u hi u sau g m b nh s có gi t mình ộ ấ ệ ồ ệ ử ậdưới 2 l n/30 phút và không ghi nh n lúc khám, s t trên 2 ngày, hay sốt trên 39ºC, ầ ậ ốnôn, lừ đừ , khó ngủ, quấy khóc vô cớ

+ Độ 2b: Có d u hi u thu c nhóm 1 ho c nhóm 2: (Nhóm 1): Có m t ấ ệ ộ ặ ộtrong các bi u hi n g m gi t mình ghi nh n lúc khám, b nh s có giể ệ ồ ậ ậ ệ ử ật mình ≥2

l n/30 phút, các d u hiầ ấ ệu kèm theo như ngủ gà, m ch nhanh (khi tr n m yên, ạ ẻ ằkhông s t), tr số ẻ ốt cao ≥ 39ºC không đáp ứng với thuốc h s t; (Nhóm 2): Có mạ ố ột trong các bi u hi n sau g m thể ệ ồ ất điều (run chi, run người, ng i không vồ ững, đi loạng cho ng), rung gi t nhãn c u, lác m t, y u chi ho c li t chi, li t th n kinh ạ ậ ầ ắ ế ặ ệ ệ ầ

s , nuọ ốt sặc, thay đổi gi ng nói ọ

+ Độ 3: Có bi n ch ng n ng v th n kinh, hô h p, tim mế ứ ặ ề ầ ấ ạch như co

gi t, hôn mê, khó th , th nhanh, rút lõm ng c, m ch nhanh >170 l n/phút hoậ ở ở ự ạ ầ ặc tăng huyết áp

+ Độ 4: Bi n ch ng r t n ng, khó h i ph c, s c, phù ph i c p, tím tái, ế ứ ấ ặ ồ ụ ố ổ ấSpO2 < 92%, ngưng thở, th nở ấc

Tác

1.1.2 nhân gây bệnh tay chân miệng

Tác nhân gây bệnh TCM là các virus đường ruột VRĐR thuộc chi (genus) Enterovirus, họ (family) Picornaviridae Chi Enterovirus bao gồm 15 loài

5

(species), trong đó 12 loài VRĐR được đặt tên t ừ A đến L trong đó chỉ có VRĐR loài A, B, C và D gây b nh ệ ở người Dưới loài, các VRĐR tiếp tục được phân chia thành các ki u huy t thanh/ki u (serotype/type) và hi n có trên 125 kiể ế ể ệ ểu VRĐR gây bệnh ở người được phát hi n [14]ệ Tác nhân VRĐR gây bệnh TCM bao g m m t s virus coxsackie, echo và các kiồ ộ ố ểu VRĐR khác trong đó tác nhân gây bệnh thường g p là EV-A71, CV-A6 và CV-ặ A16 đều thu c loài A [1] Virus ộEV-A71 là tác nhân được quan tâm đặc biệt vì có thể gây ra các biến chứng nặng và dẫn đến tử vong trong khi các VRĐR khác thường gây nên các bệnhcảnh nhẹ

Đặc điểm hình thái cấu trúc và vật liệu di truyền

mỗi đơn vị được hình thành b i 4 protein c u trúc VP1, VP2, VP3, VP4 Trong ở ấ

đó, VP1, VP2 và VP3 ằ n m trên b m t capsid, ch a các v trí là th th t bào ề ặ ứ ị ụ ể ế(receptor) và vị trí k t h p kháng nguyên kháng th , h u h t các v trí này n m ế ợ – ể ầ ế ị ằtrên VP1 Trong khi đó, VP4 n m hoàn toàn bên trong v capsid và hằ ỏ ầu như không có vai trò trong đáp ứng mi n d ch nễ ị hưng giúp đỡ cho s ự ổn định v ỏcapsid thông qua tương tác các phần b o t n c a mình v i ARN virus [16] M i ả ổ ủ ớ ỗprotein VP1, VP2 và VP3 đều có chung c u trúc tám t m ấ ấ β i song song hay đốcòn goi là ng ố β Cứ mỗi một nhóm 4 loại protein cấu trúc trên sẽ tạo nên một đơn vị capsid “capsid promoter” Năm “capsid promoter” gộp lại thành một nhóm 5 đơn vị “pentamer” và 12 “pentamer” hình thành nên vỏ capsid của hạt virus

C u trúc c a EV-ấ ủ A71 cũng giống các VRĐR khác, có mô típ cấu trúc c ố

định T i trạ ục đối x ng bứ ậc năm (pentameric apex) là một đỉnh hình sao bao quanh hốc lõm sâu (canyon), đây là vị trí g n th ắ ụ thể ủ c a một vài VRĐR Trong

n n c a h c lõm là m t túi k ề ủ ố ộ ỵ nước đi xuyên về phía trục đố ứi x ng bậc năm [15, 16]

Hình 1.2 Cấu trúc của EV A71 - [17]

(Ghi chú các t ừ tiếng Anh trong hình: (1) Protomer: Đơn vị capsid “protomer”;

(2) Pentamer: C u trúc gấ ồm 5 đơn vị capsid “protomer”; (3) Translation: ịD ch mã; (4) Structural proteins: Các protein c u trúc ; (5) Nonstructural proteins : ấ

Các protein không c u trúc (6) Processing by viral protease: Quá trình x ấ ử lý

b ng protea virus) ằ se

Vật liệu di truyền của

1.2.1.2

Vật liệu di truyền của EV A71 là ARN mạch đơn dương bao gồm khoảng

-7500 nucleotide, có trọng lượng phân tử = 2,5 x 106 dalton, chiều dài 2.4 m cuộn lại bên trong vỏ capsid Bộ gen của VRĐR bao gồm vùng 5’UTR gắn với VPg, một khung đọc mở (ORF) duy nhất và vùng 3’UTR gắn đuôi poly A [18, 19] Đặc điểm chi tiết của ba vùng như sau [20]:

- Vùng 5’UTR: gồm khoảng 740 nucleotite, chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền ại đây có 6 cấu trúc vòng “stem loop”, ký hiệT - u t ừ I đến VI trong đó stem-loop I hình c ba lá tham gia vào quá trình t ng h p ARN c a virus còn ỏ ổ ợ ủstem-loop II đến VI g m các các trình tồ ự ế ti p nhận ribosome bên trong (internal ởribosome entry site – IRES) liên quan đến quá trình d ch mã protein S sao chép ị ự

b gen và d ch mã RNA c a EV-A71 có th b c ch rõ ràng khi c u trúc cộ ị ủ ể ị ứ ế ấ ủa cỏ

ba lá và IRES b ị tác động b enzyme ởi sirtuin 1 Vùng 5’-UTR c a EV-A71 gi ng ủ ố

- Vùng mã hoá bao gồm khoảng 6582 nucleotide, chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền của virus, là khung đọc mở chỉ huy sự tổng hợp một polyprotein lớn có trọng lượng phân tử 246 kDa, kích thước khoảng 2194  aa (dựa trên trình

tự toàn bộ genome của chủng gốc prototype BrCr AB204853.1, đã đăng ký trên genbank) Polyprotein sau này tiếp tục sẽ phân cắt thành ba polyprotein nhỏ hơn

là P1, P2 và P3 P1 chứa các protein cấu trúc hay còn gọi là protein capsid, VP0, VP1 và VP3 VP0 sẽ phân cắt tạo thành VP2 và VP4 khi bộ gen virus được capsid hóa P2 và P3 chứa các protein không cấu trúc, liên quan đến quá trình nhân lên của virus Cụ thể, P2 gồm các protein 2A, 2B, 2C, trong đó 2A là protease ngăn cản quá trình dịch mã của tế bào chủ, 2B và 2C là enzyme helicase cần cho sự sao chép và đóng gói ARN 2C gắn với ARN có hoạt tính ATP-ase và GTP-ase Polymerase chính của virus là C3Dpro tham gia phân cắt polyprotein nhưng có điểm cắt khác với 2A [5, 22]

Đặc điểm lý hóa

1.2.2

Virus EV-A71 có tính bền và ổn định về mặt cấu trúc đối với một số điều kiện vật lý và hóa chất Cụ thể, virus EV-A71 chịu được điều ki n axit y u, duy ệ ếtrì ho t tính gây nhi m t ạ ễ ừ 1 đến 3 gi ờ ở môi trường pH đến 3.0, giúp virus ổn định trong môi trường của vật chủ như khi tiếp xúc với dịch vị ở dạ dày Virus có thể tồn tại nhiều ngày ở nhiệt độ phòng trong vài ngày, 4oC trong vài tu n và ầnhiệt độ âm sâu trong vài năm Virus được tìm thấy trong nước kể cả nước ngầm

Do virus không có vỏ nên không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ như ether và chloroform, bền với nhiều chất tẩy tại nhiệt độ thường, và bền với các chất khử trùng phòng thí nghiệm như cồn, isopropanol, lysol Tuy nhiên, virus

bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 56oC, tia cực tím, bề mặt sấy khô, một số hóa chất như

nước formaldehyde, glutaraldehyde, axit mạnh, sodium hypochlorite, Clo dư [23]

Quá trình nhân lên

Phiên mã, sao chép và dịch mã

1.2.3.2

Đầu tiên, ARN đóng vai trò làm khuôn để tổng hợp ARN polymerase là enzyme mà tế bào chủ thiếu Quá trình này bắt đầu từ IRES tại đầu 5’UTR Polypotein đơn được phiên mã và được phân cắt thành các protein cấu trúc, không cấu trúc và một số tiền chất là P1, P2, P3 nhờ các enzyme protease phân giải là 2Apro và 3CproMột trong số đó, tiền thân protein capsid P1 được đồng dịch hóa Các protein P2, P3 được cắt thành 7 protein không cấu trúc Các protein được phân cắt từ P3 gồm protease 3C và 3CD cần thiết cho sự phân cắt các protein từ các tiền chất ARN dương được sử dụng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN âm nhờ enzyme polymerase 3D T ừ đây, ARN sợi âm được s d ng ử ụlàm khuôn tổng h p m t lư ng l n các sợ ộ ợ ớ ợi dương để ấy đây làm khuôn phiên mã l

và dịch mã thành các protein cũng như dùng để đóng gói thành các virion Các protein VPg được gắn vào đầu 5’ của tất cả các bản phiên mã, có chức năng mồi trong sao chép

Song song với quá trình này, việc cắt các protein eIFI4G BABP bằng protein 2Apro và 3Cpro làm chặn đứng sự phiên mã các protein của tế bào chủ,

bi n t bào ế ế chủ thành t bào ch ế ủ “dừng” – là t bào ch không có kh ế ủ ả năng chặn thực hi n các chệ ức năng thông thường và tr ở thành nơi lý tưởng cho s nhân lên ự

của virus Bên cạnh đó, các protease của virus cũng cắt đứt m t vài y u t khác ộ ế ố

c a t bào t ủ ế ừ đó hỗ trợ ự s nhân lên của virus và/ hoặc ngăn chặn ph n ng ch ng ả ứ ốvirus của tế bào

Lắp ráp và giải phóng

1.2.3.3

Việc lắp ráp thành một hạt virus mới bắt đầu khi tiền protein P1 phân cắt thành protein VP0, VP1 và VP3 được gọi là heterotrime Sau đó, 5 heterotrime liên kết với nhau tạo thành cấu trúc pentameric Một lần nữa 12 pentameric lại kết hợp với nhau tại thành tiền capsid (procapsid – VP01260) là nơi sẽ chứa bản sao hệ gen sợi ARN dương Trong quá trình đóng gói sợi ARN, phần lớn -

9

protein capsid VP0 được cắt thành VP2 và VP4 Đây được gọi là sự phân cắt trưởng thành, được coi là công đoạn “khóa” – đóng lại sự lắp ráp lớp vỏ capsid, trở thành một hạt viron hoàn chỉnh, ổn định, trưởng thành Hạt virus hoàn chỉnh

sẽ thoát ra khỏi tế bào chủ thông qua con đường phóng thích không phân giải nhờ các túi ngoại bào hoặc ly giải, đây là hệ quả của việc virus tạo enzyme ức chế các quá trình phiên mã, dịch mã của tế bào Virus được phóng thích tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào khác [55]

Hình 1.3 Quá trình nhân lên của virus EV-A71 [25]

(Ghi chú các t ng Anh trong hình: (1) Uptake: h p th ; (2) RNA release: giừ tiế ấ ụ ải

phóng RNA; (3) Translation: d ch mã; (4) Proteolytic processing: quá trình phân ị

gi i protein; (4) (-) RNA synthesis: t ng h p s i RNA âm; (5): (+) RNA synthesis: ả ổ ợ ợ

t ng h p sổ ợ ợi RNA dương; (6) Encapsidation: đóng gói; (7): Cell lysis: ly giả ếi t bào)

Một tế bào bị nhiễm thông thường có thế là “nhà máy” sản xuất ra từ

104-105 hạt virion Sự ly giải tế bào được thực hiện khi có quá trình tăng tính thấm của màng tế bào kết quả từ việc tăng nồng độ các protein không cấu trúc 3A, - 3B

ho c c ặ ả hai con đường [2] Nguồn lây chính do ti p xúc tr c ti p t ế ự ế ừ nước b t, ọ

d ch n t ph ng, phân cị ố ỏ ủa người nhi m b nh ho c cễ ệ ặ ủa người mang m m b nh ầ ệ

không có tri u ch ng ho c thệ ứ ặ ức ăn, nước u ng, bàn tay c a tr hoố ủ ẻ ặc người chăm sóc trẻ, các đồ dùng, đặc biệt là đồ chơi và vật d ng sinh ho t hụ ạ ằng ngày như chén, bát, đĩa, thìa, cốc b nhi m virus Kh ị ễ ả năng lây truyền cao nh t di n ra ấ ễtrong tuần đầu c a b nh M t s yủ ệ ộ ố ế ốu t có th ể làm gia tăng sự lây truy n và bùng ềphát d ch bao g m: mị ồ ật độ dân s cao, s ng ch t chố ố ậ ội; điều ki n v sinh kém; ệ ệthiếu nhà v sinh; thi u hoệ ế ặc không có nước s ch ph c v cho sinh ho t hàng ạ ụ ụ ạngày [2, 12]

Cơ chế bệnh sinh

1.2.4.2

B nh có th ệ ể chia làm 4 giai đoạn chính như sau: [1, 2, 12]

Gia: Kéo dài từ 3 7 ngày kể từ khi nhiễm Trong giai đoạn - này trẻ vẫn bình thường, và thông thường không có dấu hiệu nhiễm bệnh Đầu tiên, sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên ch yủ ế ởu các mô lympho liên

kết ở ầ h u h ng và ru t Sau 24 gi virus ti p t c nhân lên phía sâu trong c ọ ộ ờ ế ụ ở ổ

h ng và các h ch b ch huy t trên màng treo ru t Tiọ ở ạ ạ ế ộ ếp đó chúng xâm nhập vào

t ổ chức liên k t g m h ch b ch huy t, tu ế ồ ạ ạ ế ỷ xương, gan và lách Ở giai đoạn này các virus có th xâm nhi m vào h ể ễ ệ thần kinh trung ương Tại các t bào niêm ế

m c ru t non thì s ạ ộ ố lượng virus nhân lên nhi u nhề ất

bệnh biểu hiện mạnh nhất trong tuần đầu và có thể kéo dài vài tuần sau đó, thậm chí sau khi bệnh nhân hết triệu chứng Giai đoạn này có một số triệu chứng điển hình như sốt nhẹ, mệt mỏi, đau họng, biếng ăn, tiêu chảy vài lần trong ngày

điển hình của bệnh như: loét miệng, phát ban dạng phỏng nước ở lòng bàn tay, lòng bàn chân, gối, mông; tồn tại trong thời gian ngắn, sốt nhẹ và nôn Nếu trẻ sốt cao và nôn nhiều dễ có nguy cơ biến chứng về thần kinh, tim mạch hoặc hô hấp Biến chứng thần kinh: biểu hiện thường gặp nhất là giật mình chới với, run chi, loạng choạng, rung giật nhãn cầu, co giật, hôn mê Ngoài ra trẻ có thể gặp các biến chứng về tim mạch dẫn đến trụy mạch hay hô hấp dẫn đến suy hô hấp

-  Thường sau giai đoạn toàn phát từ 3 5 ngày Trẻ hồi - phục hoàn toàn Nếu có biến chứng sẽ trở thành thể tối cấp, bệnh diễn tiến rất nhanh có các biến chứng nặng dẫn đến tử vong

Phân loại virus EV-A71

11

nhóm gen/ki u gen ph /phân nhóm gen (sub-genogroup/sub-genotype), thông ể ụthường vẫn được g i chung là ki u/ki u gen EV-ọ ể ể A71 Các EV-A71 được x p vào ếcùng m t phân nhóm n u có trình t nucleotide ộ ế ự vùng gen VP1 tương đồng 88% trở lên và cùng m t nhóm gen/ki u gen nộ ể ếu độ tương đồng t -84% [26] Tuy ừ80nhiên, nghiên c u hi n t i c a Yoke -Fun Chan (2010) cho th y các giá tr giứ ệ ạ ủ ấ ị ới

h n khá khác nhau gi a các nhóm gen c a các ch ng ạ ữ ủ ủ EV A71- D a trên b gen ự ộhoàn ch nh, ỉ EV-A71 có th ể được phân thành các nhóm gen ho c phân nhóm gen ặtrên cơ sở khác bi t nucleotide lệ ần lượt là 17 - 22% và 10 - 14% Các giá tr gi i ị ớ

h n mạ ới này được đề xu t d a trên b gen hoàn chấ ự ộ ỉnh, được nghiên c u theo ứcách có h ệ thống hơn và dự ế ki n s phẽ ản ánh chính xác hơn các mối quan h phát ệsinh loài

Hình 1.4 Cây phát sinh loài EV-A71 dựa trên phân tích di truyền vùng VP1[27] Tính đến hi n t i, dệ ạ ựa trên cơ sở phân tích di truy n vùng VP1, EV-A71 ề đã được xác định gồm 7 nhóm gen, đặt tên là A, B, C, D, E, F và G Nhóm gen A bao g m m t ch ng virus duy nh t, là ch ng g c (prototype) c a EV-A71, kí ồ ộ ủ ấ ủ ố ủ

hi u BrCr-ệ USA-70 Ph n l n ầ ớ các EV A71 đượ- c định lo i v sau này thu c nhóm ạ ề ộgen B ho c C Nhóm gen B và C ti p tặ ế ục được phân loại thành nhiều dưới nhóm gen (phân nhóm), gồm B0, B1, , B6, B7 đối với nhóm B và C1, C2, C3, C4a, C4b

và C5 c a nhóm C [27-30] Nhóm gen D có 1 chủ ủng được phân l p ậ ở Ấn Độ năm

2002 [31] Gần đây, nhóm gen E đã được xác định t i châu Phi [29] Bessaud M ạ

và c ng s ộ ự đã công bố nhóm gen F, cũng được phát hi n t i châu Phi [27] Trong ệ ạ

m t nghiên c u v s ộ ứ ề ự đa dạng di truy n c a EV-A71 t i ề ủ ạ Ấn Độ vào năm 2015,

nhóm tác gi ả Saxena đã phát hiện ra m t nhóm gen mộ ới, đề xuất đặt tên là nhóm gen G [30] Dữ liệu phân tích di truyền phả hệ cho thấy nhóm gen D và E được phân tách từ một tổ tiên chung, trong khi các chủng nhóm gen F tiến hóa từ một

tổ tiên chung với các thành viên của nhóm gen B [27]

Các kỹ thuật phát hiện EV A71 trong phòng thí nghiệm

-1.2.6

Nuôi cấy virus và xét nghiệm định danh

1.2.6.1

a Nuôi cấy phân lập virus

Tiêu chuẩn vàng cổ điển để xác định nhiễm VRĐR nói chung và EV-A71 nói riêng là nuôi cấy, phân lập virus trên các dòng tế bào/vật chủ đặc hiệu Nuôi cấy virus trên tế bào đặc hiệu là kỹ thuật gây nhiễm virus (có trong mẫu bệnh phẩm) lên dòng tế bào nuôi thích hợp nhằm tăng sinh virus Hai trong số các dòng tế bào được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập virus EVA 71 bởi có độ -nhạy tương đối cao là dòng tế bào cơm tim người, RD (human rhabdomysorcoma cells) và tế bào thận khỉ xanh Châu Phi, Vero (Afican green monkey kidkey cells) Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy virus không được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán do đòi hỏi cao về cơ sở vật chất, năng lực xét nghiệm và mất nhiều thời gian (Mẫu bệnh phẩm đòi hỏi phải xử lý trước khi phân lập, và cần dòng tế bào phù hợp để cuôi cấy và khoảng 14 ngày mới có kết quả) [1] Hiện nay nuôi cấy phân lập virus chủ yếu là dùng để lưu giữ chủng virus Chủng virus sau khi phân lập sẽ được định danh bằng các phương pháp khác nhau như trung hòa, miễn dịch và sinh học phân tử

b.Các phương pháp định danh sau phân lập

 Phương pháp trung hòa

Sau khi phân lập virus trên tế bào, có thể xác định EV-A71 hay các nhóm gen/dưới nhóm gen bằng xét nghiệm trung hòa thông thường với kháng huyết thanh đặc hiệu Tuy nhiên các loại kháng huyết thanh này thường không có sẵn trên thị trường thương mại nên việc cung cấp cho các phòng thí nghiệm thường

bị hạn chế Thử nghiệm trung hòa vẫn là một phương pháp đáng tin cậy để xác định VRĐR, nhưng có thể mất 5 đến 7 ngày để hoàn thành xét nghiệm [1, 32]

 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) sử dụng kháng thể đơn dòng kháng EV-A71 có thể giúp xác định nhanh chóng Kháng thể sử dụng trong phương pháp thường có sẵn trên thị trường, phương pháp IFA khá đơn đơn giản

về mặt kỹ thuật và có kết quả nhanh nhưng tương đối đắt tiền [1]

13

 Phương pháp RT PCR đặc hiệu EV A71-

-Sau khi phân lập virus trên tế bào, RNA của virus được tách chiết và thực hiện phản ứng RT PCR, sử dụng các mồi đặc hiệu để xác định EV- -A71 [33] Khuếch đại RT PCR đặc hiệu cho EV A71 là phương pháp định danh nhanh - -chóng, đơn giản với chi phí thấp Tuy nhiên, các đoạn mồi dành riêng cho EV-A71 cần được cập nhật dựa theo trình tự của các nhóm gen/dưới nhóm gen và các biến chủng EV A71 mới nổi để duy trì độ tin cậy của xét nghiệm RT- -PCR Cần đào tạo tập huấn cho các nhân viên xét nghiệm khi tiến hành phương pháp này nhằm giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm

Các phương pháp huyết thanh học

1.2.6.2

Xét nghiệm trung hòa kháng thể không được khuyến cáo sử dụng trong chẩn đoán nhiễm VRĐR Tuy nhiên, xét nghiệm trung hòa rất có ích trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với EV A71 trong cộng đồng, cũng như để theo dõi phản ứng chéo của huyết thanh giữa các nhóm gen khác nhau của EV-A71 [34]

Hiện nay trên thị trường đã có nhiều hãng sản xuất cung cấp kit ELISA phát hiện kháng thể IgM hoặc IgG với giá thành thấp, chẩn đoán nhanh Đối với phương pháp IgM không những tích kiệm thời gian chẩn đoán EV-A71 mà còn cho ta biết liệu trường hợp này có phải mắc bệnh lần đầu tiên hay không Phương pháp phát hiện kháng thể EV A71 được tiến hành nhanh chóng, đơn giản, giúp -chẩn đoán sớm tác nhân với hiệu quả và chi phí thấp Thời gian để có kết quả xét nghiệm chỉ khoảng 4 giờ Tuy nhiên phương pháp có thể gây hiện tượng dương tính giả [35]

Các phương pháp sinh học phân tử

1.2.6.3

Hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, các phương pháp chẩn đoán từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng đã và đang phát triển hoàn thiện và ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán nhanh, chính xác, định loại các tác nhân gây bệnh Các phương pháp này sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên các trình tự mồi đặc hiệu được thiết kế trên vùng gen VP1 của virus EV A71 Đoạn gen dùng để -xác định có thể là một phần hoặc toàn bộ vùng gen VP1

Phương pháp sinh học phân tử có đặc điểm nổi trội là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thường cho kết quả nhanh chỉ sau một vài giờ kể từ ngày nhận mẫu

a K ỹ thuật PCR bán t và gi i trình t gen (semi-nested ổ ả ự

PCR/Sequencing):

Năm 2008, kỹ thuật PCR bán tổ và giải trình tự gen (snPCR/Seq) được dùng để xác định các týp VRĐR từ các mẫu phân lập và phải mất ít nhất 2 tuần mới có kết quả [36] Năm 2009, kỹ thuật sinh học phân tử bán tổ đã phát triển để xác định được các týp VRĐR từ các mẫu lâm sàng [32, 37] Tuy nhiên kỹ thuật này để xác định EV A71 cần phải giải trình gen nên rất tốn kém và phải có máy -giải trình tự gen Kỹ thuật nested RT PCR thường áp dụng đối với các mẫu có tải -lượng virus trong mẫu ít

b RT PC- R và multiplex RT-PCR

Phương pháp được th c hi n d a trên b mự ệ ự ộ ồi được thi t k trên vùng VP1 ế ế

c a EV-A71 H ủ ệ thống m i phát hi n EV-A71 có th s dồ ệ ể ử ụng đơn lẻ trong một

ph n ng RT-PCR ho c s dả ứ ặ ử ụng đồng th i v i các h ờ ớ ệ thống m i phát hi n các ồ ệ

kiểu VRĐR khác, ví dụ như CV-A16, CV-A6, CV-A10… trong phản ứng multiplex RT-PCR (RT-PCR đa mồi) Phương pháp có độ nhạy, độ đặ c hi u cao, ệthích h p cho vi c chợ ệ ẩn đoán EV-A71 khi các v d ch xụ ị ảy ra Ưu điểm của phương pháp là thời gian xét nghi m nhanh trong vòng 1 ngày, quá trình thao ệthác, các ph n ng diả ứ ễn ra trong điều kiện kín do đó giảm các l i do pipette và ỗlây nhi m chéo [38] Xét nghi m này áp d ng cho các b nh ph m d ch não t y, ễ ệ ụ ệ ẩ ị ủcác ch t dấ ịch cơ thể khác như phân, dịch tiết đường hô h p và máu [1]ấ Đố ới i vphương pháp multiplex có thể xác định nhanh chóng cùng m t lúc các tác nhân ộgây bệnh Nhược điểm của phương pháp là cần có b m i thi t k chuộ ồ ế ế ẩn và đặc

hi u có cùng nhiệ ệt độ, kích thước band khuếch đại ch t 70-150bp, và vi c tỉ ừ ệ ối

ưu hóa nồng độ các mồi, đệm trong ph n ả ứng cũng tốn th i gian và công s c ờ ứtrước khi đưa vào ứng d ng ụ

d Realtime RT-PCR (rRT-PCR):

rRT-PCR là k ỹ thuật nhân bản gen đích trong ống nghi m thành hàng t ệ ỷ

b n sao, k t qu khuả ế ả ếch đại ADN đích hiển th ngay sau mị ỗi chu k nhi t cỳ ệ ủa phả ứn ng, không ph i làm tiả ếp các bước của giai đoạn sau PCR nên h ệ thống rRT-PCR giúp chẩn đoán phát hiện nhanh chóng và c ụthể ộ ố ệ m t s b nh truyền nhi m ễHiện nay, trên th giế ới đã phát triển nhi u h ề ệ thống realtime RT-PCR xác định nhanh và riêng tác nhân EV-A71 hoặc phương pháp multiplex rRT-PCR xác hiện đồng thời đa tác nhân bao gồm EV-A71 [39, 40] H ệ thống rRT-PCR có thể làm giảm nguy cơ nhiễm chéo khi so sánh v i RT-ớ PCR thông thường, đặc bi t là h ệ ệthống Nested PCR phải thực hiện 2 vòng, tăng nguy cơ nhiễm chéo dẫn đến dương tính gi [1] ả

15

e RT-LAMP

Đây là một phương pháp mới có th khuể ếch đại m t lư ng lớn gen đích trong ộ ợthời gian ngắn, đọc k t qu dế ả ễ dàng Điểm mấu ch t của kỹ thu t LAMP là thiố ậ ết kếmồi cho gen đích Vùng gen mã hóa protein VP1 của EV-A71 đã được chọn đểphát triển nghiên cứu này Phương pháp có độ nhạy độ đặ c hi u cao, d sệ ễ ử d ng và ụgiá thành r , có th anh chóng phát hi n EV-A71 khi có các d ch TCM bùng ẻ ể nh ệ ịphát, đồng thời gi m thiểu nguy cơ lây nhiễm chéo vì thao tác mộả t bư c [41] ớ

Các phương pháp giải trình tự gen phân tích đặc điểm di truyền

1.2.6.4

a Phương pháp giải trình t gen vùng VP1 bự ằng phương pháp Sanger

Harvestala và cộng sự, 2018 đã nghiên cứu đề xu t r ng ch cấ ằ ỉ ần độ dài VP1

t i thi u 350 nucleotide ố ể để thực hi n giám sát nhanh ki u gen t i các phòng thí ệ ể ạnhiệm Tuy nhiên để có thông tin đầy đủ và đáng tin cậy v m t di truyề ặ ền, đặc

bi t khi phân tích s xu t hi n c a m phân nhóm gen m i c n ph i có trình t ệ ự ấ ệ ủ ột ớ ầ ả ựnuleotide c a toàn b ủ ộ chuỗi VP1 [42] Trong t t c các protein capsid, VP1 là ấ ảprotein capsid quan tr ng nh t, n m hoàn toàn bên ngoài và là thành ph n chính ọ ấ ằ ầ

c a h m núi (caynon) trên b m t c a virus Vùng gen ủ ẻ ề ặ ủ VP1 có liên quan đến kh ảnăng gây bệnh c a virus, liên k t v i th th c hi u, quyủ ế ớ ụ ể đặ ệ ết định tính kháng nguyên và độ ố ủc t c a virus [43] Hơn nữa, s ự đa dạng di truy n t i VP1 có liên ề ạquan ch t ch v i s khác bi t v ki u huy t thanh virus; d a vào s khác bi t v ặ ẽ ớ ự ệ ề ể ế ự ự ệ ềtrình t nucleotide và axit amin cự ủa VP1, các VRĐR được phân chia thành các loài, ki u huyể ết thanh, nhóm gen và dưới nhóm gen [44] Ngoài ra có s tái t ự ổ

hợp thường xuyên x y ra giả ữa các nhóm gen VRĐR trong cùng một loài, giữa các vùng gen c u trúc và phi c u trúc, và trong quá trình phân l p V i nh ng lý ấ ấ ậ ớ ữ

do trên trình t vùng gen VP1 c a mự ủ ẫu lâm sàng được khuy n ngh ế ị dùng để phân tích di truyền và định lo i các VRĐR [45] ạ

Trên th gi i, các kế ớ ỹ thu t chậ ẩn đoán sinh học phân t khi nghiên c u v di ử ứ ềtruy n c a EV-ề ủ A71 thường s d ng các c p mử ụ ặ ồi đặc hiệu để khuếch đại toàn b ộvùng gen VP1, trung bình là 891 nucleotide (297 aa) [15] Phương pháp này đã

và đang được s d ng t i các phòng thí nghi m t i Viử ụ ạ ệ ạ ệt Nam khi phân tích đặc điểm di truy n EV-A71 ề

b Phương pháp giải trình t gen th h m i Next Generation Sequencing ự ế ệ ớ

(NGS)

Công ngh gi i trình t gen th h mệ ả ự ế ệ ới NGS đã tạo ra cu c cách m ng trong ộ ạnghiên c u c u trúc h gen M c dù vi c phân loứ ấ ệ ặ ệ ại VRĐR thường d a vào kiự ểu gen của protein capsid VP1, nhưng việc xác định b gen EV-A71 hoàn ch nh ộ ỉ là mong muốn và lý tưởng vì s tái t h p x y ra rự ổ ợ ả ất thường xuyên giữa các VRĐR

Giải trình t toàn b b gen một cách chính xác và đầy đủ ủa VRĐR sẽự ộ ộ c cho phép xác định các điểm tái t h p và theo dõi s xu t hi n các chổ ợ ự ấ ệ ủng độ ực l c m i ớ[41, 46] Phương pháp cho phép đọc trình t dài có th b ng c m t h gen ự độ ể ằ ả ộ ệlên đến hàng t c p nucleotide, cung cỉ ặ ấp lượng d li u c c l n, tuy nhiên v n có ữ ệ ự ớ ẫ

nh ng h n ch nhữ ạ ế ấ ịt đnh là t l sai s cao (0,1-15%), mỉ ệ ố ỗi đoạn gi i trình t ả ự ngắn hơn rất nhi u so v i sanger (35-ề ớ 700 bp), đòi hỏi ngườ ử ụi s d ng ph i ki m ra k ả ể ỹlưỡng k t qu và s d ng các ph n m m chuyên dế ả ử ụ ầ ề ụng Phương pháp cần sinh

phẩm và máy móc khá đắt ti n.ề Phương pháp này cũng đã áp dụng t i PTN ạVRĐR Viện VSDTTW

Các ca b nh nh l và nh ng v d ch c a b nh TCM di n ra t i m i thệ ỏ ẻ ữ ụ ị ủ ệ ễ ạ ọ ời điểm và m i quọ ốc gia trong các điều ki n khí h u khác nhau trên th gi i B nh ệ ậ ế ớ ệthường có xu hướng x y ra và lan nhanh, r ng vào mùa xuân hè ả ộ – – thu Điều này được cho là do có s liên quan v y u t khí hự ề ế ố ậu đặc biệt là trong đều ki n ệ

độ ẩ m và nhiệt độ cao [1] Bệnh thường x y ra vùng nông thôn nhiả ở ều hơn so

v i khu v c thành th , ớ ự ị ảnh hưởng b i mở ức độ ệ v sinh, v ệ sinh kém là điều kiện thuậ ợn l i cho b nh có kh ệ ả năng phát triển, nhân r ng [47] ộ

R t nhi u các nghiên cấ ề ứu đã chỉ ra rằng đặc điểm c a b nh TCM ph ủ ệ ụ thuộc vào nhi u y u t ề ế ố như lứa tu i m c b nh, gi i tính, th i gian m c b nh, mổ ắ ệ ớ ờ ắ ệ ật độdân cư…Bệnh thường g p tr ặ ở ẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt dưới 3 tu i, g p tr nam ổ ặ ở ẻnhiều hơn trẻ ữ n Các y u t sinh ho t t p th ế ố ạ ậ ể như trẻ đi học t i nhà tr , m u ạ ẻ ẫgiáo, các khu trung tâm vui chơi của tr em là y u t ẻ ế ố nguy cơ dễ khi n b nh lây ế ệtruy n, lan rề ộng và đặc bi t có th bùng phát thành các v d ch l n S xu t hi n ệ ể ụ ị ớ ự ấ ệ

của TCM ở đây có liên quan m t thiậ ế ết đ n phân b mùa, tu i và khu vố ổ ực [48] EV-A71 được phân l p t phân c a mậ ừ ủ ột đứa tr 9 tháng tu i b viêm não, ẻ ổ ị ởCalifornia, Hoa Kỳ, vào năm 1969 Các vụ ịch sau đó liên quan đế d n nhi m EV-ễA71 đã được báo cáo ở New York, năm 1972 và 1977, Philadelphia ở năm 1987,

ở Úc năm 1972-1973 và 1986, Thụy Điển năm 1973, Nhật Bản năm 1973 và

1978, Bulgaria năm 1975, Hungary năm 1978, Pháp năm 1979, Hồng Kông năm

1985 [28] Trong những đợt bùng phát đó, EV A71 đã gây ra mộ- t lo t b nh vạ ệ ới các tri u ch ng lâm sàng khác nhau, bao gệ ứ ồm tay chân mi ng, viêm màng não vô ệ

17

khu n, viêm não, li t, tri u ch ng hô hẩ ệ ệ ứ ấp cấp tính và viêm cơ tim Mặc dù các dù các bi u hi n lâm sàng trong nhể ệ ững đợt bùng phát này ch yủ ếu điển hình của

b nh TCM d ng nh ệ ở ạ ẹ nhưng ộm t nhóm trẻ nh có bi n ch ng viêm não và t ỏ ế ứ ửvong cũng đã được ghi nh n [28, 57] ậ

Năm 1997, m t v d ch l n EV-A71 Sarawak, Malaysia vộ ụ ị ớ ở ới 2618 trường

h p m c TCM và 34 t ợ ắ ử vong đã được báo cáo, ngay sau đó hàng loạt v dụ ịch TCM đã xảy ra trên kh p khu v c châu Á-ắ ự Thái Bình Dương [49] Trong nh ng ữ

đợt bùng phát d ch này, h u h t các tr u có tri u ch ng c a bị ầ ế ẻ đề ệ ứ ủ ệnh điển hình và

h i phồ ục không để ạ l i các di ch ng Tuy nhiên, có m t s ít b nh nhân có các ứ ộ ố ệ

bi n ch ng nguy hi m, ph i nh p vi n và thế ứ ể ả ậ ệ ậm chí đã tử vong Các trường h p b ợ ịphù /xu t huy t ph i nhanh chóng và gây t ấ ế ổ ử vong cũng được phát hi n lệ ần đầu tiên [44] Năm 1998, dịch EV-A71 l n nhớ ất đã xảy ra ở Đài Loan cho đến nay:

ước tính có kho ng 1,5 triả ệu ngườ ịi b nhi m và 405 tr có bi n ch ng th n kinh ễ ẻ ế ứ ầnghiêm tr ng, 78 tr t vong D ch b nh l n nh t Châu Á-ọ ẻ ử ị ệ ớ ấ Thái Bình Dương là ởTrung Quốc năm 2008, khi có khoảng 490.000 ca nhiễm và 126 trường h p t ợ ửvong ở trẻ em; t i tâm ch n tạ ấ ở ỉnh An Huy, hơn 6.000 trường h p mợ ắc ệb nh TCM và 22 trường h p t vong ợ ử ở trẻ em đã được báo cáo [50] Ngoài nh ng v ữ ụ

d ch r t l n này, nhi u khu v c, bao g m Nh t B n, Hàn Qu c, H ng Kông, ị ấ ớ ề ự ồ ậ ả ố ồSingapore, Đài Loan và ệVi t Nam đã xảy ra d ch b nh theo chu k kho ng 2 - 3 ị ệ ỳ ảnăm [44] Theo c p nhậ ật năm 2018 về tình hình b nh TCM khu v c Tây Thái ệ ựBình Dương từ ngu n s li u c a T ch c Y t th gi i (WHO) ngày 14/8/2018, ồ ố ệ ủ ổ ứ ế ế ớ

Đặc điểm dịch tễ

1.2.7.2 và gánh nặng bệnh tật tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ca tay chân miệng liên quan đến nhi m EV-ễ A71 đầu tiên có kèm bi n ch ng viêm não nế ứ ặng được Nguy n Th ễ ị Hiền Thanh và c ng s phát ộ ự

hi n, nghiên c u tệ ứ ại Hà Tây vào năm 2003 [52] Tuy nhiên, đến năm 2005 vụ

dịch TCM đầu tiên x y ra t i mi n Nam ả ạ ề Việt Nam mới được báo cáo chính th c ứNăm 2007, nghiên cứu d ch t h c phân t bài b n v ị ễ ọ ử ả ề căn nguyên VRĐR gây

d ch b nh TCM ị ệ ở Việt Nam đã được Phan Văn Tú và cộng s ự thực hi n ệ Việt Nam, với đặc điểm địa lý trải dài trên 15 vĩ độ - khi n cho khí h u có tính chế ậ ất

thất thường, đa dạng và bi n ng gi a các vùng mi n Ngoài ra, thói quen sinh ế độ ữ ề

ho t tạ ập quán, môi trường sinh s ng nhiố ở ều nơi đặc bi t t i vùng sâu, vùng xa ệ ạcòn h n ch ạ ế là điều ki n thu n l i cho b nh xu t hi n, phát tri n nhanh chóng ệ ậ ợ ệ ấ ệ ểthành v d ch nụ ị ếu không được giám sát tốt Đối tượng mắc b nh ch yếệ ủ u v n ẫtương tự và đặc trưng cho bệnh - tập trung vào nhóm đối tr ẻ em dưới 5 tu i ổTrong đó, độ ổ tu i chi m t l nhi m cao nh t là tr ể ỷ ệ ễ ấ ẻ em dưới 3 tuổi Năm 2011, tỷ

l này c ba miệ ở ả ền đều dao động t -95% s ca m c b nh B nh di n ra t i c ừ 80 ố ắ ệ ệ ễ ạ ả

3 mi n Bề ắc – Trung – Nam T l nhi m b nh các mi n không có s khác biỷ ệ ễ ệ ề ự ệt theo không gian địa lý và th i gian [53-56] ờ

S ố trường hợp được báo cáo/t vong c a ử ủ TCM tương ứng là 5.719/23 trong năm 2007, 10.958/25 năm 2008 và 10.632/23 trong năm 2009 [1] D li u giám ữ ệsát qu c gia do B Y t công b cho thố ộ ế ố ấy xu hướng gia tăng trong các năm liên tiếp và đến đỉnh điểm vào năm 2011 khi Việt Nam ghi nhận 113.121 trường h p ợ

m c bắ ệnh TCM và 170 trường h p t vong [57] T ợ ử ừ năm 2011, Bộ Y t ế đã xếp TCM là m t b nh truy n nhi m nghiêm tr ng có kh ộ ệ ề ễ ọ ả năng bùng phát (bệnh truy n nhi m lo i B) và bề ễ ạ ệnh đã được báo cáo hàng tu n b i h ầ ở ệ thống giám sát

b nh truy n nhi m qu c gia thu th p báo cáo t t t c các b nh việ ề ễ ố ậ ừ ấ ả ệ ện Năm 2005,

t i b nh viạ ệ ện Nhi Đồng 1 đã chẩn đoán 764 trẻ ắ m c b nh TCM t i Thành ph H ệ ạ ố ồChí Minh, trong s ố đó, 96% là trẻ dưới 5 tu i, 51 (29%) ổ trường h p nhi m EV-ợ ễA71 có bi n ch ng th n kinh nghiêm tr ng và t vong [5] ế ứ ầ ọ ử

Năm 2011, 64 tỉnh thành trong cả nước đã ghi nhận những ca mắc bệnh tay chân miệng, làm 98 trẻ em tử vong 75% trong số đó là trẻ em dưới 3 tuổi Mặc

dù không có tuyên bố chính thức dịch bệnh bùng phát, nhưng theo báo cáo hơn

42.000 trường hợp mắc bệnh đã được ghi nhận, và hơn 10 000 trường hợp mới xuất hiện chỉ trong tháng 8 năm 2011 ộM t nghiên c u ti n hành trên 2041 b nh ứ ế ệnhân TCM được nh p vi n t i 5 b nh vi n lậ ệ ạ ệ ệ ớn đại di n cho c ệ ả nước g m b nh ồ ệviện Nhi Đồng 1, Nhi Đồng 2, Nhiệt đới thành ph H Chí Minh, Nhi Trung ố ồương và bệnh vi n B nh nhiệ ệ ệt đới Trung Ương trong giai đoạn 2011-2012 cho

thấy 97,8% trường h p mợ ắc TCM dưới 5 tuổi (88,2% dưới 3 ổtu i) Trong v ụ

d ch này, m c dù s ị ặ ố trường h p b nh TCM ợ ệ ở nhóm dưới 6 tháng là th p nhấ ất nhưng tỷ ệ ệ l b nh n ng lúc nh p vi n lặ ậ ệ ại khá cao (13,5%) và các trường h p nh ợ ẹtrong quá trình n m viằ ện ở nhóm này có t l chuyỷ ệ ển sang độ ặ n ng là cao nhất (15,4%) so với các nhóm khác Bé trai có nguy cơ mắc b nh cao g p 1,3 l n bé ệ ấ ầgái [58]

Nghiên c u c a nhóm tác gi ứ ủ ả Trần Th ị Nguyễn Hòa và c ng s trên 424 ộ ựtrường hợp dương tính với virus đường ru t từộ 546 b nh nhân m c b nh TCM ệ ắ ệ ở

19

các t nh mi n Bỉ ề ắ Việc t Nam trong năm 2015-2016 cho k t qu b nh TCM x y ế ả ệ ả

ra ở ầ h u h t các tháng cế ủa năm, tập trung cao vào các tháng xuân hè và thu đông Tuổi m c bắ ệnh thường tr trong vòng 5 tu i, t p trung chính tr t 7 ở ẻ ổ ậ ở ẻ ừ

Tiêm globulin mi n d ch vào máu c a tr ễ ị ủ ẻ sơ sinh cũng là một cách điều tr ị

b nh nhiệ ễm VRĐR nói chung và EV-A71 nói riêng Globulin mi n dễ ịch được tiêm vào máu ho c vào tu s ng cho nhặ ỷ ố ững ngườ ị ệi b b nh viêm não, viêm màng não mãn tính nghi ng do virus ờ đường ru t ho c nhộ ặ ững cơ thể thi u h t miế ụ ễn

d ch có nhiị ễm VRĐR tiềm tàng bao g m c vồ ả irus polio Globulin mi n d ch có ễ ịtác d ng b o v ụ ả ệ cơ thể chống lại bệnh Tuy nhiên, trong một vài trường h p, hi u ợ ệ

qu ả điều tr ị cũng bị gi i hớ ạn do không đủ các lo i kháng th có trong globulin ạ ểmiễn d ch [51] ị

Phòng bệnh không đặc hiệu

1.2.8.2

Hiệ ạn t i, r a tay b ng xà phòng, gi gìn v sinh, kh khuử ằ ữ ệ ử ẩn là phương pháp phòng tránh b nh hi u qu nhệ ệ ả ất Điều ki n v sinh t t s làm gi i h n s lan ệ ệ ố ẽ ớ ạ ựtruy n b nh Biề ệ ện pháp cách ly ngườ ệi b nh, v ệ sinh môi trường, v ệ sinh đồ chơi trẻ em, v sinh cá nhân s làm giệ ẽ ảm nguy cơ nhiễm b nh Các bi n pháp v sinh ệ ệ ệ

cá nhân nên áp dụng thường xuyên là r a tay sau m i lử ỗ ần vệ sinh, sau thay tã cho trẻ Kh ử trùng nơi bị nhi m bễ ệnh như dụng cụ, đồ chơi của tr , nhà c a, khu v ẻ ử ệsinh…[1] R a tay b ng xà phòng và kh trùng b ng dung d ch chlor s làm ử ằ ử ằ ị ẽ

giảm nguy cơ nhiễm b nh Tránh các ti p xúc g n vệ ế ầ ới ngườ ệnh như hôn, vuốt i b

ve, dùng chung d ng c [12] ụ ụ

Phòng bệnh đặc hiệu bằng vaccine:

1.2.8.3

EV-A71 là m t trong các tác nhân chính gây ra các v d ch TCM trên th ộ ụ ị ế

giới, liên quan đến các trường h p bi n ợ ế chứng nặng ho c t vong T l nhiặ ử ỷ ệ ễm EV-A71 là r t khác nhau gi a các quấ ữ ốc gia, đồng th i các ki u gen c a virus này ờ ể ủđang trải qua nh ng tiữ ến hóa nhanh chóng, điều này đặt ra m t nhu c u c p bách ộ ầ ấtrên toàn c u v vi c phát tri n vaccine ầ ề ệ ể EV A71 để- phòng ng a và kiừ ểm soát

b nh ệ

Theo một nghiên cứu tổng hợp của Dingmei Zang v cộng sự vào năm à

2010 dựa trên 55 bài viết về phát triển vaccine EV-A71 cho ta thấy đã có rất nhiều vaccine EV-A71 đã và đang được phát triển [60] Một số vaccine EV-A71

đã được nghiên cứu sản xuất, bao gồm vaccine tiểu đơn vị, vaccine vỏ virus (VLP), vaccine ADN, vaccine sống giảm động lực và vaccine virus bất hoạt Đây đều là các vaccine tiềm năng nhằm mục tiêu kiểm soát và ngăn ngừa bệnh TCM

do EV-A71 gây ra [61]

Năm 2010, đã có 5 loại vaccine bất hoạt EV A71 được đưa vào thử nghiệm lâm sàng tại Viện nghiên cứu y tế quốc gia (NHRI) của Đài Loan; Trung Quốc (Sinovac, Bejiing Vigoo, CAMS) và Singapore (Inviragen) [62-64] Hiệu quả lâm sàng của ba loại vaccine Trung Quốc đã được đánh giá trong các thử nghiệm pha III cho thấy tất cả ba loại vaccine đều được bảo đảm an toàn dung nạp tốt ,

-và cung cấp bảo vệ ≥90% bệnh do EV-A71 gây ra [64]

Tháng 12 năm 2015, vaccine EV-A71 bất hoạt toàn phần đầu tiên trên thế giới đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc (CFDA) phê duyệt [65] Tuy các loại vaccine được nghiên cứu chế tạo trên các chủng phân lập C4 tại Trung Quốc nhưng đã được chứng minh có tác dụng chéo với các kiểu gen EV A71 khác lưu hành gây dịch vào các năm khác trên toàn cầu như -B1, B4, B5, C2, C4 và C5 [66, 67] Tuy nhiên, vẫn còn một vài thách thức đối với việc sử dụng vaccine EV-A71 trên toàn thế giới, bao gồm khả năng áp dụng đối với các chủng đại dịch EV-A71khác nhau ở các quốc gia khác, yêu cầu quốc

tế về sản xuất và kiểm soát chất lượng vaccine, tiêu chuẩn hóa các phương pháp theo dõi và phát hiện mầm bệnh khác nhau Do đó, cùng với việc đưa vaccine EV-A71 ra thị trường, vẫn còn một chặng đường dài trước khi đạt được sự bảo

vệ hiệu quả chống lại bệnh TCM nghiêm trọng về sau [65, 68] Ngoài ra, các nghiên cứu cho rằng vaccine EV-A71 không thể ngăn ngừa nhiễm trùng do CA16 và các loại VRĐR khác [69], và vaccine EV-A71 / CA16 cũng không gây đáp ứng miễn dịch với CA10 và CA6 [66] Điều này đặt ra một thách thức cho các nhà sản xuất vaccine, tiến tới phải là vaccine đa giá để kiểm soát và ngăn chặn một cách hiệu quả các vụ dịch TCM

1.3 Tình hình nghiên c u d ch t h c phân t và s phân b        kiu gen, phân nhóm gen virus EV-A71 gây b nh TCM 

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.3.1

VRĐR gây bệnh TCM ở người chủ yếu là những VRĐR thuộc nhóm A (HEV-A), bao gồm CV-A6, CV-A10, đặc biệt là CV-A16 và EV-A71 Những năm gần đây tại khu vực Châu Á Thái Bình Dương, virus EV A71 thường gây ra -

21

các vụ dịch TCM có biến chứng trầm trọng như các dạng thần kinh trung ương

và tử vong, các chủng virus gây bệnh được phân lập và xác định gồm nhiều kiểu gen khác nhau

Kiểu gen chuẩn (kiểu gen gốc) của chủng EV-A71, BrCr-CA-70, được phân lập tại Califorinia vào năm 1970 và là kiểu gen duy nhất trong nhóm A, kiểu gen này đã không được phát hiện sau đó cho đến năm 2008 trong một vụ dịch tại tỉnh An Huy, Trung Quốc [70] Theo một nghiên cứu đưa ra có thể có hai cách giải thích cho sự tái xuất hiện kiểu gen này, một là các chủng lưu hành trong

vụ dịch tại tỉnh An Huy năm 2008 xuất hiện do sự trao đổi giữa Mỹ và Trung Quốc, hai là những chủng virus này có nguồn gốc từ Trung Quốc và sau đó bị đột biến Sự tái xuất hiện của kiểu gen A cho thấy mối nguy cơ tiềm tàng bùng phát các vụ dịch tay chân miệng đe dọa đến sức khỏe của trẻ em Hơn nữa khả năng tái tổ hợp của virus EV A71 cho thấy virus này có khả năng biến đổi thành nhiều -kiểu gen hoặc các phân nhóm mới [71]

Các chủng virus thuộc kiểu gen C được phân lập vào năm 1985 ở Hoa Kỳ, Canada, Trung Quốc Dòng gen C có nhóm gen ph ụ C1 được báo cáo lần đầu tiên t i M ạ ỹ và Australia trong năm 1970, năm 1980, phân lập vào năm 1998 ởSarawark, Tây úc năm 2000 và nhóm gen phụ C2 phân l p ậ ở Tây úc và Đài Loan năm 1998-1999 Tuy nhiên trong 4 nhóm ph trên thì nhóm ph ụ ụ C1 (lưu hành chính ở Sydney) có kh ả năng gây dịch th p, nhóm gen C2 có kh ấ ả năng gây dịch

lớn và có độ ực đốc l i v i h ớ ệ thần kinh Nhóm gen C2 chính là căn nguyên đầu tiên gây v d ch l n tụ ị ớ ại Đài Loan năm 1998 Nhóm gen C3 được phân l p tậ ại Nhật B n vào ả năm 1994, và tại Hàn Quốc năm 2000 [72] Các nhóm gen ph C4 ụ

đã chủ ếu được xác đị y nh trong các v d ch l n châu Á, có nhiụ ị ớ ở ều trường h p ợ

n ng và t ặ ử vong đã được báo cáo Trong năm 2004, nhóm gen phụ C4 đã được phát hi n lệ ần đầu tiên ở châu Âu, và đến nay ch ỉ được báo cáo trong t ng s chín ổ ốtrường h p Áo, Croatia, Hungary Theo các nghiên cợ ở ứu trước đây các chủng virus phân l p t ậ ừ năm 1998 và 2017 Trung Qu c thu c v ở ố ộ ề các nhóm gen phụ C2, C3, C4, và các kiểu gen C là kiểu gen chiếm ưu thế [71, 73] Tại Đài Loan, các nghiên cứu cho thấy phân nhóm gen chiếm ưu thế khác nhau xảy ra trong năm 1998 (C2), 2000-2001 (B4), 2004-2005 (C4), và 2008 (B5) Các phân nhóm gen này cũng đã được quan sát thấy ở Malaysia và Việt Nam, trong khi các chủng dưới nhóm C3 và C5 ít xuất hiện [74]

Các chủng thuộc nhóm gen B được phân lập ở Hoa Kỳ và Úc trong giai đoạn 1972 1988, và từ một vụ dịch lớn ở Malaysia năm 1997, và hiện nay các -chủng này vẫn lưu hành trên thế giới [75] Virus EV-A71 kiểu gen B được tách thành hai phân nhóm ph B1 và B2 có s khác bi t kho ng 12% v trình t ụ ự ệ ả ề ự

nucleotide, các chủng này lưu hành chính trong những năm 1970 và 1980 Năm

1970 nhóm ph B1 là nguyên nhân gây b nh ch y u t i M , Châu Âu, Nh t Bụ ệ ủ ế ạ ỹ ậ ản

và Australtia, trong khi đó nhóm phụ B2 được phân l p M ậ ở ỹ vào năm 1980 Năm 1997, trong mộ ụ ịt v d ch l n bùng phát tớ ại Sarawark, Malaysia đã tìm là một chủng virus nhóm B khác biệt và được đặt tên là nhóm ph B3 ụ Virus thuộc nhóm gen B3 cũng được phân lập tại Singapore vào năm 1998, và B3 là nhóm

gen phổ biến ở Perth trong năm 1999 Một nhóm gen B dưới nhóm B4 đã được xác định tại Singapore vào năm 1997 và tiếp tục lưu hành ở đó trong năm 2000 kéo dài đến năm 2002 Virus từ nhóm gen B4 cũng được xác định là nguyên nhân chính của sự bùng phát dịch bệnh TCM lớn ở Sarawak, Nh t B n, Malaysia ậ ả

và Singapore năm 2000 Năm 2003 nhóm phụ B4 đã được thay th b i nhóm ph ế ở ụB5 ở Sarawak, và lưu hành như chủng virus ch yếủ u t i Nh t Bạ ậ ản, Đài Loan [76-79]

So sánh các vụ dịch TCM đã xảy ra trong bốn thập kỷ qua, các đặc điểm dịch tễ học của virus EV-A71 dường như đang thay đổi EV A71 đã nổi lên như -một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng trên toàn thế giới Chưa có mối liên quan nào được thiết lập cụ thể giữa kiểu gen và mức độ nghiêm trọng của bệnh [80] Từ năm 1900 đến năm 2016, các bệnh nhiễm trùng liên tiếp gây ra bởi các virus thuộc nhóm con B0, B1 và B2, sau đó là sự thay đổi về ưu thế này so với các nhóm thuộc nhóm con C1, C2, C3, C4a và C4b Một nghiên cứu dịch tễ học phân tử cho thấy sự tiến hóa của virus EV A71 có đặc điểm toàn cầu Khả năng -miễn dịch toàn cầu chống lại virus C1 và C2 có thể giải thích tại sao dịch bệnh gây ra bởi các nhóm con B4 và C4 bị hạn chế ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương [81] Nhóm con B5 đã được báo cáo là khác biệt về mặt kháng nguyên so với B1, B4, C2 và C4 [28] và do đó có thể gây nguy cơ tiềm ẩn cho dịch bệnh lan

ra ngoài khu vực châu Á

Nghiên c u cho th y t ứ ấ ừ năm 1997, virus đã tăng đáng kể ự lưu hành và s

động l c t i khu v c Châu Á-ự ạ ự Thái Bình Dương và có sự ế ti n hoá liên t c trong ụ

vật liệu di truy n c a các ch ng EV-ề ủ ủ A71 lưu hành S ự biến đổi đó ảnh hưởng đến

kh ả năng dịch t h c và b nh hễ ọ ệ ọc của virus Tỷ lệ tiến hóa hàng năm ở các 2 kiểu gen B và C được ước tính là khoảng 1,35 x 10-2 nucleotide thay đổi/điểm/năm (substitutions/site/year), kết quả cho thấy virus EV A71 có sự đa dạng và tiến -hóa nhanh chóng về mặt di truyền Sự lưu hành rộng rãi trên toàn thế giới và khả năng gây bệnh nghiêm trọng của virus EV A71 đã nhấn mạnh sự cần thiết phải -giám sát và phát triển các biện pháp xác định, ngăn chặn loại virus này [82] Ngoài ra, việc giám sát quá trình tiến hóa di truyền và kháng nguyên liên tục của EV-A71 là quan trọng đối với việc kiểm soát dịch bệnh và sự phát triển vaccine

B ng 1.1 S ả ự thay đổi phân nhóm gen EV-A71 các qu c gia, 1997 - 2018 [83, 84] ở ố

Australia Trung Qu c ố Nhậ t B n ả Hàn Qu c ố Malaysia Singapore Đài Loan Thái Lan Áo Hà

C2

B3, B4, C1, C2

Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.3.2

Ở Việt Nam, EV-A71 được phân lập đầu tiên t i viạ ện VSDTTƯ vào năm

2003 t b nh nhân 27 tháng tu i s ng t i Hà Tây v i bi u hi n lâm sàng cừ ệ ổ ố ạ ớ ể ệ ủa

b nh tay chân mi ng kèm theo li t chi và viêm não [52] ệ ệ ệ Cũng vào năm này, viện Pasteur thành ph HCM công b phân lố ố ập được EV-A71 t ừ 12 trường h p b nh ợ ệnhân tay chân miệng và đây cũng là năm đầu tiên phân lập được EV-A71 Trong năm 2005, 764 trẻ em đã được đưa đến bệnh viện Nhi Đồng tại TP Hồ Chí Minh, Việt Nam, với chẩn đoán lâm sàng về bệnh TCM Tất cả các trẻ em được lấy mẫu dịch ngoáy họng và phân lập VRĐR bằng phương pháp nuôi cấy tế bào VRĐR đã được phân lập từ 411 mẫu bệnh phẩm, trong đó 173 (42,1%) mẫu phân lập được xác định là EV-A71 và 214 (52,1%) là coxsackivirus A16 Khi phân tích cây di truyền của EV A71 phân lập được cho thấy, virus EV A71 lưu hành - -trong vụ dịch thuộc 3 nhóm phân loại C1, C4, và một nhóm chưa từng xuất hiện

ở Việt Nam và các nước láng giềng, C5[5]

Ở miền Bắc chưa có một vụ dịch lớn nào do EV A71 gây ra nhưng vẫn phân lập được chủng EV A71 rải rác ở những ca bệnh lâm sàng khác nhau từ -bệnh nhân bệnh tay chân miệng, bệnh bại liệt giống polio, viêm não cấp, nghiên cứu chủng virus EV A71 phân lập trong các năm 2003, 2005 2007 đã cho - -thấy có sự lưu hành của virus EV A71 nhóm gen C, nhóm gen phụ C5 - [5]

-Tuy nhiên, bệnh TCM thực sự được xem xét là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng tại Việt Nam khi dịch bệnh bùng phát khắp nước vào năm 2011 2012 với tỷ lệ ca bệnh nặng và tử vong tăng cao, từ năm 2011, bệnh -TCM đã được đưa vào hệ thống giám sát bệnh quốc gia Số liệu giám sát ghi nhận, từ năm 2005 đến 2010, số ca TCM mắc/tử vong tại miền Nam là 10.128/6

ca thì chỉ trong năm 2011, số ca mắc/tử vong tại hai vùng miền là 20.529/3 ca tại miền B c, 70.261/145 t i miắ ạ ền Nam Năm 2012, số mắ ửc/t vong là 51.618/0 ca

t i mi n B c và 75.268/41 ca t i mi n Nam [55, 56, 85, 86] Phân nhóm C4 cùng ạ ề ắ ạ ề

v i B5 là hai phân nhóm chính c a EV-ớ ủ A71 lưu hành gây bệnh TCM ở Việt Nam trong quá trình giai đoạn 2011-2013 [87]

25

B ng 1.2 Các phân nhóm gen ả EV-A71 lưu hành ại Việ t t Nam, 2003-2016

Năm Miền Bắc Miền Trung Miền Nam

Một số nghiên cứu di truyền trên vùng gen VP1 của

Trong t t c b n lo i protein capsid (VP1-VP4), VP1 có vai trò quan tr ng ấ ả ố ạ ọtrọng vi c nh n di n t bào ch , quyết định đến tính kháng nguyên và độ ựệ ậ ệ ế ủ c l c của virus Đoạn gen tương ứng mã hóa VP1 có chiều dài 891 nucleotide (từ ị trí vnucleotide 2446 đến 3336 trên b gen c a chộ ủ ủng gốc (prototype) EV-A71_BrCr),

mã hóa 297 axit amin Những đột biến trong vùng VP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần axit amin, c u trúc v ấ ỏ capsid, thay đổi đặc tính kháng nguyên, tính gây bệnh của virus, từ đó có thể hình thành biến chủng mới Ngoài ra, vì vùng VP1 có tính đột biến cao, ảnh hưởng đáng kể n sđế ự biến đổi chung của hệ gen nên thường được lựa chọn để nghiên cứu đặc điểm di truyền phát sinh loài của virus [44]

M t s nghiên cộ ố ứu đặc điểm vùng gen VP1 c a EV-ủ A71 đã xác định s ựthay đổ ủi c a m t vài v trí axit amin quan trộ ị ọng trong đoạn VP1 c a EV-A71 có ủthể ẫn đế d n bi n ch ng mế ủ ới hay tăng tính độ ực l c virus Ví dụ độ, t biến t i vùng ạđầu cuối N VP1 có thể làm tăng khả năng gây nhiễm c a virus S ủ ự thay đổi VP1 (K244E) của phân nhóm B5 hoặc VP1 (Q145E) của phân nhóm C4 được cho là yếu

tố quyết định di truyền quan trọng làm tăng độc lực c a virus [89, 90] Hơn nữa, đột ủbiến VP1-145E chịu trách nhiệm chính cho s nhân lên cự ủa virus trong máu và gây

ra các biến chứng th n kinh nghiêm trầ ọng [91] S thay th A170V có th liên ự ế ểquan t i s ớ ự tăng độc tính th n kinh c a EV-A71 trong v d ch t i Perth [92] V ầ ủ ụ ị ạ ịtrí aa 292 là v trí quyị ết định tính xâm nh p và sao chép c a EV-ậ ủ A71 đố ớ ếi v i t bào ch [15] M t nghiên c u t i khu v c Châu Á ủ ộ ứ ạ ự – Thái Bình Dương dựa trên vùng gen VP1 EV-A71 liên quan đến m t s ộ ố đợt bùng phát b nh TCM t ệ ừ năm

1994 2013, nhóm nghiên c– ứu đã chỉ ra mười b n v trí thay th ố ị ế đã được phát

hi n trong trình t gen VP1, bao g m các v trí ph biệ ự ồ ị ổ ến liên quan đến trung hòa

ở ị trí V249I và A289T; Q22H và Q22R liên quan đến tăng độ ực; độ v c l t bi n ếK43E, A58T, S184T và T240S có th ể làm thay đổ ấi c u trúc không gian; G145E

và T240S ảnh hưởng đến tính k ỵ nước của VP1 do đó làm thay đổi kh ả năng miễn d ch EV-ị A71 [93]

Trên vùng gen VP1 c a EV-ủ A71 có 6 vòng “chức năng”, (functional loop), được đặt tên BC (nằm v trí axit amin s -105), DE (142-156), EF (163-177), GF ị ố 97(182-185), GH (208-222) và HI (240-260) Các v trí axit amin nhô ra b mị ề ặt bên ngoài virus và n m cằ ạnh các h m núi (canyon) trong các vòng lẻ ần lượt là 97, 145,

164, 184, 212-215, 242-244, đây là các axit amin quan trọng cho việc liên k t thế ụ thể [16, 20, 94] Đột biến (L97R) trong vòng lặp BC làm tăng rõ rệ ựt s nhân lên của virus trong tế bào thần kinh [15]

27

Vùng gen VP1 của EV-A71 có tính bảo tồn cao và có nhiều v trí quyị ết nh địkháng nguyên (epitopes), nên các nhà nghiên c u vứ ề vaccine tiểu đơn vị hiện nay đều tập trung vào việc phát triển vaccine trên vùng gen này VP1

Thời gian thu thập mẫu nghiên cứu: 2012-2017

Địa điểm thực hiện xét nghiệm: PTN virus đường ruột – Khoa Virus –Viện

Vệ sinh Dịch Tễ Trung Ương

+ Hidi Formamide (ABI, 4311320)

+ Các sinh ph m dùng cho máy Sequencer ABI3100: ẩ

29

+ ADN LADER 100 (300 ul), (Promega, G8291)

- B m i  vùng gen VP1 c a virus EV-A71  [3]

+ T ủ an toàn sinh học; Máy ly tâm; T l nh và t âm sâu; ủ ạ ủ

- Một ố ật tư và trang thiết bị s v khác s d ng cho kử ụ ỹ thuật sinh h c phân t ọ ử2.4  pháp nghiên c u 

Thiết kế nghiên cứu

2.4.1

Nghiên cứu h i ồ c u, ứ thực nghiệm PTN kế ợt h p mô t ả

Quy trình nghiên cứu

2.4.2

Phân tích các y u t d ch t h c b nh TCM t các phiế ố ị ễ ọ ệ ừ ếu điều tra d ch t ca ị ễ

b nh: 2.228 phiệ ếu điều tra của các trường h p m c b nh TCM t i 26 t nh phía ợ ắ ệ ạ ỉ

B c t ắ ừ năm 2012-2017 Thông tin (thông tin dịch ễ tuổ t : i, giới tính, địa chỉ; Thông tin m u b nh ph m thu th p: ẫ ệ ẩ ậ nơi gửi m u, ngày khẫ ởi phát, các đặc điểm lâm sàng, độ lâm sàng) được ki m tra rà soát và nh p file excel Các ca b nh ể ậ ệđược ghi nh n qua h th ng giám sát b nh truy n nhi m các tậ ệ ố ệ ề ễ ỉnh, được g i v ử ềphòng thí nghi m qua các trung tâm y t d phòng t nh Phiệ ế ự ỉ ếu điều tra được lưu

gi tữ ại PTN Virus Đường ruột – ệ vi n VSDTTW Các phân tích bao g m m i liên ồ ốquan gi a s phân b c a virus theo nhóm tu i m c b nh, thữ ự ố ủ ổ ắ ệ ời gian lưu hành, vùng địa lý và các mức độ lâm sàng c a ca b nh N i dung nghiên c u này mang ủ ệ ộ ứtính k ế thừa vì s d ng k t qu ử ụ ế ả chẩn đoán các căn nguyên VRĐR gây bệnh TCM

t i các t nh mi n Bạ ỉ ề ắc trong chương trình giám sát TCM thường xuyên và tr ng ọđiểm được th c hiự ện hàng năm tại PTN VRĐR trong giai đoạn 2012-2017

M u b nh phẫ ệ ẩm được thu th p b i h ậ ở ệ thống TTYTDP t nh và chuyỉ ển đến PTN để ế ti n hành xét nghi m chệ ẩn đoán tác nhân gây bệnh Có 2 phương pháp

chẩn đoán chính được s d ng t i phòng thí nghi m trong quá trình nghiên c u ử ụ ạ ệ ứNăm 2012-2013, các mẫu được xác định dương tính với VRĐR và định danh EV-A71 bằng phương pháp CODEHOP snRT-PCR, các mẫu dương tính với VRĐR còn ạl i s ẽ được định danh bằng phương pháp snRT-PCR/Sequencing [37] K t ể ừ năm 2014, VRĐR và một trong b n kiố ểu VRĐR EV-A71, CV-A6, CV-A16, CV-A10 được xác định bằng phương pháp multiplex RT PCR - [95] Các mẫu dương tính với VRĐR còn lạ ẽ được đượi s c ti p tế ục định danh b ng ằphương pháp CODEHOP snRT-PCR/Sequencing [37] Việc định danh dưới nhóm gen c a EV-ủ A71 (nhóm C4a và B5) được th c hi n bự ệ ởi phương pháp giải trình t và phân tích m t phự ộ ần đoạn gen VP1 [33, 37] Các bước xét nghi m trên ệ

đã được th c hi n bự ệ ởi PTN VRĐR-viện VSDTTW giai đoạn 2012-2017

Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành vi c ch n m u và gi i trình t ứ ế ệ ọ ẫ ả ựtoàn b ộ vùng gen VP1 đối v i các mớ ẫu đã được xác định dương tính với phân nhóm B5 c a EV-A71 (EV-ủ A71_B5) C ụ thể, các mẫu dương tính với EV-A71_B5 s ẽ được ch n ng u nhiên có h ọ ẫ ệ thống, cân nhắc đến y u t ế ố thời gian (tháng kh i phát b nh ho c tháng thu th p m u) và y u t a lý (t nh thu thở ệ ặ ậ ẫ ế ố đị ỉ ập

m u) T ng c ng 200 mẫ ổ ộ ẫu dương tính với EV-A71_B5 đã được chọn để khu ch ế

đại và gi i trình t toàn b vùng gen VP1 bả ự ộ ằng phương pháp RT-PCR sequencing, sử ụ d ng h th ng mệ ố ồi đặc hi u v i EV-ệ ớ A71[3] Kết qu gi i trình t ả ả ựsau đó được phân tích, kết nối trình tự bằng phần mềm Lasergene và tiến hành các phân tích di truyền, sử dụng gói phần mềm Mega7 [96]